Bài giảng ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống

Nội dung text: Bài giảng ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ DỰ ÁN HỢP TÁC VIỆT NAM – HÀ LAN BÀI GIẢNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CHỌN GIỐNG Người biên soạn: TS. Lê Tiến Dũng Huế, 08/2009
2. Chương I CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÂY TRỒNG I. KHÁI NIỆM CHUNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khoảng từ những năm 1970 trở lại đây, người ta hay bắt gặp thuật ngữ "Biotechnologie". Thuật ngữ này được hình thành từ tiếng La tinh - "Bios", sinh học và "Technology"- công nghệ. Sự ra đời của công nghệ sinh học (CNSH) thể hiện sự phát triển nhanh chóng về tri thức khoa học, sinh học và các ngành liên quan đến sinh học như hoá học, vật lý học, đồng thời nói lên ý nghĩa thực tiễn to lớn của ngành sinh học. Nhiều nguyên lý, quá trình sinh học mới được khám phá và ứng dụng trong sản xuất, giải quyết nhiều khó khăn trong cuộc sống của loài người trong nhiều lĩnh vực. Các nhà khoa học đã có những ý kiến khác nhau về CNSH. Có người cho rằng nó là một sự phát triển tiếp theo của công nghệ vi sinh, hoặc của sinh học phân tử và kỹ thuật gene. Những khái niệm đó đều chưa hoàn chỉnh, không đại diện được một cách tổng thể về nội dung khoa học và thực tiễn của CNSH. Gần đây có người đưa ra một định nghĩa bao quát, khoa học hơn: CNSH là quá trình nghiên cứu, khai thác, sử dụng các nguyên lý và quá trình sinh học để giải quyết các vấn đề thực tiễn sản xuất phục vụ đời sống con người ở quy mô công nghiệp. Xuất phát từ quan điểm trên, người ta phân biệt CNSH làm hai loại: - CNSH cổ truyền: Khai thác các nguyên lý và quá trình sinh học dựa trên cơ sở những hiểu biết sơ đẳng và kinh nghiệm sống của con người. Chúng ta có thể liệt kê một số hoạt động như: thuần hoá, tuyển chọn vật nuôi và cây trồng, lên men nấu rượu, làm bánh mỳ, sữa chua, làm tương, dấm, muối dưa và chữa, chẩn đoán bệnh bằng phương pháp y học cổ truyền. - CNSH hiện đại: là quá trình nghiên cứu, khai thác các nguyên lý sinh học trên cơ sở những kiến thức khoa học tiên tiến và bằng những phương pháp nghiên cứu hiện đại. Kết quả và sản phẩm của CNSH hiện đại có thể mang lại những cuộc cách mạng, thúc đẩy phát triển sản xuất, đáp ứng nhu cầu cuộc sống của loài người. CNSH đã phát triển qua ba giai đoạn: + Trước hết nó được hình thành từ khi con người chưa hiểu biết nhiều về sinh học. Bằng những kinh nghiệm, quy định sản xuất thủ công, họ tạo nên những sản phẩm từ vi sinh, động vật và thực vật. Ví dụ: làm đưa, làm dấm, nấu rượu, lai tạo giống mới, nhân giống + Giai đoạn hai: Bắt đầu từ cuối thế kỷ 19 khi con người đã hiểu biết về các quá trình sinh lý, sinh hoá, di truyền của sinh vật và có nhiều kết quả sử dụng chúng phục vụ nhu cầu con người. Trước hết sử dụng vi sinh vật trong sản xuất sinh khối, chiết xuất một số hoá chất như butanol, aceton và các loại nấm men có lợi khác, như làm sạch nước cho thành phố. Công tác nuôi cấy phân lập các chủng vi sinh mới phát triển. Nhiều quy trình công nghệ sử dụng những nồi lên men với công suất lớn ra đời và tạo ra những sản phẩm mới như thuốc kháng sinh, phân bón, chế phẩm vi sinh 1
3. + Giai đoạn ba: Từ những năm 60, 70 trở lại đây, CNSH phát triển mạnh mẽ nhờ những tiến bộ vượt bậc của sinh học phân tử, điều chế enzymẹ, kỹ thuật gene, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật Ngày nay người ta có thể khai quát tương dối đầy đủ nội dung cũng như như phạm trù hoạt động của CNSH. Nó được xây dựng dựa trên nền tảng của sự hợp các công nghệ cơ bản: - Công nghệ vi sinh. - Công nghệ enzyme. - Công nghệ lên men (Fennenlation) - Công nghệ nuôi cấy tế bào động vật và miễn dịch học - Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật. - Kỹ thuật gene di truyền. CNSH ngày càng phát triển và hoàn thiện, đi sâu thâm nhập vào mọi lĩnh vực, ngành khoa học khác nhau như công nghiệp mỏ, địa chất, chế biến thực phẩm, y tế, môi trường và các ngành sản xuất nông, lâm, ngư nghiệp Thực sự, CNSH đã đóng vai trò hết sức quan trọng, tạo ra nhiều sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu phát triển ngày một đa dạng và phong phú của con người: Lương thực thực phẩm: sản phẩm cá, thịt, tinh bột, đường ; thực phẩm bổ trợ, chất màu, hương vị; các loại vitamin và acid amin quan trọng. Nông nghiệp: thức ăn gia súc, thuốc trừ sâu, vi khuẩn, vi rút, chế phẩm vi sinh, nhân giống vô tính, cấy hợp tử, sản xuất phôi, vaccin. Hoá học: acid hữu cơ, rượu, men, chất cao phân tử, metal extraction, bioaccumulation. Dược học: các chất kháng sinh, các chất chẩn đoán bệnh, men ức chế, vaccin, steroids, alcaloids. Lên men: bia rượu, chất kích thích, lương thực, bánh mỳ, bơ, protein tế bào, cồn công nghiệp, men, chất kháng sinh, thuốc, vitamin, vaccin. Năng lượng: sinh chất, ethanol, methane. Môi trường: xử lý chất thải, làm sạch nước, tinh chế, phân giải dầu gây ô nhiễm. II. VAI TRÒ CỦA THỰC VẬT Thực vật là chìa khoá của cuộc sống trên trái đất. Thực vật là sinh vật sản xuất đầu tiên trong tất cả các chuỗi thức ăn trong hệ thống tự nhiên và là nguồn cung cấp năng lượng vì chúng có khả năng tái sinh. Thực vật là cơ thể tự dưỡng, có nhu cầu sinh dưỡng rất đơn giản, sử dụng nước, muối khoáng, CO2 và năng lượng ánh sáng mặt trời để tổng hợp các đường đơn. Đây là sản phẩm sinh tổng hợp đầu tiên để từ đó chúng được chuyển hoá tổng hợp các phức chất khác. Đường được sử dụng ngay hoặc dự trữ để đưa vào cùng với muối vô cơ và nước, tổng hợp nên những đại phân tử cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển và tồn tại của thực vật. Như vậy thực vật có khả năng duy nhất chuyển hoá năng lượng mặt trời thành năng lượng sinh học. Trong số toàn bộ năng lượng thực vật chuyển hoá 2
4. được chúng chỉ để lại 10% cho mình, còn 90% được sử dụng bởi động vật và con người, đồng thời chúng còn cung cấp 80% lượng protein có trong tự nhiên (20% được sản xuất từ nguồn sinh vật khác). Theo Simmonds (1976), chúng ta có khoảng 120-130 cây trồng chính, thuộc 64 họ và 180 giống (genera). Rõ ràng nguồn cây trồng của chúng ta rất đa dạng và phong phú. Tuy vậy chúng chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong số 300 họ và 3000 giống (genera) thực vật tồn tại hiện nay. Sự đa dạng này phản ánh sự đa dạng về nhu cầu sản phẩm của con người. Đồng thời chúng còn có sự đa dạng về vị trí địa lý mà ở đó chúng được thuần hoá (Simmonds 1989). III. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC TIỄN CẢI TẠO CÂY TRỒNG NÔNG NGHIỆP Giai đoạn đầu, con người tồn tại và phát triền được nhờ săn bắn và hái lượm, sau đó chuyền sang một dạng vận động cao hơn: Trồng trọt và thuần hoá vật nuôi, cây trồng. Trong quá trình đó, cây trồng đã thay đổi rất lớn. Sự thay đổi này xảy ra qua sự chọn lọc có ý thức theo những đặc tính có lợi cho con người. Quá trình thực tiễn đó làm cho con người và cây trồng liên kết chặt chẽ với nhau, tạo nên mối quan hệ mật thiết phụ thuộc lẫn nhau. Từ ngày đầu trồng trọt cho tới cuối thế kỷ 19, tất cả những cải tạo cây trồng là do chính người nông dân thực hiện. Vào cuối thế kỷ 19 đến giữa thế kỷ 20, tốc độ cải tiến cây trồng diễn ra càng nhanh. Dưới đây là một số khám phá sinh học và ảnh hưởng của nó đối với lĩnh vực này: Sự khám phá lại định luật của Mendel cung cấp cho các nhà khoa học những cơ sở khoa học trong công tác lai tạo và làm sáng tỏ cơ chế của sự phân ly và quy luật di truyền các tính trạng. - Những định luật di truyền của Mendel, quy luật biến dị của Darwin và nhiều khám phá sinh học khác giúp người ta tiên đoán được nhanh và chính xác các tính trạng, làm cho công tác lai tạo giống tiến nhanh và hiệu quả hơn. - Morgan và cộng sự đã xây dựng được bản đồ gene ở ruồi dấm. Nó giải thích được sự liên kết và tái tổ hợp của các đặc tính. - Sự thu thập nguồn gene giống cây trồng, cây đã thuần hoá và cây dại thành lập ngân hàng gene, cung cấp thực liệu cho chương trình lai tạo. - Sự phát triển di truyền tế bào giúp những người tạo giống hiểu biết về cấu trúc chức năng và cơ chế tái tổ hợp. - Khám phá ra colchicine, nhờ đó tạo những giống mới bằng sự đa bội hoá. - Vai trò của tia X trong việc tạo ra những biến dị mới, ra đời các kỹ thuật gây đột biến khác là công cụ tích cực cho những người làm công tác giống. - Những phát triển trong di truyền số lượng giúp các nhà tạo giống hình thành được chiến lược chọn giống và phân tích tính ổn định của tính trạng. Nhờ những thành tựu trên, người ta ước tính chỉ trong thế kỷ 20 năng suất sản lượng cây trồng đã tăng 50%. 3
5. Ví dụ nổi bật về sự thành công của những người làm công tác giống và ảnh hưởng của nó đến việc cung cấp lương thực thế giới là cuộc cách mạng Xanh ở Bắc Mỹ 1950-1960. Công tác nghiên cứu khoa học dẫn đến cách mạng Xanh được bắt đầu vào những năm 1940, nhưng thực sự cách mạng Xanh có ảnh hưởng và được người ta đặt tên cho nó vào năm 1960, do William S.Gang - người Mỹ đề xướng. Nội dung nghiên cứu của cách mạng Xanh là sự chuyển giao công nghệ tổng hợp nhiều mặt: Lai tạo giống, canh tác, tưới tiêu., phân bón, bảo vệ thực vật từ các nước phát triển sang các nước nghèo - đối tượng áp dụng cho cây khoai tây và lúa mỳ. Trong hai cây đó sau này việc chuyển giao sản xuất cây lúa mỳ thu được nhiều thành quả, có tác dụng lớn tạo ra cuộc cách mạng. Còn cây khoai tây khó áp dụng triển khai hơn. Năm 1947 giống lúa mỳ lùn (Norin dwarf) từ Nhật Bản được chuyển sang nghiên cứu ở Mỹ và năm 1954 Borlaug đã mang nó sang Mexico và ông đã chọn tạo được những dòng giống lúa mỳ lùn có thời gian sinh trưởng ngắn, thích nghi rộng, năng suất cao, trồng được hai vụ/năm, chịu nóng, có thể phát triển được ở vùng nhiệt đới. Những năm 1960- 1970, các giống lúa mỳ này đã phát triển nhanh chóng ở ấn Độ, Pakistan và sản lượng lúa mỳ ở đây tăng gấp 2 lần, diện tích trồng lúa mỳ lên tới 10 triệu hecta. Ít năm sau (1956) Viện IRRI bắt đầu thực hiện chương trình nghiên cứu theo mô hình cây lúa mỳ, áp dụng cho cây lúa nước và năm 1962 người ta đã tạo ra những giống lúa nước thấp cây, thời gian sinh trưởng ngắn, có bộ lá đứng, đẻ khoẻ, cho năng suất cao. Vào năm 1970, những giống lúa này cũng phát triển nhanh, đạt diện tích 10 triệu ha ở Pakistan, ấn Độ, lndonesia và Trung Quốc (giống đầu tiên là IR8). Tiếp theo, các giống lúa được trồng và khảo sát ở Việt Nam năm 1975, 1976 và giống lúa lR8 đã nhanh chóng phát huy tác dụng hình thành thêm 1 vụ lúa xuân ở miền Bắc nước ta, cho năng suất tới 3 tấn/ha, sau đó lên 4-5 tấn/ha. Hiện nay chúng ta trồng chủ yếu là các giống mới thấp cây, ngắn ngày, năng suất, chất lượng của chúng luôn luôn được cải thiện. Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế đang chuẩn bị đưa ra những giống lúa mới có kiểu hình đặc biệt gọi là "Superrice". Superrice có những đặc điểm ưu việt sau (bảng 1.1): Bảng 1.1. Một số giống lúa ưu việt nổi bật Tên giống Sinh khối Chỉ số thu Năng suất Thời gian sinh (tấn/ha) hoạch (tấn/ha) trưởng Modernrice 20 0,5 8 100 – 120 Supenrice 22 0,6 12 100 – 120 Localrice 12 0,3 3 160 Giống này có nguồn gốc lai tạo từ Indica và Tropical Javania (Kush 1966 chưa công bố). 4
6. Chương II NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trải qua gần một trăm năm phát triển. Có thể tạm thời phân chia quá trình phát triển đó thành 4 giai đoạn: 1. Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930) Bắt đầu từ những thí nghiệm đầu tiên của Haberlandt (1898) khi ông đề xướng ra tính toàn thể của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập từ tầng tế bào lược, tế bào tầng nhu mô, tầng biểu bì và lông hút của thực vật để chứng minh cho luận điểm của ông nhưng không thành công. Tiếp theo Haberlandt, còn có một số phòng thí nghiệm khác như Winkler ( 1902), Thielmann (1924) và Kuster (1928) cũng đã tiến hành thí nghiệm tương tự nhưng không nhận được tế bào phân chia nào. Winkler lúc bấy giờ đã có những quan sát rất tinh tế. Ông nhận thấy: tế bào noãn trương lên khi hạt phấn nảy mầm và đề nghị nuôi tế bào dinh dưỡng phân lập cùng với ống phấn trong một giọt treo để bắt ống phấn kích thích tế bào dinh dưỡng phân chia. Ngoài ra ông còn đề nghị bổ sung vào môi trường dinh dưỡng dịch chiết từ các phần mô dinh dưỡng khác, ví dụ như dịch lấy từ túi phôi và ông tin rằng bằng con đường đó có thể nuôi thành công một tế bào dinh dưỡng phân lập thành phôi mà ông định gọi là phôi nhân tạo (artificial embryo). Phải đến những năm 30 của thế kỷ 20 người ta mới đạt được những tiến bộ thực sự: Schmucker (1929), Scheitterer (1931), Pfeiffer (1931, 1933), Larue (1933) thông báo về nuôi cấy thành công đoạn đầu rễ riêng rẽ. Trong môi trường nhân tạo các đoạn rễ này phát triển thành những chiếc rễ hoàn chỉnh. Đây là tiến bộ đánh dấu một giai đoạn phát triển mới. 2. Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950) Bắt đầu bằng thành công của White (1934) nuôi cấy được một dòng rễ cà chua sinh trưởng mạnh và liên tục. Cùng năm, Gautheret thông báo thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ tượng tầng (cambium) của cây Salix apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã liên tục phân chia trong nhiều tháng trên môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride. Trong thời kỳ này Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra IAA là một auxin tồn tại tự nhiên trong cơ thể thực vật. IAA được công nhận là một loại hormon thực vật, có chức năng như một chất điều khiển sinh trưởng tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ. IAA lập tức được Gautheret sử dụng vào môi trường nuôi cấy, kết quả thu được mới chỉ hạn chế ở mô tượng tầng của cây Salix. 5
7. Tiếp đó năm 1938 Nobecourt nhận được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota. Cùng năm 1938, White nuôi cấy được mô tượng tầng của cây thuốc lá lai Nicotiana glauca x N.langsdorffi. Vào cuối thời kỳ này đã có những quan sát về sự phân hoá cơ quan rễ, lá trong mô nuôi cấy của cây cà rốt hoặc cây thuốc lá lai. Thành công quan trọng của thời kỳ này là đã xây dựng và sử dụng có kết quả một số loại môi trường bán nhân tạo, đồng thời phát hiện được vai trò của một số vitamin đảm bảo sự thành công đối với việc nuôi cấy cơ quan (rễ) và mô (tượng tầng) ở thực vật. 3. Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950 - 1960) Đại diện cho giai đoạn này là Miller, Skoog, Steward, Reinert. Giai đoạn phát sinh hình thái bắt đầu bằng công trình của Camus (1949) ghép chồi lên khối mô nuôi cấy và thấy quá trình phân hoá ống mạch xảy ra trong khối mô. Đây là tiền đề để nghiên cứu về sự điều khiển quá trình phân hoá tế bào trong khối mô nuôi cấy. Tiếp theo là công trình của Miller và Skoog (1956) tạo chồi thành công từ mô thuốc lá nuôi cấy. Trong giai đoạn này, Skoog đã phát hiện ra kinetin là một chất điều khiển quá trình phân bào (thuộc nhóm cytokinin) và phân hoá mầm chồi. 1958-1959 Steward à Reinert đã sử dụng nước dừa (có chứa các chất nhóm cytokinin) vào nuôi cấy tế bào cà rốt (Daucus carota) và đã thu được phôi từ nuôi cấy tế bào cà rốt. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn trong dịch lỏng được Muir (1953) xây dựng đối với tế bào của cây Tageter erecta và Nicotiana tabacum và Nickell (1956) nuôi được tế bào đơn của Phaseolus vulgaris trong dịch lỏng thông qua cấy truyền 4 năm liên tục. Như vậy, sau 50 năm giả thiết của Haberlandt được Muir chứng minh là đúng trong luận văn tiến sĩ của ông, Muir đã sử dụng tế bào Crown-gall một loại tế bào khối u thực vật và đã nuôi cấy thành công tế bào đơn. 1960 Bergmann đã phát triển kỹ thuật tế bào đơn lên một bước mới tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kỹ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đa thạch (cell platting) như trải tế bào vi sinh vật. 4. Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật 1959 Melchers sử dụng mô đơn bội của Antirrinum majus nghiên cứu tính biến động mức bội thể trong nuôi cấy và gây đột biến. 1967 Nitsch, 1968 Nakata và Tanaka tạo được cây đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra một triển vọng ứng dụng đơn bội vào công tác giống và nghiên cứu di truyền. 1960 Cocking tách được tế bào trần protoplast. 6
8. 1964 Guha và Maheswari tạo được cây cà độc dược (Datura innoxia) có bộ nhiễm sắc thể đơn bội từ nuôi cấy bao phấn. 1968 Niieki và Ono nuôi cấy thành công bao phấn và tạo được cây đơn bội ở lúa (Oryza sativa). 1971 Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xan thi. 1977 Melchers lai sôma thành công cây cà chua và cây khoai tây. 1985 cây thuốc lá mang gene biến nạp đầu tiên được công bố. Khái niệm transgenic plant trở thành phổ cập trong thuật ngữ công nghệ sinh học thực vật. 1994 giống củ cải đường mang gene kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà tại Nauy. Ở Mỹ có hàng trăm giống cây mang gene biến nạp đã được sản xuất chấp nhận. Thế nhưng cho đến nay những quan niệm và qui định về an toàn sinh học của các nước đang còn rất khác nhau, vì thế việc đưa cây trồng mang gene biến nạp vào sản xuất đại trà còn phụ thuộc vào trình độ khoa học và chính sách của từng nước. II. YÊU CẦU CƠ BẢN CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT 1. Phòng thí nghiệm Cần được bố trí theo sơ đồ sau: a) Buồng chuẩn bị: Được bố trí liên hoàn cho các khâu pha chế và bảo quản lạnh các dung dịch chất khoáng, vitamin ; pha chế và khử trùng (hấp ở nhiệt độ và áp suất cao) môi trường nuôi cấy; chuẩn bị sơ bộ mẫu vật trước khi cấy. Các thiết bị tối thiểu cần thiết là cân phân tích (10-3g), cân kỹ thuật (l kg), tủ hoá chất, tủ lạnh có ngăn lạnh sâu, máy đo pH, nồi khử trùng. b) Buồng cấy: Có thể lựa chọn các phương án sau: Buồng vô trùng Điều kiện tối thiểu là phải kín gió, được phủ kính hoặc ốp gạch men kính. Hàng ngày sau giờ làm việc tiến hành tiệt trùng bằng: - Dung dịch formol 5-10% phun thành sương mù. - Chiếu UV (254nm) trong 2-3 giờ. Như thế cũng chỉ đảm bảo cho thao tác 2-3 giờ, sau đó lại phải khử trùng từ đầu. Tủ cấy vô trùng Có thể tự thiết kế và đóng lấy theo dạng tủ cấy vi sinh, có 2 lỗ để luồn tay vào thao tác. Tủ cũng được khử trùng như buồng vô trùng bằng formol và đèn cực tím. Bàn cấy vô trùng Thiết bị lý tưởng là bàn cấy vô trùng làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác. Hiện nay 7
9. trên thế giới có rất nhiều hãng sản xuất loại bàn cấy vô trùng này để dùng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu , dịch vụ và sản xuất như y dược học, sinh học, điện tử Giá tuỳ theo chất lượng từng loại, nằm trong phạm vi 1.000 – 10.000 USD. c) Buồng nuôi cây Nhiệt độ Yêu cầu chính đối với buồng để đặt các bình nuôi cây là phải đảm bảo nhiệt độ ổn định trong khoảng 25oC. Có những loài cây yêu cầu nhiệt độ cao hơn, tuỳ theo mà bố trí thêm những tủ nuôi có chế độ nhiệt độ khác nhau cho thích hợp. Ở nước ta, để giữ được nhiệt độ 25oC nhất thiết phải sử dụng máy điều hoà nhiệt độ. Thông thường 1 máy công suất 1,5 KW đủ để giữ mát cho 15m2 hoặc 50m3 buồng nuôi. Ánh sáng Theo chế độ chiếu sáng mà chia ra thành: 1. Buồng tối liên tục (nuôi tạo mô sẹo, giữ mô sẹo). 2. Buồng sáng theo chu kỳ quang 12-16 giờlngày. 3. Buồng sáng liên tục. Tuỳ theo yêu cầu cụ thể của nuôi cấy mà bố trí việc chiếu sáng cho thích hợp ánh sáng trên dàn nuôi phải là loại ánh sáng có phổ gần như ánh sáng tự nhiên (230- 780 nm). Các loại đèn huỳnh quang ánh sáng trắng nói chung đều đáp ứng được yêu cầu trên. Cũng có những phát hiện cho thấy ánh sáng vùng cận tím (350-400 nm) có tác dụng kích thích sinh trưởng của thực vật nói chung, trong đó có cây nuôi cấy invitro. Cường độ ánh sáng trên dàn nuôi cây tối thiểu phải đạt 2000 lux (đo ở cự ly 25 - 30cm, tương đương mặt đáy của bình nuôi cây). Có hai cách bố trí nguồn sáng: 1. Trực tiếp trên mỗi tầng của giá hoặc tủ nuôi cây. Đèn mắc song song với mặt phẳng cần chiếu sáng. 2. Bên cạnh, đèn mắc vuông góc với mặt phẳng cần chiếu sáng. Cách này tránh được hiện tượng dàn nuôi bị đốt nóng do đèn vì nhiệt lượng do đèn sinh ra có lối thoát lên trên theo luồng khí đối lưu, nhưng cách mắc đèn này có nhược điểm là ánh sáng phân bố không đều, các bình nuôi phía ngoài nhận được cường độ chiếu sáng yếu hơn. Giá nuôi cây Được đóng bằng gỗ hay hàn bằng kim loại (sắt góc) thành khung. Kích thước thông dụng của khung cao 2000 mm, dài 1500-2000 mm, rộng 450 mm, chia thành 4 tầng, mỗi tầng cao 500 mm. Được lót bằng kính 4-5mm cho tiện lau chùi và không cản ánh sáng. 2. Một số thiết bị chính dùng cho nuôi cấy mô và tế bào thực vật a) Bình nuôi cấy Phải được sản xuất bằng thuỷ tinh trung tính, có khả năng chịu nhiệt tốt 200oC và áp suất 1,5 at. 8
10. Ống nghiệm nuôi cấy: Đáy tròn hay phẳng, kích thước tối ưu là 24 x 160mm hoặc 32 x 160mm. Miệng không có gờ. Đĩa petri: đường kính 70mm, cao 15mm hay đường kính 95mm, cao 15mm. Hiện nay địa petri chất liệu plastic đủ các chủng loại đường kính từ 30mm đầu 150mm đang được sử dụng thay thế chất liệu thuỷ tinh. Các loại đĩa này thường không chịu nhiệt, được tiệt trùng bằng chiếu xạ và chỉ dùng một lần. Bình tam giác: Loại 50, 100 và 250ml, miệng rộng hoặc miệng hẹp. Các loại bình nuôi dịch lỏng: - Bình cầu - Bình cầu chuyên dụng có nhiều nhánh phụ Hộp nuôi cấy: Một số hãng sản xuất loại hộp (kích thước 75x75xl00 mm) bằng nhựa trong chịu nhiệt có nắp đậy chuyên dụng để nuôi cây invitro. Dùng loại hộp này rất tiện lợi trong khi thao tác cấy và chuyển cây ra ngoài đất. Hiện nay đang lưu hành loại hộp nhựa hình khối lập phương 100x100x100 mm, miệng tròn, rộng ở bên hông. Khi nuôi có thể xếp chồng lên nhau, đỡ không gian và che chắn nhau. Trong nhân giống công nghiệp các loài cây rất tiện lợi. Chai nuôi cấy: Một số loại chai miệng rộng thường dùng trong công nghiệp thực phẩm, có nắp đậy xoáy bằng hợp kim nhôm không rỉ hoặc gần đây người ta cải tiến dùng nắp nhựa trong suốt và chịu nhiệt có thể khử trùng. Loại chai này chủ yếu được đưa vào làm bình nhân giống cây invitro theo qui mô công nghiệp. b) Nút đậy Bông không thấm nước là loại nguyên liệu làm nút tốt nhất. Ở nước ta điều kiện vệ sinh phòng nuôi chưa cao nên dùng giấy quấn thành nắp đậy ngoài để chống bụi và chống ẩm. Giấy nhôm (hay gọi nhầm là giấy bạc) là vật liệu làm nắp đậy phổ biến nhất hiện nay. Ưu điểm của loại vật liệu này là không bắt bụi, tránh được hiện tượng nhiễm trùng do nút bông gây ra đối với những nuôi cấy dịch lỏng. Vật liệu nhôm có thể hơ trên lửa trực tiếp để khử trùng trong khi cấy. Gần đây loại vật liệu nhựa trong suốt, chịu được nhiệt độ cao, có thể khử trùng đang được sử dụng nhiều. c) Phương tiện và hoá chất khử trùng - Tủ sấy cho dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ sấy bảo đảm 160-200oC. - Nồi hấp tiệt trùng cổ khả năng chịu 1,2-1,5 at và nhiệt độ 120-130oC, sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy bằng hơi nước áp suất và nhiệt độ cao. - Dung dịch khử trùng hoá học để khử trùng bề mặt mẫu vật sẽ được nuôi cấy, thường dùng: Ca-hypochloride, Na-hypochloride, clorua thuỷ ngân (HgCl), nước brôm, oxy già (H2O2), cồn để khử trùng sơ bộ và đốt dụng cụ khi nuôi cấy. - Phễu lọc vô trùng loại microspore (0,2 µm) dùng cho những trường hợp bông được khử trùng bằng nhiệt độ cao. Ví dụ: môi trường nuôi cấy protoplast, dung dịch enzym hay dung dịch GA3 9
11. III. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG Vào thời kỳ Haberlandt tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy tế bào phân lập, những hiểu biết về nhu cầu dinh dưỡng khoáng của mô và tế bào thực vật còn rất hạn chế, đặc biệt là vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng hầu như chưa được khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công. Đến nay có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm những nhóm chất chính sau đây: 1. Các loại muối khoáng 2. Nguồn carbon 3. Vitamin 4. Các chất điều hòa sinh trưởng 5. Các nhóm chất bổ sung 6. Chất độn 1. Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dùng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô và tế bào thực vật được phân chia thành 2 nhóm theo hàm lượng sử dụng: nhóm đa lượng và nhóm vi lượng. a) Các nguyên tố khoáng đa lượng Bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (phần triệu = part per million), tức là trên 30 mg/l. Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mo và Ca. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng chưa rõ vai trò của chúng. - + Nitơ (N): Được sử dụng ở hai dạng NO3 và NH4 riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành ammonium thông qua hệ thống nitrat reductase (NR). Ammonium được tế bào thực vật đồng hoá trực tiếp để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như amino acid. Điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng ammonium ( không có nitrat) thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hoàn toàn. Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi lớn của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi độ pH của môi trường. Cụ thể: Khi chỉ dùng nitrat, độ pH của môi trường tăng dần và khi chỉ dùng riêng ammonium, độ pH của môi - + trường giảm dần do tế bào hấp thu NO3 hoặc NH4 và thải ra môi trường loại lớn có hoá trị tương đương. Khi pH giảm thì quá trình trao đổi Fe của tế bào kém đi, kết quả là tế bào sinh trưởng chậm lại. Vì vậy hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat và ammonium dạng phối hợp, nhưng tuỳ theo đặc tính hấp thu nhỏ của loài cây đó mà phối hợp theo tỷ lệ thích hợp. 2- Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4 . Các dạng ion khác như SO3 hoặc SO2 thường kém tác dụng, thậm chí còn độc. Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về phospho rất cao. Phospho là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử acid nucleic. Ngoài ra 10
12. - 2- khi phospho ở dạng H2PO4 và HPO4 còn có tác dụng như một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy. b) Các nguyên tố vi lượng Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm. Đó là Fe, B, Mo, Cu, Zn, Ni, Co. Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Thí nghiệm với sắt đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy Fe được dự trữ trong nhân rất nhiều. Thiếu Fe làm giảm lượng RNA và giảm sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng lượng DNA và amino acid tự do. Kết quả là giảm phân bào Fe thường tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi, phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào. Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrat hoặc với EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). Từ các phức chất này Fe được giải phóng trong một phạm vi pH khá rộng. Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino acid tự do và DNA tăng lên, nhưng lượng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào. Bo (B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là loại mô sẹo xốp, mọng nước, kém tái sinh. Molypden (Mo): Là ion đóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat reductase, như vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật. 2. Nguồn cacbon Mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là saccharose. Nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3 %, cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi, có khi xuống tới 0,2% (chọn dòng) và tăng lên đến 12% (nhằm gây cảm ứng stress nước). Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay được đưa vào môi trường nuôi cấy (glucose cho nuôi cấy protoplast và maltose cho nuôi cấy bao phấn lúa). Các loại đường khác như fructose, raffinose, lactose, galactose cũng đã được thử nghiệm nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt. Các dạng polysaccharide như tinh bột, pectine, dextrine cũng có thề dùng nuôi cấy. Tuy nhiên, những loại tế bào được nuôi trên môi trường chỉ có chứa một trong các polysaccharide trên nhất định phải thể hiện khả năng thuỷ phân thông qua các enzyme như amylase chẳng hạn. Có những chủng tế bào nuôi cấy giải phóng ra môi trường chứa tinh bột khá nhiều amylase. Chuyển chúng lên môi trường chỉ chứa saccharose, lượng amylase thải ra giảm ngay, nguyên nhân chính do các promotor của gen amylase chịu tác động khống chế của saccharose. 11
13. Các loại rượu như glycerin cũng có thể được tế bào sử dụng. Manitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast vớ chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu. Các loại rượu một lần rượi ethanol, methanol ít hiệu quả, còn propanol và butanol thì rất độc. Axit hữu cơ thường không phải là nguồn cacbon thích hợp cho tế bào thực vật nuôi cấy. Thí nghiệm với folic acid, succinic acid, pyruvic acid và keto glutaríc acid chỉ đạt 15% sinh trưởng so với saccharose. 3. Vitamin Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả năng tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B. a) Vitamin B1 (Thiamin): Là một chất bổ sung rất cần cho môi trường nuôi cấy. Khi khử trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ cao, B1 bị nhiệt phân thành pyrimidin và thiazol là hai cấu tử của B1, nhưng tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp chúng lại thành phân tử B1. Vì vậy không nhất thiết phải khử trùng bằng phương thức khác như lọc. b) Vitamin B2 (Riboflavin): Có thể tiệt trùng bằng phương pháp nhiệt, nhưng lại dễ bị ánh sáng phân huỷ. Đối với nuôi cấy sáng chỉ dùng nồng độ 0,01 ppm, nhưng đối với nuôi cấy trong tối có thể tăng lên 10-50 ppm. c) Vitamin B6 (Pyridoxin, Adernin): Là tiền chất của pyridoxalphosphat - cofactor của các nhóm enzym như carboxylase và transaminase. Khi hấp ở nhiệt độ cao, phản ứng xảy ra: Pyridoxin + Phosphat → Pyridoxalphosphat. d) Myo Inositol (Bios I): Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, cụ thể là sinh tổng hợp polygalacturonic acid và pectine. Inosit là chất bền vững khi khử trùng. Thường được sử dụng ở nồng độ cao 100 ppm. Khi phân tích thành phần của nước dừa, người ta thu được inosit trong một phân đoạn trung tính. e) Biotin (Bios II): Cần thiết cho phân bào của một số loại mô. Chỉ sử dụng ở nồng độ rất thấp 0,001-0,01. f) Pantothenic acid (Bios III, Vit. B5): Được sử dụng để làm thành phần của coenzym A. 4. Các hỗn hợp chất tự nhiên Các nhà sáng lập của ngành nuôi cấy mô thường sử dụng môi trường dinh dưỡng rất đơn giản gồm muối khoáng và đường. Ngày nay người ta khẳng định rằng lại môi trường đơn giản như vậy không đủ để cho tế bào sinh trưởng bình thường. Vì vậy thành phần môi trường ngày càng phong phú, đầy đủ và phức tạp hơn. Người ta đã sử dụng một số hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như: a) Nước dừa: Từ 1941 được sử dụng để nuôi phôi của Datura và 1949 nuôi của Daucus. Kết quả phân tích thành phần của nước dừa từ non đến già của Tulecke và ctv (1961) cho thấy, trong nước dừa có: 12
14. - Amino acid tự do: Đạt nồng độ từ 190,5 ppm đến 685 ppm trong nước dừa tuỳ theo tuổi của quả tính từ non đến già. Khi hấp ở nhiệt độ cao chỉ còn 70 ppm. - Amino acid dạng liên kết có trong protein và peptid - Axit hữu cơ - Đường - RNA và DNA Ngoài ra nước dừa còn chứa các hợp chất quan trọng đối với tế bào nuôi phân lập như: - Myo Inositol - Các hợp chất có hoạt tính auxin - Các cytokinin dạng glycoside b) Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): Thành phần hoá học chưa được phân tích kỹ, chủ yếu chứa một số đường, vitamin và một số chất có hoạt tính điều khiển sinh trưởng. c) Dịch chiết nấm men (Yeast Extract: YE): Với dịch nấm men, White (1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn. Thành phần hoá học của dịch nấm men ít được chú ý phân tích. Chủ yếu chứa: đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, khoáng. Tác dụng của YE với rễ tốt, nhưng với mô sẹo không rõ ràng. d) Dịch thủy phân casein [Casein Hydrolysae (CH)]: Được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô tế bào thực vật, chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung acid amin. e) Hỗn hợp amino acid nhân tạo: Dựa trên những kết quả phân tích các hỗn hợp chất tự nhiên trên, nhiều tác giả đã đề ra những công thức pha chế hỗn hợp acid nhân tạo để bổ sung vào môi trường dinh dưỡng. Kết quả sử dụng các hỗn hợp này còn rất khác nhau: Có thể yêu cầu acid amin của từng loại tế bào rất khác nhau. Trong môi trường lỏng để nuôi mô sẹo lúa và môi trường tái sinh cây lúa từ mô sẹo prolin là một thành phần quan trọng. 5. Các chất điều hòa sinh trưởng Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hòa sinh trưởng. Những chất điều hòa sinh trưởng đó thuộc các nhóm sau: a) Auxin Được gọi là hoóc môn sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, nhưng cũng làm tăng phân bào. Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: 1. Indolylacetic acid (IAA) tồn tại trong tự nhiên 2. Naphthylacetic acid (NAA) 3. 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D) 4. Indolylbutyric acid (IBA) 13
15. Riêng IAA là auxin tự nhiên, còn lại NAA, IBA và 2,4-D là các auxin nhân tạo. Thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm phận tử của chúng nên các enzym oxy hoá auxin (auxinoxidase) không có tác dụng. Kinh nghiệm sử dụng auxin trong nuôi cấy mô: lúc đầu sử dụng nồng độ cao, sau thấp hơn để tránh tình trạng mô bị "say" và nhiễm độc. Hình 1: Cấu trúc phân tử các loại auxin tự nhiên (IAA, H.5.la) và tổng hợp (IBA, H.5.1b ; IBA, H.5.1d và 2,4-D, H.5.1c); các loại cytokinin (KIN,H.5.1e; BAP, H.5.1g; Zeatin, H.5.1f; giberellic acid (GA3, H.5.1h) và absicic acid (H.5.1i) dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 14
16. b, Cytokinin (hormone phân bào): Lần đầu tiên được Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong một thí nghiệm chiết xuất acid nucleic bị sơ suất. Đó là những cấu tử của nucleic acid bị phân huỷ thành. 3 loại cytokinin chính thường được dùng trong nuôi cấy mô là: Kinetin là sản phẩm được phát hiện đầu tiên, có cấu trúc phân tử là: 6-(2- furfuryl)-aminopurin (H.5.1e). Kinetin được phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc lnucleic acid mới sau khi hấp ở nhiệt độ cao hay đun sôi. Trong cơ thể sống có thể không có kinetin tồn tại. Sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào (do đó có tên là kinetin). Kinetin thực chất là một dẫn xuất của base hữu cơ adenin, như vậy có thể coi đây là một chất "nhân tạo". Trong tự nhiên có tồn tại một hoóc môn phân bào không? Letham là người đầu tiên đã phân lập tinh chế và cho kết tinh thành công hoóc môn phân bào tự nhiên đó từ nội nhũ đang ở dạng sữa của hạt ngô. Hợp chất cytokinin tự nhiên đó được gọi là zeatin (zea = ngô). Zeatin cũng là một dẫn xuất của adenin. Công thức hoá học của zeatin là: 6- (4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl) aminopurin (H.5.1f). Trong thực tiễn nuôi cấy, người ta chỉ dùng zeatin trong những trường hợp đặc biệt vì quá đắt mà thường sử dụng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo. Đó là: 6-Benzylaminopurin (BAP) Hoạt lực của BAP (H.5.1g) cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác động của nhiệt độ cao. c) Gibberellic acid: Được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm hoóc môn này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. 1926 thì phát hiện được bệnh đó là do loài nấm Gibberlla fujikuroi gây ra. Đến những năm 30 thì mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau Chiến tranh thế giới thứ hai, năm 1950 người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật. Tới nay đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3 (H.5.1h). Trong đời sống thực vật, gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như: - Sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi - Phát triển của hoa - Làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật Nhưng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, tác động của gibberellic acid chưa thật rõ ràng. Nhiều tác giả có sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một loại môi trường chuyên dụng nào đó. d, Absicic acid (ABA) 15
17. ABA thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng có công thức hoá học nêu trong hình 5.1i. Abscisic acid có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định. 6. Chất độn - Thạch (Agar) Là một loại polysaccharid thu được từ một số loài tảo (chủ yếu là tảo hồng Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam (Glacia sụp.). Được sử dụng làm chất đệm cho môi trường dinh dưỡng rắn lại. Ở 80oc thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái sol và Ở 40oc trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nước của thạch là 6- 12g thạch/l lít nước. 7. Nước Nước pha môi trường cấy phải là loại nước hoàn toàn sạch ion. Thông thường người ta sử dụng nước cất 2 lần và tốt nhất là sử dụng hệ thống cất nước thuỷ tinh. 8. Độ pH của môi trường Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy đối với mỗi loại môi trường nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu. Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thường là 5,5-6,0. Sau 4 tuần nuôi cấy đạt được 6,0-6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính axit cao như axit amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH (dùng 1 M Tris càng an toàn để làm tăng hoặc HCI loãng để làm giảm pH môi trường về 5,5-6,5. Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần trọng lượng môi trường nhỏ thì việc chỉnh độ pH là bắt buộc. IV. MỘT SỐ LOẠI MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN Thành phần cơ bản của một số loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật được trình bày trong bảng 5.1. Sau đây là một vài gợi ý mang tính nguyên tắc trong khi sử dụng các loại môi trường khác nhau - Môi trường MURASHIGE-SKOOG (MS): Là một trong những loại môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm. Tới nay có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962 (bảng 5.1, cột MS). - Môi trưởng ANDERSON: Là loại môi trường chuyên dùng cho việc nhân giống vô tính các cây thuốc họ Rhododendron (Mẫu đơn). Nồng độ các loại muối 16
18. khoáng dùng trong môi trường này chỉ thấp bằng nửa so với trong môi trường MS (bảng 5.1, cột A). Loại môi trường này cũng được dùng cho một số loài cây thân gỗ nhỏ. - Môi trường GAMBORG: Là loại môi trường được thử nghiệm đầu tiên cho cây đậu tương, nhưng cũng được dùng nhiều trong nhân giống vô tính và đặc biệt là trong tách và nuôi tế bào trần (bảng 5.1, cột G). - Môi trường nuôi cấy phong lan: Trên cơ sở các công thức môi trường VACIN và WENT, môi trường KNUDSON hoặc LINDEMANN, hãng Sigma đã đưa ra một số công thức môi trường nuôi cấy phong lan, ví dụ môi trường V (bảng 5.1 cột V) cho các loài Cymbidium hoặc môi trường Phytamax cho phong lan nói chung (bảng 5.1, cột P). - Môi trường CHU (N6): Là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa và cây hoà thảo (bảng 2.1, cột N6). 17
19. Bảng 2.1: Thành phần một số loại môi trường thông dụng dùng trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật T Thành phần (mg/l) MS A G V P N6 K T Muối khoáng 1 Ammonium nitrate 1650, 400, 134,0 - 825,0 - 600,0 2 Ammonium sulfate 0 0 - 500, - 463,0 - 3 Boric acid - - 3,0 0 3,1 1,6 3,0 4 Calcium chloride 6,2 6,2 113,2 - 166,0 125,3 453,0 5 Calcium phosphate tribasic 332,2 332, - - - - - 6 Cobalt Cloride.6H2O - 2 0,025 200, 0,012 - 0,025 7 Cupric sulfate.5H2O 0,025 - 0,025 0 5 - 0,025 8 Ethylene diaminetetraacetic 0,025 0,02 - 0,012 acid, 2Na.2H2O 5 37,26 - 5 37,26 37,26 9 Ferric tatrate.2H2O 37,26 0,02 - - - 10 Ferrous sulfate.7H2O - 5 27,8 - 37,26 27,8 27,8 11 Magnesium sulfate 27,8 122,1 28,0 - 90,35 146,5 12 Manganese sulfate 180,7 74,5 10,0 - 27,8 3,33 10,0 13 Molypdic acid (Na2).H2O 16,9 - 0,25 122, 90,35 - 0,25 14 Potasium iodide 0,25 55,7 0,75 1 8,45 0,8 0,75 15 Potasium nitrate 0,83 180, 2500, 5,07 0,125 2830, 1900, 16 Potasium phosphate 1900, 7 0 8 0,415 0 0 17 monobasic 0 16,9 130,5 - 950,0 400,0 170,0 18 Potasium chloride - 0,25 - - 85,5 - 300,0 Zine sulfate.7H2O - 0,3 2,0 525, - 1,5 2,0 8,6 480, 0 5,5 0 250, 330, 0 6 - - - 8,6 Các chất hữu cơ và vitamin 19 Glycine 2,0 - - - - 2,0 - 20 Thiamine.HCI 0,4 0,4 10,0 0,4 1,0 1,0 - 21 myo Inositol 100,0 100, 100,0 - 100,0 100,0 - 22 Pyridoxine HCI 0,5 0 1,0 - 0,5 0,5 - 23 Nicotinic acide 0,5 - 1,0 - 0,5 0,5 - 24 MES - - - - 1000 - - 25 Peptone - - - - 2000 - - - Các chất điều khiển sinh 26 trưởng 18
20. 27 Adenine Hemisulfate 80,0 28 6-Dimethylaminopurine 2,0 29 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid 2,0 30 Indole-3-acetic acid 0,5 alpha-Naphthaleneacetic acide 0,5 6-Benzylaminopurine 2,0 32 Saccharose (g/l) 30,0 30,0 30,0 20,0 20,0 20,0 20,0 33 Agar (g/l) 8,0 8,0 8,0 8,0 pH 5,6 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 19
21. V. KHẢ NĂNG NUÔI CẤY CỦA CÁC LOẠI MÔ VÀ TẾ BÀO Về nguyên tắc, mọi loại tế bào của một cơ thể thực vật đều còn lưu giữ được tính toàn năng, có nghĩa là vẫn còn khả năng nuôi cấy thành công. Tuy nhiên trong thực tiễn các loại tế bào và loại mô khác nhau thì có biểu hiện rất khác nhau về triển vọng, nuôi cấy thành công. Một nguyên tắc cơ bản được tổng kết là càng gần trạng thái tế bào phôi bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu. Như vậy, tế bào và mô của phôi non là có triển vọng nhất, sau đến là tế bào của các đỉnh sinh trưởng ở trạng thái hoạt động (chồi đỉnh ngọn, đầu rễ) hay ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). Cũng rất gần phôi là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non. Các tế bào của mô tượng tầng (cambium) cũng là nguồn mẫu vật nuôi cấy rất lý tưởng. Hình 5.2. Trình bày sơ đồ sử dụng các loại mô và tế bào vào các kỹ thuật nuôi cấy khác nhau và triển vọng ứng dụng thực tiễn của chúng. Chương III PHỤC TRÁNG VÀ TẠO CÂY SẠCH BỆNH I. THIỆT HẠI KINH TẾ DO BỆNH VIRUS THỰC VẬT Trong sản xuất nông nghiệp, thiệt hại kinh tế hàng năm do các nguồn bệnh nói chung (nấm, vi khuẩn, tuyến trùng ) và virus nói riêng rất lớn. Ví dụ, bệnh virus Tungro phát triển trên cây lúa, năm 1971 đã cướp đi nửa triệu tấn thóc của nhân dân Philipine. Bệnh virus khảm đã làm cho năng suất lúa mì, đại mạch ở các nước châu Âu (Anh, Pháp) và Mỹ giảm tới 20-30%. Nhìn chung mức độ gây hại và tính nghiêm trọng của bệnh virus thể hiện ở các nhóm cây khác nhau. Đối với cây hàng năm, sự thiệt hại thể hiện qua việc giảm năng suất hoặc gây mất mùa toàn bộ trong một vụ. Đối với các cây lâu năm, thân gỗ (cam, chanh, mận, lê, táo ), bệnh virus không những làm giảm chất lượng và năng suất ngay đối với cây bị nhiễm bệnh, mà còn là nguy cơ cho các cây khoẻ những năm sau. Đặc biệt, đối với các cây nhân giống vô tính, bệnh virus lây lan nhanh, dễ phát triển thành dịch gây hại nghiêm trọng hơn cả. Virus không thể phòng chống, tiêu diệt bằng xử lý các chất hoá học như những bệnh vi khuẩn, nấm và sâu bọ. Cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây trồng một cuộc sống bình thường khoẻ mạnh. 21
22. II. NGUYÊN LÝ LÀM SẠCH VIRUS VÀ DUY TRÌ TÍNH SẠCH BỆNH Danh từ làm sạch virus chỉ đúng về nội dung của công việc. Đó là việc phải giải phóng các thực vật bị nhiễm virus khỏi virus. Ở đây chỉ đề cập tới các cây trồng nhân giống vô tính vì phương thức nhân giống này là nguyên nhân truyền bệnh từ thế hệ này sang thế hệ khác. Vì vậy biện pháp làm sạch bệnh virus luôn phải kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh. Cả hai biện pháp nằm trong phạm vi phục tráng giống, người ta gọi là biện pháp giữ sạch bệnh. Bên cạnh hai nhiệm vụ là duy trì đặc tính giống và tính đồng đều của giống, nhiệm vụ chủ yếu của công tác phục tráng giống là cung cấp được tập đoàn cây bố mẹ và hạt giống sạch virus. Kết quả việc làm sạch virus thu được là sạch hay ít virus phụ thuộc rất nhiều vào ý thức trách nhiệm của người nghiên cứu. Kinh nghiệm thực tế cho hay, những biện pháp phục tráng giống có hiệu quả là biện pháp được thực hiện một cách triệt để và có trách nhiệm. Do vậy làm virus được coi là mục tiêu của công tác phục tráng giống. Bên cạnh xử lý nhiệt và xác định tính sạch bệnh, các phương pháp để thu được cây sạch virus bao gồm chủ yếu vẫn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Đương nhiên kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ở đây được thực hiện theo một mục đích khác nên phức tạp và tốn kém hơn là trong nhân giống vô tính. Vì thế người ta phân biệt rõ giữa nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong công tác phục tráng giống nói chung và làm sạch virus nói riêng. Mục đích của người bảo vệ thực vật trong nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy mô, phân biệt rõ với những người làm công tác duy trì giống. Đối với người làm công tác bảo vệ thực vật, yêu cầu lớn nhất là làm sạch virus. Trong thực tế điều đó hầu như không thể đạt được. Vì vậy phải kết hợp nhiều biện pháp để đảm bảo kết quả. Xử lý nhiệt nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và xác định (thử) virus phải được thực hiện theo một chu trình kín. Các nhà duy trì giống đòi hỏi phải có những cá thể thực sự sạch virus, để rồi thông qua phương pháp nhân invitro có thể nhân thành số lượng cây bất kỳ mà không bị tái nhiễm. Các nhà sinh lý thực vật rất quan tâm đến phương pháp nhân giống invitro (Murashige, 1974. Pierik, 1975). Ở đây lý do chính khiến các nhà sinh lý thực vật quan tâm là việc làm sạch virus đối với cây trồng. Vì lý do kinh tế người ta chỉ giới hạn việc nhân giống invitro ở những cây trồng mà đối với chúng các phương pháp cổ điển để nhân nhanh những giống mới hoặc làm sạch virus không thực hiện được. Phương pháp nhân giống invitro loại trừ được nguy cơ tái nhiễm và vì thế nó tỏ ra ưu việt hơn các phương pháp cổ điển. Tuy vậy theo kinh nghiệm thực tiễn, các cây trồng được nhân giống invitro vẫn còn mang ít nhiều tác nhân gây bệnh. Gần đây có nhiều công trình nghiên cứu xử lý hoá chất để góp phần nâng cao hiệu quả sản xuất cây sạch bệnh (Tomlinson, 1982). Như vậy để loại bỏ virus, người ta kết hợp các giải pháp: - Xử lý nhiệt và hoá chất - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chọn lọc bằng phương pháp thử virus. 22
23. III. KỸ THUẬT LÀM SẠCH VIRUS 1 Xử lý nhiệt Đây là biện pháp làm sạch bệnh có cơ sở thực tiễn. Những cây mía bị bệnh cho năng suất cao hơn khi ngâm trong nước nóng. Nhiều nghiên cứu cho thấy dùng khí nóng thuận lợi hơn đối với đa số cây trồng vì chúng chịu đựng tốt hơn và virus bị loại dần dần. Nhưng hiểu biết về cơ chế làm sạch bệnh bằng xử lý nhiệt còn chưa đầy đủ. Giả thiết chung là virus bị ức chế sinh sản ở 39 – 40oc. Quá trình sinh trưởng của thực vật ở nhiệt độ cao cũng bị ức chế nhưng ở mức độ thấp hơn và vì vậy những bộ phận sinh trưởng nhanh thường là sạch bệnh hoặc nghèo virus. Nhiều nghiên cứu cho thấy, cơ thể thực vật được bảo tồn ở trạng thái tối thích trong thời gian dài ở nhiệt độ cao. Chu kỳ quang thích hợp cho xử lý nhiệt cao là 16 h /ngày. Tuy vậy cần thận trọng và chọn thời gian thích hợp cho từng loại cây, nhiệt độ cần được kiểm tra liên tục, ẩm độ cần giữ ở 50%. Cơ chế của quá trình này (theo Kassamis, 1957) là khi ở nhiệt độ cao, quá trình tổng hợp bị ngừng nhưng vẫn diễn ra sự phân giải chất trong virus. Như vậy, khi xử lý ở nhiệt độ 40oc, mô phân sinh ở cây vẫn phát triển trong khi virus ngừng sinh sản do sự sao chép nhân RNA và DNA của chúng bị phá vỡ. Các đỉnh meristem do vậy có khả năng không chứa virus. Do việc xử lý ở nhiệt độ cao có ảnh hưởng đến cây và mẫu cây, thời gian và nhiệt độ xử lý phải được chọn lọc thích hợp cho từng loại cây và từng loại virus. Ví dụ: Để loại virus cuốn lá ở khoai tây, củ khoai tây được xử lý ở 40oc, 4 giờ. Đôi khi kết hợp 2 loại xử lý mang lại hiệu quả cao hơn. Chẳng hạn với virus khảm ở thuốc lá, đầu tiên xử lý ở nhiệt độ 40oc, 16 tiếng, sau đó ở 22oc, 8 tiếng. Tỷ lệ cây sạch bệnh thu được trong trường hợp này cao hơn so với khi xử lý 40oc với thời gian 20h (Walkey và Freeman, 1977). Ngoài ra nhiệt độ thấp cũng có tác dụng ức chế loại bỏ một số virus. Moskovers (1973) đã thu được cây khoai tây sạch virus A và Y bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có xử lý ở nhiệt độ 5 - 15oc. Ở điều kiện thích hợp hoa cúc có khả năng chịu nhiệt 38oc trong thời gian nửa năm; tiếp theo là hoa anh túc cũng chịu được thời gian khá dài, hoa thuỷ tiên chịu được nhiệt độ 34oc trong thời gian 4 - 6 tuần. 2. Nuôi đỉnh sinh trưởng Limasset và Cornnel (1949) chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952). Thực tế này đã được ứng dụng để làm sạch virus bằng cách tách đỉnh sinh trưởng ở điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy chúng thành cây hoàn chỉnh. Việc phân lập đỉnh sinh trưởng có kích thước 0,01 – 0,1mm rất khó khăn (Hollings và Storie, 1964). Qua đó tính sạch bệnh của mẫu vật nuôi cấy bị 23
24. giảm xuống nhưng tốc độ tái sinh cây tăng lên và đó chính là phương pháp được ứng dụng trong thực tiễn. Để thu được cây sạch bệnh không nhất thiết phải có đỉnh sinh trưởng hoàn toàn sạch các phần tử virus mà nó được hoàn thiện trong quá trình phân hoá của các tế bào chưa phân hoá. Vì vậy trong thực tiễn phải giới hạn nồng độ virus và khối lượng mô phân hoá ở mức nhất định nếu cần có cây sạch virus. Việc phối hợp xử lý nhiệt với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp thuận lợi bởi vì thông qua xử lý nhiệt, quá trình sinh sản của virưs trong chồi ngọn bị ức chế mạnh và thông qua quá trình phân hoá đỉnh sinh trưởng, tính sạch virus sẽ được đảm bảo với xác suất cao. đây không đề cập tới vấn đề chọn các môi trường thích hợp. Thông thường người ta sử dụng môi trường của Murashige và Skoog, Buys, White và Heller. Theo quan điểm lý thuyết và kinh nghiệm thực tiễn, người ta thu được những kết quả khác nhau. Trong từng phòng thí nghiệm nếu việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được thực hiện trên quan điểm sản xuất lớn thì cần chú ý những điểm sau đây: đảm bảo độ đồng nhất của giống trong tất cả các khâu nuôi cấy, đảm bảo tốc độ sinh trưởng nhanh và đều đối với số lượng đỉnh sinh trưởng lớn, đồng thời kết quả đưa cây ra đất cũng cần phải được đảm bảo. Các đỉnh sinh trưởng cần được nuôi sau khi phân lập ở các buồng nuôi cấy hoàn toàn khống chế từ mặt khí hậu ở nhiệt độ 22oc và 6h Chiếu sáng ở 1 .000 - 3.000 lux. Ngoài mô phân sinh đỉnh, một số mô và tế bào khác cũng được nuôi cấy để tạo cây sạch bệnh, bao gồm mô sẹo, protoplast và mô cơ quan sinh sản. Một số công trình nghiên cứu đã thu được những cây khoẻ mạnh từ mô sẹo thuốc lá bị nhiễm bệnh khảm virus (Mori, 1977). Nếu đem khối mô sẹo tế bào thuốc lá kiểm tra xét nghiệm thì thấy có khoảng 30 - 40% tế bào bị nhiễm bệnh. Như vậy trong khối mô sẹo nhiễm bệnh xuất hiện những vùng mô sạch bệnh. Điều này có thể giải thích là sự nhân, sao chép virus chậm hơn sự phân chia tế bào (Svobodva, 1965). Nuôi cấy tế bào trần để thu cây sạch bệnh được Shepard (1975) thực hiện trên cây khoai tây. Từ protoplast của lá bị nhiễm virus X, ông đã tái sinh được các cây khoai tây sạch bệnh virus X; trong tổng số 4140 cây, có 7,5% là cây sạch bệnh. Việc nuôi cấy mô từ hoa để tạo cây sạch bệnh được áp dụng có kết quả đối với cây có múi, vì có một số virus không lan truyền qua hạt. Phôi tâm và túi phôi đã được sử dụng có kết quả trong việc tạo ra những cây cam sạch bệnh (Navarro và Juarcz, 1977). 3. Xử lý hoá chất . Nói chung xử lý hoá chất không thể coi như một phương tiện để loại bỏ virus khỏi cây trồng. Các chất hoá học thường dùng để ức chế phát triển các triệu chứng và sự nhân nhanh, lây lan của virus (Tomlinson, 1982). Chúng không trực tiếp kìm hãm hoạt động của virus mà làm tăng khả năng đề kháng của cơ thể thực vật (Antonin và ctv, 1981). Các chất riboside (virazole hoặc ribavirin) có công thức 2,4 24
25. Triazole - 3 - carboxamide đã làm tăng tỷ lệ cây sạch bệnh lên đáng kể, giúp ích thực sự cho các kỹ thuật khác loại bỏ virus có hiệu quả hơn. Chất ribavirin là đồng phân của guanosin có phổ hoạt động kháng virus rộng đối với cả hai loại virus (virus chứa RNA và DNA) (Sidwell và ctv, 1972). Ngoài ra, nó còn có những hoạt động ức chế quá trình sao chép, nhân nhanh của virus trong toàn bộ cơ thể của cây trồng. Tất cả các chất hoá học có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của virus đã được Kartha (1986) tập hợp trong bài tổng quan và ông chỉ ra rằng chúng là đồng phân của purine và pirimidine, amino acid, hóoc môn sinh trưởng thực vật và các kháng sinh. Trong quá trình nuôi cấy mô, tế bào, sự có mặt của các chất này (virazole) có thể duy trì trạng thái vô trùng lâu hơn, giúp cho việc loại bỏ virus có hiệu quả hơn (Hansen và Lane, 1 985). Gần đây người ta còn sử dụng một nhóm các chất khác, như arabinoside hoặc vidarabine để làm sạch virus trong quá trình nuôi cấy mô phân sinh ở khoai lang và cho kết quả tốt (Stone và ctv, 1978). IV. KIỂM TRA, XÉT NGIIIỆM VIRUS Không phải tất cả các loại cây sau quá trình xử lý phối hợp nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đều sạch virus, vì vậy cần phải tiến hành xét nghiệm. Khoảng thời gian từ lúc tái sinh cây cho đến khi xét nghiệm cần đạt được 4 đến 6 tháng để các thể virus còn tồn lại trong thực vật đạt được nồng độ cần thiết cho việc xét nghiệm đảm bảo độ chính xác. Xét nghiệm virus trong khuôn khổ của qui trình làm sạch virus hoàn toàn khác quá trình phân tích virus ở một cây trồng. Đối với việc làm sạch virus thì độ chính xác của phương pháp thử virus trong mỗi loại xét nghiệm mang ý nghĩa quyết định, cho nên mỗi một cây cần được xét nghiệm theo nhiều phương pháp khác nhau, trong đó cần chú ý tới các phương pháp xét nghiệm nhưng loại virus phổ biến và có ý nghĩa kinh tế. Đối với việc phân tích virus một loại cây trồng, người ta chỉ chú ý tới số lượng cũng như sự phân loại của chúng. Độ nhạy cảm của mỗi phương pháp xét nghiệm có vai trò thứ yếu. Sau đây là một số phương pháp xét nghiệm virus được ứng dụng cho các loại cây hoa: 1. Xét nghiệm bằng cây chỉ thị Dùng dịch ép của thực vật cần được xét nghiệm gây nhiễm trên một cây chỉ thị thích hợp hoặc dùng phương pháp ghép có thể chứng minh được sự có mặt của virus. Chỉ sau khi thực hiện phương pháp thử này, kết luận về bệnh virus mới thực sự đảm bảo tính chính xác của nó. Phương pháp thử bằng cây chỉ thị luôn được coi là phương pháp xác định đầu tiên và cũng là phương pháp nhạy cảm nhất, tuy nhiên kết quả xét nghiệm cũng còn phụ thuộc các yếu tố khác nữa. Trong trường hợp xét nghiệm hàng loạt, công việc gây bệnh nhân tạo đối với số lượng cây chỉ thị là 10.000 đến 100.000 trong thời gian nhiều tháng thì độ chính 25
26. xác của phương pháp giảm đi và không thể tiến hành các thí nghiệm lặp lại. Tuổi của cây trồng cũng như trạng thái sinh lý của chúng trong các mùa khác nhau của 1 năm ảnh hưởng rất nhiều đến tính chính xác của phương pháp xét nghiệm. Vì lý do đó trong trường hợp phải xét nghiệm hàng loạt, phương pháp dùng cây chỉ thị không đảm bảo bằng phương pháp miễn dịch. Nếu chỉ xét nghiệm một số lượng cây vừa phải, ví dụ một nghìn cá thể thì phương pháp dùng cây chỉ thị không cần thay bằng phương pháp khác vì công việc có thể tiến hành trong một thời vụ thích hợp. Triệu chứng bệnh lý có thể quan sát được sau 3 đến 5 ngày song thông thường là sau hai tháng, vì vậy cần một diện tích nhà kính khá rộng trong một thời gian tương đối dài, chi phí cho xét nghiệm bằng phương pháp cây chỉ thị thường đắt gấp 3 lần so với phương pháp huyết thanh. 2. Phương pháp thử huyết thanh Phương pháp xét nghiệm này dựa trên cơ sở khả năng liên kết giữa các kháng thể với kháng nguyên đặc trưng riêng của nó. Kháng nguyên là một chất protein có khả năng tạo ra một phản ứng miễn dịch khi chúng được đưa vào cơ thể động vật. Hầu hết virus thực vật đều có tác dụng như những kháng nguyên. Khi chúng được đưa vào một cơ thể động vật thích hợp (như thỏ), chúng sẽ kích thích sản xuất ra những kháng thể. Những kháng thể này có thể được dùng trong các xét nghiệm huyết thanh (Van Regenmontel, 1982). Phản ứng kết tủa xảy ra khi có sự kết hợp giữa một kháng nguyên và một kháng thể thích hợp. Trong các phản ứng như vậy, kháng nguyên và kháng thể liên kết với nhau tạo thành những thể huyền phù không tan (latex). Phản ứng miễn dịch này chính là nguyên lý của những phương pháp xét nghiệm huyết thanh. Dựa vào hình dạng, kích thước, sự phân bố của sản phẩm phản ứng, người ta có thể phân biệt được các loại xét nghiệm sau: - Xét nghiệm căn cứ vào sự kết tủa của các thành phần kháng nguyên và kháng thể xảy ra trong môi trường lỏng. Phương pháp thử này thường được dùng để so sánh sự khác nhau của các virus. Mối quan hệ giữa các virus được xác định thông qua mức độ pha loãng của kháng huyết tương trong phản ứng kết tủa. Chuẩn độ cho một kháng huyết tương là mức độ pha loãng cao nhất của kháng huyết tương đó đủ để thực hiện phản ứng miễn dịch với một loại virus đồng dạng. a) Xét nghiệm miễn dịch khuếch tán, được thực hiện trong thạch. Sản phẩm phản ứng liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ khuếch tán đều qua thạch (Akers và Steere, 1967). Miễn dịch khuếch tán dùng để nhận biết một loại virus gọi là Radial diffusion (Mancini và ctv, 1965). Trong miễn dịch khuếch tán kép (gel double-difusion), kháng nguyên và kháng thể được chứa trong những hố thạch và chúng sẽ khuếch tán lẫn vào nhau (Ouerlory, 1968), hình6.1. 26
27. b, Phản ứng ngưng kết (Agglutination test) Trong phản ứng này, kháng thể hoặc kháng nguyên được bám vào những tiểu phần lớn hơn. Do vậy khi phản ứng xảy ra, phức chất giữa Ab- Ag có kích thước lớn hơn, dễ quan sát. Phương pháp này sử dụng để phát hiện nhanh virus lây nhiễm khoai tây trên đồng ruộng (Van Slogteren, 1955). Giá thể để kháng nguyên hoặc kháng thể bám có thể là Polystyrene hoặc vi khuẩn (Staphylococas aureus). c) Miễn dịch liên kết với enzyme [Enzyme linked immuno sorbent assay (ELISA)] Trong phương pháp này độ nhạy cảm của phản ứng miễn dịch để phát hiện được virus tăng lên do sự liên kết của phức chất Ab - Ag với enzyme nền. Do sự bổ sung thêm chất enzyme nền, màu của phản ứng thể hiện rõ hơn, cho phép người ta định lượng được phản ứng miễn dịch và phát hiện virus ở nồng độ rất thấp (Voller và ctv 1976). Ngày nay người ta đã sử dụng ELISA để nhận biết nhiều loại virus thực vật khác nhau (Koening và Paul, 1983). Một số trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế đã điều chế những bộ xét nghiệm ELISA khác nhau: CIP sản xuất bộ ELISA để nhận biết các virus X, Y, M Ở khoai tây, virus chân chim ở cây khoai lang và virus da cóc ở cây sắn. Tổ chức nghiên cứu chuối thế giới (INBAP) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm ELISA để phát hiện virus chùm ngọn ở cây chuối. Rõ ràng phương pháp xét nghiệm huyết thanh ngày càng được cải tiến và sử dụng để phân biệt nhiều loại virus. Những ưu điểm chính của phương pháp là: chính xác, nhanh (kết quả thu được chậm nhất sau 48 giờ), chi phí cho xét nghiệm thấp nhu cầu về hoá chất, điều kiện thực nghiệm đơn giản, dễ kiếm. 3. Xét nghiệm bằng lai phân tử Lai phân tử acid nucleic là một kỹ thuật mới phát triển gần đây, được áp dụng để nhận biết, phát hiện vật liệu di truyền của virus. Đây là phương pháp phân tích có độ nhạy, tính đặc trưng cao để nhận biết RNA hoặc DNA của virus (Abu, Samah và Raudles. 1983). Kỹ thuật bao gồm những nội dung sau: sản xuất DNA tương đồng dựa trên các chế phẩm acid nucleic của virus. DNA tương đồng này sẽ được gắn với các 27
28. đồng vị phóng xạ 3H hoặc 32p, và sau đó cho kết hợp với dịch chiết từ cây bị nhiễm bệnh. Trước đó, acid nucleic trong dịch chiết được tách ra và phân giải qua sắc ký trên thạch và cố định trên màng nitrocellulose. Biểu đồ chất đồng vị phóng xạ được sử dụng để phát hiện các cặp lai dương tính. DNA tương đồng được sản xuất đặc trưng cho từng loại virus và kỹ thuật này cho phép sàng lọc một số lượng lớn mẫu bệnh. 4. Xét nghiệm bằng kính hiển vi điện tử Kính hiển vi điện tử với sự hoàn chỉnh về kỹ thuật và sau khi ứng dụng phương pháp nhúng (Brandes, 1957) có thể đưa vào xét nghiệm hàng loạt với số lượng mẫu vừa phải. Khi chứng minh virus hình đũa và hình sợi ở hoa phong lan (Corbert, 1 974), ở hoa huệ (Asges và ctv, 1974) kính hiển vi điện tử đã mang lại những kết quả đáng tin cậy đối với xét nghiệm hàng loạt. Khô khăn chủ yếu hiện nay là chi phí cho thiết bị và số lượng mẫu được xét nghiệm bị hạn chế, đồng thời loại virus được chứng minh cũng chỉ là loại hình đũa và hình sợi. Nếu virus tồn tại dạng cầu thì rất khó phát hiện vì nó khá giống các cơ quan tử của tế bào thực vật bình thường. 5. Kiểm định là phương pháp duy nhất để duy trì tính sạch bệnh. Trồng vật liệu sạch bệnh thu được bằng phương pháp chọn lọc qua kiểm định có thể coi là giải pháp tối thiểu chóng mang lại kết quả nếu không tiến hành các phương pháp khác được. Virus stunt của hoa cúc không mất đi hoặc hạn chế dần khi xử lý nhiệt. Vì vậy chỉ dùng phương pháp chọn lọc bằng xét nghiệm ghép lên cầy chỉ thị. Để bảo đảm số lượng giống cần thiết, hàng năm ở Đức phải xét nghiệm 100000 cây ghép. Để sử dụng một cách tối ưu chi phí lớn này, người ta đưa xét nghiệm bằng phương pháp ghép vào một qui trình khép kín. Với việc thực hiện một cách liên tục biện pháp này trong vòng 6 năm người ta đã hạ tỷ lệ nhiễm virus stunt của hoa cúc từ 30% xuống 0% (Oertel, 1976). 6. Kiểm định là khâu cuối cùng trong qui trình làm sạch bệnh Nếu trong qui trình làm sạch virus có thể áp dụng được kỹ thuật xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì việc xét nghiệm virus chỉ còn là biện pháp kiểm tra cuối cùng của quá trình làm sạch virus. Như vậy sẽ có mâu thuẫn với mục đích làm sạch virus nếu người ta sử dụng 50% cây trong tập đoàn cây trồng bị bệnh làm vật liệu ban đầu và coi chúng là những cây có phẩm chất tốt. Một mặt thông qua cải tiến phương pháp xét nghiệm đưa độ chính xác của phương pháp lên cao, người ta phải luôn tính đến số lượng virus bảo tồn ở nồng độ tối thiểu mà phương pháp xét 28
29. nghiệm không chứng minh được. Vì vậy theo kinh nghiệm thực tế cần tiến hành xét nghiệm theo phương thức sau: Đưa vật liệu ban đầu vào xử lý nhiệt trong một thời gian dài để làm sạch những virus mẫn cảm nhiệt độ, sau đó dùng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Sau từ 4 đến 6 tháng kể từ ngày nuôi cấy mới bắt đầu xét nghiệm. Thời gian này đủ để tạo virus bảo tồn trong cây đủ nồng độ cho phép chứng minh được. Người ta hạn chế xét nghiệm ở số lượng 20000 - 30000 cây, ở hoa cúc đó là loại virus stunt, virus khảm, virus asperenie, virus B. Những cá thể được xác định là sạch bệnh là nguồn vật liệu ban đầu để cung cấp cây mẹ cho sản xuất. Khoảng 5 - 10% số cá thể này được tách riêng ra thành tập đoàn nhân để các nhà tạo giống cải tiến tính chất theo ý muốn và độ thuần chủng (đồng nhất) của giống. Người ta kiểm tra những cá thể này bằng tất cả các phương pháp xét nghiệm virus hiện có. Với hoa cẩm chướng người ta đã kiểm tra bằng phương pháp huyết thanh các loại virus carnation woltle, carnation latent và bằng cây chỉ thị nhằm loại trừ những virus hiếm sinh sản không có biểu hiện nhận biết được. Những cây xác minh được là khoẻ, người ta tiến hành ươm cành rồi sau đó đưa vào xử lý nhiệt, tiếp theo người ta nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và cuối cùng kiểm tra bằng xét nghiệm virus. Đó là toàn bộ qui trình làm sạch virus khép kín. Phương pháp làm sạch virus trong qui trình khép kín đã được thực hiện nhiều năm ở xí nghiệp cây con thuộc tỉnh Dresden của Đức đối với hoa cúc, cẩm chướng (Oertel, 1978). V. DUY TRÌ TÍNH SẠCH VIRUS Vấn đề có tầm quan trọng đáng kể và cũng là vấn đề quyết định cuối cùng đối với thực tiễn nông nghiệp liên quan tới thời gian duy trì được cây trồng sạch virus đối với thực tiễn sản xuất thì cây coi là bị bệnh chỉ khi nào năng suất giảm xuống. Hiện nay trong sản xuất nông nghiệp và trồng cây ăn quả, vấn đề này còn chưa được giải quyết thoả đáng. Việc sản xuất dòng elite trong qui trình sản xuất khoai tây giống kéo dài nhiều năm, trong khi đó nguy cơ tái nhiễm thông qua yếu tố truyền bệnh luôn tồn tại và phụ thuộc vào điều kiện khí hậu. Trong ngành trồng hoa tình hình thuận lợi hơn nhiều. Hiện nay Ở CHLB Đức, với tập đoàn nhân của hoa cúc và cẩm chướng người ta duy trì được tính sạch bệnh trong một năm rưỡi, trong khi chỉ cần một năm là có thể thay được hoàn toàn tập đoàn giống. Vì vậy vấn đề nêu ra ở trên có thể được trả lời tóm tắt như sau: Khối lượng và chất lượng vật liệu có sẵn ban đầu xác định khả năng sản xuất một vụ không bị giảm năng suất do bệnh virus. Giảm năng suất có thể xuất hiện nếu nguồn giống sạch virus bị nhiễm sớm. Đối với khoai tây thì nhiễm chủ yếu do các yếu tố truyền bệnh sống ở điều kiện tự nhiên. Đối với cây hoa thì tái nhiễm xảy ra khi đưa cây giống sạch bệnh vào các xí nghiệp sản xuất bị nhiễm sẵn. Có thể nói rằng, trong ngành trồng hoa qui trình làm 29
30. sạch virus được coi như mô hình phương pháp. Cũng qua đó chúng ta nhận thấy phương pháp làm sạch virus không phải là biện pháp chữa bệnh một lần mà là một quá trình phức tạp đối với cây trồng đã bị bệnh từ trước. Người ta có thể so sánh bệnh virus của thực vật nhân giông vô tính như bệnh xã hội của con người, không thể chữa bằng thuốc men mà phải thay đổi cả thói quen sinh hoạt. Ở các xí nghiệp công nghiệp sản xuất giống cây trồng có thể gọi các tiến bộ khoa học kỹ thuật là một loại stress, khi mà từ một cây cúc mẹ một năm cho 100 cây ươm, trước kia chỉ thu được 15 và một cây ươm chỉ cần 11 ngày để ra rễ, trước đây cần 21 ngày. Để tạo điều kiện cho các xí nghiệp sản xuất công nghiệp cây giống thu được những thành tích to lớn hơn nữa thì việc đầu tư hàng năm cho công tác chống bệnh virus trở nên cần thiết. Trong trường hợp nhân giống vô tính invitro thì việc làm sạch virus càng phải được coi là điều kiện trước tiên. VI. QUY TRÌNH PHỤC TRÁNG Phục tráng, sản xuất cây sạch bệnh bao gồm nhiều giai đoạn, sử dụng kết hợp nhiều công nghệ. Để vật liệu sạch bệnh phân bố đến người nông dân phải qua nhiều công đoạn, chúng cần được thực hiện một cách nghiêm ngặt (hình 6.1). VII. MỘT SỐ KẾT QUẢ PHỤC TRÁNG, TẠO CÂY SẠCH BỆNH 1. Cây lương thực - Khoai tây: Khoai tây là cây trồng ở châu Âu, được nhân giống vô tính và bị virus phá hoại nhiều nhất. Trong thời gian qua việc làm sạch virus ở khoai tây mới được ứng dụng một cách chậm chạp trong quá trình duy trì giống. Người ta chú ý nhiều nhất tới việc tạo ra các cây giống sạch bệnh bằng qui trình thử virus và trồng ở các khu vực sạch bệnh để tránh tái nhiễm thông qua các loại rệp lá. Qui trình được sử dụng chủ yếu là giết các cây cỏ có thể truyền bệnh vào củ khoai tây(klinkowski và schmelzer, 1974). Tài liệu cho biết qui trình này có thể nâng cao hiệu suất thông qua xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Quá trình xử lý nhiệt ở nhiệt độ giữa 32 và 38oc trong thời gian 7 ngày đến 7 tuần và sau đó nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có thể loại trừ được virus A, xoăn lá, x và y trong khi virus M và S cũng được giảm đi một cách đáng kể (Kassanis, 1950; Thomson, 1956-1958; Quak, 1961; Kassanis và Varna, 1967; Stace-smith và Mellor, 1968; Mc Donald, 1973; Pett, 1974a; Wang và Huang, 1975). 30
31. Hình 3.1 Các ảnh hiển vi điện tử của đỉnh sinh trưởng khoai tây có độ lớn từ 80- 100mm cho thấy chúng vẫn còn chứa trong tiêu bản tới 12 thể virus x (Krylova và ctv, 1973). Tuy vậy sau quá trình phân loại từ các đỉnh sinh trưởng đó vẫn thu được một tỷ lệ phần trăm nhất định các cây sạch virus. 2. Cây thức ăn gia súc Để sản xuất hạt giống cây trồng làm thức ăn gia súc, ví dụ cỏ Tam Điệp, cần phải có cây bố mẹ sạch bệnh virus để tránh sự lây bệnh thông qua hạt giống và đảm bảo thu được năng suất hạt cao. Người ta nghiên cứu nhiều phương pháp làm sạch virus khác nhau. Xử lý lạnh và nuôi chồi ngọn mang lại tốc độ sinh trưởng cao, nhưng chỉ sạch virus từng phần. Nếu xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thì thu được phần lớn các cây sạch virus (Frosheiser, 1969. Barnett và ctv, 1975). 3. Hoa huplông 31
32. Các loại bệnh virus ở hoa huplông thường làm giảm năng suất một cách đáng kể (Schmidt, 1966). Tiến hành chọn lọc bằng mắt thường (Schmidt và ctv, 1972) xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Gipperp và ctv, 1974) cải tiến dần tình trạng sạch bệnh. Adams (1975) giải phóng 66% cây khỏi virus hop - mosaic và latent bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, sau đó làm sạch virus prumis necrotic ringspot bằng xử lý nhiệt trong thời gian 10 ngày. 4. Cây thực phẩm - Cây rau: Hầu hết các loại rau, trừ một vài trường hợp ngoại lệ, đều được nhân giống bằng hạt. Truyền bệnh virus qua hạt vừa mới được chứng minh ở loại virus gây bệnh khảm ở xà lách và đậu (đậu ăn quả trắng hoặc xanh), vì vậy ở những cây trồng này cần phải chọn lọc những cây làm giống và thông qua biện pháp trồng trọt cách ly để tạo ra hạt giống sạch virus. Đối với các loại virus gây bệnh ở cây rau khác thì quá trình lây lan thường xảy ra do cơ học hoặc do rệp lá, vì vậy cần có biện pháp vệ sinh đồng ruộng và phòng trừ tác nhân truyền bệnh. Ở một số cây rau nhân giống vô tính (nấm rơm ), cần sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoặc xử lý nhiệt để giải phóng virus (Holmes, 1965. Paludan, 1971. Mori, 1971. Walkey, 1968). Đối với nấm rơm, có thể làm sạch bệnh bằng phương pháp xử lý nhiệt (Gandy và Hollings, 1962) và trong thời gian gần đây người ta đã tạo được phương pháp miễn dịch trong agar gel (Meyer và Smith, 1976). Ngoài ra ở những cây trồng dùng để sản xuất hạt của chúng, có thể nhân giống vô tính qua nhiều năm, ví dụ như súp lơ người ta cũng cần phải có vật liệu sạch bệnh virus ban đầu. Thông qua nuôi cấy mô, người ta tạo được một vài trăm cây và thông qua biện pháp thử virus đã thu được 3220 cây sạch bệnh (Walkey và ctv, 1974). 5. Cây ăn quả Cây ăn quả thường bị virus phá hoại một cách mạnh nhất. Các thể virus gây bệnh không những lan truyền khi nhân giống vô tính mà cả khi nhân giống bằng hạt. Ngoài ra cây ăn quả thường là cây lâu năm, luôn luôn chịu tác động của các tác nhân truyền bệnh, vì thế chúng rất dễ bị nhiễm bệnh. Việc chứng minh virus nhiễm ở cây ăn quả gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa thời gian ủ bệnh dài và khả năng chống chịu cao gây nhiều khó khăn cho việc làm sạch virus cây ăn quả, vì vậy cần tiến hành công tác chống virus gây bệnh ở cây ăn quả một cách liên tục. Vì việc xử lý nhiệt đối với các cây thân gỗ và việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng của chúng khó khăn hơn nhiều so với các loại cây thân cỏ cho nên từ lâu người ta đã sử dụng phương pháp thử để tìm ra các vật liệu sạch bệnh ban đầu (Kegler, 1964a). 32
33. Quá trình xử lý nhiệt đối với cây ăn quả đến nay thường được tiến hành chủ yếu ở những đoạn cành mà các mắt của chúng sẽ được sử dụng để ghép sau này. Theo tài liệu tổng hợp của Nyland và Coheen (1969) về vấn đề xử lý nhiệt ở các cây thân gỗ có thể loại trừ được 4 loại virus ở cây anh đào, 1 loại virus ở cây mận, 7 loại virus ở cây táo, 2 virus ở cây nho đất (nho tây), 6 virus ở cây đào và 2 virus ở phúc bồn tử. Thành công trong xử lý nhiệt ở cây ăn quả không bao giờ đạt được 100% ở mỗi đối tượng ít nhất còn lại một, thậm chí một số loài còn tới 4 virus không bị mất hoạt tính khi xử lý nhiệt. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ở cây ăn quả tới nay mới chỉ được sử đụng ở những đối tượng sau: Dâu chua (Putz, 1974), dâu chua quả đỏ (Yones và Vine, 1968), dâu chua quả đen (Zatyko và ctv, 1974-1975) và cây táo (Walkey, 1972). Thực tiễn cho thấy, đối với cây ăn quả (cây thân gỗ) việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng còn gặp khó khăn hơn bởi vì khả năng tái sinh của chúng yếu hơn so với cây thân cỏ. Các thí nghiệm trong những năm sắp tới chắc chắn sẽ nêu ra những kết quả mới, ví dụ: người ta đang nghiên cứu ở đối tượng Promis amygdalor (Mehra, 1974) và Promis serrulata (Boxus và Quoirin, 1974). 6. Cây hoa Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân giống vô tính thường bị bệnh virus Oertel, 1962) trong khi bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch ở những cây hoa có nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thuỷ tiên ). Hiện nay người ta bắt đầu nuôi cấy các loại hoa khác, ví dụ như hài vệ nữ, hoa huệ, hoa layơn Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được sử dụng để làm sạch virus đối với hoa anh túc (Quak, 1957) và hoa cúc (Houings và Kassanis, 1957). Việc tạo cây sạch bệnh trong các xí nghiệp chuyên sản xuất hoa đã trở thành quen thuộc, trong những năm gần đây ở Hà Lan có những cơ sở của tổ chức trồng hoa chuyên môn nhận các loại vật liệu để làm sạch virus. Ở Anh cũng mới tổ chức một cơ quan như vậy gọi tắt là NTD (Lane, 1968). Ở Đức, xí nghiệp ươm cây con ở thành phố Dresden cũng nhận các loại hoa như cúc, hoa anh túc, hoa thuỷ tiên để xử lý nhiệt và làm sạch virus. Các điều kiện được nêu ở chương V để làm sạch virus đối với cây hoa thường được thực hiện dễ dàng, vì thế ở những loại cây trồng này việc làm sạch virus thường được thực hiện có kết quả nhất. 33
34. Chương IV NHÂN GIỐNG INVITRO I. MỤC ĐÍCH CHUNG Nhân giống invitro hay vi nhân giống (micropropagation) là một trong 4 lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật (bao gồm: Làm sạch virus; Nhân nhanh các giống cây trồng quí, Sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự nhiên và Cải lương về mặt di truyền các giống cây trồng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất. Trong chương này chủ yếu nói về lĩnh vực thứ 3 là nhân giống vô tính các cây trồng trong nông nghiệp, lâm nghiệp và y tế, trong đó kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ các mục đích sau: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gene quí hiếm làm vật liệu cho công tác tạo giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gene quí của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm cây thân gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch bệnh virus. - Bảo quản các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài cây giao phấn trong ngân hàng gene. II. DÒNG VÔ TÍNH Khái niệm dòng vô tính (Clone) được Weber (1903) đề cập tới như là một phần mô, cơ quan sinh dưỡng được tách ra từ một cơ thể thực vật có khả năng tái sinh thành công. Shull (1912) cho rằng "Clone" là một nhóm cá thể có kiểu gene tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính. Stout (1940) coi Clone là một đơn vị nhân tạo, bao gồm các cá thể đồng nhất về mặt di truyền, chúng được nhân vô tính từ một cá thể. Ngày nay kỹ thuật nuôi cấy invitro cho phép từ mô, tế bào có thể tái sinh một số lượng lớn cây, chúng được xem như một Clone. Các phương pháp nhân giống vô tính bằng giâm cành, chiết ghép, tách cây con, củ từ cây mẹ đều là những kỹ thuật tạo ra các dòng vô tính. III.CÁC PHƯƠNG THỨC NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO 34
35. Phương pháp nhân giống invitro đã bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống vô tính cổ điển như dâm cành, dâm chồi, chiết, ghép, tách dòng một kỹ thuật tiến bộ với những ưu thế chính sau đây: - Tính khả thi rộng Ví dụ: Kỹ thuật dâm cành chỉ có thể ứng dụng thành công ở một số cây trồng nhất định vì với kích thước 5-20cm khả năng tạo rễ phụ của vùng mô tượng tầng gần vết cắt hoặc khả năng đánh thức chồi phụ vẫn bị các vùng tế bào lân cận và toàn bộ phần còn lại của đoạn dâm khống chế. Nếu tiến hành nuôi cấy mô với kích thước 5-20mm, tức là làm giảm thể tích khối mô xuống 103 lần thì rõ ràng mối tương tác giữa các tế bào và các loại mô đơn giản đi rất nhiều, hiệu quả tác động của các biện pháp nuôi cấy sẽ phải cao hơn. - Tốc độ nhân giống cực kỳ cao. Hệ số nhân giống invitro thường đạt ở các loài cây khác nhau nằm trong phạm vi từ 36 đế 1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn. - Có tiềm năng công nghiệp hoá cao. Nuôi cấy trong điều kiện ổn định môi trường dinh dưỡng, về chế độ chiếu sáng nhiệt độ là tiền đề để hoàn toàn thoát khỏi sự lệ thuộc mùa vụ vẫn xảy ra trong sản xuất nông nghiệp và có thể công nghiệp hoá hoàn toàn công việc sản xuất cây giống trong một dây chuyền sản xuất liên tục. Sau đây là một số phương thức nhân giống vô tính invitro: 1. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh trưởng. Trong thực tế, mẫu nuôi cấy được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hành nuôi cấy với mục đích làm sạch virus cho cây trồng. Thường sẽ gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công các đỉnh sinh trưởng riêng rẽ như vậy. Phổ biến nhất ở các đối tượng như phong lan, dứa, mía. Đỉnh sinh trưởng được tách với kích thước từ 5-10mm, nghĩa là toàn bộ mô phân sinh và một phần mô xung quanh. 35
36. Hình IV.2. Sơ đồ nhân giống invitro cây dứa sợi Agave Tương quan giữa độ lớn chồi tách tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi được biểu hiện như sau: Độ lớn , tỷ lệ sống và tính ổn định  Độ lớn , tỷ lệ sống và tính ổn định  Nhưng xét hiệu quả kinh tế nuôi cấy (thể tích bình nuôi, lượng dung dịch môi trường dinh dưỡng) thì: Độ lớn , hiệu quả kinh tế  Độ lớn , hiệu quả kinh tế  (Dấu  biểu hiện tăng và dấu  biểu hiện giảm) Do đó phải kết hợp được các yếu tố để tìm ra phương thức lấy mẫu tối ưu. Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầy đủ. Xét về nguồn gốc của các cây đó có 3 khả năng: - Cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn). - Cây phát triển từ chồi nách phá ngủ. - Cây phát triển từ chồi mới phát sinh. Tuy nhiên rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi phát sinh mới. Có hai phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy 37
37. a) Phát triển cây trực tiếp: Chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc nhưng có cả ở cây một lá mầm như dứa sợi (hình 7.2), mía. Ví dụ: Khoai tây (hình 7.1) Mầm (đỉnh sinh trưởng) Chồi nách  Cây. b, Phát triển cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorn) Chủ yếu gặp ở các đối tượng đơn tử điệp (một lá mầm) như phong lan, dứa, huệ. Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm có thể tiếp tục phân chia thành các protocorm mới hoặc phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bằng phương thức này, trong một thời gian ngắn người ta có thể thu được hàng triệu cá thể. Ví dụ: Lan "Hài vệ nữ" Cymbidium. Các đối tượng hoa lan Orchidaceae đã mang lại hiệu quả kinh tế đặc biệt cao. Sau những kết quả đầu tiên ở Cymbidium của Morel (1966), người ta đã thu được kết quả rất tốt ở 22 chi khác nhau của họ này. Sở dĩ nhân giống vô tính hoa lan đạt được thành công lớn và được ứng dụng rộng rãi như vậy là vì phong lan có phương thức sinh sản qua dạng dẻ hành (protocorm). Nhờ có phương thức nhân giống nhanh và rẻ tiền mà hoa Cymbidium vốn đắt trở nên có giá phải chăng và được nhiều người ưa chuộng. Những thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác. Lĩnh vực ứng dụng mới đây nhất cũng đã bắt đầu có kết quả là các cấy ăn quả và cây lâm nghiệp, trong đó có cây quí như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ đề Tổng số có trên 30 chi khác nhau đã được nuôi cấy thành công. Vì rằng các cây trồng rừng và cây ăn quả là những cây trồng lâu năm nên mọi chi phí trong nhân giống invitro đều có thể chấp nhận được. 2. Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công các bộ phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể sử dụng cho việc nhân giống invitro được. Các bộ phận đó là: - Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh - Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải - Cuống lá: Narcissus. . - Các bộ phận của hoa: xúp lơ, lúa mỳ - Nhánh củ: hành tỏi, họ hoa huệ Liliaceae, Iridaceae, Amaryllidaceae. Ở một số giống rau, người ta đã thành công và nhân giống bằng các bộ phận khác: - Hành: đoạn bẻ củ ( Debrgh và ctv, l976). - Bắp cả: đoạn rễ, đoạn thân, mảnh lá, lá mầm ( Bajaj và Nitsch, l975). - Măng tâ: đoạn mầm ( Kohler, l975). 38
38. - Xúp lơ: hoa tự ( Kohler, 1978). 3. Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà các cây cũng khá đồng nhất về mặt di truyền. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền. Để tránh tình trạng đó nhất thiết phải sử dụng loại mô sẹo vừa phát sinh, tức là mô sẹo sơ cấp, hy vọng sẽ thu được cây tái sinh đồng nhất. Thông qua giai đoạn mô sẹo có thể thu được những cá thể sạch virus như trường hợp của Kehr và Sehaffer (1976) thu được ở tỏi. Một phương hướng nhân giống vô tính nữa là tạo phôi soma từ tế bào mô sẹo. Cho tới nay mới thành công ở hai đối tượng đó là: - Cà rốt (Daucus carota) của Reinert (1959). - Thuốc lá (Nicotiana tabacum) của Lorz (1977). Tuy nhiên vẫn chưa có bằng chứng cụ thể về sự đồng đều của những cá thể này. Như vậy có 3 con dường tạo cây: - Mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh. - Mẫu mô phát sinh mô sẹo và mô sẹo tạo chồi. - Mẫu mô tạo mô sẹo từ tế bào đơn, mô sẹo phát triển phôi và từ phôi thu được cây hoàn chỉnh. IV. QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG INVITRO Cho tới nay việc sử dụng nhân giống invitro đã dược áp dụng cho rất nhiều loài cây (350 loài). Murashighe (1974) đã chia quy trình nhân giống thành 4 giai đoạn: 1. Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi. 2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro. 3. Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con. 4. Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên Hoa. lá, thân, củ, cuống lá, mô phân sinh. Hình 7.3. Quy trình nhân giống invitro 1. Giai đoạn I – Cấy gây Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau: - Tỷ lệ nhiễm thấp. 39
39. - Tỷ lệ sống cao. - Tốc độ sinh trưởng nhanh. Kết quả bước cấy gây này rất phụ thuộc vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ Ví dụ: Măng tây chồi ngọn Kohler.1975. Khoai tây mầm Morel.1952. Dứa chồi nách Paunethier. 1 976. Bắp cải mảnh lá Bimomillo.1975. Xúp lơ hoa tự Kohler.1978. Hoa Narcissus cuống hoa Seabrock.1976. Dưa (Cucurbita pepo) lá mầm Jelaska. 1 972. Geranium bao phấn Abo El-Nil. 1971 . Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: Theo White (1943), Heller (1953) hoặc Murashige và Skoog (1962). Chất hữu cơ: Đường saccharoza 1 - 6% Vitamin: B1, B6, inositol, nicotinic acid. Amino acid: Arg, Asp, Asp-NH2 Glu, Glu-NH2 Tyr. Hoóc môn: Auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D. Cytokinin: BAP, Kin, 2P. Gibberellin: GA3. 2. Giai đoạn II - Nhân nhanh Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc có cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là: - Phát triển chồi nách. - Tạo phôi vô tính. - Tạo đỉnh sinh trưởng mới. Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hoá cơ quan, đặc biệt là chồi như: - Bổ sung tổ hợp hoóc môn sinh trưởng mới (tăng kinetin giảm auxin). - Tăng cường ánh sáng 16 giờ/ngày tối thiểu 1000lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hoá mạnh (Weiss và Jaffe,1969). - Bảo đảm chế độ nhiệt độ 20-300C Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích. 40
40. 3. Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Giai đoạn này thường bị bỏ qua một cách thiếu căn cứ. Khi nghiên cứu về cấu trúc của lá cây khoai tây nuôi cấy invitro và so sánh với lá cây khoai tây trồng bên ngoài chúng tôi thấy chúng rất khác nhau. Cụ thể số lượng khí không cao hơn nhiều lần so với lá cây sống ngoài tự nhiên. Điều đó chứng tỏ phải tiến hành thích nghi dần dần cây nhân giống invitro với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi ở đây phải được hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thì cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi sau: - Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô. - Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng bị thối nhũn. - Cháy lá do nắng. V. NHÂN GIỐNG INVITRO VÀ VIỆC SỬ DỤNG GIỐNG ƯU THẾ LAI Trong chăn nuôi, việc sử dụng giống vật nuôi mang ưu thế lai ở thế hệ Fl đã trở thành biện pháp tăng năng suất quan trọng bậc nhất. Ở ngành trồng trọt, giống ưu thế lai mới chỉ được ứng dụng ở một số đối tượng như ngô, cà chua, lúa, cải dầu, bắp cải, hành tây, măng tây, đặc biệt là các giống hoa Sử dụng ưu thế lai không những làm tăng năng suất từ 20-40%, mà giống lai còn có đặc điểm là rất đồng đều so với giống bố mẹ. Tính đồng đều của giống là tiền đề quan trọng cho sản xuất theo phương thức công nghiệp. Ở xúp lơ chẳng hạn, phương thức sản xuất công nghiệp đòi hỏi phải thu hoạch toàn bộ diện tích bằng cơ giới vào một thời điểm. Điều này chỉ thực hiện được khá sử dụng giống ưu thế lai F1. Nếu dùng giống thuần chủng loại tốt thì vẫn phải thu hoạch làm 4-5 lần. Muốn sử dụng giống ưu thế lai F1, nhất định phải có giống bố mẹ thuần chủng. Nếu bảo quản giống thuần chủng theo phương thức tự phối thì không đảm bảo vì ở các giống rau họ Brassicaceae thường xuất hiện hiện tượng bất tự thụ. Vì vậy phương pháp nhân giống và bảo quản giống trong ống nghiệm đối với một số giống rau và giống hoa có một giá trị kinh tế cao. Vấn đề đặt ra hiện nay là phải nghiên cứu các qui trình nhân giống invitro tối ưu cho từng loại cây trồng và cải tiến qui trình đó để giảm tới mức tối đa các tốn kém về nhân công lao động trong các công đoạn nuôi cấy và đưa cây con ra ngoài đất. Đánh giá ưu thế lai: Ngô: lá dưới bắp thể hiện ưu thế lai rõ nhất. 41
41. Kê (mile): lá thứ năm thể hiện ưu thế lai rõ nhất. Petunia (mào gà): lá mầm thể hiện ưu thế lai tốt nhất. Nuôi cấy invitro cho phép đánh giá sớm ưu thế lai. Ví dụ: Trong chọn giống cây lâu năm như cao su, nuôi cấy invitro cho phép đánh giá sức sống của cây trước 5 năm. Cây cao su phát triển theo một chu kỳ nhất định không phụ thuộc vào mùa. Nhân giống cao su bằng phương pháp ghép So sánh sức sống của N. synvestris đồng hợp tử 1. Cây đồng hợp tử do tự thụ 9 thế hệ (T). 2. Cây lai giữa 2 dòng đồng hợp tử nhận bằng phương pháp đơn bội (Hi x Hj) 3. Cây đồng hợp tử thế hệ 1 bằng phương pháp đơn bội (Ho ). Ờ điều kiện tự nhiên T (Hi x Hj) Ho Ở nuôi cấy invitro T (Hi x Hj) Ho VI. NHÂN GIỐNG INVITRO VÀ CÁC ĐẠC ĐIỂM KHÔNG DI TRUYỀN (EPIGENETIC) Bên cạnh những đặc điểm di truyền ở thực vật, người ta còn phát hiện được hàng loạt đặc điểm hình thái và sinh lý không di truyền, đó là các đặc điềm pigenetic. Quá trình nhân giống invitro có ảnh hưởng gì tới các đặc điểm pigenetic này. 1. Hiện tượng các đặc điểm epigenetic được lưu lại Nghiên cứu nhân giống vô tính về cây Phyllanthus amarys (cây chó đẻ) cho thấy: Phyllanthus là một cây cỏ có thân thẳng đứng và cành ngang giống lá kép nhưng ở nách lá có hoa cho nên vẫn tạm coi như cành ngang. Công thức diệp tử ở thân đứng là xoắn ốc, nhưng ở cành ngang là tương đối so le: Ở nách có cành ngang chồi nách phát triển mạnh thành cành thẳng đứng như thân. Nếu cắt cành ngang để ươm thì sẽ thu được cành ngang dài hàng mét. Cành ngang phát triển vô hạn theo một chương trình "ngang" định trước. Nếu ươm cành thẳng thì sẽ thu được cây thẳng đứng. Như vậy mô phân sinh của cành khác mô phân sinh của thân và khi nhân vô tính các bộ phận khác nhau sẽ thu được các dạng cây khác nhau. Ở đây mô phân sinh đỉnh điều khiển mô phân sinh cành phát triền theo hướng ngang. Nếu cắt bỏ phân sinh đỉnh sớm thì cành ngang sẽ phát triển thành cành đứng. 42
42. Tế bào sinh trưởng đỉnh (organisator) điều khiển sự hoạt động của các tế bào khác (tương tự như ở động vật). Hiện tượng điều khiển hướng phát triển này có một ý nghĩa thực tiễn lớn lao. Các cây cà phê và ca cao cùng có đặc điểm sắp xếp cành tương tự như vậy, vì vậy khi tiến hành nhân giống vô tính các loài cây này phải chú ý đến hiện tượng điều khiển hướng phát triển như ở Phyllanthus. 2. Hiện tượng các đặc điểm epignetic không lưu lại Nhân giống vô tính invitro giống dứa Cayen không gai thông qua phân chia protocorm người ta thu được một tỷ lệ đáng kể các cá thể có gai. Bình thường trong kỹ thuật trồng dứa người ta sử dụng hom dứa có kích thước khá lớn 15-30cm. Đặc điểm không gai đã được chương trình hoá trong các đọt có kích thước lớn đó và vườn dứa trồng như vậy đều không có gai. Vì sao khi tách đỉnh sinh trưởng và nuôi cấy thành protocorm và cây dứa non thì gai lại xuất hiện? Có thể ở giai đoạn sinh lý trẻ của protocorm và quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phân lập mô phân sinh của những cây dứa non tương lai đã được giải phóng một phần khỏi ảnh hưởng của tổ chức điều khiển và vì thế chúng phát triển tự do theo đặc điểm có gai của thế hệ xa xưa. Hiện tượng tương tự chúng ta cũng bắt gặp ở trường hợp cây cam không gai: Khi gieo hạt hoặc nuôi cấy phôi soma trừ mô phôi tâm sẽ thu được những cá thể có gai. Vấn đề này hiện nay đang được quan tâm vì một số đặc tính chống chịu như chịu mặn, chịu bệnh, chịu lạnh vẫn thường là những đặc tính epigenetic và liệu thông qua nhân giống invitro các đặc tính đó có còn được giữ lại hay không? Chương V THỤ PHẤN VÀ NUÔI CẤY PHÔI INVITRO 1. Tính bất hợp của giao tử trước khi thụ tinh Trong tự nhiên, quá trình thụ phấn của thực vật thường xảy ra theo trình tự sau: Hạt phấn chín rơi lên núm nhụy nẩy mầm và tạo ra ống phấn. Ống phấn mọc dài xuyên dọc theo nhụy và tiếp cận túi phôi. Lúc này 2 nhân tinh tử đơn bội của hạt phấn thâm nhập vào túi phôi và thực hiện quá trình thụ tinh kép. Một tinh tử kết hợp với tế bào noãn đơn bội tạo thành hợp tử nhị bội sau phát triển thành phôi, tinh tử còn lại kết hợp với tế bào nội nhũ nhị bội tạo ra hộp bào nội nhũ tam bội. 43
43. Nếu một hạt phấn lạ rơi lên núm nhụy thì lập tức nhụy sẽ tạo ra một chất ức chế sự phát triển của ống phấn hoặc làm biến dạng ống phấn ngăn cản sự thụ tinh. Đó chính là tính bất hợp giao tử trước khi thụ tinh. 2. Tính bất hợp giao tử sau khi thụ tinh Trong một số trường hợp khác khi hạt phấn của loài lạ rơi lên núm nhụy, ống phấn vẫn mọc bình thường và quá trình thụ tinh xảy ra, nhưng hạt không phát triển được. Nguyên nhân chủ yếu là giữa nội nhũ và phôi đã hình thành một cơ chế ức chế sự phát triển của phôi. Đây là trường hợp hay gặp khi tiến hành lai xa (lai khác loài và khác chi). 3. Thụ phấn invitro Tính bất hợp của giao tử có thể vượt qua được bằng kỹ thuật thụ phấn trong ống nghiệm. Công việc này bao gồm tách bầu quả cùng với noãn ra và nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Hạt phấn được lấy và đặt lên đầu nhụy một cách khéo léo. Khi thụ phấn thành công, phôi sẽ sinh trưởng và phát triển trên môi trường nuôi cấy. Biện pháp này áp dụng cho những trường hợp phôi không phát triển bình thường hoặc cho những cây có hạt phấn ít và ống phấn phát triển chậm, tỷ lệ hạt phấn nảy mầm thấp. Điều kiện cơ bản là phải nuôi cấy thành công bầu quả hay noãn phân lập và chủ động điều khiển quá trình nảy mầm của hạt phấn trong môi trường nuôi cấy vô trùng. Như vậy sau khi thụ phấn thành công, phôi sẽ được nuôi ngay trên môi rường vô trùng. 1942: La Rue là người đầu tiên nuôi thành công hoa của nhiều loài nhưng quả lại không có hạt. 1951 Nitsch đã nuôi nụ cà chua và dưa chuột và lần đầu tiên thu được hạt có khả năng nẩy mầm. 1958: Maheshwari tách noãn và thụ tinh thành công cây thuốc phiện Papaver soniferum. 1966: Guha và Johri nuôi được quả hành để lấy hạt. 1975: Inomata thu được hạt tam bội Brassica pakonenusis x Br.sinensis bằng nuôi nụ quả. 1974: Beasley thành công trong việc phân lập noãn của nhiều loài cam chanh. Trên cơ sở những kết quả đạt được, người ta tiến hành thử nghiệm thụ phấn trong ống nghiệm, nghĩa là thực hiện quá trình tạo hợp tử không phụ thuộc vào cơ thể mẹ. Công việc gồm các bước. - Kích thích hạt phấn nảy mầm. 44
44. - Kích thích sinh trưởng ống phấn. - Nuôi noãn và thụ tinh noãn. - Nuôi hợp tử thành hạt. Một số tác giả đã thành công: - Kanta và ctv (1962) ở loài anh túc Papaver sonniferum. - Dulieu (1963) ở thuốc lá Nicotiana tabacum. - Zenktenler (1965) ở họ Caryophyllaceae. - Rangaswamy (1967) ở hoa mào gà Pentunia. Một thời gian dài phương pháp thụ phấn invitro chỉ thành công ở một số đối tượng thuộc họ Paparaceae, họ Caryophyllaceae và họ Solanaceae. Ở các họ này bầu quả chứa nhiều noãn nên tương đối dễ nuôi cấy. Ở họ hoà thảo Graminaceae bầu quả chỉ có một noãn rất khó nuôi cấy, đồng thời hạt phấn cũng khó kích thích nảy mầm. Sau gần 10 năm tìm tòi nghiên cứu người ta đã bắt đầu thu được kết quả mới trên đối tượng hoà thảo: Sladky và Havel (1976) bước đầu nghiên cứu trên cây ngô. Nitzsche và Hennig (1976) nuôi thành công bầu quả của Lobium thụ phấn Festuca. Glunewald (1976) thụ phấn invitro thành công noãn đại mạch (Hordeum) bằng hạt phấn của mạch đen (Secale) và lúa mỹ (Triticum). 4. Cứu phôi Trong một số trường hợp, sau thụ phấn phôi tiêu biến, không phát triển được. Nguyên nhân của tình trạng này có nhiều, nhưng chủ yếu là do nội nhũ không phát triển bình thường và không cung cấp đủ thức ăn cho phôi phát triển. Điều này có thể xảy ra trong lai cùng loài, nhưng chủ yếu là khi lai các loài khác nhau. Vì vậy, để thu được hạt lai trong những trường hợp này, người ta phải nuôi cấy nhằm cứu phôi sau khi thụ phấn được hoàn thành. Phôi non được tách ra và nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Thành công đã thu được trong nhiều trường hợp lai cùng loài: Bông, đại mạch, cà chua, lúa và khác loài: Đại mạch x Lúa mì, Tripsacum x Zea (Raghavan, 1977). Nuôi cấy phôi còn được áp dụng trong các trường hợp tự bất thụ. Một số loài cây nhiệt đới như chuối dại, khoai nước có khả năng sinh sản hữu tính nhưng hạt của chúng không nảy mầm. Do vậy, tách phôi và nuôi cấy chúng trong môi trường thích hợp dễ dàng thu được những cây con. Việc này có ý nghĩa trong việc chọn tạo giống. Laibach ( 1925) lần đầu tiên nuôi được phôi non của cây lai bất dục thành cây non khoẻ mạnh theo sơ đồ dưới đây: Linum perenna x L.austriacum. 45
45.  Fl bất dục (tạo được phôi nhưng không sống)  Phân lập phôi non, nuôi cấy invitro.  Cây non khoẻ mạnh. Một số cặp lai khác loài và khác chi thành công nhờ phương pháp nuôi cấy phôi: - Triticum x Secale  Tritical. - Hordeum x Secale (Brink và ctv, 1944). - Elyms x Triticum (Ivanovskaja, 1946). - Trisacum x Zea (Farquarharson, 1957). Trong đó có cây lai hữu thụ nổi tiếng Hordecale: Hordeum maritinum x Secale cereale (Dehue và ctv, 1977). 5. Một số khó khăn trong nuôi cấy phôi a) Môi trường dinh dưỡng: Các môi trường dinh dưỡng đang sử dụng hiện nay thường có áp suất thẩm thấu thấp hơn dịch noãn được nuôi cấy trên môi trường đó. Rất có thể môi trường không hoàn toàn thích hợp. Vì vậy người ta đang tìm cách sử dụng dịch chiết suất từ nội nhũ. Kruse (l974) đưa ra công thức "vú em" Môi trường dinh dưỡng + Nội nhu khỏe + Phôi lai Vai trò của nội nhũ khỏe cung cấp cho phôi lai những chất cần thiết. Cây cho nội nhũ có thế là những loài khác nhau của cùng một chi. b, Phát sinh mô sẹo: Khi nuôi phôi non của tổ hạt lai: Hordedum vulgare x Secale cerale, các tác giả (Clauss và Kunert, l977) thấy phôi phát triển thành khối mô sẹo. Điều này chỉ có thể giải thích được rằng mối tương tác giữa phôi và môi trường dinh dưỡng không bình thường như giữa phôi và nội nhũ. Dù sau đó có thể tái sinh được cây hoàn chỉnh từ khối mô sẹo thì cây tái sinh cũng sẽ mang những thay đổi vì mô sẹo thường không ổn định về mặt di truyền. Ternovsky và ctv (1976) đạt được một kết quả lý thú là thu được cây thuốc lá có tính chống chịu mới khi nuôi phôi từ hạt lai không nảy mẩm. 46
46. Chương VI NUÔI CẤY BAO PHẤN VÀ TẠO DÒNG THUẦN 1. Hiện tượng đơn bội của thực vật Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ biến là nhị bội 2n và tứ bội 4n. Như vậy mỗi đặc điểm di truyền ở những cơ thể này đều bị hai hay nhiều allen của một gene chi phối. Nếu đó là những cơ thể dị hợp tử, tức là các gene trong mỗi bộ gene nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính trạng (phenotyp) của gene đó hoàn toàn tuỳ thuộc vào tính trạng lặn hay trội của chúng quyết định. Vì vậy mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền các tính trạng phải là mức đơn bội hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng phải đồng nhất tuyệt đối. Haploidy là bộ nhiễm sắc thể đặc trưng của trạng thái bào tử của chu kỳ phát triển của cây khoả tử. Nó thể hiện sự sinh sản hữu tính bình thường. Thỉnh thoảng các tế bào đơn bội có thể phân chia và sinh trưởng tạo thành cây hoàn chỉnh, có số nhiễm sắc thể bằng 1/2 cây mẹ. Cây đơn bội thu được từ cây nhị bội gọi là monohaploid, từ cây đa bồi được gọi đơn giản là haploid. Thực tế có sự khác biệt về bản chất, ví dụ nếu xuất phát từ tetraploid thì được gọi là dihaploid, ở mức độ bội thể cao hơn gọi là polyhaploid (khác với polyplid). Ở thực vật, cây đơn bội được hình thành từ nhiều cách khác nhau. Hiện tượng parthenogenesis ở hoa cái, khi tế bào cái không được thụ phấn vẫn phát triển thành cây. Tương tự, ở hoa đực hiện tượng như vậy cũng xảy ra. Cây đơn bội còn xuất hiện khi phân hoá phôi. Trường hợp này có tần số quá thấp trong tự nhiên. Từ lâu các nhà di truyền và chọn giống cây trồng đã biết sử dụng trạng thái đơn bội của cây trồng để tiến hành nghiên cứu và thông qua đa bội hoá thể đơn bội đó để thu được các dạng đồng hợp tử tuyệt đối. Thông thường người ta có thể thu được đơn bội bằng hai cách: - Chọn lọc đơn bội xuất hiện ngẫu nhiên với tỷ lệ rất thấp. - Lai xa và sau khi một bộ nhiễm sắc thể thoái biến sẽ còn lại bộ nhiễm sắc thể đơn bội. Cả hai cách này mới chỉ thành công nhiều ở các cây trồng thuộc họ hoà thảo (Gramineae). Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro thông qua kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội đã là một lối thoát kỳ diệu đối với lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào nghiên cứu di truyền và tạo giống cây trồng. Với các thể bội của thực vật bậc cao người ta có thể sử dụng vào các nghiên cứu: - Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gene. 47
47. - Tạo đột biến ở mức đơn bội. - Tạo dạng đồng hợp tử tuyệt đối. 2. Phương pháp tạo cây đơn bội invitro a) Kỹ thuật nuôi cấy Nuôi cấy hạt phấn: Nuôi cấy hạt phấn thành công đầu tiên vào năm 1950 đối với hạt phấn cây khoả tử ở đáy ống phấn và tế bào sinh sản tạo thành mô sẹo. Guha Maheshawari ( 1964, Ấn Độ) đã nuôi cấy thành công hạt phấn cây bí tử tạo phôi và từ các phôi này đã cho cây con hoàn chỉnh. Đặc biệt năm 1968, Nizecki và Ocno đã nuôi cấy thành công hạt phấn lúa, thu được cây đơn bội, tạo ra một khả năng ứng dụng rất lớn cho công tác chọn tạo giống lúa. Có 3 phương thức nuôi cấy hạt phấn sau đây: 1. Nuôi cấy hạt phấn trưởng thành trên môi trường nửa cứng. Callus và cây con được phát sinh trực tiếp từ túi phấn. 2. Nuôi cấy túi phấn trong môi trường nước, hạt phấn giải phóng ra ngoài, phôi cây con tái sinh từ hạt phấn. 3. Nuôi cấy hạt phấn non. Kết quả thu được qua nuôi cấy túi phấn có thể là: mô sẹo, phôi, cây con. Nhiều khi trên cùng một thí nghiệm nuôi cấy một loại hạt phấn có thể thu được cả ba loại. Kết quả phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của hạt phấn và trạng thái sinh lý của cây cho phấn. Nhìn chung tỷ lệ hạt phấn, túi phấn cho kết quả rất thấp, khoảng 1-2% số hạt phấn, túi phấn được cấy. Dĩ nhiên là tỷ lệ này phụ thuộc vào bản chất kiểu gene và các chất điều hoà sinh trưởng được bổ sung vào môi trường, nhất là nhóm cytokinin BA, zeatin, kinetin, hoặc nguồn carbon cung cấp, glucoza, maltosa v.v Những môi trường chính sử dụng cho nuôi cấy túi phấn và phấn được tập hợp trong hai nhóm (xem phần phụ lục) Nhóm 1: Bao gồm muối khoáng, vitamin và đường. Thành phần môi trường này dùng chung cho cả hai giai đoạn: tạo mô sẹo và tái sinh cây con. Nhóm 2: Ngoài những thành phần trên, môi trường phải được bổ sung thêm các chất điều hoà sinh trưởng auxin, cytokinin với một tỷ lệ thích hợp, hoặc than hoạt tính và các axit amin khác như: glutamin, serin và asparagin. Những loài thực vật sử dụng môi trường nhóm 1 là: thuốc lá và cây họ cà độc dược. Những thực vật sử dụng môi trường nhóm hai là: lúa, lúa mì. Các phấn và túi phấn ở cây này tạo mô sẹo sau đó mới tái sinh cây đơn bội, hoặc 2n. b, Phương thức phát sinh cây đơn bội Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực (Androgenesis). 48