Bài giảng Miễn dịch học - Chương 6; Các kĩ thuật miễn dịch thường dùng - Nguyễn Thành Luân

Nội dung text: Bài giảng Miễn dịch học - Chương 6; Các kĩ thuật miễn dịch thường dùng - Nguyễn Thành Luân

1. 13/12/2012 KHOA CNSH & KTMT Bài giảng Miễn dịch học CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƢỜNG DÙNG GV: Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn 1 Vai trị của miễn dịch trong sinh học • Vơ cùng quan trọng trong CNSH y dược & các ứng dụng sinh học khác • Các bệnh ở người và động vật chủ yếu xuất phát từ sự tạp nhiễm hoặc rối loạn của hệ thống miễn dịch • KN (bệnh) lạ xuất hiện ngày càng nhiều & phức tạp dưới các hình thức khác nhau Cải thiện các cách chuẩn đốn bệnh 1 cách nhanh chĩng là yêu cầu đối với ngành miễn dịch học 2 1
2. 13/12/2012 Nhu cầu đáp ứng sản xuất miễn dịch trong sinh học • Sản xuất vaccine phịng ngừa các bệnh ở người và động vật như: influenza, MMR (measles, mumps, rubella), HIV/AIDS, sốt xuất huyết, di ứng & hen xuyễn, tiểu đường loại 1, thấp khớp • Tăng hiệu quả trong cấy ghép mơ TB/cơ quan • Cải thiện sức khỏe động vật hoang dã & vật nuơi (thú y) • Hỗ trợ ngành nơng nghiệp/cơng nghiệp chăn nuơi3 Các kỹ thuật miễn dịch cơ bản • Định lượng immunoglobulin và các protein khác – Miễn dịch ngưng kết – Miễn dịch kết tủa – Miễn dịch khuếch tán đơn & kép • Miễn dịch liên kết enzyme – Miễn dịch vi hạt – Miễn dịch huỳnh quang – Miễn dịch hĩa/điện phát quang 4 2
3. 13/12/2012 Kỹ thuật định lƣợng immunoglobulin và các protein đặc hiệu khác Kỹ thuật cạnh tranh: KN khơng đánh dấu cạnh tranh với KN cĩ đánh dấu, kết hợp với KT Yêu cầu của phản ứng này là KT phải cĩ tính đặc hiệu cao, KN dùng xác lập đồ thị tương quan chuẩn phải rất tinh khiết, kháng nguyên khơng mất hoạt tính sinh học sau khi đánh dấu. 5 Kỹ thuật định lƣợng immunoglobulin và các protein đặc hiệu khác Kỹ thuật khơng cạnh tranh: được sử dụng rộng rãi trong định lượng KN hoặc KT bằng phương pháp miễn dịch 6 3
4. 13/12/2012 Miễn dịch ngƣng kết (Agglutination) Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT, dùng hạt latex hay HC làm nền phản ứng. Bản chất của phương pháp này là định tính và định lượng bằng cách pha lỗng tuần tự. 7 Cơ chế miễn dịch ngƣng kết 8 4
5. 13/12/2012 9 Agglutination Sperm Cách hoạt động: 10 howitworks.htm 5
6. 13/12/2012 Miễn dịch ngƣng kết (Agglutination) Ưu điểm của phương pháp - Đơn giản - Chỉ cần trang bị máy quang phổ kế đo được bước sĩng 340 nm và ủ nhiệt ở 37oC. Khuyết điểm - Hạn chế trong 1 số thử nghiệm - Độ nhạy của cơ chất phát hiện khá thấp. 11 Miễn dịch kết tủa (Immuno-precipitation) Dựa trên nguyên tắc kết hợp KN và KT tạo kết tủa trong mơi trường thích hợp (như polyethylene glycol) Nếu lượng KT quá nhiều sẽ tạo thành độ đục và đo ở bước sĩng UV (340nm). 12 6
7. 13/12/2012 Miễn dịch kết tủa (Immunoprecipitation) 13 Miễn dịch khuyếch tán đơn (Single radial immunodiffusion, RID) 14 7
8. 13/12/2012 15 Kỹ thuật Mancini • Kháng huyết thanh này được hịa tan vào thạch đun lỏng • Hỗn hợp thạch-kháng huyết thanh được đổ rải đều • Đục các lỗ trịn trên thạch và cho huyết thanh cần đo hoặc huyết thanh chứng vào • Kháng nguyên sẽ khuyếch tán theo hướng ly tâm từ các lỗ ra vùng thạch cĩ chứa kháng huyết thanh • Vịng tủa mất 48 giờ mới ổn định=>tương đối nhạy (->5 mg/lít) và đáng tin cậy 16 8
9. 13/12/2012 Đường chuẩn dùng trong kỹ thuật Mancini 17 Miễn dịch khuyếch tán kép trên thạch (Double diffusion in two dimensions) Kỹ thuật Ouchterlony Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phân tử cĩ trọng lượng nhỏ hơn 200 kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân tử cĩ trọng lượng lớn di chuyển chậm và khĩ khăn hơn. 18 9
10. 13/12/2012 Immuno-diffusion 19 Miễn dịch khuyếch tán kép trên thạch 20 10
11. 13/12/2012 Căn cứ vào đường kết tủa cĩ 3 trường hợp xảy ra + Các giếng chứa kháng nguyên đều đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau => hiện tượng hai kháng nguyên đồng nhất + Hai giếng chứa kháng nguyên chỉ cĩ một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện hai đường kết tủa cắt nhau => hai kháng nguyên khơng đồng nhất nhau + Hai giếng chứa kháng nguyên cĩ liên quan một phần với kháng thể (cùng cĩ chung một epitop A), sẽ tạo ra hai đường kết tủa gặp nhau, nhưng là một đường dài và một đường ngắn hơn 21 22 11
12. 13/12/2012 23 Miễn dịch Enzyme (ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay) Nguyên tắc kết hợp KN và KT và phát hiện (định lượng) bằng chất đánh dấu là một enzyme (alkaline phosphatase hoặc peroxidase) ELISA thuộc hệ thống kỹ thuật MD enzyme pha rắn (giá đỡ KN hay KT). Pha rắn là điều kiện cần thiết cho thành cơng của phản ứng, trên đĩ phản ứng MD được xảy ra. Tùy theo yêu cầu kỹ thuật pha rắn cĩ thể là: - Bề mặt polystyrol, polyvinylchlorid, các chất dẽo các thành phần phản ứng được hấp phụ vật lý. - Cellulose, agarose các thành phần phản ứng được gắn bởi các liên kết hĩa học. 24 12
13. 13/12/2012 Đo mật độ quang Cơ chất Máy rửa Máy ủ Kháng Cộng hợp nguyên Kháng IgM Máy đo quang Phản ứng gồm các giai đoạn cơ bản Giai đoạn 1: Kết hợp KN và KT Giai đoạn 2: Kết hợp chất đánh dấu (conjugate enzyme) vào phức hợp KN và KT Giai đoạn 3: Biểu hiện màu và đọc kết quả 26 13
14. 13/12/2012 Miễn dịch vi hạt (MEIA) (micro-particle enzyme immuno assay) - Cải tiến từ kỹ thuật ELISA: pha cứng (solid phase) của phản ứng (KN hay KT) được gắn trên các vi hạt treo lơ lững trong dung dịch. - Các ưu điểm: + Tăng diện tích tiếp xúc KN và KT, làm tăng độ nhạy, giảm thời gian ủ, giảm thời gian làm phản ứng + Giúp tự động hĩa kỹ thuật rửa, giúp rửa sạch hơn 27 Miễn dịch huỳnh quang (FIA) (fluoro immuno assay) Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: - Thay thế chất đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang. - Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một quang kế huỳnh quang (fluorometer) Khuyết điểm cơ bản nhất là vấn đề nhiễu, chất phát huỳnh quang cĩ thể hiện diện trong tự nhiên. Do đĩ tín hiệu huỳnh quang phát ra phải cao hơn hẳn so với nhiễu Độ nhạy của thử 28 nghiệm này khơng cao. 14
15. 13/12/2012 Miễn dịch huỳnh quang (FIA) (fluoro immunoassay) KT gắn FITC Kháng thể (KT) Tiêu bản tế bào nhiễm bệnh Miễn dịch phĩng xạ (RIA) (radial immuno assay) Kỹ thuật thực hiện bao gồm các giai đoạn cơ bản như kỹ thuật ELISA, ngoại trừ 2 điểm sau: + Chất đánh dấu là một đồng vị phĩng xạ của một nguyên tố như I125 hay Co63 + Phát hiện (định lượng) chất đo bằng một máy đếm phĩng xạ (Geiger Meter) Phương pháp này cĩ độ nhạy tốt, nhưng tốc độ phản ứng chậm và cần nhiều thời gian để đếm bức xạ phát ra 30 15
16. 13/12/2012 Tạo các Ag phĩng xạ bằng miễn dịch cạnh tranh 32 16
17. 13/12/2012 33 Miễn dịch hĩa phát quang trực tiếp (DCLIA) (Direct-chemiluminescense immuno assay)  Chất đánh dấu là phân tử khả năng phát quang khi thay đổi pH mơi trường (Acridinium Ester ).  Phức hợp KN-KT sau khi rửa sẽ thêm vào một chất acid, sau đĩ khi cho vào chất kiềm, trong vịng 2 giây phân tử Acridinium Ester sẽ phát quang.  Để định lượng ánh sáng phát ra, cần dùng buồng nhân quang (luminometer) trong buồng tối, lượng ánh sáng phát ra tỉ lệ với nồng độ cơ chất cần phân tích cĩ trong mẫu thử. 34 17
18. 13/12/2012 PP gắn trực tiếp PP gắn cạnh tranh Kháng thể trên pha rắn KN cần đo và chất đánh gắn vào KN trong HT dấu mang acridinium bệnh nhân, sau đó được gắn cạnh tranh vào KT gắùn vào chất liên kết trên pha rắn kháng thể mang 35 acridinium Miễn dịch điện hĩa phát quang (ECLIA) (Electro-chemiluminescense immuno assay) Dựa trên sự sử dụng phức hợp 2+ Ru(bry)3 (Ruthemium (II) và tris (bipyridyl) và TPA (Tripropylamine). Hoạt động cĩ sự khởi động điện. Phản ứng xảy ra dưới tác dụng của điện áp. Khi đặt một điện thế lên điện cực buồng đo, phức hợp ruthenium được kích hoạt và tín hiệu phát quang được hình thành 36 18
19. 13/12/2012 37 Máy điện hĩa phát quang 38 19
20. 13/12/2012 TPA e- + H * TPA TPA e- Điện cực 3+ 2+ [Ru(bpy)3 ] [Ru(bpy)3 ] e- 2+ [Ru(bpy)3 ] Photon (620nm) NỘI DUNG NẮM BẮT KIẾN THỨC PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH CÁC XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG Miễn dịch ngưng kết độ đục Apo A , Apo B , C , C , CRP, Ferritin Các hệ thống máy sinh hóa tự động và 1 3 4 IgA, IgG, IgM, Microalbumin bán tự động Miễn dịch men (ELISA, MEIA) Các hệ thống ELISA thủ công và bán Các hormon: TSH, LH, FSH, tự động Prolactin, FT3, FT4, TBG, Abbott (AxSYM) Thyroglobulin, Insulin, Testosteron, BioMerrieux (Vidas, MiniVidas) Progesteron Miễn dịch huỳnh quang Các chỉ điểm ung thư: CEA, PAS, Abbott (iMX, AxSYM) AFP, NSE Hóa phát quang trực tiếp Các XN viêm gan siêu vi: Anti HAV, Abbott (Architect i2000 ) 5HBV, Anti HCV Bayer (ACS:180SE, ADVIA centaur) Các chất khác: Troponi I, TroponinT, Điện hóa phát quang 40 Ferritin Roche (Elecsis 1010, Elecsis 2010) 20
21. 13/12/2012 KẾT THÚC CHƢƠNG 6 41 21