›
›

Bài giảng Thực hành hệ cao đẳng Vi sinh thực phẩm

pdf 56 trang huongle 5740
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Thực hành hệ cao đẳng Vi sinh thực phẩm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbai_giang_thuc_hanh_he_cao_dang_vi_sinh_thuc_pham.pdf

Nội dung text: Bài giảng Thực hành hệ cao đẳng Vi sinh thực phẩm

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HỆ CAO ĐẲNG Năm học 20102011
  2. NỘI QUI PHÒNG THÍ NGHIỆM Một số vi sinh vật được sử dụng trong các bài thí nghiệm có thể gây bệnh cho người và động vật, vì thế các nội qui được ban hành để ngăn ngừa nguy cơ nhiễm bệnh cho sinh viên và cán bộ phòng thí nghiệm. Bất kỳ cá nhân nào không tuân thủ tốt các nội qui hay gây nguy hại cho người khác đều không được phép vào phòng thí nghiệm. Khi có bất kỳ thắc mắc nào cần phải yêu cầu sự hướng dẫn của giáo viên hoặc cán bộ phòng thí nghiệm. 1. Các qui định chung + Sinh viên vào phòng thí nghiệm phải mặc trang phục bảo hộ (áo khoác trắng) có bảng tên (thẻ sinh viên) + Sinh viên phải tham dự 100% các buổi thí nghiệm + Sinh viên phải đến đúng giờ, nếu đến trễ quá 15 phút, sinh viên không được phép vào phòng thí nghiệm và được xem như vắng mặt không lý do + Nếu vì bất kỳ lý do bất khả kháng nào sinh viên không tham dự được buổi thí nghiệm, sinh viên phải báo trước (hoặc vào buổi thí nghiệm) cho cán bộ các trách nhiệm + Khi làm hư hỏng các trang thiết bị/dụng cụ của phòng thí nghiệm, sinh viên có nghĩa vụ phải hoàn trả lại + Sinh viên phải đọc kỹ bài trước khi vào thí nghiệm và không được mang tài liệu thí nghiệm vào phòng + Khi làm đổ/tràn các dung dịch hoặc làm bể dụng cụ thủy tinh phải báo cáo cho cán bộ phòng thí nghiệm và xin ý kiến giải quyết. + Sinh viên phải nắm vững các thao tác vô trùng. + Giảm thiểu sự hình thành khí dung khi thao tác. + Rửa tay trước và sau khi thí nghiệm. + Không được ăn/uống/nghe nhạc/đọc sáchbáo trong phòng thí nghiệm. + Đọc kỹ các nội qui/qui định có ở cửa phòng thí nghiệm. + Vệ sinh bàn/ghế/kệ và các dụng cụ trước và sau khi thí nghiệm. + Đổ bỏ rác thải đúng qui định. + Không ngậm các đồ dùng (viết, kiếng ) trong miệng hay gắn vào tai. + Đọc và ký tên vào các qui định/nội qui để chắc chắn sinh viên đã đọc và hiểu. + Trả đầy đủ dụng cụ sau khi hoàn thành xong bài thí nghiệm. Dụng cụ phải được
  3. rửa sạch. + Vệ sinh phòng thí nghiệm theo yêu cầu của người phụ trách 2. Các yêu cầu an toàn + Cột tóc, mặc các phục trang bảo hộ (áo khoác trắng, găng tay chống nhiệt ) và dùng dụng cụ/thiết bị đúng lúc, đúng nơi. + Nghiêm cấm dùng miệng hút pipette. 3. Trong các tình huống khẩn cấp + Lưu ý vị trí các trang bị cấp cứu khi cần (dụng cụ y tế, bình cứu hỏa, vòi nước, điện thoại và số điện thoại cấp cứu). + Báo cáo các tình huống khẩn cấp ngay lập tức cho giáo viên hướng dẫn hoặc cán bộ phòng thí nghiệm. + Bình tĩnh khi có tình huống khẩn cấp. PTN Chất lượng Thực phẩm
  4. PHẦN I: ĐẠI CƯƠNG VỀ VI SINH VẬT HỌC Bài 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH 1. Môi trường , pha chế và chuẩn bị môi trường 1.1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Để phân lập, nuôi cấy hay bảo quản giống vi sinh vật, người ta phải sử dụng các môi trường dinh dưỡng đặc (hoặc lỏng). Môi trường dinh dưỡng không chỉ chứa các thành phần cần cho sự phát triển của ví sinh vật mà còn phải đảm bảo các điều kiện lý hóa thích hợp cho sự trao đổi chất của vi sinh vật với môi trường bên ngoài. Vì vậy, để thiết lập môi trường cần phải biết rõ nhu cầu của vi sinh vật về các chất dinh dưỡng và các đặc điểm trao đổi chất của chúng. Cần lưu ý là nồng độ các chất hòa tan trong môi trường phải cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào vi sinh vật thì mới đảm bảo được sự phát triển tối ưu của chúng Môi trường thường đặt tên theo người đã sáng tạo ra chúng (ví dụ môi trường Kzapek, môi trường Hansen) hay theo các thành phần dinh dưỡng đặc trưng của môi trường đó (ví dụ môi trường dịch trích giá đậu, khoai tây) 1.2. Nguyên tắc pha chế môi trường: Nguyên tắc cơ bản nhất để pha chế môi trường là phải đảm bảo các nhu cầu cơ bản của vi sinh vật (nguồn C, N và các khoáng). Ngoài ra còn có một số nguyên tắc sau: a. Tùy theo nhu cầu nghiên cứu hay học tập mà pha chế môi trường phù hợp: - Nếu muốn nuôi cấy vi sinh vật để quan sát hình thái thì phải nuôi cấy trên môi trường đặc - Nếu muốn tìm hiểu sự trao đổi chất của vi sinh vật thi dùng môi trường lỏng - Môi trường chỉ chưa cao thịt, pepton dùng nuôi cấy vi khuẩn hoại sinh b. Tùy vào nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt của vi sinh vật để bổ sung thành phần khác nhau nào đó: - Cần nuôi cấy vi sinh vật phân giải cellulose cần bổ sung cellulose vào môi trường - Cần nuôi cấy vi sinh vật chuyển hóa N, cần bổ sung các hợp chất chứa N vào môi trường - Hay bổ sung các kháng sinh vào môi trường nhằm nuôi cấy các vi sinh vật có khả năng kháng lại kháng sinh
  5. 1.3. Phân loại môi trường i. Dựa vào thành phần - Môi trường tự nhiên: Các loại môi trường là các hợp chất tự nhiên như: khoai tây, cám gạo, bã khoai mì, phế phẩm chế biến thịt, dịch sữa thành phần môi trường thường phức tạp và không ổn định - Môi trường tổng hợp: sử dụng các loại hóa chất hữu cơ hoặc vô cơ tinh khiết để pha chế môi trường với tỷ lệ chính xác - Môi trường bán tổng hợp: sử dụng cả các hóa chất tinh khiết lẫn các thành phần tự nhiên. ii. Dựa vào tính chất vật lý - Môi trường lỏng - Môi trường rắn: thường có từ 1,52% agar hoặc gelatine - Môi trường bán lỏng: có khoảng 0,30,7% agar iii. Dựa vào công dụng: - Môi trường đặc trưng hay chọn lọc: môi trường có chứa một thành phần đặc biệt chỉ phù hợp với 1 hoặc 1 nhóm vi sinh vật nào đó. Ví dụ môi trường dùng để phân lập vi sinh vật chuyển hóa đạm, chuyển hóa lân - Môi trường kiểm định: dùng để xác định một tính chất nào đó của vi sinh vật. Người ta thương bổ sung một hợp chất đặc biệt có sự biến đổi có thể nhìn thấy được trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật như các chất chỉ thị màu. 1.4. Cách pha chế môi trường Pha chế môi trường là một khâu quan trọng do vậy cần phải chính xác. Gồm các bước sau: - Cân các thành phần môi trường - Nếu là môi trường lỏng: pha các thành phần vào nước, chú ý thứ tự pha chế - Nếu là môi trường đặc: hòa tan các thành phần vào nước rồi thêm 1,52% agar và đun đến khi agar tan chảy. - Lọc: thường lọc môi trường qua vải hoặc bông - Chỉnh pH: tùy theo yêu cầu vi sinh vật hoặc yêu cầu nghiên cứu, thường điều chỉnh pH phù hợp. Thường dùng các loại hóa chất như: H 2SO 4, H3PO 4, KOH, NaOH
  6. - Phân phối vào dụng cụ chứa: nếu là bình chứa thì cho vào khoảng 2/3 thể tích bình, nếu là làm môi trường thạch dĩa thì cho vào khoảng 1015ml/dĩa, nếu làm thạch nghiêng thì cho vào 1/41/5 chiều cao ống nghiệm. - Tiệt trùng môi trường: thường dùng phương pháp chủ yếu là nhiệt ẩm với áp suất cao (121 oC, 1atm) nhằm tiêu diệt tất cả các bào tử cũng như các vi sinh vật không mong muốn có sẵn trong môi trường . Thực hiện pha chế môi trường Mỗi nhóm thực hành pha chế hai môi trường dùng để nuôi cấy vi sinh vật như sau: Môi trường 1 (môi trường dịch trích giá đậu): + Giá đậu: 200g + Glucose: 10g + Trypton: 5g + Yeast extract: 1g + Agar: 15g + H 2O: đủ 1000 ml Môi trường 2 (Môi trường dịch trích khoai tây): + Khoai tây: 200g + Saccharose: 50g + Pepton: 5g + Yeast extract: 1g + Agar: 20g + H2O: đủ 1000 ml Cách thực hiện: giá đậu hoặc khoai tây đun với H 2O để sôi trong 20 phút, lọc lấy dịch trong, bổ sung các thành phần còn lại. Sau đó tiếp tục đun đến khi agar tan hoàn toàn. Phân phối vào các bình chứa và đem tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút. 2. Các dụng cụ sử dụng trong vi sinh vật học
  7. 2.1. Dụng cụ dùng cấy chuyền Các loại dụng cụ được sử dụng cấy chuyền đều nhằm mục mục đích chuyển vi sinh vật từ môi trường cũ sang một môi trường mới cho các nhu cầu khác nhau: cấy chuyền, nhân giống, phân lập vi sinh vật.
  8. Tất cả các dụng cụ dùng cấy chuyền đều phải đảm bảo được vô trùng bằng nhiều cách khác nhau, nhằm tránh việc đưa vào môi trường những vi sinh vật không mong muốn. thường sử dụng phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô 140150 oC trong ít nhất 1 giờ. Các dụng cụ kể trên đều chủ yếu dùng chuyển đổi vi sinh vật từ một môi trường lỏng sang môi trường khác. Để chuyển vi sinh vật từ môi trường rắn sang môi trường khác, người ta chủ yếu sử dụng que cấy vòng/ thẳng hoặc que cấy móc. Que cấy thẳng (a) và que cấy vòng (b) Khi sử dụng que cấy, thường que cấy sẽ được tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsel. Khi tiệt trùng phải đảm bảo đầu que cấy hoặc bất cứ thành phần nào của que cấy phải được tiệt trùng hoàn toàn bằng cách đốt nóng đỏ. 2.2. Các phương pháp phân lập và cấy chuyền vi vi sinh vật: Phân lập vi sinh vật là việc phân tách các chủng vi sinh vật trong môi trường tự nhiên và cô lập chúng nhằm chọn lựa giống vi sinh vật thuần khiết cho những mục đích khác nhau. Để phân lập vi sinh vật, người ta thường tiến hành nuôi cấy vi sinh vật trên các môi trường chọn lọc nhằm ưu tiên sự phát triển của một loại vi sinh vật nào đó. Nếu như không có được môi trường đặc trưng thì thường người ta sẽ nuôi vi sinh trên các môi trường rắn và làm cách nào đó tách rời các tế bào vi sinh vật và cho chúng
  9. phát triển riêng rẽ trên môi trường rắn để tạo thành khuẩn lạc (colony) với hình dáng đặc trưng và việc chọn lựa sẽ được tiến hành trên các khuẩn lạc này. Một số hình dạng khuẩn lạc mọc trên môi trường rắn: hàng 1 (nhìn từ trên xuống), hàng 2 (nhìn ngang), hàng 3 (dạng rìa khuẩn lạc) Các phương pháp cấy Cách cấy trong ống thạch nghiêng
  10. Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que cấy vòng Cấy trên đĩa môi trường thạch bằng que trãi
  11. Các thao tác chính khi cấy ví sinh vật Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, dễ chọn lựa
  12. Thực hành: Sử dụng môi trường đã pha chế ở phần trên, tiến hành làm các dạng môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng và tiến hành cấy một số giống vi sinh vật do phòng thí nghiệm cung cấp. Nuôi ủ ở nhiệt độ thích hợp và đánh giá kết quả sau 48 giờ nuôi cấy.
  13. Bài 2:KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG Một kính hiển vi tốt là một dụng cụ rất quan trọng trong phòng thí nghiệm vi sinh. Có nhiều loại kính hiển vi khác nhau, trong đó loại thường dùng nhất là kính hiển vi quang học nền sáng ( brightfield light microscope ). Kính hiển vi này có nhiều thấu kính và có một nguồn ánh sáng trắng. Chúng phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ bé như vi khuẩn và các vi sinh vật khác mà chúng ta không thể nhìn thấy bằng mắt thường. Kính hiển vi loại này sẽ được chúng ta sử dụng trong toàn bộ môn học này. Nếu sử dụng thành thạo kính hiển vi, sinh viên có thể thu nhận được những thông tin chính xác và hữu ích về các tiêu bản hoặc mẫu nuôi cấy vi sinh vật. Việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm với kính hiển vi sẽ giúp cho chúng ta có được những ấn tượng sâu sắc về các hình thái rất nhỏ bé của sự sống, những hình thái chỉ quan sát được khi chúng được phóng đại nhiều lần. 1. Các bộ phận chủ yếu của kính hiển vi quang học nền sáng và chức năng của chúng a. Hãy nhìn vào kính hiển vi trước mặt và so sánh nó với hình vẽ. Kính hiển vi được đặt trên một chân đế ( base ) vững chắc và có một bộ phận tay cầm ( arm ) để chúng ta có thể di chuyển kính hiển vi đến vị trí khác (Lưu ý: khi cầm hoặc mang kính hiển vi đi nơi khác, luôn phải sử dụng cả hai tay; một tay nắm lấy bộ phần tay cầm trong khi tay khác đỡ vào chân đế). Không bao giờ được nhấc kính lên bằng cách nắm vào các thấu kính. b. Hãy nhìn vào bàn chứa tiêu bản, chúng nằm giữa hệ các thấu kính bên trên và một bộ phận cung cấp ánh sáng bên dưới. Bàn chứa tiêu bản có một lỗ tròn ở vị trí trung tâm. Nó cho phép ánh sáng từ bên dưới đi xuyên qua và đến được các thấu kính bên trên. Tiêu bản cần quan sát sẽ được đặt trên bàn chứa tiêu bản, nơi mà có ánh sáng chiếu từ bên dưới tới. Lưu ý đến núm điều chỉnh bên cạnh bàn chứa tiêu bản, chúng dùng để di chuyển tiêu bản qua trái/phải hoặc trước/sau trên bàn chứa tiêu bản . Bàn chứa tiêu bản loại này gọi là bàn chứa tiêu bản cơ khí (mechanical stage ) c. Một đèn chiếu được đặt trong chân đế. Anh sáng sẽ đi xuyên qua tụ quang Abbe (Abbe condenser ). Tụ quang có chứa các thấu kính. Chúng có tác dụng tập trung các tia sáng vào tiêu bản. Tụ quang có cửa sập ( iris diaphragm , shutter ) dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng. Một thanh gạt ( rotating knob ) được gắn kèm theo để điều chỉnh cửa sập. Tụ quang có thể được nâng lên hay hạ xuống nhờ một núm
  14. điều chỉnh ( adjustment knob ). Khi hạ kính tụ quang xuống sẽ làm giảm lượng tia sáng chiếu vào tiêu bản (điều này thường không được thực hiện khi nghiên cứu vi sinh vật). Cách tốt nhất là giữ tụ quang ở vị trí cao nhất và chỉ điều chỉnh lượng sáng bằng cách đóng/mở cửa sập. d. Phía trên bàn chứa tiêu bản, được gắn với tay cầm, là một ống tròn ( tube ) có các thấu kính phóng đại. Bên dưới ống tròn là một cổ xoay ( rotating nosepiece ) được gắn với ba hay bốn vật kính ( objective lenses ). Khi xoay cổ xoay, một trong số các vật kính sẽ được đặt đúng vào vị trí lỗ tròn trên bàn chứa tiêu bản. Bên trên ống tròn là thị kính ( ocular lens, eyepiece ) (kính hiển vi có thể có một thị kính, loại hai thị kính cho phép chúng ta có thể nhìn bằng cả hai mắt). e. Tùy loại kính hiển vi đang sử dụng mà cổ xoay và bàn chứa tiêu bản có thể được nâng lên hay hạ xuống bằng núm sơ cấp ( coarse adjustment knob ) và núm thứ cấp ( fine adjustment knob ). Trong một số loại kính hiển vi, chúng được đặt tại hai vị trí riêng hoặc sẽ được đặt cái này bên trên cái kia. Khi sử dụng phải vặn nút sơ cấp một cách nhẹ nhàng để nâng hoặc hạ bàn chứa tiêu bản. Đầu tiên, điều chỉnh cho bàn chứa tiêu bản được nâng lên tối đa gần sát với vật kính, đồng thời phải đưa mắt nhìn từ phía bên ngoài để tránh việc vật kính đâm thủng tiêu bản, từ đó làm hỏng vật kính. Nút thứ cấp sẽ làm di chuyển bàn chứa tiêu bản một cách rất chậm chạp vì vậy không thể thấy sự di chuyển này khi nhìn bên ngoài. Ta sử dụng nút thứ cấp khi mắt đang nhìn vào thị kính và điều chỉnh nhẹ nhàng để chỉnh rõ nét ảnh đang quan sát. f. Lưu ý chỉ được hạ bàn chứa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát ở thị kính để tránh trường hợp vật kính đâm thủng tiêu bản; chỉ khi người kỹ thuật viên quan sát từ bên ngoài mới cho phép nâng bàn chứa tiêu bản lên g. Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh có thể làm cho nút xoay bị kẹt cứng, khi đó không được cố xoay tiếp mà phải thông báo ngay cho giáo viên hướng dẫn. h. Tổng số lần phóng đại tùy thuộc vào vật kính và thị kính đang dùng. Nhìn vào thị kính, sinh viên sẽ thấy một ký hiệu “ 10X ”, có nghĩa là phóng đại 10 lần. Nhìn vào các vật kính sẽ thấy ký hiệu “ 4X ”, “ 10X ”, “ 40X ” và “ 100X ”, tương ứng với độ phóng đại 4, 10, 40, và 100 lần. Vật kính lowpower còn được gọi là vật kính 10x hay 16mm. Vật kính highdry (highpower ) còn được gọi là vật kính 40x hay 4mm. Vật kính dầu còn gọi là vật kính 90x, 100x hay 1.8mm. Khi độ phóng đại tăng, kích thước của đầu vật kính sẽ nhỏ dần và cho phép ít ánh sáng đi qua. Đó là lý do mà sinh viên cần phải điều chỉnh vị trí của tụ quang và cửa sập chắn sáng
  15. khi dùng các vật kính khác nhau để có thể nhìn tiêu bản được rõ ràng hơn. Tụ quang tập trung ánh sáng lên một vùng nhỏ bên trên bàn chứa tiêu bản, còn cửa sập điều chỉnh lượng sáng đi vào tụ quang. Khi sử dụng dầu soi kính, dầu soi kính sẽ được đặt ở vị trí giữa tiêu bản và vật kính. Do dầu soi kính có tác dụng khúc xạ giống như thủy tinh nên sẽ giảm thiểu lượng tia sáng bị mất đi. Thị kính được đặt trên đầu của một ống kim loại sẽ phóng đại ảnh được truyền từ vật kính. Kết quả là độ phóng đại chung nhận được sẽ là tích số độ phóng đại của vật kính với độ phóng đại của thị kính. Ví dụ, khi sử dụng thị kính 10x và vật kính 43x thì độ phóng đại chung là 10 x 43 = 430 lần. Kính hiển vi quang học nền sáng
  16. i. Độ dài tiêu cự ( focal length ) của một vật kính tỉ lệ với đường kính của vật kính đó. Lưu ý, trước khi chỉnh một vật kính sang vị trí thẳng đứng với lỗ tròn trên bàn chứa tiêu bản, phải đảm bảo vật kính sẽ không đâm thủng tiêu bản. Nêu chưa chắc chắc, tốt nhất nên hạ bàn chứa tiêu bản xuống tận dưới cùng trước khi chuyển sang sử dụng một vật kính khác. j. Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính và phía trên tụ quang khi chúng bị bám bụi. k. Chỉ duy nhất nhân viên phòng thí nghiệm mới được lấy vật kính hay thị kính ra khỏi kính hiển vi (vì một lý do nào đó). l. Chỉ những người đã học cách sử dụng mới được dùng kính hiển vi. Ánh sáng truyền qua tiêu bản, dầu soi và vật kính Cách cầm để di chuyển kính hiển vi 2. Thực hành trên kính hiển vi với tiêu bản a. Sử dụng một số tiêu bản có sẵn hoặc tự làm. b. Đặt tiêu bản lên bàn chứa tiêu bản và kẹp lại chắc chắn. Đặt tiêu bản ở vị trí sao cho tia sáng đi từ tụ quang xuyên qua trung tâm phần được nhuộm màu. c. Đưa vật kính lowpower vào vị trí thẳng đứng và đưa bàn chứa tiêu bàn thật gần vật kính. Lưu ý: quan sát từ phía bên ngoài. d. Đưa mắt vào thị kính để quan sát. Nếu sử dụng loại kính đơn tròng ( monocular scope ), sinh viên phải mở cả hai mắt (sinh viên sẽ làm quen dần với việc chỉ tập
  17. trung vào ảnh đang quan sát trong kính hiển vi thay vì các ảnh khác bên ngoài). Nếu sử dụng loại kính hai tròng ( binocular scope ), sinh viên hiệu chỉnh hai tròng kính qua lại để khi nhìn vào thị kính chỉ thấy một thị trường duy nhất. Phải đảm bảo tụ quang đang ở vị trí cao nhất và chỉnh cửa sập sao cho ánh sáng xuyên qua là vừa đủ để quan sát. Hạ bàn chứa mẫu vật xuống từ từ bằng nút sơ cấp cho đến khi thấy những vật thể có màu xuất hiện trong thị trường. e. Sử dụng nút thứ cấp để chỉnh cho ảnh rõ nét nhất. Di chuyển tiêu bản theo hướng tới/lui và trái/phải. Vật kính lowpower cho một cái nhìn toàn cảnh về tiêu bản và giúp sinh viên lựa chọn một thị trường vừa ý. Để quan sát rõ hơn cần phải chuyển sang một độ phóng đại cao hơn. f. Khi đã lựa chọn được thị trường vừa ý, xoay vật kính highdry vào vị trí thẳng đứng. Nếu độ sắc nét của ảnh chưa đạt, sinh viên chỉnh lại bằng nút thứ cấp. Nếu không thấy ảnh trong thị trường, sinh viên hãy nhìn từ bên ngoài đồng thời quan sát và chỉnh cho vật kính gần sát vào tiêu bản (không được chạm vào tiêu bản). Sau đó nhìn vào thị kính, chỉnh cho bàn chứa tiêu bản hạ xuống từ từ, đầu tiên bằng nút sơ cấp, sau đó bằng nút thứ cấp cho đến khi ảnh rõ nét nhất. Lưu ý: sinh viên cần so sánh về cấu trúc của ảnh quan sát được ở các độ phóng đại khác nhau. g. Di chuyển vật kính highdry sang một tư thế hơi nghiêng một chút rồi nhỏ một giọt dầu soi kính lên trên tiêu bản. Sinh viên quan sát từ bên ngoài và chuyển vật kính dầu sang vị trí thẳng đứng (tránh để chạm vào tiêu bản). Sử dụng nút thứ cấp để chỉnh ảnh cho rõ nét. h. Ghi nhận lại ảnh quan sát được bằng cách vẽ vào trong một hình tròn một số tế bào vi sinh vật mà sinh viên nhìn thấy. i. Sau khi hoàn tất việc quan sát, lấy tiêu bản ra khỏi kính hiển vi (không được để dầu soi kính dính vào vật kính highdry ) 3. Một số vấn đề gặp phải khi sử dụng kính hiển vi Vấn đề gặp phải Cách xử lý Nâng tụ quang lên Không đủ ánh sáng Mở cửa sập khi nhìn vào thị kính Kiểm tra lại tiêu bản: đặt sai vị trí Lau nhẹ nhàng vật kính và thị kính Bụi hay sợi vải được nhìn Gây ra bởi các bọt khí trong dầu soi thấy trong thị trường kính; kiểm tra lại tiêu bản
  18. Phải chắn rằng đang sử dụng vật kính dầu Những hạt nhỏ di chứ không phải là vật kính highdry chuyển trong một thị Đảm bảo rằng dầu soi kính đang trường mờ ngập trong vật kính
  19. Bài 3: TIÊU BẢN GIỌT TREO, GIỌT ÉP – QUAN SÁT SỰ DI ĐỘNG CỦA VI KHUẨN Một số vi khuẩn không di động ( nonmotile ) nhưng trong môi trường lỏng chúng thường di chuyển hỗn loạn, gọi là chuyển động Brown ( Brownian movement ). Đây là kết quả chuyển động của các phân tử nước từ đó kéo các vi khuẩn chuyển động theo. Sự di chuyển thật sự (động lực tự thân, selfpropulsion ) được thấy ở một số vi khuẩn nhờ một số cơ chế khác nhau. Vi khuẩn di chuyển nhờ tiên mao ( flagella motion ). Các xoắn khuẩn có các lông mao xung quanh ( axial fibrils ) sẽ di chuyển theo kiểu xoắn ốc (corkscrewtype motion ) và kiểu uốn khúc ( bendingtype motion ). Một số vi khuẩn khác thì trượt nhẹ nhàng ( gliding motion ). Các kiểu di động hay không di động có thể được quan sát bằng tiêu bản giọt treo (hanging drop slide ). Tiêu bản giọt treo cũng dùng để quan sát hình dạng vi khuẩn ở trạng thái sống cũng như sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn khi chúng kết hợp với nhau (xem hình). Một vòng Vaseline xung quanh gờ của chỗ lõm ( coverslip ) sẽ giúp tiêu bản không bị khô. Tiêu bản giọt treo 1. Sử dụng các vi sinh vật sau trong thí nghiệm a. Saccharomyces cerevisiae b. Lactobacillus acidophilus c. Bacillus subtilis d. Staphylococcus sp e. Một số chủng khác 2. Dùng que tăm, vẽ một vòng tròn nhỏ bằng Vaseline xung quanh chổ lõm của phiến kính. Không nên dùng nhiều Vaseline. 3. Sau khi lắc thật kỹ dung dịch huyền phù vi sinh vật, dùng que cấy vòng đã vô trùng đặt một giọt dung dịch huyền phù này lên giữa phiến kính hình vuông (coverslip ). 4. Đưa phiến kính hình chữ nhật ( depression slide ) úp lên phiến kính hình vuông (coverslip ), sao cho chỗ lõm của phiến kính hướng xuống dưới và giọt huyền phù vi sinh vật nằm lọt vào chỗ lõm. Nhấn xuống nhẹ nhàng để hai phiến kính gắn vào nhau. 5. Lật ngược hai phiến kính lại và đặt lên kính hiển vi để quan sát với vật kính dầu.
  20. Cách làm tiêu bản giọt treo
  21. Bài 4: QUAN SÁT NẤM SỢI Nấm sợi (nấm mốc) thường được nhận diện bằng các đặc điểm hình thái đặc trưng quan sát được dưới kính hiển vi. Tế bào nấm thường phát triển thành hệ sợi gọi là khuẩn ty thể. Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn. Khuẩn ty mọc lên trên bề mặt cơ chất thường là những cấu trúc mang bào tử. Cuống mang bào tử có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh. Bào tử vô tính của nấm sợi thường tập trung trong hai nhóm: bào tử kín và bào tử trần. Hai giống nấm sợi Aspergillus và Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes , không có hình thức sinh sản hữu tính. Hệ sợi có vách ngăn. Bào tử vôi tính là bào tử trần. Mucor và Rhizopus thuộc nhóm nấm tiếp hợp Zygomycetes . Hệ sợi không có vách ngăn và có thể có rễ giả. Bào tử vô tính là bào tử kín. Bào tử hữu tính là bào tử tiếp hợp. Rhizopus có cuống mang bào tử và không phân nhánh. Mucor có cuống mang bào tử phân nhánh. Aspergillus sp. Mucor sp. Rhizopus sp.
  22. Qui trình + Sử dụng các nấm sợi sau trong thí nghiệm: Mucor, Aspergillus, Rhizopus + Quan sát hình thái khuẩn lạc, màu sắc sợi nấm trên hộp petri. + Dùng một miếng băng keo trong, đặt mặt có keo dính lên khuẩn lạc nấm mốc. Sau đó lấy ra và áp sát vào phiến kính sao cho băng dính dính chặt vào phiến kính. + Quan sát dưới kính hiển vi
  23. Bài 5: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN Tiêu bản giọt ép đem lại rất nhiều thông tin nhưng chúng cũng có những nhược điểm nhất định. Vi sinh vật di chuyển trong dịch lỏng bởi chuyển động Brown hay tự chuyển động nên rất khó khăn trong việc quan sát. Chúng ta có thể thấy được hình dạng và hoạt động của vi sinh vật nhưng không thể xác định chính xác hình thái của chúng (đặc biệt là nhóm vi khuẩn). Do vậy, để xác định chính xác hình thái của vi sinh vật người ta thường sử dụng phương pháp nhuộm màu (quan sát vi sinh vật chết) Vi khuẩn có thành tế bào vững chắc để duy trì hình dạng của mình. Vì vậy, chúng ta có thể phân loại vi khuẩn căn cứ theo hình dạng của chúng. Vi khuẩn có ba dạng cơ bản: hình cầu ( spherical , round ), hình que (hình gậy, rod ) và hình xoắn ( spiraled ). Vi khuẩn hình cầu gọi là coccus (số nhiều là cocci ). Vi khuẩn hình que gọi là bacillus (số nhiều là bacilli ) hay chỉ đơn giản gọi là rod . Vi khuẩn có dạng xoắn có tối thiểu hai đến ba đường cong trên tế bào được gọi là spirillum (số nhiều là spirilla ). Các vi khuẩn có tế bào dài và ngoằn ngoèo với các vòng xoắn (lỏng hoặc chặt) được gọi là spirochetes . Cách thức mà các tế bào tạo thành nhóm thì đặc trưng cho từng giống hoặc loài vi khuẩn. Các tế bào đứng thành từng cặp ( diplococci ), đứng thành chuỗi ( streptococci ), đứng thành từng cụm ( staphylococci ), hoặc đứng thành một cụm bốn tế bào ( tetrads ), và đôi khi chúng cũng đứng thành từng tế bào riêng lẻ. Các vi khuẩn hình que ( bacilli ) thường ở dạng một tế bào riêng lẻ, nhưng cũng có khi xuất hiện ở dạng một cặp nối tiếp nhau ( diplobacilli ) hay đứng thành một chuỗi dài (streptobacilli ). Một số loài có khuynh hướng đứng thành một cụm các tế bào hình que song song ( palisade ) hoặc tạo thành hình chữ V, X, Y khi chúng nhân đôi và phân chia. Một số loài tạo thành nhiều hình dáng và kích thước khác nhau (đa hình thể, pleomorphism). Các xoắn khuẩn thường xuất hiện ở dạng một tế bào đứng riêng lẻ và thường không kết thành nhóm. 1. Tạo vết bôi và làm tiêu bản nhuộm đơn Tạo vết bôi vi khuẩn ( bacterial smear ) là làm khô tế bào vi khuẩn trên phiến kính. Các bước thực hiện cơ bản là (1) vi khuẩn được trải lên phiến kính sao cho các tế bào nằm thành một lớp mỏng, (2) tế bào vi khuẩn không bị rửa trôi trong quá trình nhuộm và (3) vi khuẩn không bị biến dạng. Sử dụng phương pháp nhuộm đơn sẽ tạo sự tương phản giữa vi khuẩn và cảnh nền. Phương pháp này được dùng để thu thập thông tin về hình dạng, kích thước và sự sắp
  24. xếp của tế bào. Bước kế tiếp là đặt phiến kính lên giá, phủ lên vết bôi phẩm nhuộm, chờ một vài giây. Các phẩm nhuộm cơ bản thường dùng là crystal violet (thời gian nhuộm 20 – 30 giây), carbolfuchsin (thời gian nhuộm 5 – 10 giây) hoặc methylene blue (thời gian nhuộm 1 phút). Tạo vết bôi i. Dùng bút lông (không xóa) khi chú tên vi khuẩn ở một đầu phiến kính. Dùng băng keo trong dán đè lên dòng chữ vừa ghi ii. Lắc kỹ dung dịch vi khuẩn. Với thao tác vô trùng chuyển 1 hoặc hai vòng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kính. Trải đều trên diện tích khoảng ½ inch. Nếu tạo vết bôi từ môi trường rắn thì cho một giọt nước vào giữa phiến kính và dùng que cấy thẳng cho một lượng nhỏ sinh khối vào giọt nước. Trộn đều sinh khối với giọt nước. Trải đều trên diện tích khoảng ½ inch. iii. Hơ phiến kính trên ngọn lửa để cố định và giết chết vi khuẩn. Nhuộm đơn i. Đặt phiến kính lên bàn (hay lên giá). ii. Nhuộm với phẩm nhuộm (alkaline methylene blue trong 1~1.5 phút, cabolfuchsin trong 5 ~10 giây, hoặc crystal violet trong 20 ~30 giây) iii. Rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước trong vài giây. iv. Thấm khô bằng giấy thấm. Không được chà xát lên vết bôi. v. Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính dầu vi. Có thể sử dụng ba loại phẩm nhuộm khác nhau với cùng một loại vi sinh vật để có sự so sánh.
  25. Tạo vết bôi vi sinh vật Hình dạng cơ bản và sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn.
  26. (a) Cocci. 1.Diplococci (cặp); 2. Treptococci (chuỗi); 3. Staphylococci (chùm nho); 4.Tetrads (nhóm 4 tế bào). (b) Bacilli (hình que). 1. Streptobacilli (chuỗi); 2. Palisades; hình V, X và Y; 3. Bacilli tạo bào tử (bào tử nhỏ, tròn, rỗng, không bị nhuộm màu, ở giữa hay một đầu của tế bào); 4. Một bacillis đa hình thể (chiều dài và rộng khác nhau). (c) Xoắn khuẩn. 1. Spirilla (hình uốn cong hay xoắn ngắn); 2. Spirochetes (dài, cuộn xoắn chặt hay lỏng lẻo) Vi khuẩn được nhuộm bằng Crystal Violet. (a) Bacillus subtilis (x1000). (b) Spirillus volutans (x 1000). (c) Micrococcus luteus (x 1000)
  27. Một số hình dạng thông thường của vi khuẩn
  28. Bài 6: NHUỘM GRAM Vào năm 1884, Christian Gram, một nhà nghiên cứu bệnh học người Đan Mạch, đã khám phá ra một phương pháp nhuộm vi sinh vật bằng phẩm nhuộm pararosaniline. Thông qua việc sử dụng theo trình tự hai loại phẩm nhuộm, có 2 màu khác nhau, ông ta đã nhận thấy vi khuẩn được chia thành 2 nhóm. Nhóm thứ nhất giữ màu phẩm nhuộm đầu tiên: crystal violet (nhóm vi khuẩn gram dương ). Nhóm thứ hai bị mất màu phẩm nhuộm đầu tiên sau khi được rửa bằng một dung dịch tẩy màu rồi được tiếp tục nhuộm bằng phẩm nhuộm thứ hai là safranin hay carbon fuchsin (nhóm vi khuẩn gram âm ). Dung dịch iodine được dùng như là một chất cẩn màu ( mordant ) (có nhiệm vụ gắn phẩm nhuộm lên/vào một chất bằng cách kết hợp với phẩm nhuộm để tạo phức không tan) ở sau lần nhuộm đầu tiên. Cơ chế của kỹ thuật nhuộm này chưa được hiểu một cách tường tận. Tuy nhiên, người ta vẫn cho rằng đó là do có sự khác biệt về thành phần hóa sinh của thành tế bào vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn Gram dương thì có nhiều peptidoglycan (phức chất của protein đường) và các peptidoglycan này được liên kết chặt chẽ với nhau từ đó giúp cho tế bào có thể kháng lại chất tẩy màu. Thành tế bào vi khuẩn Gram âm có thành phần lipid ở nồng độ cao cho nên chúng có thể hòa tan trong chất khử màu (alcohol, acetone, ) và bị rửa trôi cùng với crystal violet. Nhuộm Gram là một trong số các công cụ hữu dụng nhất trong các phòng thí nghiệm vi sinh và được sử dụng rất thường xuyên. Phương pháp nhuộm Gram được cải biên bằng cách thay đổi nồng độ phẩm nhuộm, thời gian nhuộm và thành phần của chất tẩy màu. Phương pháp cải biên của Hucker, được sử dụng trong bài thí nghiệm này, hiện nay đang được sử dụng rộng rãi. Việc lựa chọn chất tẩy màu tùy thuộc vào thời gian mong muốn hoàn thành các bước nhuộm. Sử dụng ethyl alcohol 95%, dùng trong bài thí nghiệm này, cho phép sinh viên tập làm quen với chất tẩy màu bởi vì nó có tác dụng rất chậm. Acetone là chất tẩy màu có tác dụng nhanh nhất trong khi hỗn hợp (50:50) của ethyl alcohol 95% và acetone thì ở mức trung bình. Hỗn hợp acetonealcohol thường được dùng trong các phòng thí nghiệm. Vật liệu và hóa chất Dung dịch Crystal violet + 2 g Crystal violet hòa tan trong 20 ml ethanol 95% + 0.8 g Ammoni oxalate hòa tan trong 80 ml nước cất + Trộn 2 dung dịch trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ sẫm màu, sử dụng trong vài tháng
  29. Dung dịch Iodine Hòa tan 1 g Iodine trong 3 ~ 5 ml nước cất, thêm 2 g KI. khuấy cho tan hoàn toàn, thêm nước cất cho đủ 300 ml . Bảo quản trong lọ sẫm màu Dung dịch tẩy màu + Ethanol 95% hoặc hỗn hợp gồm 70ml ethanol 95% và 30 ml aceton Dung dịch Safranin + Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2.5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỉ lệ 1:5 (v/v) để có dung dịch 0.5% Qui trình i. Sử dụng các vi sinh vật sau để thí nghiệm - Staphylococcus sp. - Bacillus subtilis - Lactobacillus acidophilus - E. coli. - Streptobacillus sp. ii. Chuẩn bị vết bôi và cố định vi sinh vật iii. Dùng dung dịch crystal violet phủ lên vết bôi. Để yên trong 1 phút iv. Để nghiêng phiến kính 45 o, rửa dưới vòi nước cho trôi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối cùng chảy khỏi phiến kính không còn màu) v. Phủ lên vết bôi dung dịch iodine. Để yên 1 phút vi. Để nghiêng phiến kính 45 o, tẩy màu bằng dung dịch alcohol 95% cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu (thông thường khoảng 10 – 20 giây). Đây là bước quan trọng nhất . Nếu bị tẩy màu quá mức, một số vi khuẩn Gram dương sẽ bị mất màu tím và sẽ trở thành Gram âm sau khi nhuộm màu lần thứ 2 vii. Ngay lập tức rửa phiến kính dưới vòi nước viii. Phủ lên vết bôi dung dịch Safranin. Để yên 1 phút ix. Rửa dưới vòi nước x. Thấm nhẹ bằng giấy thấm. Hơ khô phiến kính trước khi quan sát dưới kính hiển vi xi. Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát Lưu ý: - Luôn dùng giống vi khuẩn “trẻ” bởi vì một số giống vi khuẩn Gram dương ”già” sẽ mất khả năng giữ màu của phức chất violetiodine và sẽ trở thành Gram âm khi
  30. quan sát. Vì vậy, chỉ nên sử dụng các tế bào nuôi cấy trong vòng 24 giờ. - Ngoài ra, cũng có một số chủng vi khuẩn là Gram dương yếu. - Các tế bào vi khuẩn Gram dương có thể xuất hiện dưới dạng Gram âm, nhưng các tế bào vi khuẩn Gram âm thì không bao giờ xuất hiện dương dạng Gram dương. - Không làm vết bôi vi khuẩn quá dày. Vết bôi dày đòi hòi thời gian tẩy màu lâu hơn vết bôi mỏng. - Tẩy màu cho đến khi giọt dung dịch cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không. - Vi khuẩn Gram dương có thể xuất hiện dưới dạng Gram âm do khử màu bằng ethanol 95% quá mức, vì vậy cần đảm bảo thời gian rửa bằng ethanol từ 10 – 20 giây. - Một số sai sót khác là: (a) que cấy quá nóng, (b) hơ nóng quá mức khi cố định vi sinh vật trên phiến kính. Hơ quá nóng khi cố định vi khuẩn lên phiến kính có thể làm vỡ tế bào, từ đó màu của tế bào Gram (+) có thể bị rửa trôi làm cho tế bào Gram (+) trở thành Gram (). - Nếu vết bôi vi khuẩn quá dày, thuốc nhuộm thấm vào các tế bào không đồng đều. - Có thể thay Safranin bằng một thuốc nhuộm khác dễ phân biệt với màu tím. - Dung dịch Iod có thể bị phân hủy nếu để lâu - Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram () bắt màu hồng
  31. Sự bắt màu của tế bào vi khuẩn khi nhuộm Gram Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram ()
  32. Bài 7: NHUỘM BÀO TỬ Một số vi khuẩn ( Clostridium botulinum, Bacillus subtilis ) có khả năng tạo bào tử (spore, endospore). Bào tử là một thể nghỉ có dạng hình cầu hay hình bầu dục hình thành bên trong tế bào vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển. Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra một bào tử nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sản như ở nấm sợi. Bào tử tạo thành do môi trường không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển, do thiếu chất dinh dưỡng, do độ ẩm thấp . Khi môi trường trở nên thích hợp thì bào tử lại hồi sinh và tế bào lại có thể tiếp tục phân chia. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Bào tử có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao, hóa chất mà các tế bào sinh dưỡng không thể tồn tại được. Trong thời kỳ nghỉ không thấy bào tử vi khuẩn thể hiện bất kỳ sự trao đổi chất nào, đó là trạng thái sống ẩn (cryptobiosis). Chỉ có một số chi vi khuẩn có khả năng sinh bào tử: Bacillus, Clostridium, Sporosarcina (G+) , Deusulfotomaculum (G) Bào tử rất khó nhuộm bởi đa số các thuốc nhuộm do màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Vì thế, cần thiết phải có những phương pháp nhuộm đặc biệt đối với bào tử. Với bất kỳ phương pháp nào, tế bào phải được xử lý nhiệt – acid để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu. Sau đó nhuộm tế bào chất của bào tử và tế bào với thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nó với một thuốc nhuộm phân biệt khác. Khi đó, tế bào chất sẽ mang một màu, bào tử sẽ mang một màu khác. Đôi khi bào tử được nhìn thấy bên trong tế bào. Hình thái của nó trong tế bào và kích thước bề ngang của tế bào mang nó. Bào tử thường nằm trong tế bào sinh dưỡng theo ba vị trí: + Nằm ở tâm tế bào: gọi là bào tử kiểu Bacillus + Nằm lệch tâm: gọi là bào tử kiểu Clostridium + Nếu nằm ở cực tế bào: gọi là bào tử kiểu Plectidium + Các bào tử có thể tồn tại tự do do bởi tế bào xung quanh nó đã tan rã. 1. Nhuộm bằng phương pháp Carbolic Fuchsin Hóa chất Dung dịch A + 10 ml dung dịch Fuchsin kiềm bão hòa trong ethanol (khoảng 10%) + 100 ml dung dịch acid carbolic (phenol 5% trong nước) + Trộn đều với nhau (chuẩn bị trước khi dùng)
  33. Dung dịch B + 100 ml Ethanol 95% + 3 ml HCl đậm đặc Dung dịch C + 30 ml Methylen blue bão hòa trong ethanol (khoảng 2%) + 100 ml dung dịch KOH 0.01% trong nước + Trộn đều với nhau, để càng lâu càng tốt Qui trình nhuộm bào tử i. Làm vết bôi trên phiến kính ii. Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nhẹ bên dưới phiến kính để làm bay hơi, tránh để sôi. Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị khô cạn, giữ trong 5 phút. Đợi nguội, đổ thuốc nhuộm đi. iii. Dùng dung dịch B rửa lại cho đến khi thấy vừa hết màu đỏ, rửa nước. iv. Nhuộm lại bằng dung dịch C trong 2 ~ 3 phút, rửa nước, thấm khô. v. Soi kính: dùng vật kính dầu x100. Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh. 2. Nhuộm bằng phương pháp Malachite green (phương pháp SchaefferFulton hoặc phương pháp WirtzConklin) Hoá chất - Dung dịch Malachite green bão hòa (khoảng 7.6%) - Dung dịch Safranin 0.5% Qui trình nhuộm i. Làm vết bôi và cố định tế bào bằng nhiệt ii. Đặt phiến kính lên trên cốc nước sôi. Phiến kính được đậy bằng một tờ giấy thấm có cùng kích thước iii. Tẩm ướt tờ giấy thấm bằng dung dịch Malachite green. Để yên 5~6 phút. Đừng để tờ giấy thấm bị khô iv. Bóc tờ giấy thấm ra, để cho phiến kính nguội hoàn toàn. Rửa phiến kính bằng nước trong 30 giây v. Nhuộm với Safranin trong 90 giây vi. Rửa phiến kính bằng nước trong 30 giây
  34. Bào tử và sự hình thành nội bào tử ở vi khuẩn Qui trình nhuộm bào tử theo phương pháp SchaefferFulton
  35. PHẦN 2: CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM Bài 1: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ 1. Nguyên tắc: Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng trong một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem 1 khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng một đơn vị hình thành khuẩn lạc ( Colony Forming Unit, CFU ), trong 1 đơn vị khối lượng thực phẩm. Chỉ số này có một số tên gọi khác nhau như sau: số vi sinh vật hiếu khí ( Aerobic Plate Count, APC ), tổng số đếm trên đĩa (TotalViable Count, TPC ), tổng số vi sinh vật sống ( Total Viable Count, TVC ), số đếm đĩa chuẩn ( Standard Plate Count, SPC ) Qui trình phân tích bao gồm các bước cân mẫu, đồng nhất mẫu, pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân, chuyển và phân phối đều một thể tích xác định mẫu lên trên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri bằng phương pháp trãi hộp (spread plate) hay đổ hộp (pour plate). U ở điều kiện nhiệt độ và thời gian qui định. Phương pháp đổ hộp được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh. Điều kiện nhiệt độ và thời gian ủ thay đổi tùy theo yêu cầu phân tích và qui định của từng quốc gia. Tiêu chuẩn của nhiều quốc gia qui định ủ ở 30 oC trong 3 ngày. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. 2. Môi trường
  36. Môi trường sử dụng là Plate Count Agar (PCA ) có pH 7.0 ± 0.2. Môi trường được pha chế, phân phối vào các bình thủy tinh và hấp tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút. Các bình hoặc ống nghiệm chứa môi trường chưa sử dụng phải được bảo quản trong tủ lạnh 2 – 8oC. Trước khi sử dụng phải được đun chảy và làm nguội khoảng 45 – 50 oC trong bể điều nhiệt. Nước cất được chứa trong các bình thủy tinh và hấp trùng ở 121 oC trong 15 phút. Sau đó phải được bảo quản trong tủ lạnh 2 – 8oC. 3. Qui trình phân tích (mẫu dạng lỏng) 3.1. Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích Mẫu được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước vô trùng. Trộn mẫu thật kỹ. Dung dịch này có độ pha loãng 10 1. Tiếp tục chuyển 1 ml mẫu từ độ pha loãng 10 1 sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng thứ 2. Trộn mẫu thật kỹ. Dung dịch này có độ pha loãng 10 2. Tiếp tục tiến hành tương tự để có các độ pha loãng 10 3, 10 4 Ống nuôi cấy ban đầu (ống gốc) Nồng độ 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 Độ pha lo ãng 10 1 10 2 10 3 10 4 10 5
  37. *Lưu ý: + Pipet có nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác (chạm tay, chạm mặt ngoài ống nghiệm, mặt ngoài bình chứa ), cần phải thay pipet vô trùng khác. + Các thao tác tiến hành trong điều kiện vô trùng (sử dụng đèn cồn) + Các dụng cụ (pipet, đĩa petri ) phải được tiệt trùng trước khi sử dụng (sấy ở 150 oC/3 giờ) 3.2. Đổ hộp (cấy mẫu) i. Dùng bút lông dầu ghi chú lên đĩa petri (tên mẫu, ngày tiến hành, độ pha loãng ) ii. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện ít nhất 2 – 3 đĩa (tức là 2 – 3 lần lặp lại). iii. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn đđịnh ở 45 50 oC. iv. Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường. v. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn (khoảng 15 phút). vi. 6. Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 48 – 72 giờ (48 giờ lấy kết quả sơ bộ, 72 giờ lấy kết quả chính thức)  Lưu ý: khi ủ phải để hộp petri ở trạng thái lật úp (phần môi trường ở trên, phần nắp nằm bên dưới)
  38. 1 ml Dung dch o mu đã 45 C pha loãng PCA 10 15 ml Đĩa petri vô Lc đu đĩa petri trùng Lt ngưc đĩa Đ ngui 30 oC/3 ngày Đm s khun lc và tính kt qu  Cách tính kết quả Đếm tất cả số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc đếm được từ 25 – 250 để tính toán. Mật độ tổng vi khuẩn hiếu khí: Trong đó: A: số tế bào (CFU) vi khuẩn trong 1ml (hay trong 1 g) mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn Ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: độ pha loãng tương ứng Làm tròn kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa và biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1.0 và 9.9 nhân với 10 n (n là số mũ)
  39. Trường hợp có khuẩn lạc vi sinh vật mọc loang, mỗi vết loang được tính là 1 khuẩn lạc. Nếu số khuẩn lạc loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả nhận được. TRƯỜNG HỢP ĐẶC BIỆT: Nếu ở độ pha loãng cao nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa > 250: ví dụ ở 10 5 (độ pha loãng cao nhất) có số khuẩnlạc đếm được > 250, kết quả được ghi là : > 2.5 x 10 7 CFU/ml Nếu ở độ pha loãng thấp nhất trong dãy các ống nghiệm nói trên, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa < 250: ví dụ nồng độ 10 2 (độ pha loãng thấp nhất) có số khuẩn lạc đếm được < 25, kết quả được ghi là: < 2.5 x 10 3 CFU/ml
  40. BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN VÀ NẤM MỐC 1. Định nghĩa và nguyên tắc Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 4 trăm ngàn loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Chúng thuộc nhóm Eucaryote , có vách tế bào là lớp vỏ chitin. Nấm men và nấm mốc là các vi sinh vật dị dưỡng, chúng tiêu thụ nguồn carbon hữu cơ được cung cấp từ môi trường bên ngoài tế bào. Hầu hết nấm mốc và nấm men thuộc nhóm mesophiles , một số ít thuộc nhóm psychrophiles , hoặc thermophiles . Hầu hết nấm men và nấm mốc phát triển trong môi trường có hoạt độ nước từ 85% trở lên, một số ít loài có thể tăng trưởng trong môi trường có hoạt độ nước 60 – 70%. Nấm mốc và nấm men tăng trưởng được trong khoảng pH từ 2.0 – 9.0, trong đó pH thích hợp nhất là 4.0 – 6.5. Đa số nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một số loài có thể tiếp nhận oxi nguyên tử từ cơ chất, nhưng dù ở dạng nào, oxi vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm mốc và nấm men. Trong thực phẩm, sự hiện diện và sinh trưởng của chúng có thể làm thay đổi các tính chất của thực phẩm (màu sắc, mùi vị ), gây hư hỏng và có thể tạo thành một số độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Mật độ nấm mốc và nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng số nấm men và nấm mốc bằng các kỹ thuật pha loãng, trải đĩa và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar , hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC ). Môi trường Dichloran Glycerol Agar được sử dụng cho các loại thực phẩm có hàm lượng nước thấp (thực phẩm khô, ngũ cốc, tiêu , các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường/muối cao). Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao (sữa, các sản phẩm từ sữa, đồ hộp, các loại rau quả ). Đối với các mẫu có mật độ nấm mốc thấp, các môi trường thường được sử dụng là Malt Extract Agar (MEA), Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm chloramphenicol hay chlotetraciline. 2. Cách tiến hành a. Tiến hành pha loãng thập phân mẫu ban đầu
  41. b. Sử dụng kỹ thuật trải đĩa để tiến hành xác định chỉ tiêu tổng số nấm men, nấm mốc trong mẫu Ghi nhãn lên đĩa petri (tên mẫu, tên kỹ thuật viên, ngày ) Đổ môi trường vào trong đĩa petri (khoảng 15ml). Chờ cho môi trường đông đặc hoàn toàn (khoảng 15 phút) Dùng pipette cho 0.1 ml mẫu vào chính giữa đĩa thạch Nhúng que thủy tinh hình L vào một cốc chứa ethanol. Sau đó gõ nhẹ que thủy tinh vào thành cốc để loại bớt ethanol thừa Khẽ đưa que thủy tinh gần ngọn lửa đèn ethanol để làm bốc cháy que thủy tinh. Làm nguội bằng cách chạm que thủy tinh vào phần nắp bên trong đĩa thạch. Trải mẫu vi sinh vật sao cho mẫu dàn đều khắp bề mặt môi trường thạch. Nhúng que thủy tinh vào ethanol, gõ nhẹ vào cốc và đốt cháy que thủy tinh. Lặp lại thao tác với đĩa thạch kế tiếp. Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện ít nhất 2 – 3 đĩa (tức là 2 – 3 lần lặp lại). Tiến hành nuôi cấy trong tủ ủ vi sinh ở 30 oC trong 5 – 7 ngày Tiến hành quan sát hình thái đại thể của khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc nấm men/nấm mốc và ghi nhận lại kết quả. 3. Đọc kết quả a. Tương tự bài “Định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí” b. Đọc kết quả từ ngày 5 – 7  Lưu ý: trong thời gian ủ, nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi trường nuôi cấy, tạo thành khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ, không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để tránh sự phát tán của bào tử vào không khí, gây nhiễm vào mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. Các đĩa khi đem ủ phải để mặt thạch nằm phía dưới, nắm hộp petri nằm trên.
  42. Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN 1. Giới thiệu về Coliform Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37 oC trong 24 – 48 giờ. Trong thực tế phân tích, Coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37 oC trong môi trường lỏng Lauryl Sulfate và môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay có loại môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Tuy nhiên, mối liên hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi. Coliforms gồm 4 giống: Escherichia với 1 loại duy nhất là E.coli , Citrobacter , Clebsiella , E nterobacter . Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm indol (I), Methy Red (MR), VogesProskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC. Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi ủ ở 44oC trong môi trường lỏng EC. Coliforms phân (faecal coliforms hay E.coli giả định)là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44.5oC trong môi trường lỏng Trypton. Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và động vật máu nóng khác và được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển, thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường. E.coli là Coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++ (Indol + , Methyl Red + ,VogesProskauer , Citrate ) 2. Phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN (phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp
  43. dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại ở 3 lần độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. Qui trình thực hiện định lượng theo phương pháp này là như sau: cho vào ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 10 1, 10 2, 10 3). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục ). Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100 ml, MPN/1 g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số vi sinh vật có thể được nuôi cấy trong môi trường lỏng chọn lọc và cho kết quả biểu kiến thích hợp. Ví dụ, môi trường BGBL ở 37 oC có thể định lượng nhóm coliforms, cùng môi trường này ở 45 oC cho phép định lượng coliforms phân hoặc môi trường Mannitol Salt Broth có thể dùng để định lượng Staphylococcus 3. Định lượng Coliforms bằng phương pháp MPN Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10 1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml môi trường LST và ống Durham úp ngược. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10 2, 10 3 đến 10 10 Ủ ống nghiệm trong 48 giờ ở 37 oC. Ống dương tính là ống có sinh khí bọt khí trong ống Durham). Ghi nhận số ống dương tính. Thử nghiệm khẳng định: dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LST dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL và ủ ở 37 oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống dương tính ứng với mỗi độ pha loãng Lưu ý: cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham sau khi tiệt trùng môi trường. Các ống có khả năng hiện diện của Coliforms là các ống dương tính ở cả môi trường LST lẫn BGBL.
  44. Các thao tác chính 4. Lựa chọn các độ pha loãng để tính kết quả Mỗi mẫu kiểm nghiệm chọn 3 độ pha loãng liên tiếp ứng với 1 trong 3 trường hợp sau sao cho thích hợp. Tiến hành thứ tự theo các trường hợp và các bước (a, b,c ) sau: Trường hợp 1 a. Chọn độ pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho 3 ống dương tính, cùng với hai độ pha loãng cao hơn tiếp theo (tức là độ pha loãng này có nồng độ mẫu là 1/10 và 1/100 của độ pha loãng thứ nhất đã được chọn (xem ví du) b. Xem trường hợp 3 c. Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũng cho 3 ống dương tính thì chọn tiếp 3 độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) (xem bảng 1, ví dụ 2)
  45. Trường hợp 2 a. Nếu trường hợp 1 không thể áp dụng, chọn 3 độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), trong số đó ít nhất thu được 1 kết quả dương tính (xem bảng 1, ví dụ 3) b. Xem trường hợp 3 Trường hợp 3 (trường hợp đặc biệt) Trong tất cả các trường hợp, khi có nhiều hơn một trong 3 độ pha loãng được chọn theo trường hợp 1 và 2 không có ống dương tính, thì hãy chọn độ pha loãng nào có độ pha loãng thấp nhất không có các ống dương tính (tức là độ pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất) và 2 độ pha loãng thấp hơn kế tiếp trong dãy pha loãng (tức là có nồng độ mẫu gấp 10 lần và 100 lần độ pha loãng thứ nhất đã chọn), (xem bảng 1, ví dụ 4 & 5), trừ khi các ống dương tính chỉ tìm thấy ở mức pha loãng đầu tiên được chuẩn bị từ mẫu thử. Trong trường hợp cuối cùng này, cần chọn ra 3 độ pha loãng đầu tiên để tính MPN, thậm chí loạt ống này bao gồm 2 độ pha loãng không có ống dương tính nào Ví dụ lựa chọn các kết quả dương tính đối với việc tính toán MPN 5. Xác định chỉ số MPN Sử dụng kết quả của phần 4. để tra bảng 2
  46. Kết quả (MPN/ml) = kết quả trang bảng x f/10 f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n) Ví dụ
  47. Bảng tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
  48. BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG TRỰC TIẾP TẾ BÀO VI SINH VẬT 1. Định lượng trực tiếp tế bào bằng buồng đếm Có thể sử dụng buồng đếm để định lượng vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc với độ phóng đại x100 đến x400. Với tế bào vi khuẩn, do kích thước nhỏ, nên phải sử dụng buồng đếm PetroffHasser. Phương pháp đếm trực tiếp còn giúp quan sát được hình thái tế bào Kết quả đếm được là tổng số tế bào có trong mẫu, không phân biệt được tế bào còn sống hay tế bào chết (chỉ phân biệt tế bào nấm men chết khi tiến hành nhuộm với dung dịch methylen blue ) 2. Cấu tạo buồng đếm hồng cầu Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính dày hình chữ nhật, giữa là phần lõm phẳng, tại đây có kẻ một lưới gồm 400 ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng là 1mm 2.Bao gồm 25 ô vuông lớn; mỗi ô vuông lớn này gồm có 16 ô vuông nhỏ. Vì thế, diện tích một hình vuông nhỏ là 1/400 mm 2 và một hình vuông lớn là 1/25 mm 2. 3. Cách tiến hành a. Pha loãng huyền phù tế bào vi sinh vật sao cho trong mỗi ô lớn chỉ từ 10 – 50 tế bào). b. Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào (đã pha loãng), dùng pippet Pasteur để hút dịch 2. huyền phù này. 3. Đậy buồng đếm bằng một phiến kính mỏng 4. Nhẹ nhàng dùng đầu pippet (chứa một giọt huyền phù vi sinh vật), đặt vào cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng). Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Buồng đếm được chuẩn bị đúng khi chỉ có vùng không gian nằm giữa lá kính và buồng đếm được phủ bởi dịch huyền phù tế bào, còn các rãnh chung quanh thì không bị dính ướt. 5. Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy các khoang. Khi đó, dịch nằm trong khoang có độ dày khoảng 0.1mm 6. Đặt buồng đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính x10 để tìm buồng đếm. Chỉnh thật rõ, sau đó chuyển qua vật kính x40 để đếm
  49. 7. Điều chỉnh cường độ ánh sáng bằng cửa sập để có thể quan sát rõ ràng cả tế bào lẫn các đường kẻ. Tuỳ vào số lượng tế bào mà có thể chọn cách đếm tất cả các tế bào có trong ô trung tâm hay chỉ đếm các tế bào có trong một số ô vuông lớn đại diện. Thông thường ta chọn 1 ô trung tâm và 4 ô nằm ngoài bìa hoặc 5 ô theo đường chéo (các ô đánh dấu X) 8. Bắt đầu đếm tế bào sau khi nhỏ giọt dịch từ 3 – 5 phút; phải đếm các tế bào nằm trên 2 đường kẻ kề nhau được chọn của từng ô.
  50. PHẦN 3: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG CHẾ BIẾN THỰC PHẨM Bài 1: LÊN MEN RƯỢU VANG QUẢ 1. Giới thiệu: Danh từ rượu vang quả được dùng để chỉ loại rượu được lên men từ dịch ép trái cây (nho, dâu, thơm, táo ) của một số chủng nấm men. Rượu vang quả thu được không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có độ cồn nhẹ (10 – 15%) là loại nước giải khát thơm ngon, giàu chất bổ dưỡng, đặt biệt rất thích hợp đối với phụ nữ. Tùy theo lượng đường khử còn lại trong rượu vang sau khi lên men xong, người ta phân biệt: (a) rượu vang khô: 10 g đường/l, (b) nửa khô: 20 – 30 g đường/l, (c) nữa ngọt: 45 g đường/l, và (d) rượu ngọt: 80 – 110 g đường/l. Trong rượu vang có chứa các acid hữu cơ và vô cơ (acid tartric, acid malic, acidcitric, acid oxalic ). pH của rượu vang khoảng từ 2.9 – 3.9. 2. Qui trình thí nghiệm 1. Rửa sạch quả (2~3kg) 2. Làm dập quả (nho, ) hoặc xay dập (thơm, xoài, ) hoặc cắt thành lát mỏng. Với chuối, nên tiến hành xắt lát và sấy khô trước đó. Với các loại quả khác, ta xay dập, vắt lấy nước quả bằng túi vải lọc. 3. Cho quả (hoặc dịch quả) vào trong hũ plastic loại 5 L đã rửa sạch (chọn loại có nắp vặn chắc). 4. Bổ sung thêm nước (1~2 L) sao cho đạt 2/3 thể tích bình chứa. 5. Bổ sung đường cát trắng sao cho dung dịch đạt nồng độ chất khô 25 oBx (khuấy đều để đường tan hoàn toàn). 6. Điều chỉnh về pH 5.0 (sử dụng giấy quỳ tím và acid citric). 7. Bổ sung môi trường chứa huyền phù Saccharomyces oviformis đã qua nhân giống trong 30 oC /48 giờ với thể tích phù hợp
  51. 8. Kết thúc quá trình lên men chính khi nồng độ chất khô không tiếp tục giảm và hầu như không có sự hình thành bọt khí trong bình lên men (khoảng 5 –7 ngày). Ta có được rượu non 9. Lọc bỏ xác quả bằng vải lọc thưa. 10. Tiến hành quá trình lên men phụ trong các chai plastic (chai pet loại 1.25–1.50 L) ở nhiệt độ 15 – 18 oC (ngăn mát tủ lạnh). Thỉnh thoảng mở hé nắp vặn để xả bớt lượng khí CO 2 tích lũy trong chai (phòng tránh phồng/nổ chai) 11. Sau 7 ngày, lọc bỏ cặn nhiều lần (qua bông gòn loại thấm nước) để có được rượu sống . 12. Tiếp tục ủ chín trong các chai plastic như trên ở 15 – 18 oC với thời gian vài tháng để có được rượu vang chín . Gợi ý: tùy điều kiện, sinh viên có thể dùng 100% dịch quả (không bổ sung thêm nước) để có được hương vị của rượu tốt hơn. Để có được loại rượu với hương vị tốt, sinh viên nên sử dụng nho và thơm để làm thí nghiệm. Sinh viên có thể sử dụng rượu sống hoặc tiếp tục ủ chín để có rượu vang chín với hương vị tốt hơn 3. Theo dõi quá trình lên men qua một số chỉ tiêu sau Trong giai đoạn lên men chính: a. Nồng độ chất khô ( oBx): kiểm tra 2 ngày/lần. b. pH. c. Sự tạo thành bọt khí bên trong hũ nhựa (ghi nhận kết quả quan sát được). d. Độ cồn: mẫu rượu sau khi kết thúc lên men chính được chưng cất và xác định độ cồn bằng phương pháp chuẩn độ (hoặc phương pháp dùng bình tỉ trọng). Các kết quả được ghi nhận vào bảng biểu và được vẽ đồ thị theo thời gian. .
  52. Bài 2: LÊN MEN GIẤM 1. Giới thiệu: Theo khái niệm của Tổ Chức Nông Lương Thế Giới (FAO), giấm được định nghĩa như sau: “Giấm (vinegar) là dung dịch acid loãng mà con người có thể sử dụng được thông qua đường tiêu hóa. Giấm phải được sản xuất từ những nguyên liệu có nguồn gốc từ nông nghiệp chứa tinh bột, đường, đầu tiên bằng quá lên men chuyển đường thành rượu sau đó tiếp tục lên men acetic chuyển rượu thành acid acetic (thành phần chủ yếu của giấm)”. Đây là khái niệm được sử dụng phổ biến nhất trên thế giới cho tới ngày nay. Một số ứng dụng quan trọng của giấm trong công nghệ thực phẩm là: − Chất gia vị làm tăng giá trị cảm quan của một số sản phẩm thực phẩm như: xốt, tương cà, tương ớt, mayonaise, salad trộn, rau dầm giấm (dưa chuột dầm giấm, rau cải dầm giấm, hành dầm giấm, hương thảo dầm giấm ) − Phụ gia bảo quản, khử mùi tanh của thịt cá trước khi chế biến. Ngày nay, giấm đang được đa dạng hóa từ nhiều nguyên liệu khác nhau. Ở Nhật, ngoài vai trò tăng giá trị cảm quan, người ta còn sản xuất một số loại giấm chức năng như giấm từ gạo lức giàu acid amin, giấm từ củ hành giàu acid amin, K, Mg. Hàng năm, trên thế giới, sản lượng giấm tiêu thụ là rất lớn. 2. Quy trình thử nghiệm i. Tiến hành làm rượu vang quả (dứa, nho ) hoặc rượu gạo, rượu nếp than, rượu từ dịch chiết malt để thu được rượu non. ii. Lọc bỏ bã bằng vải lọc iii. Hiệu chỉnh nồng độ rượu về 5% bằng nước iv. Bổ sung giống vi khuẩn Acetobacter aceti với tỉ lệ 10% 30%. v. Cho phần rượu non đã bổ sung giống vi khuẩn đã lọc vào hũ (nhựa hoặc thủy tinh) sao cho phần rượu chiếm 50 – 70% thể tích vật chứa. Lưu ý, sau khi bổ sung giống nồng độ acid của dịch lên men phải đạt tối thiểu 0.5% (tính theo acid acetic), nếu chưa đạt phải hiệu chỉnh bằng acid acetic
  53. vi. Để yên trong khoảng 1 tháng. Hàng ngày mở nắp hũ chứa một lần trong khoảng thời gian 1 – 2 phút. Tuyệt đối không được lắc hũ chứa hoặc làm cho lớp váng mỏng bị vỡ hay chìm xuống vii. Kiểm tra độ acid định kỳ hàng tuần. Nếu đạt nồng độ acid acetic >4.5% là đạt yêu cầu. Ta thu được giấm non. viii. Lọc kỹ qua một lớp bông gòn thấm nước hoặc ly tâm 5000 rpm trong 15 phút ix. Cho vào chai thủy tinh và đóng nắp sau đó tiến hành thanh trùng 80 – 90oC (đun cách thủy) trong 15 – 30 phút x. Để có được loại giấm ngon ta có thể tiếp tục ủ chín giấm non ở điều kiện 30oC trong 1 – 2 tháng tiếp theo. Sau đó, lọc, đóng chai và thanh trùng như trên.
  54. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THÔNG DỤNG M1 (môi trường giá đậu đường) Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước. Đun sôi 30 phút. Lấy phần dịch trong. Thêm nước cho đủ 1000ml. bổ sung thêm glucose với hàm lượng 5% (w/v) M2 (môi trường khoai tây đường cám): 1000ml Khoai tây cắt nhỏ, rửa sạch, cân lấy 300g. Thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút. Lọc lấty nước trong. Cân 100g cám, thêm 500ml nước, đun sôi 30 phút. Lọc lấy nước trong. Trộn 2 loại dịch lọc trên và thêm sucrose 5% (w/v). Bổ sung nước cho đủ 1000ml. Khoai tây 30% Cám 10% Sucrose 5% Nước đủ 1000ml M3 (môi trường Sabouraud): 1000ml Pepton 1% Glucose 4% Agar 2% Nước đủ 1000ml pH 5.6 – 6.0 M4 (môi trường Hansen) Glucose 5% Pepton 1% K2HPO4 0.3% MgSO4.7H2O 0.2% Agar 2% Nước đủ 1000ml M5 (môi trường Potato Dextrose Agar) Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ với 1000ml nước trong 30 phút. Lọc qua vải thưa, giữ lại phần dịch, đó là chất chiết khoai tây. Trộn với các thành phần khác rồi đun sôi để hoà tan (đối với môi trường Potato dextrose salt: chuẩn bị như môi trường M5 rồi thêm: 7.5% NaCl) Chất chiết khoai tây 20% (v/v) Dextrose 2% Agar 2% Nước đủ 1000ml M6 (môi trường thạch malt) Lấy 250g malt, nghiền nhỏ, hoà vào 1000ml nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, đến 45 – 50 oC, giữ ở nhiệt độ này trong 30 phút. Sau đó nâng nhiệt độ lên 65 – 68 oC, có khuấy, cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn (không thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch Lugol). Lọc tách bã qua vải thô (hay bông gòn thấm nước), đem hấp phần dịch 121 oC / 30 phút, lấy ra để
  55. lắng. Lọc bỏ kết tủa, pha loãng để đạt 6 – 8o Brix, thêm 2% agar, đun và khuấy đều cho đến khi thạch tan hết. Cho môi trường thạch vào các dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 121 oC / 15 phút. M7 (môi trường BGBL 2% Broth – dạng pha sẵn) Peptic digest of animal tissue 1% Lactose 1% Oxygall 2% Brilliant green 0.0133g/L Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để pha thành 1000ml môi trường. M8 (môi trường Plate Count Agar – ATCC medium 1048): 1000ml Agar 150 g Yeast extract 2.5 g Trypton 5 g Glucose 1.0g M9 (môi trường LST Lauryl Sufate Broth/Lauryl Trypton Broth): 1000ml Trypton 20 g Lactose 5 g NaCl 5 g K2HPO 4 2.75 g KH 2PO 4 2.75 g Sodium lauryl sufate 0.1 g pH 6.8 ± 0.2 Nước Đủ 1000ml M10 (Môi trường VRBL Crystal Violet neutral Red Bile Lactose agar): Pepton 7g Neutral Red 0,03g Yeast Extract 3g Crystal Violet 0,002g Lactose 10g Agar 15g NaCl 5g Nước đến 1000 ml Muối mật 1,5g Hòa tan các thành phần trên trong nước, để yên vài phút, đặt lên bếp đun sôi và khuấy đều, để sôi 25 phút. Làm nguội đến 45 oC để sử dụng. Chú ý: Không để sôi quá lâu Không được tiệt trùng môi trường Pha chế xong sử dụng ngay trong vòng 3 giờ
  56. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ ph ẩm – Trần Linh Thước – Nhà xuất bản Giáo dục, 2003 2. Thực tập Vi sinh vật học thực phẩm – Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn – Đại học Bách Khoa TP.HCM 3. Thí nghiệm Vi sinh vật học thực phẩm – Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương – Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP.HCM, 2006 4. Handbook of Microbiologycal Media for the Examination of Food – Ronald M. Atlat – CRC Press, Taylor &Francis Group, 2006 5. Laboratory Manual of Food Microbiology for Ethiopian health and Nutrition Research Institute – Dr. Ciira Kiiyukia – Unido project, 2003 6. Food Microbiology Laboratory Manual – Professor Nagendra Shah – School of Molecular Sciences Victoria University, 2004