Bài giảng Ứng dụng vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm

Nội dung text: Bài giảng Ứng dụng vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm

1. Company LOGO II.II. ỨngỨng dụngdụng vivi sinhsinh vậtvật trongtrong bảobảo quảnquản thựcthực phẩmphẩm
2. CácCác kháikhái niệmniệm • Kiểm soát sinh học (biocontrol) • Vi sinh vật đối kháng (antagonistic microorganism) • Bảo quản bằng phương pháp sinh học (bio-preservation) • Vi sinh vật bảo vệ (protective culture)
3. II.1.II.1. KiểmKiểm soátsoát sinhsinh họchọc ((biocontrolbiocontrol)) • Biocontrol- Biological Control – Google 2.390.000 kết quả; tiếng Việt: 8.910 kết quả – PubMed: 7988 bài báo • Kiểm soát sinh học gắn liền với phát triển nông nghiệp bền vững • Định nghĩa kiểm soát sinh học: “Dùng một loài sinh vật hoặc sản phẩm của sinh vật sống để hạn chế, tiêu diệt sinh vật khác”
4. KiểmKiểm soátsoát sinhsinh họchọc đốiđối vớivới sảnsản phẩmphẩm sausau thuthu hoạchhoạch • Có từ lâu đời • Thế kỷ 19: Có một số công bố của các nhà khoa học • Khoảng những năm 60: Dịch bệnh trên cây Phát triển các sản phẩm trừ sâu sinh học • Những năm 80: Phát triển ứng dụng vi sinh vật đối kháng đối với sản phẩm sau thu hoạch
5. II.2.II.2. TácTác nhânnhân kiểmkiểm soátsoát sinhsinh họchọc ViVi sinhsinh vậtvật đốiđối khángkháng • Vi sinh vật có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật có hại (antagonistic microorganism) – Trichoderma kháng mốc thối xám (Botrytis) ở dâu tây – Pseudomonas syringae Van Hall có khả năng kháng Botrytis, Penicillium, Mucor và Geotricum – Candida oleophila Montrocher kháng Botrytis, Penecillium spp.
6. YêuYêu cầucầu củacủa vsvvsv đốiđối khángkháng 1. Bền về di truyền 2. Hoạt động có hiệu quả ở nồng độ thấp 3. Có khả năng kháng nhiều loại vsv gây hỏng, gây bệnh 4. Nhu cầu dinh dưỡng đơn giản 5. Có khả năng sống trong môi trường không thuận lợi
7. YêuYêu cầucầu củacủa vsvvsv đốiđối khángkháng 6. Có thể sinh trưởng trên cơ chất đơn giản trong thiết bị phản ứng 7. Không gây độc hại đối với vật chủ, không sinh độc tố gây hại cho người 8. Bền dưới tác dụng của các chất bảo quản khác, chịu được các công đoạn xử lý hóa học và vật lý
8. II.3.II.3. CơCơ chếchế hoạthoạt độngđộng củacủa cáccác táctác nhânnhân kiểmkiểm soátsoát sinhsinh họchọc Vật chủ VSV gây hại, (thực phẩm) gây bệnh VSV khác VSV đối kháng
9. CơCơ chếchế hoạthoạt độngđộng 1. Khả năng sinh kháng sinh 2. Cạnh tranh về dinh dưỡng và không gian 3. Khả năng bám lên VSV có hại hoặc tác dụng trực tiếp lên chúng (ký sinh) 4. Kích thích khả năng chống chịu VSV gây bệnh của vật chủ
10. 1.1. KhảKhả năngnăng sinhsinh khángkháng sinhsinh • Đây là cơ chế hiệu quả nhất • Bacillus subtilis sinh – Iturin: một peptide có tính kháng nấm – Gramicidin S • Cơ chế này thường phối hợp một số cơ chế khác theo “công nghệ rào cản” (hurdle technology)
11. KiểmKiểm soátsoát sinhsinh họchọc bằngbằng PseudomonasPseudomonas cepaciacepacia P.d: Penecillium digtatum gây mốc xanh lam P.i: Penecillium italicum gây mốc xanh lục Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com)
12. KiểmKiểm soátsoát sinhsinh họchọc bằngbằng PseudomonasPseudomonas cepaciacepacia • Xử lý bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia với nồng độ khác nhau • VSV gây bệnh Penecillium digitatum Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com)
13. Kiểm soát sinh học bằng Pseudomonas cepacia • Kiểm soát mốc xanh lục gây ra do Penecillium expansum bằng pyrrolnitrin sinh tổng hợp từ P. cepacia Theo nghiên cứu của Dr. Wojciech Janisiewicz, USDA-ARS, Kearneysville, WV (www.ars.usda.com)
14. 2.2. CạnhCạnh tranhtranh dinhdinh dưỡngdưỡng vàvà khôngkhông giangian • Cơ chế này thường gặp ở nấm men • Nấm men thường cạnh tranh với VSV gây hại, ức chế sinh trưởng, nhưng không tiêu diệt chúng • Khả năng ức chế hiệu quả hơn nếu nguồn dinh dưỡng khan hiếm
15. CạnhCạnh tranhtranh dinhdinh dưỡngdưỡng vàvà khôngkhông giangian • Nấm men có khả năng tổng hợp màng polysaccharide tăng khả năng bám dính lên bề mặt của rau quả • VSV đối kháng sinh trưởng rất nhanh và xâm chiếm vị trí vết dập ở rau quả • Sự sinh trưởng và nhu cầu dinh dưỡng của vsv đối kháng làm cho một số nấm mốc không có đủ dinh dưỡng để phát triển
16. SựSự tạotạo thànhthành BiofilmBiofilm bởibởi CandidaCandida oleophilaoleophila Wisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications
17. 3.3. SựSự kýký sinhsinh • Pichia guilliermondii có khả năng bám dính trên sợi nấm Botrytis cinerea, tiêu diệt nấm bằng một số enzym phân hủy màng tế bào • Aspergilus pullulans ở vết dập của táo có khả năng sinh tổng hợp enzym exochitinase và β-1,3 -glucanase • Một số nấm men khác có khả năng giảm sự bám dính của bào tử và ngăn cản bào tử nảy mầm
18. SựSự bámbám dínhdính củacủa PichiaPichia guillemondiiguillemondii lênlên sợisợi nấmnấm BotrytisBotrytis cinereacinerea Wisniewski et al. (2007). Post harvest biocontrol: New concepts and applications
19. 4.4. KíchKích thíchthích khảkhả năngnăng chốngchống chịuchịu • Một số vsv có khả năng tương tác với vật chủ, thúc đẩy quá trình lành sẹo • Một số nấm men biểu hiện tính đối kháng khi được đưa vào trước khi cấy vsv gây hại
20. II.4.II.4. CácCác bướcbước phátphát triểntriển mộtmột sảnsản phẩmphẩm kiểmkiểm soátsoát sinhsinh họchọc N N Xác định Thu thập các Xác định đặc tính g g Cải thiện chủng h h sự nhiễm tạp tác nhân KSSH và phân loại i i ê ê n n c c ứ ứ S u u Khả năng Đánh giá áp dụng Đánh giá trong Tương tác với ả n tương thích thử nghiệm PTN vùng rễ p h ẩ m c P P u h h ố á á i t c t Lưu kho và Phối trộn định dạng ù t Nhân giống t r r n i phân phối i sản phẩm ể g ể hàng loạt n n M M ở ở r r ộ ộ n Áp dụng trên diện rộng Đánh giá sự chấp nhận sản phẩm n g g
21. MộtMột sốsố chếchế phẩmphẩm kiểmkiểm soátsoát sinhsinh họchọc đãđã thươngthương mạimại hóahóa Tên chế Tác nhân Tác nhân Dạng chế Ứng dụng Nước sản phẩm kiểm soát gây hư phẩm xuất sinh học hỏng Bio-save 100 Pseudomonas Botrytis Tế bào viên Bảo quản quả EcoScience Bio-save syringae ESC cinerea, nhỏ dạng lạnh sau thu hoạch Corp., USA 1000 -10 Penecillium đông bằng cách dội Bio-save 110 Pseudomonas spp., Mucor qua, nhúng, syringae ESC pyroformis, hoặc phun -11 Geotrichum candidum BlightBan Pseudomonas Hỏng do đông Bột pha nước Phun vào hoa Plan Health A506 fluorescens đá, Erwinia lúc mới nở Technology, A506 amylovora, vi hoặc trực tiếp USA khuẩn gây nâu lên quả đỏ
22. MộtMột sốsố bướcbước tiếptiếp cậncận nhằmnhằm ứngứng dụngdụng sảnsản phẩmphẩm KSSHKSSH trongtrong bảobảo quảnquản raurau quảquả Áp dụng sau thu hoạch • Thông thường VSV đối kháng được phân lập ngay từ bề mặt rau quả • Số lượng tự nhiên của VSV đối kháng thường không đủ để biểu hiện hoạt tính mạnh • Đưa vào một lượng lớn VSV đối kháng đối với sản phẩm sau khi thu hoạch • Tăng sinh đối với VSV đối kháng đã có sẵn trên sản phẩm
23. ÁpÁp dụngdụng sausau thuthu hoạchhoạch • Ưu điểm – Đơn giản, dễ thực hiện ngay sau thu hoạch bằng cách phun, ngâm, tưới – Nếu đúng cách, đúng thời điểm (trước khi VSV gây bệnh xâm nhập) sẽ có hiệu quả cao – Ít tốn kém hơn việc phun thuốc cả diện tích lớn, có thể dùng VSV nồng độ cao Candida oleophila, Cryptococcus albidus, Pichia membranefaciens
24. ÁpÁp dụngdụng sausau thuthu hoạchhoạch • Giới hạn – Cần đưa vào ngay lập tức sau thu hoạch trước khi VSV gây hại xâm nhập – Một số vết thương ở vỏ quả họ cam chanh có chứa tinh dầu, khó khăn hơn cho VSV đối kháng bám vào
25. ÁpÁp dụngdụng sausau thuthu hoạchhoạch Giới hạn • Hiệu quả của VSV đối kháng tương đối hẹp • Phụ thuộc loại rau quả • Phụ thuộc vào hoạt tính đặc hiệu đối với VSV gây bệnh • Khả năng bám dính của VSV đối kháng lên bề mặt là khác nhau đối với những sản phẩm sau thu hoạch khác nhau
26. ÁpÁp dụngdụng trướctrước khikhi thuthu hoạchhoạch • Phun định kỳ vào cây trước khi thu hoạch • Giới hạn – Có thể ảnh hưởng môi trường – VSV đối kháng bị tiếp xúc và biểu hiện hoạt tính trong điều kiện khắc nghiệt (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, VSV khác, các thuốc diệt sâu bọ, ) • Biện pháp: – Lựa chọn VSV có khả năng thích nghi tốt – Cho VSV làm quen, thích nghi với một số stress trước khi ứng dụng
27. DùngDùng nhữngnhững chủngchủng biếnbiến đổiđổi • Các loại hạt lạc, đậu đỗ: – Ứng dụng nấm mốc Aspergillus flavus không sinh độc tố aphlatoxin để cạnh tranh với những chủng hoang dã sinh độc tố • Thường ít ứng dụng đối với rau quả tươi
28. II.II. ỨngỨng dụngdụng vivi sinhsinh vậtvật trongtrong bảobảo quảnquản thựcthực phẩmphẩm • II.1. Kiểm soát sinh học (biocontrol) • II.2. Tác nhân kiểm soát sinh học Vi sinh vật đối kháng • II.3. Cơ chế hoạt động của các tác nhân kiểm soát sinh học • II.4. Các bước phát triển một sản phẩm kiểm soát sinh học • II.5. Vi khuẩn Lactic trong bảo quản thực phẩm
29. Company LOGO II.5.II.5. ViVi khuẩnkhuẩn LacticLactic trongtrong bảobảo quảnquản thựcthực phẩmphẩm Vi khuẩn lactic làm hư hỏng thực phẩm hay bảo quản thực phẩm?
30. GiớiGiới thiệuthiệu chungchung • Vi khuẩn lactic: lactic acid bacteria, vi khuẩn làm chua sữa • 1873: J. Lister thu nhận Bacterium lactis (nay có thể là Lactococcus lactis) • 1919: Orla-Jensen phân loại vi khuẩn lactic dựa theo đặc điểm – Hình thái (cầu, que, ) – Kiểu lên men glucoza: đồng hình, dị hình – Nhiệt độ sinh trưởng – Khả năng sử dụng các loại đường
31. II.5.1.II.5.1. ĐặcĐặc điểmđiểm chungchung củacủa VKVK lacticlactic • Vi khuẩn G+ • Không sinh bào tử (còn tranh cãi, Sporolactobacillus) • Catalase – • Yếm khí tùy tiện • Chịu được axit • Lên men đường tạo thành chủ yếu là axit lactic • Vi khuẩn lactic thường sống ở nơi có môi trường dinh dưỡng dồi dào (thực phẩm), có một số sống trong cơ thể động vật
32. CácCác đặcđặc điểmđiểm phânphân loạiloại củacủa vivi khuẩnkhuẩn lacticlactic Đặc điểm Hình que Hình cầu Carnob. Lactob. Aeroc. Enteroc. Lactoc Leucon Pedioc. Streptoc. Tetragenoc. Weissella Vagoc Oenoc. Tạo tứ cầu - - + - - - + - + - Sinh CO2 từ - ± - - - + - - - + glucoza Sinh trưởng + ± + + + + ± - + + ở 10oC Sinh trưởng - ± - + - - ± ± - - ở 45oC Chịu muối ND ± + + - ± ± - + ± 6,5% Chịu muối - - - - - - - - + - 18% Sinh trưởng ND ± - + ± ± + - - ± pH4,4 Sinh trưởng - - + + - - - - + - pH9,6 Axit lactic L D, L, DL L L L D D, DL L L D,D L
33. II.5.2.II.5.2. CơCơ chếchế táctác dụngdụng củacủa vivi khuẩnkhuẩn lacticlactic trongtrong bảobảo quảnquản thựcthực phẩmphẩm • Cạnh tranh không gian • Cạnh tranh dinh dưỡng • Sinh ra một số chất kháng vi sinh vật
34. CạnhCạnh tranhtranh khôngkhông giangian • Nhiều loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh trên bề mặt • Bản chất chất này chưa được nghiên cứu nhiều • Chất hoạt động bề mặt (surlactin), glycoprotein, glycolipid
35. CácCác chấtchất khángkháng VSVVSV từtừ vivi khuẩnkhuẩn lacticlactic • Axit hữu cơ • H2O2 • CO2 • Diacetyl • Các chất phân tử lượng thấp • Bacteriocin
36. YếuYếu tốtố ảnhảnh hưởnghưởng đếnđến táctác dụngdụng củacủa axitaxit hữuhữu cơcơ • Trong thực tế thường ứng dụng trong thực phẩm_ hệ phức tạp các chất hữu cơ • Các chất trong thực phẩm ảnh hưởng đến khả năng kháng VSV của vi khuẩn lactic – Cao nấm men làm giảm khả năng kháng khuẩn của vk lactic và axetic – Sữa và máu tăng cường khả năng kháng khuẩn của axit axetic
37. HH22OO22 • Vi khuẩn lactic khi có O2 chuyển thành H2O2 dưới tác dụng của oxidases, NADH oxidases có chứa flavoprotein và superoxide dismutase • Một lý do nào đó lactic không sinh catalase để phân hủy H2O2 hoặc hệ phân hủy yếu hơn hệ sinh ra • Thực tế theo một số nhà nghiên cứu H2O2 không tích tụ lại nhiều in vivo, thường bị phân hủy nhanh chóng
38. CơCơ chếchế táctác dụngdụng củacủa HH22OO22 • Tính kháng khuẩn dựa vào khả năng oxy hóa các đại phân tử của H2O2 khi bị phân hủy • Protein hoặc lipid ở phía vỏ tế bào bị ôxy hóa • Một số phản ứng xảy ra đối với vi khuẩn lactic để tạo H2O2 lấy hết oxy, tạo môi trường yếm khí, không có lợi cho một số vsv • Vi khuẩn lactic sinh H2O2 có mặt ở đường tiết niệu, đóng vai trò quan trọng trong việc tránh viêm nhiễm
39. HH22OO22 • Trong tự nhiên, tác dụng kháng khuẩn của H2O2 được tăng lên do lactoperoxidase và thiocyanate (SCN-). - - • SCN + H2O2 OSCN + H2O lactoperoxidase • Cấu trúc màng tế bào vsv bị thay đổi khi tiếp xúc với OSCN- • Hiệu quả chủ yếu do chu trình glycolysis bị chặn do các enzym bị ảnh hưởng • Tác dụng nhanh đối với VK G-, lâu hơn đối với G+
40. COCO22 • Tạo môi trường yếm khí, ức chế một số vi khuẩn • Quá trình decarboxyl hóa bị ức chế • Tích tụ CO2 ở màng lipid của tế bào làm vô hoạt sự thẩm thấu của các chât qua thành tế bào • Vi khuẩn G- nhạy cảm hơn vi khuẩn G+
41. TácTác dụngdụng củacủa DiacetylDiacetyl • Diacetyl kháng vi sinh vật tốt hơn khi pH<7 • Diacetyl tác dụng trên vi khuẩn G-, nấm men, nấm mốc tốt hơn trên vi khuẩn G+ • Vi khuẩn lactic bền với diacetyl nhất • Diacetyl tác dụng với protein bám arginin của vi khuẩn G-, ngăn cản quá trình sử dụng axit amin của vi khuẩn
42. CácCác hợphợp chấtchất khángkháng vivi sinhsinh vậtvật phânphân tửtử lượnglượng thấpthấp • Phân tử lượng thấp • Hoạt động tốt ở pH thấp • Bền nhiệt • Phổ hoạt động rộng • Hòa tan trong acetone
43. ReuterinReuterin 3-hydroxypropanal, reuterin o Sinh ra do Lactobacillus reuteri sinh trưởng trên môi trường chứa hỗn hợp glucose và glycerol hoặc glyceraldehyde o Ở pha log: chưa có reuterin. Pha cân bằng reuterin bắt đầu tích tụ o Khi tiếp xúc với tế bào của vsv mục tiêu, Lb. reuteri được kích thích sinh ra reuterin
44. ReuterinReuterin • Dưới dạng dung dịch hòa tan trong nước, reuterin tồn tại dưới dạng đơn phân tử (monomer), ngậm nước hoặc dimer dạng vòng – Chưa có số liệu ở dạng nào reuterin thể hiện tính kháng khuẩn mạnh hơn • Phổ tác dụng rộng: kháng vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, một số động vật nguyên sinh, kháng virus
45. ReuterinReuterin • Chưa có số liệu tác dụng gây hại cho người • Cơ chế kháng vi sinh vật của reuterin dựa trên tác dụng lên enzyme sulfhydryl • Reuterin có tác dụng ức chế subunit gắn lên cơ chất của ribonucleic reductase ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp ADN
46. ReutericyclinReutericyclin • Phân tử lượng 349 Da, tích điện âm, không ưa nước • Kích thích bởi sự có mặt của các axit béo • Sinh reutericyclin tăng khi hàm lượng muối khoảng 2%, pH 100 mg/l
47. 2-Pyrrolidone-5-carboxylic2-Pyrrolidone-5-carboxylic AcidAcid • Tìm thấy ở Lactobacillus casei ssp. casei, Lb. casei ssp.pseudoplantarum và Streptococcus bovis • Bền nhiệt (121oC, 20 phút), giảm hoạt tính khi pH tăng trên 2,5
48. BacteriocinBacteriocin • Hợp chất sinh tổng hợp tại ribosome • Bản chất Protein • Ức chế các vi khuẩn khác • Có mặt ở hầu hết các vi khuẩn • Phổ ức chế tương đối hẹp: – Nhược điểm – Ưu điểm: Tiêu diệt có chọn lọc vi sinh vật đặc hiệu mà không ảnh hưởng đến hệ sinh vật có ích
49. BacteriocinBacteriocin vàvà khángkháng sinhsinh Đặc điểm Bacteriocin Kháng sinh Ứng dụng Thực phẩm Y dược Sinh tổng hợp Ribosome SP trao đổi chất bậc hai Hoạt độ Phổ hẹp Phổ khác nhau Miễn dịch của sinh Có Không vật chủ Cơ chế thích nghi Sự thích nghi của Có thể biến đổi về của vsv đích màng tế bào mặt di truyền ở vị trí tác dụng Cơ chế tác dụng Thường tạo lỗ ở Màng tế bào hoặc màng tế bào nội bào Phản ứng phụ Chưa có báo cáo Có
50. TácTác dụngdụng củacủa PediocinPediocin AcHAcH lênlên ListeriaListeria monocytogenesmonocytogenes L. monocytogenes chưa xử lý Sau 30 phút xử lý với Pediocin Sau 5 giờ xử lý với Pediocin Ennahar et al. (1996). Production of pediocin AcH by Lactobacillus plantarum WHE 92 isolated from cheese. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12) 4381-4387