Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tính ổn định của DNA (DNA replication)

Nội dung text: Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tính ổn định của DNA (DNA replication)

1. Chương IV: Tính ổn định của DNA (DNA replication) Trịnh Thị Thu Thủy BM: SHPT & CNVS Khoa CNSH
2. TÁI BẢN GEN (DNA REPLICATION) • Tái bản đảm bảo tính đặc trưng ổn định của mỗi loài và truyền đạt thông tin di truyền qua các thế hệ.
3. TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA DNA Cấu trúc: - 2 mạch xoắn kép bổ xung - Cấu tạo hóa học các nucleotide Hoạt động: - Cơ chế tái bản: sao chép thông tin di truyền từ 1 thành 2 bản - Cơ thế kiểm tra, sửa chữa sai sót
4. I. NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA TÁI BẢN • Tái bản là việc sao chép thông tin từ sợi DNA ban đầu. Kết quả là tạo ra 2 sợi DNA giống hệt nhau. • Tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semi-conservative): Một sợi cũ làm khuôn, tổng hợp thêm 1 sợi mới. – Do Watson & Crick dự đoán – Được chứng minh bởi Meselson và Stahl (1958)
5. 1.THÍ NGHIỆM MESELSON-STAHL • Đối tượng: E.coli • Phương pháp: Đánh dấu đồng vị phóng xạ N15 kết hợp li tâm siêu tốc (ultra- centrifuge) • Thực hiện 1. Nuôi E.coli trên môi trường có N15 (nặng) 2. Chuyển sang môi trường có N14 (Nhẹ) 3. Tiến hành thu tế bào sau 1, 2, 3 thế hệ và li tâm để xác định tỉ trọng.
6. • Trước khi li tâm trộn dịch tế bào với CsCl • Tỷ trọng xác định theo 3 mức – Nặng: Gồm N15 – Trung bình: gồm N14 và N15 – Nhẹ: gồm N14
7. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM MESELSON-STAHL
8. Sự tái bản theo nguyên tắc bản bảo thủ Thí nghiệm của Matthew Meselson và Franklin Stahl (1958) Nguyên tắc bán bảo thủ: giữ lại một mạch đơn cũ và một mạch đơn mới được tổng hợp
9. Kết quả • Ban đầu: 100% sợ nặng • Sau 1 thế hệ: 100% sợi trung bình • Sau 2 thế hệ: 50% sợi trung bình, 50% sợi nhẹ • Sau 3 thế hệ? • Sau 4 thế hệ??
10. 2.CÁC NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA TÁI BẢN • Tái bản theo kiểu bán bảo toàn và gián đoạn • Sự tái bản bắt đầu tại một hoặc nhiều vị trí đặc biệt trên phân tử DNA và diễn ra theo 2 hướng ngược nhau. Điểm bắt đầu gọi là điểm khởi đầu tái bản (ori) • Mỗi chạc tái bản gọi là một đơn vị tái bản
11. • Tại mỗi chạc tái bản đầu tiên diễn ra quá trình tổng hợp mồi (do các DNA polymerase không có khả năng tự kéo dài) • Do sự tổng hợp DNA luôn diễn ra theo chiều 5’-3’ nên sự tổng hợp trên 2 sợi khuôn là không giống nhau, một sợi nhanh và một sợi chậm.
12. ĐIỂM KHỞI ĐẦU TÁI BẢN
13. II. Tái bản DNA ở prokaryote Mô hình chung - Xảy ra chỉ ở 1 điểm trên phân tử DNA vòng của prokaryote - vùng DNA được sao chép từ 1 điểm khởi đầu được gọi là đơn vị tái bản-replicon
14. CÁC ENZYME THAM GIA TÁI BẢN • Protein nhận biết và bám vào điểm khởi đầu tái bản (ori) để hình thành phức hợp mở (ở E.coli là dnaA) • DNA gyrase: mở cuộn DNA siêu xoắn phía trước mỗi chạc tái bản • Helicase: tháo xoắn các sợi DNA mạch kép, hình thành các vùng sợi đơn (ở E.coli là dnaB) • Primase: Tổng hợp các đoạn mồi RNA (ở E.coli là protein dnaG
15. CÁC ENZYME THAM GIA TÁI BẢN (ếp) • Protein SSB (single strand binding protein): bám vào vùng DNA sợi đơn do Helicase tách ra, giữ tạm thời không cho DNA xoắn lại. • DNA polymerase III: là enzyme chính tham gia quá trình tổng hợp DNA, có hoạt tính polymerase 5’-3’ và hoạt tính exonuclease 3’-5’
16. CÁC ENZYME THAM GIA TÁI BẢN (ếp) • DNA polymerase I: vừa cắt bỏ dần đoạn mồi RNA nhờ hoạt tính exonuclease 5’-3’, vừa kéo dài đoạn Okazaki để lấp chỗ trống (ở E.coli là DNA polymerase) • DNA ligase: Nối các đoạn Okazaki với nhau tạo thành đoạn liên tục
17. Tái bản DNA ở prokaryote Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép 1. Topoisomerase: tháo xoắn dạng DNA siêu xoắn thành dạng thẳng
18. Topoisomerase Topoisomerase I: gắn vào DNA và cắt một trong hai sợi đơn. Sau khi tạo được DNA thẳng thì enzyme này nối chỗ đứt lại Topoisomerase II: Cắt cả hai mạch của phân tử DNA (gyrase của E.coli) Tạo chạc tái bản
19. Tái bản DNA ở prokaryote Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép v Helicase: phá vỡ liên kết hydro giữa các bazơ trên 2 sợi đơn bổ sung - Một số gắn trên mạch theo hướng 3’-5’ : các protein của gen Rep - Một số khác gắn trên mạch theo hướng 5’ -3’ : helicase II và III
20. Tái bản DNA ở prokaryote Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép v DNA polymerase: + DNA pol I: tổng hợp lấp chỗ trống khi đoạn mồi tách ra DNA polymerase I chỉ chứa một chuỗi polypeptide + DNA pol II: có chức năng đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease, kéo dài chuỗi + DNA polymerase III : là một holoenzyme phức chứa 7 polypeptide khác nhau (α, β, 2γ, δ, ε, µ, 2θ) tổng hợp mạch bổ sung từ đầu 3’OH tự do của mỗi mồi RNA
21. Tái bản DNA ở prokaryote Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép v SSB: protein gắn sợi đơn, làm 2 mạch đơn không kết hợp lại với nhau v ligase: nối tất cả các chỗ gián đoạn trên mạch mới.
22. Tái bản DNA ở prokaryote đơn vị sao chép ở SV tiền nhân (replicon) - Cắt tại một điểm của 1 trong 2 mạch đơn DNA - Tại điểm bắt đầu tái bản: thường nằm ở những vùng đứt tại một điểm của 1 trong 2 mạch đơn DN đứt tại một điểm của 1 DNA có chứa nhitrongều 2trình mạch tđơự nAT DNA (100 A - 200bp)
23. CƠ CHẾ TÁI BẢN Ở E.coli • Là đại diện của tế bào Prokaryote • Quá trình tái bản là cơ chế phức tạp có sự tham gia của nhiều yếu tố. • Gồm 3 giai đoạn – Giai đoạn khởi đầu – Giai đoạn kéo dài – Giai đoạn kết thúc
24. GIAI ĐOẠN KHỞI ĐẦU (iniaon) • Bắt đầu từ điểm khởi đầu tái bản Ori – Các protein nhận biết điểm Ori được tổng hợp, bám vào sợi sợi DNA tạo cấu trúc nucleoprotein – Cấu trúc này mở xoắn vùng DNA giàu AT để hình thành phức hợp mở – Hai phân tử Helicase chui vào mở xoắn tạo 2 chạc tái bản (replication fork)
25. CHẠC BA TÁI BẢN Ở NST VÒNG • 1. Nhiễm sắc thể dạng vòng ở vi khuẩn • 2. Khởi đầu tái bản với 2 chạc tái bản • 3,4. Hình thành cấu trúc dạng theta.
26. CHẠC BA TÁI BẢN
27. KHỞI ĐẦU (ếp) – Khi 2 sợi đơn tách ra, các protein SSB bám vào để giữ sợi DNA không bị xoắn trở lại – Quá trình tổng hợp sợi mới bắt đầu bằng việc tổng hợp các đoạn mồi RNA do Primase • Mồi thường dài 10-12nu
28. GIAI ĐOẠN KÉO DÀI (elongaon) • Sự kéo dài chuỗi trên cả 2 mạch là khác nhau. (nhắc lại: DNA luôn được tổng hợp theo chiều 5’-3’) • Enzyme then chốt cho quá trình kéo dài là DNA polymerase III • Tốc độ tái bản ở E.coli khoảng 1000nu/ giây
29. KÉO DÀI TRÊN SỢI KHUÔN 3’-5’ • Primase tổng hợp một đoạn mồi RNA có đầu 3’-OH • DNA polymerase III kéo dài sợi DNA mới theo chiều 5’-3’ một cách liên tục • Sợi mới được tổng hợp gọi là sợi liên tục hay leading strand
30. TỔNG HỢP 2 SỢI MỚI • Sợi khuôn 3’-5’: tổng hợp liên tục • Sợi khuôn 5’-3’: tổng hợp gián đoạn • Chiều dịch chuyển chạc 3 tái bản cùng chiều với DNA polymerase III trên sợi nào?
31. KÉO DÀI TRÊN SỢI KHUÔN 5’-3’ • Quá trình tổng hợp diễn ra chậm, cần tổng hợp nhiều đoạn mồi. • Các đoạn mới được tổng hợp theo chiều 5’-3’ gọi là các đoạn Okazaki • Chiều dài mỗi đoạn Okazaki 1000-2000 nu • Sợi mới được tổng hợp gọi là sợi chậm hay lagging strand • Cần sự tham gia của nhiều enzyme
32. Các enzyme tham gia tổng hợp trên sợi khuôn 5’-3’ • Primase tổng hợp mồi RNA • DNA polymerase III kéo dài đoạn Okazaki • DNA polymerase I cắt bỏ dần đoạn mồi RNA và lấp dần khoảng trống vừa cắt bằng DNA • Ligase nối các đoạn Okazaki lại với nhau
33. 3 giai đoạn hoàn thiện nối các đoạn Okazaki - Phân hủy đoạn mồi RNA (enzyme gì? - Lấp đầy khoảng trống bằng cách kéo dài các đoạn Okazaki (enzyme gì?) - Nối các đoạn Okazaki lại với nhau (enzyme gì?)
34. Quá trình tái bản 1. Topoisomerase: Tháo xoắn tạo Topoisomerase DNA thẳng Ø Vị trí khởi đầu tái bản: nằm ở những vùng chứa nhiều trình tự AT Helicase SSB protein (100 – 200bp) 2. Helicase: Phá vỡ liên kết hydro trên hai mạch đơn 3. SSB protein (single strand binding protein) Bám vào các sợi đơn đang được kéo dài hai mạch đơn không kết hợp lại với nhau
35. Quá trình tái bản Topoisomerase 4. RNA primase tổng hợp mồi cho việc tái bản Đoạn RNA mồi: 8 – 12 nu Helicase SSB protein 5. Hệ DNA polymerase tham RNA gia kéo dài chuỗi và đọc sửa primase trên hai sợi đơn DNA polymerase DNA ligase 6. Ligase: Nối tất cả các chỗ gián đoạn trên mạch mới
36. Tái bản DNA ở prokaryote Hướng tổng hợp trên hai sợi đơn Topoisomerase 1. Trên mạch khuôn hướng 3’ – 5’: sinh tổng hợp mạch đơn mới diễn ra liên tục gọi là mạch tiến Helicase SSB protein ( leading) RNA 2. Trên mạch khuôn 5 – 3’ : primase Sinh tổng hợp diễn ra không DNA liên tục mà dưới dạng ngắn gọi polymerase là đoạn Okazaki (mạch chậm – DNA ligase lagging) Kích thước đoạn Okazaki: 1000 – 2000bp
37. VẤN ĐỀ KẾT THÚC TÁI BẢN • Do khác nhau về đặc điểm cấu tạo nên vấn đề kết thúc ở Prokaryote và Eukaryote là khác nhau.
38. Kết thúc ở Prokaryote • Khi chạc ba tái bản gặp vị trí kết thúc đặc thù gọi là các điểm kết thúc tái bản (replication termination) • Ở vùng kết thúc tái bản có các protein kết thúc tái bản (replication termination protein – RTP). • Phức hợp DNA- Protein này ngăn cản sự dịch chuyển của chạc ba tái bản • Ở E.coli RTP có KLPT 36kDa • Ở Bacillus subtilis gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần 14,5kDa
39. Tái bản DNA ở Eukaryote - Diễn ra tại kỳ trung gian (S phase) giữa 2 lần phân bào. Tế bào nhân đôi chỉ sau khi DNA tái bản - Sự tái bản xảy ra tại nhiều điểm trên nhiễm sắc thể. VD ở bộ NST người có 20.000-30.000 đơn vị tái bản, chiều dài một replicon từ 100 đến 200 kb Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể kép Bidreconal DNA synthesis Replicaon forks will merge
40. Tái bản DNA ở Eukaryote Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép 1. Polymerase α/ primase: tổng hợp mồi RNA cho mạch chậm Không có khả năng đọc sửa (exonuclease) 2. Polymerase β: tương tự như polymerase I ở sinh vật tiền nhân Tổng hợp đi liền với sửa chữa và hoàn chỉnh sợi đơn mới 3. Polymerase γ: được tìm thấy ở ty thể nhưng chưa rõ chức năng 4. Polymerase δ: tương tự như DNA pol III ở sinh vật tiền nhân Tổng hợp sợi đơn mới 5. Polymerase ε: mới được phát hiên , chưa rõ chức năng
41. Tái bản DNA ở Eukaryote Các nhân tố tham gia vào quá trình sao chép 6. Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1) nhân tố kết gắn nhiễm sắc + protein β tổ chức lắp ghép trung gian PCNA (Proliferating cell nuclear antigen ) Chức năng: tháo bỏ và lắp ghép lại các protein nằm trong nucleosome 7. Các nhân tố sao chép A và C (Replication Factor) RF-A, RF-C Chức năng: cần cho hoạt động của các DNA polymerase α và β
42. PCNA: gồm 3 protein Newly made histone proteins
43. Tái bản DNA ở Eukaryote 1. Dưới tác dụng của Topoisomerase và nhân tố tái bản RF-A, phức hợp nhận biết vùng khởi đầu tái bản (origin recognition complex – ORC) bọc lấy điểm khởi đầu (giàu AT) DNA được tháo xoắn 2. Trên mạch chậm:Primase tương tác với RF-A tổng hợp các mồi RNA (10nu) kéo dài thêm 20 nu nhờ nhân tố RF-C kết hợp với Pol α - Pol δ gắn vào chuỗi và tổng hợp đoạn Okazaki 3. Pol α chuyển đến mạch đối diện và tổng hợp liên tục mạch tiến
44. Tái bản DNA ở Eukaryote Mô hình tái bản ở Eukaryote
45. 4. Kết thúc tổng hợp tại đầu telomere của nhiễm sác thể Đầu cuối của DNA (telomere) có chứa nhiều đoạn lặp lại giống nhau, trình tự đoạn lặp TTAGGG hay TTGGGG Cấu trúc đầu so le 3’ (overhang): có chiều dài 12-16 nu Sự liên quan giữa đầu telomere của nhiễm sắc thể đến tuổi thọ?
46. Telomerase RNA đóng vai trò quan trọng Cơ chế kéo dài đầu telomere
47. III. CƠ CHẾ SỬA SAI TRONG QUÁ TRÌNH TÁI BẢN • Sửa chữa DNA là thuộc tính của mọi tế bào sống • Sai sót tự nhiên khi tái bản là 10-5 • Sai sót khi kết thúc tái bản là 10-9 • Các nu gắn sai trong quá trình tái bản được DNA polymerase cắt bỏ thay thế bằng nu thích hợp • Cơ chế sửa sai ở prokaryote đã được sáng tỏ, ở eukaryote vẫn còn được nghiên cứu.
48. HỆ THỐNG SỬA CHỮA SAI SÓT KHI TÁI BẢN 1. Cơ chế phòng ngừa: Trong tế bào có hệ thống ngăn chặn tác hại của các chất chuyển hóa trong tế bào: Ví dụ: v hệ thống điều hòa cân bằng acid – bazo (thông qua kênh vận chuyển) v Hệ thống khử: NADH, NADPHH+
49. 2. Cơ chế đảm bảo sự trung thành trong tái bản v Cơ chế đọc sửa của các DNA pol I và Pol III: Cắt bỏ bazo lắp ghép sai rồi thay thế bằng bazo đúng bổ sung
50. v Cơ chế hoạt quang: exonuclease dưới tác dụng của ánh sáng ở bước sóng 300nm sẽ cắt bỏ Thymine dimer gây bởi tia UV ra khỏi phân tử DNA
51. v Sửa chữa bằng tái tổ hợp: Cơ chế: Trao đổi chéo chính xác giữa đoạn có sai sót với đoạn không sai sót giữa hai phân tử DNA trong quá trình phân bào giảm nhiễm
52. v Cơ chế cắt bỏ và chỉnh sửa đúng Cắt bỏ đoạn DNA tổng hợp sai và tổng hợp đoạn DNA mới thay thế