Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào - Chương 3: Hệ thống nuôi cấy tế bào vi sinh vật - Nguyễn Thành Luân

Nội dung text: Bài giảng các phương pháp nuôi cấy tế bào - Chương 3: Hệ thống nuôi cấy tế bào vi sinh vật - Nguyễn Thành Luân

1. 5/17/2013 TRƢỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CNSH & KTMT BÀI GIẢNG CÁC PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO Chƣơng III HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO VI SINH VẬT GV: Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Hệ thống nuôi cấy TB VSV Bể phản ứng sinh học (bioreactor) hay còn gọi là hệ thống lên men (fermenter system) là loại thiết bị chủ yếu sử dụng trong nuôi cấy tế bào VSV Sự biến đổi hóa sinh được tiến hành bởi các tế bào sống hoặc các thành phần tế bào in vivo (enzyme). • Trong phòng thí nghiệm, các tế bào thường được nuôi cấy trong các bình tam giác trên máy lắc ổn nhiệt (thermal shaker) hoặc chế tạo ra các hệ thống khác nhau dựa trên các dụng cụ hiện có. • Dựa trên đòi hỏi của mô hình/hệ thống nuôi cấy tế bào VSV: điều kiện môi trường, tốc độ nuôi cấy & thời gian nuôi cấy. 1
2. 5/17/2013 Các dạng hệ thống cơ bản Theo cấu tạo thiết bị: • Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (Stirred Tank) và nuôi cấy hình ống (Plug Flow) • Hệ thống nuôi cấy lắng ly tâm (Segregated Reactor) • Nuôi cấy đồng nhất (homogenous reactor) và không đồng nhất (heterogenous reactor) Phân loại hệ thống nuôi cấy • Theo mô hình – Nuôi cấy mẻ (batch culture), mẻ bổ sung cơ chất (fed-batch culture) & liên tục (continuous culture) – Nuôi cấy dạng cột (spin column culture) & nuôi cấy dạng vòng (loop culture) – Nuôi cấy cân bằng phản ứng tế bào – Nuôi cấy mô & nuôi cấy tế bào một lần – Nuôi cấy bổ trợ TB (Cell support system) – Bể phản ứng nuôi cấy tế bào (Cell bioreactors) Hệ thống nuôi cấy thùng khuấy Là 1 dạng lên men liên tục trong nuôi cấy tế bào Đối với hoạt động sản xuất ở quy mô lớn, thì hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (stirred-tank fermenter, STF) được sử dụng rộng rãi nhất để thiết kế cho quá trình nuôi cấy quy mô công Hình: Sơ đồ hệ thống nuôi cấy dùng trong sản xuất nghiệp. penicillin 2
3. 5/17/2013 Điều kiện vận hành hệ thống • Cường độ pha trộn (mixing intensity) có thể rất khác nhau bằng cách chọn loại cánh khuấy (impeller) thích hợp và các tốc độ khuấy khác nhau • Nó có thể được dùng cho cả hai trường hợp lên men hiếu khí (aerobic) và yếm khí (anaerobic) trong một phạm vi rộng các loại tế bào khác nhau bao gồm vi sinh vật, động vật và thực vật, Ƣu điểm của hệ thống • Là một trong những hệ thống lên men quy mô lớn đầu tiên được phát triển trong công nghiệp dược, bia, rượu • Do hệ lên men thùng khuấy thường được làm bằng thép không rỉ và hoạt động trong điều kiện ôn hòa nên tuổi thọ của thiết bị rất lâu Nhƣợc điểm của hệ thống • Bộ phận (cánh) khuấy tiêu thụ một lượng lớn công suất và có thể gây nguy hiểm cho những hệ thống nuôi cấy tế bào mẫn cảm với lực trượt (shear force) như tế bào động vật có vú hoặc tế bào thực vật khả dụng cho nuôi cấy VSV • Lực trượt của chất lỏng trong hỗn hợp được tạo ra bởi gradient tốc độ của các thành phần tốc độ cao do khi chất lỏng rời khỏi vùng trung tâm, thì tốc độ của nó ở vị trí trên và dưới cánh khuấy (có khoảng cách bằng chiều rộng cánh khuấy) sẽ giảm. 3
4. 5/17/2013 • Khi tỷ lệ chiều rộng cánh khuấy trên đường kính của nó tăng thì cấu hình tốc độ ít có dạng đặc trưng của parabol mà trở nên tù hơn và nó tạo ra lực trượt ít hơn do gradient tốc độ lớn dần lên Hạn chế trong việc có thể ứng dụng thành công hệ thống lên men thùng khuấy trong nuôi cấy tế bào động vật hoặc tế bào thực vật Hệ lên men dòng nút (plug-flow fermenter, PFF) • Còn được gọi là hệ lên men mẻ (batch fermenter) hệ lên men lý tưởng có khả năng pha trộn tốt sao cho các thành phần đồng nhất trong một kết cấu ở mọi thời điểm • Chất dinh dưỡng (cơ chất) và tế bào đi vào một đầu của ống hình trụ và tế bào sẽ sinh trưởng trong khi chúng đi qua ống này Hệ lên men dòng nút (plug-flow fermenter, PFF) 4
5. 5/17/2013 • Nuôi cấy theo đường ống dài và thiếu bộ phận khuấy nên đã ngăn cản sự pha trộn hoàn toàn của chất lỏng tế bào thay đổi dựa trên tính chất của chiều dòng chảy • Một hệ lên men dòng ống mà không có những biến thiên hướng tâm thì được gọi là hệ lên men dòng nút (PFF) Nuôi cấy mẻ tế bào (Batch culture) • Đơn giản & sử dụng rộng rãi trong sản xuất vaccine quy mô công nghiệp & các sản phẩm rRNA protein • Cho phép sinh trưởng & sản sinh tế bào trong 1 bình chứa kín HỆ THỐNG NUÔI CẤY MẺ 5
6. 5/17/2013 Nuôi cấy mẻ tế bào (Batch culture) • Hạn chế về môi trường (do cung cấp 1 lần) nên khi không còn cơ chất, TB dừng phát triển và chết dễ thoái hóa TB trong hệ thống • Nếu muốn tiếp tục nuôi cấy, phải tạo môi trường phụ bổ sung bằng việc thêm các tế bào trong môi trường nuôi cấy cũ vào trong môi trường dinh dưỡng mới ban đầu (tăng sinh) Nuôi cấy mẻ (batch culture) • Tốc độ khởi đầu của phản ứng xúc tác tự động chậm do nồng độ của cơ chất ban đầu thấp. • Tốc độ phản ứng tăng lên khi các tế bào sinh sản và sau đó sẽ đạt đến tốc độ tối đa. • Khi lượng cơ chất giảm và các sản phẩm độc được tích lũy, thì tốc độ phản ứng giảm xuống ở giá trị thấp hơn Cách lắp đặt hệ thống mẻ trong quy mô phòng thí nghiệm nhỏ Nguyên liệu: • 250 mL Erlenmeyer flask. • Vải mùng /miếng gạt y tế vừa với 1 Pasteur pipette • Không khí được bơm vào trong môi trường duy trì nồng độ CO2 và O2 • Kéo, bông mỡ (cotton) 6
7. 5/17/2013 • Bƣớc 1: Cắt 2 lớp của bông mỡ (10 X 10 cm) và đặt vào giữa miếng vải mùng đã được chuẩn bị. • Bước 2: Gấp các góc của miếng vải mùng lại thành 1 khối tròn cho cả 4 góc . • Bước 3: Lấy 1 đầu nhọn của cây kéo và khoan 1 lỗ nhỏ cho Pasteur pipette. • Cho Pasteur pipette đâm xuyên qua lỗ và cố định trên miệng của bình Erlenmayer. 7
8. 5/17/2013 • Thêm môi trường và tế bào nuôi cấy vào bình, cho không khí đi vào bình thông qua 1 máy sục khí • Đặt môi trường nuôi cấy ra ngoài ánh sáng/dưới ánh đèn nếu nuôi cấy VSV tự dưỡng Các pha tăng trƣởng của hệ thống Các pha Sự tăng trƣởng Mật độ tế bào Đặc điểm 1 lag zero Thích nghi cơ học của các tế bào với sự thay đội diều kiện sống 2 Gia tốc Gia tăng Không đáng kể 3 Pha log Tăng liên tục Gia tăng mật độ thay đổi môi trường (exponential) của tế bào 4 Chậm phát triển TB Giảm sút nhanh Tác dụng của những điều kiện thay đổi xuất hiện 5 Ổn định zero 1 hay nhiều thành phần dinh dưỡng (hoặc ánh sáng) bị cạn kiệt đến mức nguy hại cho sự phát triển của tế bào 6 Suy vong Tiêu cực (độc tố) Quãng thời gian của pha ổn định và sự giảm sút các tỷ lệ tế bào phụ thuộc hoàn toàn vào cấu tạo của tế bào VSV Hệ thống nuôi cấy liên tục (Continuous culture system) Môi trường nuôi cấy được chứa đựng trong 1 bể chứa lớn. Không khí được thổi vào khu vực rỗng trong bình chứa. Áp lực không khí sẽ đẩy môi trường đi qua đường ống kết nối với môi trường chứa tế bào nuôi cấy. Bằng việc đóng mở khóa trên đường ống môi trường, có thể kiểm soát việc thêm môi trường vào bình nuôi cấy . 8
9. 5/17/2013 Hệ thống nuôi cấy liên tục (Continuous culture system) Sơ đồ hệ thống nuôi cấy liên tục Hệ thống nuôi cấy liên tục (Continuous culture system) • Hệ thống nuôi cấy liên tục được sử dụng rộng rãi cho cả mục đích sản xuất công nghiệp & nghiên cứu (theo Kubitschek 1970; Tempest 1970; Veldkamp 1976, 1977; Rhee 1980; Munawar và cộng sự, 1989) • Được nghiên cứu nhiều trong các nghiên cứu VSV hoặc các phương pháp VSV môi trường như tảo, nấm, VK kỵ khí gây độc cho môi trường (ecotoxicology theo Rhee 1980, 1989). • Hệ thống nuôi cấy liên tục được sử dụng từ nghiên cứu của Novik and Szilard (1950) với sự phát triển hệ thống “chemostat”, và Monod (1950) người đặt tên hệ thống nuôi cấy là 1 “bactogen” Lắp đặt hệ thống nuôi cấy liên tục trong phòng thí nghiệm • Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong 1 bể chứa khoảng 6-7 lít môi trường • Thêm vào 500mL sau đó cứ thêm 100 mL môi trường nuôi cấy mỗi ngày đảm bảo tỷ lệ pha loãng 20% và thể tích đạt được là 6-7 lít trong 2 tuần. 9
10. 5/17/2013 Hệ thống nuôi cấy liên tục (Continuous culture system) • Fogg and Thake (1987) làm rõ ràng hệ thống nuôi cấy liên tục “turbidostat” và “chemostat” • Trong hệ thống “turbidostat”, môi trường dinh dưỡng chỉ được thêm vào khi số lượng tế bào đạt ngưỡng kỳ vọng khi được đo lường qua mật độ quang (OD) của tế bào. Tại điểm này, môi trường sẽ bắt đầu thêm vào và tế bào đạt sẽ được thu nhận. Nếu quá số lượng cho phép, sẽ tiến hành pha loãng và lặp lai từ đầu. • Trong hệ thống chemostat, môi trường được duy trì ở 1 tỷ lệ nhất định kiểm soát hoàn toàn tỷ lệ sinh trưởng và độ phân bố tế bào. . Phân biệt Chemostat vs Turbidostat Turbidostat Chemostat Turbidostat vs Chemostat Các yếu tố Turbidostat Chemostat PP kiểm tra tốc độ sinh Bên trong Bên ngoài trƣởng Tỷ lệ sinh trƣởng của tế Bằng hoặc gần đạt µ Từ 0 – gần đạt µ bào max max Tác dụng của việc gia Chỉ gia tăng cơ chất phản tăng nồng độ của các ứng khi có sự thay đổi của Gia tăng trong điều kiện chất dinh dƣỡng trong máy đo cường độ ánh gia tăng nồng độ cơ chất bể nuôi cấy sáng (photometer) Thể tích nuôi cấy Cố định Cố định Điều kiện môi trƣờng Cố định Cố định Thời gian nuôi cấy Không xác định Không xác định Các biến đổi µmax tại tỷ lệ Các loại đột biến đƣợc Biến đổi µmax và các dạng pha loãng cao, các đột chọn lọc qua việc nuôi khác nhau của những loại biến Ks tại nơi có tỷ lệ pha cấy kéo dài biến đổi trung gian loãng thấp và 1 số dạng biến đổi trung gian 10
11. 5/17/2013 Turbidostat vs Chemostat • Trong chemostat, tốc độ dòng chảy được cài đặt ở một giá trị đặc biệt và tốc độ sinh trưởng của nuôi cấy sẽ điều chỉnh tốc độ dòng chảy này. • Hoạt động chemostat dễ dàng hơn turbidostat, do nó có thể được thực hiện bằng cách đặt máy bơm ở một tốc độ dòng chảy không đổi. Turbidostat vs Chemostat • Turbidostat đòi hỏi một thiết bị cảm quang (optical sensing device) và một bộ điều chỉnh (controller) • Turbidostat chỉ thực hiện được với các tế bào có khả năng hấp thụ ánh sáng như tảo, TB thực vật, VSV quang dưỡng (photocells) Batch vs continuous culture • Trong nuôi cấy liên tục, dinh dưỡng được cung cấp đến tế bào theo 1 tỷ lệ nhất định không đổi và theo 1 thể tích nhất định, lượng tế bào cũng tương đương (Số lượng TB nuôi cấy đạt được pha ổn định ở cả tế bào nuôi cấy đi vào và đi ra) ổn định • Nuôi cấy mẻ tạo ra sinh khối nhiều & thời gian sử dụng cơ chất nhanh nhưng dễ bị thay đổi cơ chất (do VSV sử dụng & biến đổi theo từng pha) 11
12. 5/17/2013 Batch vs continuous culture • Nuôi cấy liên tục đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng của TB nhưng khó thay đổi cơ chất và VSV (in vivo) phức tạp • Nuôi cấy mẻ đòi hỏi việc đáp ứng nhu cầu sinh trưởng của TB nhưng dễ dàng chuyển qua cơ chất khác (in vitro) đơn giản hơn Batch vs continuous culture • Hầu hết các hệ lên men sản xuất là một hệ thống nuôi cấy liên tục (cánh khuấy) hoạt động với nồng độ tế bào mà ở đó giá trị của là tối thiểu do nó đòi hỏi thời gian lưu ngắn nhất. • Nếu nồng độ cuối cùng của tế bào được hướng tới ở trong pha tĩnh, thì hệ lên men mẻ là chọn lựa tốt hơn nuôi cấy cánh khuấy (liên tục - CSTF), vì thời gian lưu cần thiết cho nuôi cấy mẻ là ngắn hơn của CSTF Các hệ thống nuôi cấy khác 12
13. 5/17/2013 Mục đích • Nhằm để cải thiện hoặc nhược điểm của hệ thống nuôi cấy thùng khuấy (tiêu thụ công suất lớn) hoặc các yêu cầu đặc biệt của một quá trình nuôi cấy nhất định – Sục khí tốt hơn, – Chuyển nhiệt hiệu quả, – Tách hoặc giữ lại tế bào, – Bất động tế bào, – Giảm bớt thiết bị và giá thành của sản phẩm, – Không được thiết kế cho quy mô lớn. Hệ thống nuôi cấy dạng cột Các hệ lên men cột: (a) cột bong bóng (bubble column), (b) cột hình nón (tapered column), (c) cột bong bóng có khay sàng lọc (sieve-tray bubble column), (d) cột bong bóng có khay sàng lọc với bơm ở bên ngoài, (e) cột nhồi (packed-bed) với bơm ở bên ngoài. Hệ lên men cột bong bóng • Hệ lên men đơn giản nhất là hệ lên men cột bong bóng (còn gọi là hệ lên men tháp-tower fermenter), thường bao gồm một bình trụ dài, có bộ phận phun khí ở dưới đáy • Tuy nhiên, hệ lên men cột bong bóng thường bị hạn chế ở trường hợp lên men hiếu khí và việc tăng các bong bóng không thể cung cấp một sự pha trộn đầy đủ cho sự sinh trưởng tối ưu 13
14. 5/17/2013 Hệ lên men chóp và có khay sàng lọc • Hệ lên men cột hình chóp ngược có thể duy trì lưu tốc không khí cao trên một đơn vị diện tích ở phần thấp hơn của hệ lên men mà ở đó có nồng độ tế bào cao. • Một vài khay sàng lọc có thể được cài đặt trong cột để tăng hiệu quả tiếp xúc khí-chất lỏng và phá vỡ sự kết khối của bong bóng khí (hệ lên men có khay sàng lọc) Hệ lên men cột nhồi • Để tăng cường sự pha trộn mà không có các phần chuyển động bên trong • Dịch lên men (môi trường) có thể được bơm ra ngoài và quay vòng (tuần hoàn) bằng cách dùng một bơm chất lỏng ở bên ngoài Hệ thống nuôi cấy dạng vòng Các hệ lên men vòng: (a) Lực đẩy không khí, (b) Lực đẩy không khí có bơm bên ngoài, (c) Áp lực chu kỳ ICI. 14
15. 5/17/2013 Hệ thống nuôi cấy dạng vòng • Hệ lên men vòng là hệ lên men thùng (tank fermenter) hoặc cột (column fermenter) có vòng lưu thông chất lỏng, • Nó có thể là một ống thông gió ở giữa hoặc là một cái vòng ở bên ngoài. • Tùy thuộc vào sự lưu thông chất lỏng được tạo ra như thế nào, được phân loại thành ba kiểu: lực đẩy không khí (air-lift), vòng khuấy (stirred loop) và vòi phun (jet loop) Hệ lên men áp lực chu kỳ ICI • Thuộc Imperial Chemical Industries Ltd., England • Là một hệ lên men dùng lực đẩy không khí với một vòng bên ngoài (outer loop) được phát triển cho lên men hiếu khí đòi hỏi có sự chuyển nhiệt. • Môi trường và không khí được đưa vào trong các phần cao hơn và thấp hơn Vai trò của việc bơm không khí • Cung cấp oxygen cần thiết cho sự sinh trưởng của tế bào • Tạo ra sự lưu thông tự nhiên của chất lỏng trong hệ lên men thông qua một cái vòng. Bộ phận trao đổi nhiệt để làm lạnh môi trường lỏng được cài đặt vào trong cái vòng đó. • Hệ lên men này đã được chứng minh là tạo ra một tốc độ hấp thụ oxygen cao trên một đơn vị thể tích 15
16. 5/17/2013 Ƣu & nhƣợc điểm của hệ thống nuôi cấy cơ bản Fed-batch culture Fed-batch culture  Hệ thống nuôi cấy mẻ bổ sung cơ chất là quá trình công nghệ hóa hệ thống nuôi cấy mẻ bằng việc bổ sung cơ chất dinh dưỡng để kiểm soát sinh trưởng VSV  Sử dụng trong bể phản ứng sinh học nhằm thu nhận lượng tế bào với mật độ cao  Hầu hết dung dịch bổ sung (feed solution) là đậm đặc nhằm hạn chế việc pha loãng nhiều lần trong bể phản ứng sinh học  Kiểm soát việc thêm các cơ chất trực tiếp ảnh hưởng đến tỷ lệ sinh trưởng của VSV và hạn chế việc trao đổi cơ chất tràn lan.  VD: Bổ sung acetate cho nuôi cấy Escherichia coli, lactic acid cho Lactobacillus, ethanol cho Saccharomyces cerevisiae), hạn chế oxygen trong nuôi cấy kỵ khí. 16
17. 5/17/2013 Hệ thống nuôi cấy dạng túi (Bag system) Hệ thống nuôi cấy chai xoay (Roller bottle system) Các dạng bể phản ứng sinh học • Cánh khuấy đơn giản (Simple Stirred Tank Bioreactor) • Airlift Bioreactor (Vận chuyển khí) • Membrane Stirred Tank Bioreactor (cánh khuấy màng lọc) • Spin Filter Stirred Tank Bioreactor (cánh khuấy cột lọc) • Vibromixer (máy trộn bằng gây chấn động) • Fluidized Bed Bioreactor (Thảm lỏng) 17
18. 5/17/2013 Các dạng bể phản ứng sinh học • Hollow fiber bioreactor • Multiple membrane plate bioreactor KẾT THÚC CHƢƠNG III Tài liệu tham khảo • Asenjo JA and Merchuk JC. 1995. Bioreactor System Design. Marcel Dekker, Inc. New York, USA. • Atkinson B and Mavituna F. 1991. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. 2nd ed. Stockton Press, New York, USA. • Flickinger MC and Drew SW. 1999. Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation. John Wiley & Sons, New York, USA. • Lee JM. 2001. Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA. • Shuler ML and Kargi F. 2002. Bioprocess Engineering-Basic Concepts. 2nd ed. Prentice Hall, Inc. NJ, USA. • Vogel HC and Todaro CL. 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook (Principles, Process Design, and Equipment). 2nd ed. Noyes Publications. New Jersey, USA. 18
19. 5/17/2013 CHÂN THÀNH CẢM ƠN & CHÚC CÁC BẠN MAY MẮN 19