›
›

Đồ án Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường Type 2 - Hà Thị Bích Ngọc

pdf 139 trang huongle 580
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường Type 2 - Hà Thị Bích Ngọc", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_dieu_tra_nghien_cuu_mot_so_thuc_vat_viet_nam_co_tac_du.pdf

Nội dung text: Đồ án Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường Type 2 - Hà Thị Bích Ngọc

  1. ®¹i häc quèc gia hµ néi Tr•êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn Hµ ThÞ BÝch Ngäc ®iÒu tra, nghiªn cøu mét sè thùc vËt viÖt nam cã t¸c dông hç trî ®iÒu hßa l•îng ®•êng trong m¸u ®Ó øng dông cho bÖnh nh©n ®¸i th¸o ®•êng type 2 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Hµ Néi - 2012
  2. ®¹i häc quèc gia hµ néi Tr•êng ®¹i häc khoa häc tù nhiªn Hµ ThÞ BÝch Ngäc ®iÒu tra, nghiªn cøu mét sè thùc vËt viÖt nam cã t¸c dông hç trî ®iÒu hßa l•îng ®•êng trong m¸u ®Ó øng dông cho bÖnh nh©n ®¸i th¸o ®•êng type 2 Chuyªn ngµnh : Hãa sinh häc M· sè : 62 42 30 15 LuËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc Ng•êi h•íng dÉn khoa häc: 1. PGS.TS. NguyÔn V¨n Mïi 2. TS. Ph¹m ThÞ Hång Minh Hµ Néi – 2012
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nghiên cứu sinh Hà Thị Bích Ngọc
  4. LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này tôi xin đƣợc gửi lời biết ơn trân trọng nhất tới ngƣời Thầy của tôi, PGS.TS.Nguyễn Văn Mùi, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua. Kính chúc sức khỏe Thầy! Cũng với lòng biết ơn chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.Phạm Thị Hồng Minh, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, ngƣời đã dành cho tôi những điều kiện thuận lợi nhất để hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn tập thể các cán bộ Phòng Hoạt chất sinh học và Phòng Cấu trúc phân tử - Viện Hóa học đã giúp đỡ tôi về chuyên môn nghiên cứu. Nhân đây cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS.Nguyễn Xuân Phƣơng, ThS.Nguyễn Thế Cƣờng, TS.Trần Thế Bách – Phòng Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên thực vật đã tận tình giúp đỡ. Tôi xin đƣợc cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị em công tác tại Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Bộ môn Tế bào-Mô phôi-Lý sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng ĐH KHTN, PGS.TS.Bùi Phƣơng Thuận, GS.TS.Nguyễn Quốc Khang, GS.TS.Đỗ Ngọc Liên, PGS.TS.Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS.Nguyễn Thị Quỳ, PGS.TS.Trần Ninh, TS.Nguyễn Quang Huy, ThS.Bùi Thị Vân Khánh đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đề tài KLEPT.09.03- Phòng thí nghiệm trọng điểm– ĐH KHTN đã tạo điều kiện về vật chất, thiết bị trong thời gian nghiên cứu luận án. Nhân đây tôi cũng xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng, Viện Dinh dƣỡng, Trung tâm chẩn đoán Y khoa VIPLAB, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành những nghiên cứu của mình. Một lời biết ơn chân thành từ đáy lòng mình, tôi xin đƣợc cảm ơn GS.TS.NGƢT Trần Hữu Nghị, TS.Trần Thị Mai cùng Ban lãnh đạo Trƣờng ĐH Dân lập Hải Phòng, các đồng nghiệp đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cả về mặt vật chất và tinh thần, luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin đƣợc cảm ơn các bạn đã từng học tập và làm việc tại Phòng Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống – ĐH KHTN đã giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trên những bƣớc đƣờng nghiên cứu. Lời biết ơn cuối cùng tôi xin đƣợc dành cho cha mẹ và gia đình tôi, những ngƣời thân yêu, những ngƣời bạn, vì tôi biết rằng nếu không có họ tôi không thể có đƣợc ngày hôm nay. Xin chân thành cảm ơn!
  5. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT - - nhân proton) 13C-NMR: 13C-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy nhân cacbon) ATP: Adenosine triphosphate BMI: Body Mass Index (Chỉ số khối cơ thể) CBuOH: Cao n-buthanol CC: Cao cồn CEtA: Cao ethylacetate CHe: Cao n-hexane CNC: Cao nƣớc cuối CNN: Cao nƣớc nóng COSY : Chemical Shift Correlation Spectroscopy CTPT : Công thức phân tử DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer ĐTĐ: Đái tháo đƣờng ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzym) g: Gam G1P: Glycerol 1 phosphate GOD: Glucose oxidase GOT: Glutamate oxalate transaminase GPT: Glutamate pyruvate transaminase h: Giờ HbA1C: Glycated hemoglobin (Hemoglobin gắn đƣờng glucose) HDL: High Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng cao) HFD: High fat diet (Chế độ ăn giàu chất béo) HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence IC50: Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ gây ức chế 50% hoạt tính sinh học hoặc hóa sinh) IDF: International Diabetes Federation (Liên đoàn Đái tháo đƣờng Quốc tế)
  6. LD0: Lethal dose, 0% (Liều dƣới liều chết) LD50: Lethal dose, 50% (Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm) LDL: Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng thấp) m: Khối lƣợng mg: Miligam ml: Mililit Mp: Melting point (Điểm nóng chảy) MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) NCEP: National Cholesterol Education Program (Chƣơng trình Giáo dục Quốc gia về Cholesterol) ND: Normal diet (Ăn chế độ ăn bình thƣờng) NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân) OD: Optical Density (Mật độ quang) POD: Peroxidase P-value: Probability value (Trị số p) PVPP: Polyvinylpyrrolidone R: Receptor Rf: Hệ số di chuyển R2: Hệ số tƣơng quan Ser: Serine STZ: Streptozotocin TV: Thực vật Tyr: Tyrosine Thr: Threonine VLDL: Very Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỷ trọng rất thấp) WHO: World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới μg: Microgram μl: Microlit
  7. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ 5 Bảng 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá kết quả xét nghiệm của ngƣời bệnh ĐTĐ theo 5 WHO-năm 2002 Bảng 1.3. Định nghĩa của NCEP về hội chứng trao đổi chất 10 Bảng 1.4. : Dịch chiết/hoạt chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính ức chế α- 26 glucosidase Bảng 2.1. Các mẫu thực vật đƣợc điều tra, nghiên cứu 35 Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu 37 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2 41 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của 24 mẫu 44 thực vật lên chuột nhắt ĐTĐ type 2 Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu phân đoạn mẫu lá vối và lá chè đắng 45 Bảng 3.1. Chiết xuất các mẫu thực vật bằng nƣớc nóng và cồn 57 Bảng 3.2. Sự khác biệt về các chỉ số mỡ máu giữa chuột ở nhóm ND và HFD 61 Bảng 3.3. Mật độ quang của insulin chuẩn 63 Bảng 3.4. Khả năng dung nạp glucose của các nhóm chuột 65 Bảng 3.5 . Phần trăm tách chiết thu cao phân đoạn lá vối 75 Bảng 3.6. Nồng độ đƣờng huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết phân 75 đoạn lá vối Bảng 3.7: Các số liệu phổ của 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’- 80 dimethylchalcon Bảng 3.8. Độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR của chất C3 82 Bảng 3.9. Số liệu phổ cacbon của LVE2 (3 -hydroxy-olean-12(13)-en- 28-oic 85 acid) và phổ của oleanolic acid Bảng 3.10. Phần trăm khối lƣợng của các chất tinh sạch từ lá vối 89 Bảng 3.11. Phần trăm tách chiết cao phân đoạn lá chè đắng 92 Bảng 3.12. Nồng độ đƣờng huyết chuột ĐTĐ type 2 sau khi uống cao chiết 92
  8. phân đoạn lá chè đắng Bảng 3.13. Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR của H4 96 Bảng 3.14. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 5 chất tinh sạch từ lá 97 vối, lá chè đắng Bảng 3.15. Kết quả định tính thành phần hóa học 101 Bảng 3.16. Thành phần chế phẩm Thivoda 104 Bảng 3.17. Bảng theo dõi chuột thí nghiệm LD50 110
  9. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của insulin 8 Hình 1.2. Cơ chế phân tử giải phóng insulin 9 Hình 1.3. Receptor của insulin và vùng tyrosine kinase 12 Hình 1.4.Thủy phân oligosaccharide(trái) - Cơ chế cạnh tranh của Acarbose 25 (phải) Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 38 Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ 40 Hình 2.3 . Thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase bởi Glucose Kit 48 Hình 2.4. Qui trình bào chế chế phẩm Thivoda 54 Hình 3.1. Sự thay đổi trọng lƣợng chuột sau 8 tuần nuôi 60 Hình 3.2. Chuột nuôi HFD (bên trái) và chuột nuôi ND (bên phải) 61 Hình 3.3. Nồng độ đƣờng huyết của các lô chuột thí nghiệm tại các thời điểm 62 Hình 3.4. Xây dựng phƣơng trình hồi qui tuyến tính 64 Hình 3.5. Định lƣợng nồng độ insulin máu chuột HFD + STZ 65 Hình 3.6. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực vật 66 đợt I Hình 3.7. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực vật 68 đợt II Hình 3.8. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực vật 69 đợt III Hình 3.9. Đƣờng huyết của chuột ĐTĐ type 2 cho uống cao chiết thực vật 70 đợt IV Hình 3.10. Giá trị các chỉ số GOT, GPT trong máu chuột 72 Hình 3.11. Hình ảnh quan sát tiêu bản đúc cắt gan chuột 73 Hình 3.12. Tác dụng hạ đƣờng huyết của cao chiết phân đoạn lá vối 76 Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất H1 ( -sitosterol) 78 Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất H2 ( -sitosterol-glucopyranoside) 79
  10. Hình 3.15. Chất H6 tinh sạch (A) và sắc ký đồ bản mỏng chất H6 (B) 80 Hình 3.16. Cấu trúc H6 (2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’- 81 dimethylchalcon) Hình 3.17. Chất tinh sạch (phải) và xác định cấu trúc C3 (3β-hydroxy-lup- 83 20(29)-en-28-oic acid) (trái) Hình 3.18. Sắc ký đồ bản mỏng (phải) và cấu trúc của LVE2 (3 -hydroxy- 85 olean- 12(13)-en- 28-oic acid) (trái) Hình 3.19. Sắc ký đồ bản mỏng (phải) và cấu trúc của LVE4 (2 ,3β,23- 87 trihydroxy-urs-12-en-28-oic acid) (trái) Hình 3.20. Sắc ký đồ bản mỏng (phải) và cấu trúc hóa học của quercetin 88 (trái) Hình 3.21. Nồng độ đƣờng huyết chuột cho uống cao chiết phân đoạn lá chè 93 đắng Hình 3.22. Cấu trúc phân tử của H4 (24 methyl (3 -hydroxy-lup-20(29)-en- 95 24-oic acid) ester) Hình 3.23. Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của một số hoạt chất 98 Hình 3.24. Các đối tƣợng thực vật là thành phần của chế phẩm Thivoda 100 Hình 3.25. Nghiên cứu khả năng điều hòa đƣờng huyết của cao tổng số 102 Hình 3.26. Chỉ số men gan (trái) và các chỉ số mỡ máu (phải) 103 Hình 3.27. Dụng cụ đóng viên nang (trái), chế phẩm Thivoda (phải) 105 Hình 3.28. Khả năng hạ đƣờng huyết của chế phẩm Thivoda và Metformin 106
  11. MỞ ĐẦU Đã từ lâu con ngƣời biết rằng đái tháo đƣờng (ĐTĐ) là một bệnh rối loạn chuyển hóa, nhƣng những biến chứng mà nó gây ra thì gần đây mới đƣợc làm sáng tỏ. Ảnh hƣởng của bệnh đái tháo đƣờng đến các bệnh lý khác rất nặng nề. Ngày nay đái tháo đƣờng đƣợc xếp vào nhóm bệnh không lây cùng với các bệnh phổ biến khác đang đƣợc cả loài ngƣời - tất cả các quốc gia, đồng tâm hợp sức phòng chống. Bệnh đái tháo đƣờng cũng đƣợc xem là “đại dịch” ở các nƣớc đang phát triển [2]. Từ những năm 90 của thế kỷ 20, các chuyên gia y tế đã dự báo “Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh rối loạn chuyển hoá”. Theo ƣớc tính của Tổ chức Y tế thế giới WHO và Liên đoàn ĐTĐ quốc tế IDF, số bệnh nhân ĐTĐ sẽ tăng từ 150 triệu ngƣời vào năm 2009 lên 399 triệu ngƣời vào năm 2025, tăng 214% so với năm 2006. Đáng chú ý là tốc độ gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ở các nƣớc phát triển chỉ là 42% thì ở các nƣớc đang phát triển trong đó có VN là 170%. Bệnh ĐTĐ có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm và là nguyên nhân hàng đầu gây nhồi máu cơ tim, đột quỵ, suy thận giai đoạn cuối và mù lòa làm tăng tỷ lệ tử vong lên gấp 2-4 lần so với ngƣời không bị ĐTĐ. Trên thế giới cứ 10 giây đi qua có thêm 1 ngƣời bị chết do ĐTĐ và các biến chứng. Bệnh ĐTĐ đã thực sự trở thành một gánh nặng cho mỗi gia đình có ngƣời mắc bệnh, cho cả hệ thống y tế và cho toàn xã hội. Hiện bệnh chiếm tỷ lệ cao nhất về số lƣợng các công trình nghiên cứu, tạp chí và sách báo chuyên ngành [15, 99]. Ở nƣớc ta, việc điều trị bệnh ĐTĐ còn gặp rất nhiều khó khăn do đội ngũ thầy thuốc chuyên khoa còn thiếu, chi phí điều trị tốn kém do ngƣời bệnh đƣợc phát hiện muộn và có nhiều biến chứng; công tác giáo dục cho ngƣời bệnh chƣa đƣợc tốt. Trong những năm qua, ngành y tế đã có nhiều nỗ lực trong công tác đào tạo các thầy thuốc chuyên khoa nội tiết ĐTĐ, tăng cƣờng kinh phí và cung cấp các thuốc thiết yếu chữa bệnh ĐTĐ cho các cơ sở y tế, đẩy mạnh công tác tuyên truyền phòng chống bệnh nhƣng chƣa đạt đƣợc kết quả mong muốn. Việc sử dụng các thực phẩm bổ sung có nguồn gốc từ thực vật cho các bệnh nhân ĐTĐ sẽ có tác dụng phối 1
  12. hợp với việc điều trị bằng thuốc, giúp hỗ trợ điều trị cho ngƣời bệnh một cách hiệu quả hơn [10]. Việt Nam ta rừng vàng biển bạc, sở hữu nguồn tài nguyên thực vật nói chung, tài nguyên thực vật chứa các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học nói riêng rất đa dạng, phong phú. Đây là nguồn dƣợc liệu quí, tiềm năng và triển vọng, có giá trị kinh tế và xã hội rất lớn lao. Ngày nay, với sự phát triển của các ngành sinh học, hóa học các hợp chất tự nhiên và dƣợc học hàng chục ngàn hoạt chất có trong cây cỏ đã đƣợc phát hiện, đƣợc nghiên cứu, chế biến và làm thuốc chữa bệnh. Có thể nói nguồn hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mà cây cỏ có khả năng sinh tổng hợp và tích lũy là vô cùng to lớn và hiểu biết của con ngƣời về chúng chỉ là một phần rất nhỏ và còn rất nhiều hạn chế. Do đó việc điều tra, nghiên cứu các cơ sở khoa học để phát hiện, khai thác, sử dụng có hiệu quả cũng nhƣ bảo tồn, phát triển bền vững nguồn tài nguyên thực vật chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học là nhiệm vụ lớn đã và đang đặt ra trƣớc chúng ta. Xuất phát từ những yêu cầu và thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Điều tra, nghiên cứu một số thực vật Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hoà lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường type 2”. Mục đích nghiên cứu của đề tài: - Điều tra, sàng lọc một số thực vật Việt Nam có tác dụng hạ đường huyết trên chuột nhắt đái tháo đường type 2. - Xác định các cao chiết phân đoạn của một số thực vật có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất. - Xác định thành phần hóa học của các phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết, tinh sạch các chất và làm sáng tỏ cơ chế hạ đường huyết của chúng. - Bào chế chế phẩm có nguồn gốc từ các thực vật đã được sàng lọc, nghiên cứu khả năng và cơ chế hạ đường huyết, xác định độc tính cấp của chế phẩm. 2
  13. Nội dung nghiên cứu: - Thu thập 24 mẫu thực vật ở Việt Nam được tham khảo là có khả năng trong hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ. Tách chiết thu cao nước nóng và cao cồn, thử nghiệm khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt ĐTĐ type 2. - Chiết phân đoạn cao nước nóng lá vối và lá chè đắng bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần và nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của các phân đoạn đó trên chuột nhắt ĐTĐ type 2. - Xác định thành phần hóa học của cao chiết phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất. - Thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cao chiết phân đoạn và các chất tinh sạch được. - Nghiên cứu bào chế chế phẩm, khả năng hạ đường huyết, xác định độ an toàn về chỉ tiêu vi sinh vật, độc tính cấp cũng như hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của chế phẩm sinh học. 3
  14. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG 1.1.1. Khái niệm và phân loại bệnh đái tháo đƣờng 1.1.1.1. Khái niệm Danh từ bệnh ĐTĐ (Diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp (diabetes: nƣớc chảy trong ống siphon) và tiếng La Tinh (mellitus: ngọt), do vậy danh từ y học Việt Nam đã dịch diabetes mellitus là ĐTĐ. Tuy nhiên cần phân biệt có nhiều loại đƣờng có trong nƣớc tiểu nhƣng không phải là ĐTĐ nhƣ fructose niệu, pentose niệu ngay cả khi đái ra glucose cũng có thể do ngƣỡng thận thấp hoặc do chấn thƣơng sọ não. Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ĐTĐ là “một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu/hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin” [99]. Còn theo Hiệp hội ĐTĐ Hoa Kỳ đã đƣa ra định nghĩa về ĐTĐ: “là một rối loạn mạn tính, có những thuộc tính nhƣ sau: tăng glucose máu; kết hợp với những bất thƣờng về chuyển hóa carbohydrate, lipid và protein; bệnh luôn gắn với xu hƣớng phát triển các bệnh lý về thận, đáy mắt, thần kinh và các bệnh tim mạch khác”. Các chuyên gia thuộc Ủy ban chẩn đoán và phân loại bệnh ĐTĐ Hoa Kỳ đã đƣa ra định nghĩa mới về ĐTĐ: “là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose máu, hậu quả của sự thiếu hụt tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin, hoặc cả hai”. Nói tóm lại: “ĐTĐ là một tình trạng rối loạn chuyển hóa phức tạp do nhiều nguyên nhân, đặc trƣng bởi sự tăng glucose máu, do khiếm khuyết tiết insulin, và/hoặc đề kháng insulin. Tình trạng tăng đƣờng huyết mạn tính sẽ gây ra tổn thƣơng của nhiều cơ quan nhƣ mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu” [2, 43]. Bảng 1.1 thể hiện tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ, đƣợc Hiệp hội ĐTĐ của Mỹ kiến nghị năm 1997 và đƣợc nhóm các chuyên gia về bệnh ĐTĐ của WHO công nhận vào năm 1998, tuyên bố áp dụng vào năm 1999 [15]. 4
  15. Bảng 1.1. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh ĐTĐ Đƣờng huyết tƣơng bất kỳ ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/l) kèm triệu chứng tiểu nhiều, uống nhiều, sụt cân. Đƣờng huyết lúc đói ≥ 126 mg/dl (7,0 mmol/l) sau 2 lần thử. Đƣờng huyết tƣơng 2 giờ sau uống 75 g glucose ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/l). Ngoài ra còn có các chỉ tiêu phấn đấu điều trị ngƣời bệnh ĐTĐ đƣợc Tổ chức ĐTĐ quốc tế cũng nhƣ WHO khuyến cáo, đƣợc thể hiện ở Bảng 1.2. Bảng 1.2. Tiêu chuẩn đánh giá kết quả xét nghiệm của ngƣời bệnh ĐTĐ theo WHO-năm 2002 Chỉ số Đơn vị Tốt Khá Kém Đƣờng huyết - Lúc đói mmol/l 4,4 – 6,1 ≤ 7,0 > 7,0 - Sau ăn 4,4 – 8,0 ≤ 10,0 > 10,0 HbA1C % 7,5 Huyết áp mmHg 130/80 – 140/90 BMI kg/m2 18,5 – 22,9 18,5 – 22,9 ≥ 23 Cholesterol mmol/l 6,0 toàn phần HDL-c mmol/l > 1,1 1,1 – 0,9 4,0 1.1.1.2. Phân loại Phân loại dựa vào nguyên nhân sinh bệnh: a. ĐTĐ type 1: Tuyến tụy của bệnh nhân hầu nhƣ hoặc không có khả năng sản sinh ra insulin. Nguyên nhân là do hệ miễn dịch tự hủy hoại các tế bào β trong tuyến tụy có nhiệm vụ sản sinh ra insulin. Tác nhân kích thích để cho hệ miễn dịch tấn công tế bào β vẫn chƣa biết rõ. Bởi vậy, trƣớc đây còn gọi ĐTĐ type 1 là bệnh tự miễn. Bệnh chiếm khoảng 10-20% các trƣờng hợp ĐTĐ. Bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ type 1 buộc phải tiêm insulin hằng ngày, có thể là vài lần trong ngày. Để hạ đƣờng máu, ngoài tiêm insulin ngƣời bệnh còn phải điều chỉnh và phối hợp thuốc theo chế độ ăn và hoạt động thể lực. Hạ đƣờng huyết là 5
  16. nguy cơ tiềm ẩn đe dọa tính mạng của ngƣời bệnh ĐTĐ type 1. Mặc dù đã đƣợc cảnh báo và ngƣời ta đã nghiên cứu tìm ra nhiều biện pháp phòng chống, bảo vệ an toàn cho ngƣời bệnh nhƣng các biến chứng xảy ra ngày càng nhiều. Do đó, chiến lƣợc dự phòng nhằm tác động vào các giai đoạn sớm nhằm ngăn chặn sự diễn tiến của bệnh đƣợc xem nhƣ là phƣơng thức tốt nhất giúp hạn chế những tổn thƣơng nặng nề về tinh thần, vật chất cho mỗi cá nhân và cho toàn xã hội [65, 70]. b. ĐTĐ type 2: Đặc điểm lớn nhất trong sinh lý bệnh của ĐTĐ type 2 là có sự tƣơng tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trƣờng trong cơ chế bệnh sinh. Đây là mối quan hệ phức tạp. Bệnh nhân ĐTĐ type 2 có lƣợng insulin ban đầu đƣợc sản sinh ra hoàn toàn bình thƣờng, nhƣng các tế bào đã không hoặc kém nhạy cảm với sự có mặt của insulin. Đó là hiện tƣợng kháng insulin. Lƣợng đƣờng trong máu do không đƣợc chuyển hóa thành năng lƣợng nên giữ ở mức cao, cơ thể bệnh nhân phản ứng bằng cách tăng sản xuất insulin, gây nên quá tải cho tuyến tụy và lƣợng insulin đƣợc tiết ra dần dần giảm. ĐTĐ type 2 chủ yếu ở ngƣời trƣởng thành, nhƣng bệnh đang gia tăng gặp cả ở những ngƣời trẻ tuổi, thậm chí ở cả trẻ em, bệnh thƣờng gặp ở những ngƣời trên 40 tuổi. Số ngƣời mắc bệnh ĐTĐ type 2 chiếm khoảng 80% - 90% tổng số ca ĐTĐ. Sinh bệnh học của bệnh vẫn chƣa đƣợc hiểu đầy đủ. Tuy nhiên, hai yếu tố đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào β tuyến tụy và hiện tƣợng kháng insulin. Giữa hai yếu tố, yếu tố nào xuất hiện trƣớc và chiếm ƣu thế cho đến nay vẫn chƣa đƣợc xác định. Đái tháo đƣờng type 2 có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen, nó làm cho bệnh phát triển nhanh. Nếu những ngƣời mang trong mình gen tạo mầm mống cho bệnh ĐTĐ sớm biết đƣợc điều đó và có biện pháp phòng ngừa bằng cách sống và ăn uống tốt thì bệnh có thể không phát triển. Bệnh ĐTĐ trong trƣờng hợp này sẽ giữ ở dạng tiềm ẩn. Trong trƣờng hợp ngƣợc lại, với cách sống không khoa học, căn bệnh sẽ phát triển rất nhanh [46, 110]. 6
  17. c. ĐTĐ thai kỳ: là tình trạng không dung nạp carbohydrate của ngƣời phụ nữ đƣợc phát hiện lần đầu khi mang thai. Các nghiên cứu kinh điển của Freinkel đã chứng minh ở ngƣời ĐTĐ thai kỳ, trong thời kỳ mang thai insulin tăng tiết gấp 1,5 – 2 lần khi đáp ứng với nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đƣờng uống hay truyền tĩnh mạch. Rõ ràng cả lƣợng insulin dự trữ lẫn khả năng đáp ứng bài tiết mới của tế bào beta đã bị giới hạn. Đây cũng là nguyên nhân dẫn đến hiện tƣợng không dung nạp glucose ở ngƣời mẹ. Các bất thƣờng về chuyển hóa bao gồm tiết insulin mất cân đối và các tác động của nó đến quá trình thu nhận glucose, ngăn chặn sản xuất glucose ở gan và giảm tuyệt đối sử dụng glucose đƣợc insulin hoạt hóa. ĐTĐ thai kỳ xảy ra ở khoảng 2 – 3% tổng số phụ nữ mang thai và khi hormon đƣợc sản xuất bởi nhau thai bị gián đoạn do ảnh hƣởng của insulin. ĐTĐ thai kỳ biến mất ngay sau khi sinh nhƣng có khoảng ½ trong số này tiến triển thành ĐTĐ type 2 vĩnh viễn sau sinh. Trong những trƣờng hợp hiếm gặp, ĐTĐ type 1 cũng có thể xảy ra trong thai kỳ, dẫn đến nồng độ glucose trong máu cao sau khi sinh mà đòi hỏi phải điều trị bằng insulin [68]. d. Các tình trạng tăng đƣờng huyết đặc biệt khác: + Giảm chức năng tế bào do khiếm khuyết gen + Tăng đƣờng huyết do thuốc, hóa chất + Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen + Nhiễm khuẩn + Bệnh lý tụy ngoại tiết + Bệnh nội tiết + Các thể không thƣờng gặp của ĐTĐ qua + Một số bệnh gen đôi khi kết hợp với trung gian miễn dịch ĐTĐ. 1.1.2. Bệnh ĐTĐ type 2 và tính kháng insulin 1.1.2.1. Cơ chế tác dụng của insulin Insulin là một protein nhỏ, trọng lƣợng phân tử 5800Da, là một phức hợp có 51 amino acid và gồm 2 chuỗi, chuỗi A có 21 amino acid, chuỗi B có 30 amino acid, nối với nhau bởi 2 cầu nối disulfide. Insulin đƣợc tổng hợp từ tế bào β tuyến tụy, các tế bào khác trong tiểu đảo tụy là tế bào α (sản xuất glucagon) và tế bào δ 7
  18. (sản xuất somatostatin), tế bào γ sản xuất polypeptide tuyến tụy, và tế bào ε đƣợc phát hiện và xác định là sản xuất ghrelin. Bản thân Receptor (R) của insulin là một protein kinase có khả năng vận chuyển một nhóm phosphate của ATP tới nhóm hydroxyl của một gốc Tyrosine, gồm 2 tiểu đơn vị α (trọng lƣợng phân tử 140 kDal) giống nhau nằm ở mặt ngoài của màng plasma và 2 tiểu đơn vị β (trọng lƣợng phân tử 95 kDal) xuyên qua màng với các đầu C tận cùng ở mặt ngoài của bào tƣơng. Các chuỗi α chứa vùng liên kết insulin, còn các chuỗi β là vùng tyrosine kinase, các chuỗi liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide. Liên kết insulin ở khu vực ngoài tế bào hoạt hóa tyrosine protein kinase đặc hiệu của R nằm trong bào tƣơng. Kinase này lại hoạt hóa tiếp nhiều protein kinase khác bằng phản ứng phosphoryl hóa các gốc Tyr đặc hiệu. Cuối cùng những enzym này có thể phosphoryl hóa enzym quan trọng khác để gây ra nhiều biến đổi về chuyển hóa trong cơ thể [104]. Cơ chế tác dụng của insulin đƣợc thể hiện trên Hình 1.1 và cơ chế phân tử giải phóng insulin đƣợc thể hiện trên Hình 1.2. Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của insulin (Nguồn hình: insulin/insulin-receptor/) 8
  19. Insulin đƣợc dự trữ trong tế bào tiết insulin, sau đó đƣợc giải phóng để đáp ứng với sự tăng cao của nồng độ Ca2+ nội bào. Nguyên nhân là dòng Ca2+ đi qua màng tế bào, xuyên qua cổng điện thế kênh Ca2+. Khi kênh này mở sẽ khởi động hoạt động điện tế bào beta. Glucose điều khiển hoạt động điện của tế bào beta theo con 2+ đƣờng trao đổi chất, dẫn đến sự thay đổi trong hoạt động của kênh Ca (kênh KATP nhạy cảm với ATP). Khi không có mặt glucose, kênh K+ mở ra và dòng K+ giữ cho màng không bị phân cực cao, vì vậy cổng điện thế kênh Ca2+ đóng lại. Khi trao đổi chất glucose, kênh KATP đóng lại và khử cực màng tế bào beta, dẫn đến mở cổng điện thế kênh Ca2+ và khởi động hoạt động điện. Hình 1.2. Cơ chế phân tử giải phóng insulin (Nguồn: Kênh KATP cũng đƣợc coi là đích phân tử trong nghiên cứu bào chế thuốc chống ĐTĐ nhƣ sulfonylurea, đây là loại thuốc đƣợc sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh ĐTĐ type 2 trong hơn một nửa thập kỷ qua. Sulfonylurea có tác dụng đóng các kênh này độc 9
  20. lập với trao đổi chất glucose, do đó nó không ảnh hƣởng đến quá trình tiết insulin và hoạt động điện [73]. 1.1.2.2. Tính kháng insulin Kháng insulin là thuật ngữ đầu tiên dùng để chỉ những bệnh nhân ĐTĐ type 1 khi phải điều trị dùng đến hay nhiều hơn 100 đơn vị insulin một ngày mới kiểm soát đƣợc đƣờng huyết. Tính kháng insulin đƣợc định nghĩa là đáp ứng sinh học dƣới mức bình thƣờng đối với nồng độ insulin đã dùng để điều trị tốt nhƣ các mô của các đối tƣợng không bị bệnh ĐTĐ. Thuật ngữ “hội chứng X” hay “hội chứng trao đổi chất” đã đƣợc dùng để chỉ các đối tƣợng biểu hiện các đặc tính kháng lại insulin và thuật ngữ này đã đƣợc định nghĩa rõ ràng hơn bởi Chƣơng trình giáo dục quốc gia về Cholesterol - NCEP (National Cholesterol Education Program ) và đƣợc sửa đổi bởi WHO, đã thêm các yêu cầu về hiện tƣợng nồng độ insulin quá cao hay lƣợng glucose trong huyết tƣơng lúc đói cao (lớn hơn 110 mg/dl nhƣng nhỏ hơn 126 mg/dl) [123]. Định nghĩa của NCEP về hội chứng trao đổi chất trình bày tại Bảng 1.3. Bảng 1.3. Định nghĩa của NCEP về hội chứng trao đổi chất Glucose trong huyết tƣơng lúc đói >110 mg/dl Béo phì vùng bụng (vòng eo >102 cm (đối với nam giới), >88 cm (đối với phụ nữ)) Hàm lƣợng các triglyceride trong huyết thanh >150 mg/dl Hàm lƣợng HDL cholesterol trong huyết thanh 130/85 mmHg Ngày nay thuật ngữ kháng insulin không còn mang ý nghĩa đơn thuần trong điều trị mà chủ yếu dùng để chỉ tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ, tăng huyết áp, béo phì, rối loạn chuyển hóa lipid và kháng insulin đƣợc định nghĩa là tình trạng giảm đáp ứng sinh học của các tế bào, cơ quan, tổ chức đối với tác động của insulin. Kháng insulin đƣợc coi là giai đoạn rất sớm, giai đoạn tiền lâm sàng và thƣờng có trƣớc nhiều năm khi ĐTĐ type 2 xuất hiện [62, 66]. 10
  21. Đặc điểm nổi bật của sinh lý bệnh ĐTĐ type 2 là những rối loạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơ vân, mô mỡ và sự suy giảm chức năng của tế bào beta biểu hiện bằng những rối loạn tiết insulin. Để duy trì nồng độ đƣờng huyết bình thƣờng cần có sự điều hòa 3 yếu tố về insulin: một là bài tiết insulin từ tế bào beta, hai là quá trình thu nạp và sử dụng insulin ở mô ngoại vi (chủ yếu từ cơ vân và một phần ở mô mỡ), thứ ba là ức chế sản xuất insulin ở gan (một phần là ở ruột). Vấn đề nổi cộm trong sinh lý bệnh ĐTĐ type 2 chủ yếu xoay quanh câu hỏi, kháng insulin có trƣớc (tức suy giảm hoạt động của insulin) hay suy giảm bài tiết insulin (suy giảm chức năng tế bào beta) có trƣớc. Nhiều nghiên cứu cho thấy sự suy yếu chức năng bài tiết insulin của tế bào beta đã có ngay từ khi ngƣời bệnh có rối loạn dung nạp đƣờng huyết lúc đói (giai đoạn tiền ĐTĐ). Nhƣng cũng có nhiều ý kiến cho rằng chính những khiếm khuyết trong hoạt động của insulin là nguyên nhân gây suy giảm bài tiết của insulin dẫn đến tăng đƣờng huyết và sau cùng chính sự tăng đƣờng huyết lại có tác động ngƣợc lại làm suy giảm khả năng hoạt động của insulin. Trong thực tế khi đƣờng huyết đã ở mức cao (>10 mmol/l) thì cả quá trình bài tiết insulin của tế bào và khả năng hoạt động của insulin đều bị suy giảm nặng. Về khái niệm kháng insulin, xuất phát từ nhận xét: “trong bệnh ĐTĐ type 2 nhiều khi lƣợng glucose trong máu tăng mà mức insulin máu vẫn bình thƣờng thậm chí còn tăng cao”. Nhƣ vậy, “kháng insulin máu xảy ra khi tế bào không đáp ứng hoặc bản thân tế bào chống lại sự tăng insulin máu”. Trong ĐTĐ type 2 kháng insulin đƣợc xem là giai đoạn sớm của quá trình tiến triển bệnh. Thực tế, ngay ở giai đoạn này cùng với kháng insulin, nhiều rối loạn khác đã xảy ra. Cũng từ thực tế rất nhiều ngƣời bệnh ĐTĐ type 2 có nồng độ insulin trong máu bình thƣờng thậm chí tăng cao, ngay sau khi ăn hoặc uống đƣờng, ngƣời ta đã đặt ra giả thuyết là có sự suy giảm hoạt động của insulin nội sinh. Sự suy giảm này có thể xảy ra ở các khâu nhƣ giảm độ nhạy của insulin, giảm đáp ứng trong bài tiết insulin và cuối cùng là do cả 11
  22. hai nguyên nhân, vừa giảm độ nhạy vừa giảm đáp ứng. Ở những ngƣời mắc bệnh “đái tháo đƣờng kháng insulin”, tuy cơ thể vẫn tiết ra insulin bình thƣờng nhƣng các tổ chức lại không đáp ứng đƣợc với chính insulin tiết ra và cả insulin ngoại sinh. Đó là do hiện tƣợng đột biến trong vùng tyrosine kinase của receptor làm enzym này không hoạt động, do đó không thể xảy ra chuỗi phản ứng tiếp theo mặc dù vẫn còn insulin gắn vào R [106]. Cấu trúc của receptor insulin và vùng tyrosine kinase thể hiện trên Hình 1.3. L1: Domain lớn 1 L2: Domain lớn 2 Fn0, Fn1, Fn2: ba fibronectin type 3 TM: Domain xuyên màng TK: Tyrosine kinase CR: Vùng giàu cysteine Hình 1.3. Receptor của insulin và vùng tyrosine kinase [104] 1.1.3. Biến chứng bệnh đái tháo đƣờng Có hai loại biến chứng: biến chứng cấp tính hôn mê tăng đƣờng máu và biến chứng mạn tính. - Biến chứng cấp tính nhƣ hôn mê nhiễm toan ceton và hôn mê tăng áp lực thẩm thấu gặp khi bệnh nhân không đƣợc điều trị tốt, đƣờng máu tăng lên quá cao có thể đe dọa trực tiếp đến tính mạng của bệnh nhân. Nhiều khi bệnh nhân đƣợc chẩn đoán bệnh ĐTĐ trong tình trạng đƣờng máu tăng cấp tính này chứng tỏ hiểu 12
  23. biết của cộng đồng về bệnh ĐTĐ còn rất hạn chế, các triệu chứng của bệnh đã tƣơng đối rõ ràng trƣớc đó khá lâu nhƣng không đƣợc chẩn đoán và điều trị kịp thời. - Biến chứng mạn tính đặc trƣng của bệnh ĐTĐ bao gồm: + Bệnh lý võng mạc do ĐTĐ + Bệnh cầu thận do ĐTĐ + Bệnh thần kinh do ĐTĐ là những bệnh lý liên quan đến tổn thƣơng mạch máu nhỏ. Quá trình gây nên biến chứng bệnh có thể hình dung nhƣ sau: đƣờng máu cao mạn tính làm gia tăng sự gắn kết đƣờng với các protein (chất đạm) trong các màng tế bào trong đó có các mạch máu. Sự gắn kết này khiến cho chức năng của các cơ quan rối loạn. Đối với mắt là quá trình tắc mạch máu nuôi dƣỡng đáy mắt, hình thành các mạch máu mới rất yếu và dễ vỡ gây chảy máu đáy mắt và tình trạng mù lòa. Bệnh võng mạc do ĐTĐ là nguyên nhân gây mù hàng đầu ở ngƣời lớn từ 20-74 tuổi ở Mỹ. Tại thời điểm mới đƣợc chẩn đoán đã có từ 10-20% số ngƣời mắc ĐTĐ type 2 có bệnh lý võng mạc do ĐTĐ. Sau 20 năm mắc bệnh, hầu hết bệnh nhân ĐTĐ type 1 và khoảng 60% bệnh nhân ĐTĐ type 2 có bệnh lý võng mạc do ĐTĐ. Đối với thận quá trình trên làm dày màng đáy cầu thận và dẫn đến giảm dần chức năng thận và suy thận phải lọc máu chu kỳ. Khoảng 20-30% bệnh nhân ĐTĐ mắc bệnh thận, là nguyên nhân suy thận giai đoạn cuối hàng đầu ở các nƣớc công nghiệp phát triển ở Mỹ và châu Âu [27, 55]. Tổn thƣơng thần kinh do ĐTĐ rất phức tạp, tuy nhiên có một số tổn thƣơng điển hình nhƣ biến chứng bàn chân đau, tê, mất cảm giác nguy cơ cao bị loét và cắt cụt chi; biến chứng thần kinh tự động gây liệt dạ dày, liệt dƣơng . Ngoài ra phải kể đến các bệnh khác tuy không phải là biến chứng trực tiếp của bệnh ĐTĐ song thực sự bệnh ĐTĐ làm gia tăng 3-4 lần các bệnh tim mạch nhƣ tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, đột quị, tắc mạch chi [109]. 13
  24. 1.1.4. Tình hình bệnh đái tháo đƣờng trên thế giới và tại Việt Nam 1.1.4.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới Theo một thông báo vào năm 1998 của các chuyên gia thuộc Tổ chức ĐTĐ quốc tế, tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ĐTĐ trên toàn thế giới là: 110 triệu ngƣời vào năm 1994, 135 triệu ngƣời vào năm 1995, dự kiến năm 2000 là 151 triệu ngƣời. Tuy nhiên con số thống kê thực tế cho thấy số bệnh nhân ĐTĐ trên toàn thế giới trong năm 2000 là 171 triệu ngƣời (chiếm 2,8% dân số thế giới), tức là vƣợt 13% so với dự đoán của năm 1998. Ƣớc tính hiện có 366 triệu ngƣời trên thế giới bị bệnh ĐTĐ, số lƣợng ca bệnh ĐTĐ trên toàn cầu tăng gấp đôi trong ba thập kỷ qua. Trong các trƣờng hợp mắc bệnh ĐTĐ, ĐTĐ type 2 chiếm đa số. Tỷ lệ mắc bệnh tăng nhanh ở các nƣớc đang phát triển là do sự thay đổi về lối sống, thói quen ăn uống, đặc biệt là lối sống ít vận động thể lực. ĐTĐ type 2 tiến triển một cách âm thầm và liên tục, nếu không đƣợc theo dõi và quản lý, điều trị tốt sẽ gây nhiều biến chứng nguy hiểm để lại di chứng nặng nề và đe dọa tính mạng ngƣời bệnh và là một trong những nguyên nhân tử vong chính của bệnh ĐTĐ. Theo khuyến cáo của Tổ chức IDF, trên thế giới mỗi năm có khoảng 3,2 triệu ngƣời chết vì bệnh ĐTĐ, nhƣ vậy một ngày có 8700 ngƣời và mỗi phút có 6 ngƣời chết do ĐTĐ. Trong số 17 triệu ngƣời chết vì đột quị tim mạch thì có 50-70% là do nguyên nhân của bệnh ĐTĐ, nhất là ĐTĐ type 2 thƣờng do phát hiện bệnh muộn. Có 30-90% ĐTĐ type 2 không đƣợc chẩn đoán và 50% bệnh nhân đã có một hoặc nhiều biến chứng vào thời điểm phát hiện bệnh. Nhiều bệnh nhân khi phát hiện bệnh lại không đƣợc quản lý, theo dõi và điều trị đúng chuyên khoa dẫn đến biến chứng sớm và nặng nề ảnh hƣởng đến đời sống của ngƣời bệnh, đồng thời tốn kém kinh tế của gia đình và ngân sách xã hội [59, 118]. Trong thời gian gần đây, xu hƣớng gia tăng bệnh ĐTĐ type 2 ở trẻ em và vị thành niên ngày càng đáng kể (Việt Nam 1%, Naru 30%). Quản lý tốt bệnh nhân ĐTĐ nghĩa là kiểm soát tốt đƣờng huyết và các yếu tố liên quan nhƣ: huyết áp, lipid máu và các yếu tố nguy cơ. Việc kiểm soát chặt chẽ trên bệnh nhân ĐTĐ type 2 bằng nhiều phƣơng pháp điều trị làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong và mức độ tàn phế. 14
  25. 1.1.4.2. Tình hình bệnh ĐTĐ tại Việt Nam Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ của các khu vực đã đƣợc điều chỉnh theo cấu trúc tuổi của quần thể là: tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ toàn quốc là 2,7%, tỷ lệ mắc ĐTĐ ở nữ là 3,7%, tỷ lệ tƣơng ứng ở nam là 3,3%. Tỷ lệ mắc ĐTĐ ở vùng núi cao là 2,1%, vùng trung du là 2,2%, vùng đồng bằng ven biển là 2,7%, vùng đô thị và công nghiệp là 4,4%. Đặc biệt tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở nhóm đối tƣợng có yếu tố nguy cơ, tuổi từ 30 đến 64 chiếm tỷ lệ 10,5%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose là 13,8%. Theo phân loại của Hiệp hội Đái tháo đƣờng quốc tế và Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Việt Nam nằm trong khu vực hai (tỷ lệ 2% - 4,99%) giống của các nƣớc khác trong khu vực nhƣ Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia và thấp hơn các nƣớc thuộc khu vực ba (tỷ lệ 5% - 7,99%) bao gồm Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Singapore, Australia Tỷ lệ mắc ĐTĐ ở VN tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p<0,0005). Ở lứa tuổi dƣới 40 tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ vẫn thấp khoảng dƣới 1%, tỷ lệ bệnh ĐTĐ dƣờng nhƣ tăng nhanh ở hai mốc tuổi là 45 (4,6%) và 60 tuổi (10,1%). Tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose cũng có diễn biến gần giống nhƣ tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ là tăng tỷ lệ thuận theo tuổi (p<0,0005) nhƣng không có mốc tăng đột ngột nhƣ tỷ lệ bệnh ĐTĐ. Tuổi trung bình của các đối tƣợng mắc bệnh ĐTĐ là 52,4 tuổi. Hầu hết ngƣời bị bệnh ĐTĐ đã đƣợc chẩn đoán từ trƣớc đều đang đƣợc điều trị đều đặn (85,8%), số ngƣời bệnh không đƣợc điều trị chỉ có 14,2%. Chế độ điều trị đƣợc áp dụng chủ yếu là thuốc đơn thuần (70,9%), thuốc kết hợp với chế độ ăn (29,1%), chế độ ăn và luyện tập đơn thuần chỉ có 2,9%. Điều này phản ánh thực tế còn yếu trong công tác quản lý nhóm ngƣời có yếu tố nguy cơ mắc bệnh cao trong cộng đồng và nhóm ngƣời mới đƣợc chẩn đoán chỉ cần chế độ ăn và luyện tập để điều chỉnh lƣợng đƣờng huyết. Điểm đặc biệt cần lƣu ý là tỷ lệ ngƣời đƣợc chẩn đoán ĐTĐ chỉ có 35,5% tức là có tới 64,5% ngƣời mắc bệnh ĐTĐ không đƣợc chẩn đoán, cá biệt có những vùng tỷ lệ ngƣời không đƣợc chẩn đoán bệnh lên tới 69,7% [2, 15]. 1.2. SỬ DỤNG THUỐC VÀ THẢO DƢỢC TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG 15
  26. 1.2.1. Sử dụng thuốc trong điều trị đái tháo đƣờng Các chiến lƣợc điều trị hiện nay cho ngƣời mắc bệnh ĐTĐ type 1 và type 2 tuân theo các nguyên tắc hƣớng vào mục tiêu toàn diện, dựa trên tầm quan trọng của việc kiểm soát chuyển hóa và quản lý tốt các yếu tố nguy cơ. Giảm đƣờng huyết vừa là mục tiêu chính của kiểm soát chuyển hóa glucose, vừa là phƣơng tiện quản lý yếu tố nguy cơ do tăng đƣờng huyết gây ra (trực tiếp hoặc gián tiếp). Cải thiện kiểm soát đƣờng huyết làm chậm sự khởi phát và giảm mức độ nặng của các biến chứng vi mạch. Ngƣời ta thấy việc duy trì mức đƣờng huyết bình thƣờng có lợi không chỉ trƣớc mắt mà còn về lâu dài. Có điều những thuốc điều trị ĐTĐ hiện có không phục hồi đƣợc cân bằng nội môi sinh lý bình thƣờng, thậm chí cả khi điều trị tích cực. Đây là nguyên nhân giải thích tại sao các biến chứng mạn tính của ĐTĐ vẫn là gánh nặng, cũng là nguyên nhân nhu cầu cấp bách về những thuốc mới, tốt hơn cho điều trị tăng đƣờng huyết. Những đặc điểm sinh bệnh khác nhau của ĐTĐ type 1 và 2 là cơ sở của các ƣu tiên trị liệu khác nhau. Điều trị ĐTĐ type 1 đòi hỏi sự thay thế ít nhất là một lƣợng insulin nào đó hoặc một chất thay thế tƣơng tự, có tác dụng càng giống insulin của cơ thể càng tốt. Chất này không chỉ bảo đảm duy trì chuyển hóa glucose để lấy năng lƣợng duy trì sự sống và phát triển, mà còn có đƣợc phổ các tác dụng rộng lên bộ gen và các ảnh hƣởng khác để đảm bảo mức sống còn của các chất vận chuyển, enzym và các con đƣờng chuyển hóa chủ chốt. Khi cần, có thể tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp, tuy nhiên điều trị lâu dài thì ƣu tiên là tiêm dƣới da. Các chế phẩm của insulin có thể đƣợc phân loại theo khoảng thời gian tác dụng: tác dụng ngắn, tác dụng trung bình và tác dụng kéo dài; hoặc theo nguồn gốc nhƣ insulin của ngƣời, insulin lợn, insulin bò hoặc là hỗn hợp insulin lợn và bò. Insulin ngƣời (Humulin, Novolin) hiện nay đƣợc dùng rộng rãi do đã sản xuất đƣợc theo phƣơng pháp ADN tái tổ hợp, insulin này dễ tan trong nƣớc do sự có mặt của threonine. Đối với ĐTĐ type 2, khi còn insulin nội sinh, các thuốc mới có thể nhằm chọn lọc vào các khiếm khuyết nội tiết cơ sở của đề kháng insulin và rối loạn chức 16
  27. năng tế bào β. Các can thiệp trực tiếp làm giảm sản xuất dƣ thừa glucose hoặc cải thiện sự sử dụng glucose sẽ luôn đƣợc quan tâm, tuy nhiên, việc giảm đƣờng huyết phải bảo đảm an toàn cho các hoạt động sống khác chứ không phải bằng mọi giá. Các kết hợp hai hay nhiều thuốc nhằm vào các tổn thƣơng khác nhau có thể làm tăng thêm hoặc hiệp lực hiệu quả hạ đƣờng huyết. Các kết hợp tiềm tàng các thuốc điều trị các thành phần khác của hội chứng chuyển hóa có thể quản lý rộng hơn nguy cơ tim mạch [10, 52, 83]. Có sự khác biệt giữa các thuốc chống tăng đƣờng huyết và các thuốc gây hạ đƣờng huyết. Cả hai đều làm giảm sự tăng đƣờng huyết, nhƣng nhóm thứ hai có thể làm hạ thấp đƣờng huyết dƣới mức bình thƣờng, mang nguy cơ hạ đƣờng huyết lâm sàng nghiêm trọng. Điều quan trọng là ở chỗ, trong khi sử dụng các thuốc gây hạ đƣờng huyết nhằm đạt đƣợc hiệu quả giảm đƣờng huyết đầy đủ, lại cần phải thận trọng để các thuốc hạ đƣờng huyết mới này không ngăn chặn hoặc làm hƣ hại nặng quá trình điều hòa đối kháng. Vì thuốc điều trị ĐTĐ phải sử dụng lâu dài, các vấn đề an toàn thuốc nhƣ hạ đƣờng huyết, tƣơng tác thuốc, sự dung nạp đều phải đƣợc quan tâm thích đáng. Lý tƣởng là các thuốc điều trị ĐTĐ mới không đƣợc làm nặng thêm các yếu tố nguy cơ tim mạch hoặc các đặc điểm của hội chứng chuyển hóa, đƣợc ngƣời bệnh thừa nhận sử dụng thuận tiện, thích hợp với lối sống, nghề nghiệp Dƣới đây là các loại thuốc uống dùng trong điều trị ĐTĐ: - Các sulfonylurea: các sulfonylurea đƣợc chia làm hai nhóm hoặc còn gọi là hai thế hệ. Toàn bộ các chất này đều là dẫn chất của arylsulfonylurea. Nhóm sulfonylurea thế hệ 1 gồm có tolbutamide, tolazamide, acetohexamide và chlorpropamide. Các sulfonylurea hạ đƣờng huyết thế hệ 2 có tác dụng mạnh hơn thế hệ 1, gồm có glibeclamide, glipizide và gliclazide. Các sulfonylurea gây hạ đƣờng huyết là do kích thích sự giải phóng insulin từ tế bào beta tuyến tụy, ngoài ra có thể làm tăng nồng độ insulin bằng cách giảm độ thanh thải insulin ở gan. Tác dụng kích thích của sulfonylurea khi dùng kéo dài trên sự tiết insulin là không đáng kể. Đó là do khi dùng lâu dài, tác dụng của sulfonylurea lên thụ thể ở bề mặt tế bào beta của đảo tụy giảm đi. Nếu lúc này, không dùng sulfonylurea trong một thời gian 17
  28. thì đáp ứng của tế bào beta tuyến tụy lại phục hồi khi dùng thuốc trở lại. Tác dụng của sulfonylurea là do thuốc gắn vào và phong bế kênh K+, gây ra sự khử cực màng, làm cho Ca2+ đi vào tế bào qua kênh Ca2+. Các sulfonylurea tăng cƣờng tác dụng của insulin trong tế bào và kích thích sự tổng hợp các chất vận chuyển glucose, các sulfonylurea cũng ức chế sự tân tạo glucose ở gan. - Các biguanide: có nhiều chất thuộc nhóm biguanide có tác dụng làm hạ đƣờng huyết, trong đó có 3 chất đã từng có mặt trên thị trƣờng là metformin, phenformin và buformin. Không giống với sulfonylurea, các biguanide không kích thích giải phóng insulin từ các tế bào beta tuyến tụy, làm giảm sự tăng đƣờng huyết sau khi ăn nhƣng không gây tai biến tụt đƣờng huyết. Cơ chế tác dụng là cải thiện liên kết của insulin và thụ thể, cụ thể là: tăng cƣờng sử dụng glucose trong tế bào, kích thích trực tiếp sự phân hủy glucose trong các mô và tăng vận chuyển glucose từ máu vào mô; làm giảm sự tân tạo glucose ở gan; làm chậm sự hấp thu glucose qua ruột; làm giảm nồng độ của glucagon trong huyết tƣơng. Ngoài ra các biguanide phần nào có ảnh hƣởng tốt trên chuyển hóa lipoprotein. - Dẫn chất thiazolidindion (còn gọi là thiazolindion, hoặc glitazon) gồm: ciglitazon, pioglitazon, rosiglitazon, englitazon làm giảm đƣờng huyết cả lúc đói, cả sau khi ăn ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 do làm tăng sự nhạy cảm của tế bào đích đối với insulin. Do đó, sự thu nạp và sử dụng glucose ở các mô ngoại vi (cơ xƣơng, mô mỡ) đƣợc tăng cƣờng, sự tân tạo glucose và sự sản sinh glucose ở gan bị ức chế. Các thiazolidindion làm giảm sự kháng insulin nên làm giảm nồng độ đƣờng huyết, insulin huyết và HbA1C. Các thiazolidindion làm tăng tác dụng của insulin ở ngƣời bị kháng insulin còn do chúng làm tăng số lƣợng các chất vận chuyển glucose. Khác với sulfonylurea, các thiazolidindion không làm tăng sự tiết insulin từ các tế bào beta của tụy, thuốc không có hiệu quả nếu không có insulin. Giống với các biguanide và các chất ức chế α-glucosidase (nhƣ acarbose), các thiazolidindion không gây tụt đƣờng huyết ở ngƣời không bị ĐTĐ, thậm chí khi dùng liều khá cao, do vậy phải đƣợc gọi là thuốc chống tăng đƣờng huyết hơn là thuốc hạ đƣờng huyết. 18
  29. - Các chất ức chế α-glucosidase: gồm acarbose, miglitol, emiglitat, với cơ chế tác dụng làm giảm sự hấp thu qua ruột của tinh bột, dextrin và các disaccharide, làm chậm sự hấp thu carbohydrate, do đó sự tăng đƣờng huyết sau khi ăn giảm ở cả ngƣời bình thƣờng và ngƣời bệnh ĐTĐ. Acarbose cũng ức chế cạnh tranh với glucomylase và sucrase, nhƣng có tác dụng yếu trên α-amylase của tụy. Acarbose có hiệu quả nhất khi dùng chế độ ăn tinh bột, có nhiều xơ và ít glucose, saccharose. - Các chất ức chế aldose reductase: hiện đã tìm đƣợc khá nhiều các chất có tác dụng ức chế aldose reductase nhƣ tolrestat, epalrestat, ponalrestat, zenarestat, zopolrestat, pimagedin, sorbinil Các thuốc nhóm này không có ảnh hƣởng trực tiếp trên đƣờng huyết mà chỉ có tác dụng chống lại một số tai biến do ĐTĐ, đặc biệt là các tai biến trên hệ thần kinh. - Các thuốc uống chống ĐTĐ thuộc nhóm khác: Glymidin, gôm guar, benfluorex, repaglinide, nateglinide [8]. 1.2.2. Nghiên cứu điều trị ĐTĐ bằng thảo dƣợc trên thế giới Có rất nhiều thực phẩm bổ sung, bao gồm cả thực vật, có thể làm thay đổi nồng độ đƣờng huyết. Ví dụ nhƣ việc sử dụng một lƣợng nhỏ các kim loại nhƣ kẽm, vanadi, crom phổ biến cho các bệnh nhân ĐTĐ type 2 [45, 54]. Tuy nhiên, tác dụng của chúng cần đƣợc nghiên cứu invitro, và các ứng dụng trong điều trị bệnh nhân đôi khi không theo mong muốn. Thật thú vị, một vài nghiên cứu đã cho thấy hoạt tính chống ĐTĐ của thực vật lại liên quan đến thành phần kim loại vi lƣợng của chúng. Hạt của cây trâm mốc hay vối rừng Eugenia jambolana, một loài thực vật của Ấn Độ đã đƣợc nghiên cứu về hoạt tính của các thành phần vô cơ trên mô hình chuột nhắt. Sau khi đốt cháy hạt thành tro, phần còn lại của hạt cháy có chứa crom, kali, natri và vanadi. Khi cho chuột ĐTĐ uống, các thành phần vô cơ này thể hiện khả năng giúp duy trì nồng độ đƣờng huyết ở mức bình thƣờng [40, 95]. Một số loài thực vật có tác dụng làm hạ đƣờng huyết, trong số đó phải kể đến quế (Cinnamomum verum hoặc C.zeylanicum, C.cassia), hồ lô bá (Trigonella foenum graecum), mƣớp đắng (Momordica charantia), dây thìa canh (Gymnema sylvestre) và tỏi (Allium sativum). 19
  30. Thí nghiệm cho chuột ĐTĐ type 2 uống dịch chiết từ quế với liều 50 đến 200 mg/kg chuột/ngày trong vòng 6 tuần, kết quả cho thấy đƣờng huyết giảm xuống một cách đáng kể và nồng độ insulin trong huyết tƣơng tăng lên, cholesterol và triglyceride giảm xuống, trong khi đó nồng độ HDLc tăng lên so với lô chuột bình thƣờng. Trong các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm, đã xác định đƣợc hợp chất trong quế có hoạt tính làm giảm đƣờng huyết là cinnamaldehyde. Dựa trên các xét nghiệm invitro, tác dụng của quế lên đƣờng huyết một phần là nhờ sự tăng cƣờng tiết insulin. Các thành phần có hoạt tính khác trong cây quế là các polyme dạng polyphenol của catechin và epicatechin. Các polyme tan trong nƣớc này có chứa hoạt chất chống oxi hóa và tăng cƣờng hoạt tính của insulin. Sự hoạt hóa insulin bởi các thành phần của quế có thể đƣợc thực hiện thông qua sự tự phosphoryl hóa các thụ thể của insulin định vị trên bề mặt của tế bào mỡ, do đó hỗ trợ thúc đẩy sự truyền tín hiệu insulin và vận chuyển glucose trong tế bào. Một loại thảo mộc khác có tác dụng hạ đƣờng huyết là cây hồ lô bá Trigonella foenum graecum. Các bệnh nhân ĐTĐ type 1 nếu đƣợc uống 100 g bột hạt hồ lô bá hàng ngày (đƣợc chia làm hai phần bằng nhau) trong thời gian 10 ngày sẽ có sự giảm đáng kể mức glucose trong máu lúc đói cũng nhƣ giảm lƣợng glucose tổng số đƣợc tiết ra trong nƣớc tiểu. Mặc dù không có sự thay đổi về mức HDLc tuy nhiên nồng độ cholesterol, LDLc đều giảm một cách đáng kể. Các bệnh nhân ĐTĐ type 2 đƣợc uống 1 g bột hạt hồ lô bá mỗi ngày sau bữa ăn trong sáu tuần, tiếp theo đó là 2g mỗi ngày trong 6 tuần sẽ giúp giảm đáng kể lƣợng glucose trong máu lúc đói. Một trong các thành phần chính của hạt hồ lô bá có tác dụng giảm đƣờng huyết là 4-hydroxyisoleucine. Dựa trên xét nghiệm chuẩn đƣợc thực hiện thƣờng quy tại Mỹ, hợp chất này đƣợc nhận thấy là an toàn thậm chí khi sử dụng với liều lƣợng lớn. Điều này là quan trọng do hồ lô bá đƣợc sử dụng với lƣợng lớn hơn nhiều so với lƣợng thông thƣờng để điều hòa đƣờng máu [95]. Một thảo mộc khác từ Ấn Độ, cây mƣớp đắng (Momordica charantia, họ Cucurbitaceae) đƣợc xác định tại trung tâm y học Ayurvedic - Ấn Độ là có hoạt tính làm giảm đƣờng huyết, nhất là đối với các bệnh nhân ĐTĐ type 2. Mƣớp đắng còn 20
  31. đƣợc biết với tên karela, lê nhựa đắng hay bí đắng. Trong các động vật ĐTĐ thực nghiệm, ngƣời ta đã chỉ ra rằng để khôi phục đƣờng huyết về bình thƣờng trong vòng vài tuần, các con chuột cống ĐTĐ đƣợc uống mƣớp đắng với liều khoảng 20 mg/kg trọng lƣợng cơ thể sẽ có nồng độ đƣờng huyết lúc đói giảm đến 48%. Các cơ chế dự đoán bao gồm sự hấp thụ glucose giảm trong ruột, tăng cƣờng hấp thụ glucose bởi các tế bào cơ xƣơng và sự tái sinh các tế bào beta trong thận để tiết ra insulin. Các nghiên cứu độc học trong động vật không phát hiện thấy có sự thay đổi mô học trong gan và thận cũng nhƣ không có sự thay đổi về chức năng của thận và gan, các enzym hóa sinh và các dấu chuẩn khác giữ nguyên không đổi sau khi cho uống cao mƣớp đắng. Gymnema sylvestre đƣợc gọi là dây thìa canh, một thảo mộc từ Ấn Độ đƣợc sự quan tâm trên toàn thế giới khi xét về phổ hỗ trợ kháng ĐTĐ. Các con thỏ ĐTĐ sau khi cho uống dịch chiết dây thìa canh đƣợc mô tả hoàn toàn bình thƣờng về cân bằng glucose nội môi, hạn chế sự tăng nồng độ đƣờng huyết cũng nhƣ các rối loạn chức năng trao đổi chất. Chữa trị bằng dây thìa canh đã hoạt hóa con đƣờng enzym chuyển hóa glucose bởi tế bào không phụ thuộc vào cơ chế insulin. Nó làm tăng sự chuyển hóa của glucose thành glycogen trong gan và hoạt hóa sử dụng glucose nhờ sự điều khiển khóa hoạt động phosphoryl hóa. Các con chuột cống đƣợc cho uống dịch chiết lá dây thìa canh trong vòng 10 ngày trƣớc khi bị tiêm dƣới da với beryllium nitrate (một hóa chất gây giảm mức đƣờng máu) và 15 ngày sau khi tiêm không bị suy giảm mức đƣờng máu nhƣ các con chuột đối chứng. Các con chuột cống bị tiêm streptozotocin có nồng độ đƣờng huyết tăng đáng kể và thử nghiệm dung nạp glucose bằng đƣờng uống bị bất thƣờng. Tuy nhiên, các con chuột bị tiêm streptozotocin đƣợc cho uống dịch chiết nƣớc lá dây thìa canh đã có sự hồi phục đáng kể cân bằng glucose nội sinh, do sự tăng insulin trong máu đã quay trở về mức bình thƣờng trong vòng thời gian 60 ngày điều trị liên tục bằng đƣờng uống. Hiện tƣợng này là kết quả của sự tái sinh các tế bào beta trong các đảo Langerhans, số lƣợng các tế bào này tăng gấp đôi so với nhóm đối chứng. Tác giả đã gợi ý rằng cơ chế mà ở đó liệu pháp dùng dây thìa canh khôi phục bình thƣờng sự điều hòa 21
  32. glucose có thể liên quan đến sự tái sinh của các tế bào beta. Các thành phần hoạt tính hạ đƣờng huyết trong lá Gymnema sylvestre đã đƣợc xác định là hỗn hợp gymnemic triterpen glycoside acid còn đƣợc biết đến nhƣ các gymnemoside (a đến f) [96]. Cơ chế hoạt động chính lên sự giảm đƣờng huyết có liên quan đến tác động ức chế sự hấp thu glucose từ ruột non. Dƣờng nhƣ các triterpene glycoside từ Gymnema sylvestre phát huy hoạt tính giảm lipid thông qua sự ức chế hấp thu chất béo trong ruột. Tác động lên sự ức chế lipid này có thể giải thích một phần do Gymnema sylvestre thúc đẩy làm giảm cân [97]. Trong mô hình nuôi chuột cống béo và cho uống dịch chiết lá dây thìa canh trong hai tuần đã suy giảm đáng kể trọng lƣợng cơ thể khi so sánh với chuột cống thƣờng đối chứng. Cholesterol, LDL, VLDL, và triglyceride đều giảm đáng kể xuống các mức thông thƣờng so với các con chuột cống đối chứng [105]. Hiện nay đã có 70 nghiên cứu trên thế giới về dây thìa canh, đƣợc sử dụng rộng rãi tại Ấn độ với tên là DIABETICIN, tại Mỹ với tên SUGAREST, tại Nhật với tên GYMNEMA, Singapore với tên GLUCO CARE. 1.2.3. Nghiên cứu điều trị ĐTĐ từ nguồn thực vật tại Việt Nam Hiện nay trên thế giới có nhiều công trình nguyên cứu sản xuất các thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng rất hiệu quả. Ở Việt Nam trong thời gian gần đây cũng có một số nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của một số thực vật, thảo dƣợc, của các vị thuốc trị bệnh ĐTĐ, tuy nhiên số công bố chƣa thật sự nhiều và mang tính toàn diện. Nguồn thực vật dùng làm dƣợc liệu ở nƣớc ta thật sự dồi dào và đa dạng, có những thực vật vốn rất quen thuộc trong đời sống ngƣời dân, đƣợc sử dụng làm nƣớc uống hàng ngày [3, 13, 22]. Một số chế phẩm đƣợc tiêu thụ trên thị trƣờng dƣới dạng thực phẩm chức năng đƣợc biết đến nhƣ chế phẩm DIABETNA bào chế từ dây thìa canh, dƣợc liệu quý hiếm mới đƣợc tìm thấy tại Việt Nam, dựa theo đề tài nghiên cứu của Tiến sỹ Trần Văn Ơn, trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội [25]. Tiến sỹ Đỗ Thị Minh Thìn đã nghiên cứu điều trị ĐTĐ type 2 bằng chế phẩm từ quả mƣớp đắng và sinh địa, thử nghiệm lâm sàng chế phẩm dƣới dạng bột ADM và chế phẩm cao lỏng Remodin trên 80 bệnh nhân, nhận thấy đƣờng huyết của bệnh nhân giảm xuống một cách có ý 22
  33. nghĩa, đối với những bệnh nhân trƣớc khi dùng chế phẩm chƣa đƣợc dùng thuốc đƣờng huyết giảm 42,80% so với trƣớc khi điều trị, còn với những bệnh nhân đã đƣợc dùng thuốc trƣớc tỷ lệ giảm đƣờng huyết là 39,04% [32]. Ngoài ra tác giả Phạm Văn Thanh nghiên cứu về thuốc điều trị bệnh đái tháo đƣờng từ quả cây mƣớp đắng Momordica charantia L Những kết quả bƣớc đầu đánh giá tác dụng của thuốc mới Morantin liều 0,25g/ngày trên bệnh nhân ĐTĐ type 2, tuần thứ 4 sau khi điều trị đƣờng huyết giảm 40, 41% có ý nghĩa thống kê, nói chung đã giảm về gần mức bình thƣờng (đƣờng huyết 7,36 ± 0,28 mmol/l). Các tháng tiếp theo điều trị duy trì với liều thấp bằng ½ liều điều trị tích cực, mức đƣờng huyết của ngƣời bệnh vẫn giữ đƣợc ở mức bình thƣờng. Qua đánh giá bằng các xét nghiệm có liên quan đến chức năng gan, thận, các xét nghiệm về máu thấy rằng các chức năng, thành phần của các cơ quan trên vẫn ổn định bình thƣờng [30]. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Xuân đã bƣớc đầu nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của Thổ phục linh Smilax glabra Roxb. trên chuột nhắt. Kết quả cho thấy mẫu Smilax glabra Roxb. (SG) có tác dụng hạ glucose huyết mạnh nhất vào giờ thứ 4 sau khi tiêm màng bụng. Tác dụng của thuốc phụ thuộc vào liều lƣợng, với liều 100mg/kg mức hạ glucose tối đa là 38%, với liều 200mg/kg mức hạ đƣờng huyết tối đa là 56%. SG với liều 200mg/kg theo đƣờng uống chƣa có tác dụng hạ đƣờng huyết. Nhóm tác giả Phạm Hữu Điển nghiên cứu khả năng hạ đƣờng huyết của sinh địa Rehmannia glutinosa Libosch. và tri mẫu Anemarrhena asphodeloides Bunge Chế phẩm TĐ-1 có thành phần từ củ sinh địa và thân rễ tri mẫu chiết với ethanol thể hiện tác dụng hạ đƣờng huyết khi dùng tiêm màng bụng cho chuột nhắt trắng với các liều 80mg/kg, 120mg/kg và 160mg/kg. Với liều 120mg/kg tác dụng hạ đƣờng huyết bắt đầu xuất hiện ở giờ thứ 4 sau dùng thuốc (hạ 37%), duy trì ở giờ thứ 8 sau dùng thuốc (hạ 45%) . Nhóm nghiên cứu của Phùng Thanh Hƣơng đã xác định đƣợc tác dụng hạn chế tăng đƣờng huyết của thân mƣớp đắng trên một số mô hình chuột gây tăng đƣờng huyết thực nghiệm. Sử dụng thân mƣớp đắng để điều trị sớm và dài ngày 23
  34. trên mô hình chuột nhắt ĐTĐ type 2 cũng có tác dụng duy trì hàm lƣợng glucose trong máu ở mức tƣơng đối thấp và ổn định. Nhóm nghiên cứu này cũng đã nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của diệp hạ châu đắng Phylanthus amarus Shum et Thonn. trên chuột nhắt trắng thực nghiệm [16, 18]. Nhóm tác giả tại Viện Dinh Dƣỡng Việt Nam và Trƣờng Đại học Phụ nữ Nhật Bản đã xác định nụ vối có hàm lƣợng polyphenol cao và có khả năng ức chế enzym α-glucosidase. Thử nghiệm về khả năng hạn chế tăng đƣờng huyết sau ăn của nụ vối trên chuột nhắt khỏe mạnh và chuột Wistar ĐTĐ cho thấy lƣợng đƣờng huyết của nhóm chuột đƣợc cho uống bột nụ vối (500mg/kg cơ thể) giảm một cách có ý nghĩa so với nhóm chuột đối chứng. Ngoài ra nụ vối còn có khả năng chống oxi hóa, phục hồi hoạt động của một số enzym ở gan (GOT, GST, GSH) [80, 81]. 1.3. HOẠT CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT DO ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE 1.3.1. Cơ chế tác dụng của chất gây ức chế enzym α-glucosidase Hiện nay, các liệu pháp điều trị dành cho bệnh nhân ĐTĐ bao gồm insulin và các loại thuốc uống khác nhau nhƣ sulfonylureas, biguanides, chất ức chế enzym α- glucosidase và glinides, các loại thuốc này có thể đƣợc dùng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau để hiệu quả hạ đƣờng huyết tốt nhất [71]. Trong những năm gần đây, các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm nghiên cứu về các hợp chất có khả năng ức chế α-glucosidase có nguồn gốc thiên nhiên nhằm bổ sung làm thành phần của thực phẩm chức năng hỗ trợ cho bệnh nhân đái tháo đƣờng. Có rất nhiều chất ức chế α- glucosidase nguồn gốc thực vật, nhƣ các flavonoid, alkaloid, terpenoid, anthocyanin, glycoside, hợp chất phenolic [48]. Cơ chế tác dụng của chất ức chế enzym α-glucosidase điển hình là Acarbose đƣợc thể hiện trên Hình 1.4. Sau khi ăn, thức ăn đƣợc đẩy qua thực quản vào dạ dày, sau đó tới ruột non. Thức ăn đƣợc nghiền nát, bị phân cắt thành các phân tử nhỏ đơn giản hơn nhờ các enzym có trong ruột. Dịch nhầy trong ruột động vật có vú tiết các disaccharidase nhƣ maltase, lactase, sucrase [37]. Bình thƣờng sẽ có một màng nằm trong biểu mô ruột non liên kết với enzym giúp cho sự hấp thu glucose 24
  35. vào ruột non nhờ phản ứng thủy phân cắt các oligosaccharide thành monosaccharide diễn ra dễ dàng hơn [50, 116]. Hình 1.4. Thủy phân oligosaccharide (trái) - Cơ chế cạnh tranh của Acarbose (phải) [116] α-glucosidase là một carbohydrase loại exo phân bố trong cơ thể vi sinh vật, mô thực vật và động vật, α-glucosidase có trong ruột cũng đƣợc hiểu là maltase, nó xúc tác cho phản ứng thủy phân đƣờng maltose thành các đơn phân glucose, làm tăng nồng độ đƣờng huyết. Glucose là một sản phẩm bị phân giải từ carbohydrate, nó ngấm qua thành ruột non và cuối cùng đi vào dòng máu, quá trình này gọi là sự hấp thụ. Sự ức chế enzym này sẽ làm quá trình giải phóng glucose từ các carbohydrate của thức ăn bị chậm lại. Enzym này bị bất hoạt bởi loại thuốc gọi là các chất ức chế α-glucosidase, điển hình là Acarbose. Acarbose là một oligosaccharide có nguồn gốc từ nấm Actinoplanes. Acarbose gây ức chế cạnh tranh cơ chất oligosaccharide tinh bột với enzym α-glucosidase, làm giảm quá trình giáng hóa của disaccharide, oligosaccharide và polysaccharide thành monosaccharide là dạng có thể hấp thu đƣợc, do đó làm chậm quá trình giải phóng đƣờng glucose cũng nhƣ làm chậm lại sự hấp thụ glucose, kết quả nồng độ đƣờng huyết sau ăn sẽ bị giảm xuống giúp ngăn chặn sự tăng đƣờng huyết sau ăn. Ngoài ra Acarbose không 25
  36. làm tăng insulin huyết, không gây đề kháng insulin, bảo tồn tế bào beta, giảm nồng độ triglyceride và giảm các biến chứng của đái tháo đƣờng [116]. 1.3.2. Tổng quan các dịch chiết thực vật và hoạt chất sinh học có khả năng ức chế α-glucosidase Bảng 1.4 là tổng hợp mới nhất và đầy đủ các thành phần hoạt chất chiết xuất từ những thực vật khác nhau có khả năng ức chế α-glucosidase thể hiện bằng giá trị IC50 (nồng độ gây ức chế tối đa 50% hoạt độ của enzym α-glucosidase). Bảng 1.4: Dịch chiết/hoạt chất chiết xuất từ thực vật có hoạt tính ức chế α- glucosidase Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái Acosmium panamense Vỏ cây Dịch chiết buthanol 109 μg/mL (Onychiuroidea)– Balsamo amarillo [74] Adhatoda vasica Nees Lá Vasicine 125 μg/mL (Acanthaceae) – Cang Vasicinol 250 μg/mL mai [64] * Alstonia scholaris Lá Quercetin3-O-β-D-pylopyranosyl 1,96 mM (m) (Apocynaceae)–Mò cua (1→2″)-β-D- pyranoside 1,95mM (s) [44] * (-)-lyoninesinol3-O-β- D- 1,43 mM (m) glucopyranoside Bergenia ciliate Thân rễ (-)-3-O-galloylepicatechin 560μM (s), 334μM (Saxifragaceae) – (m) Pakhanbhed [49] (-)-3-O-galloylcatechin 297μM (s), 150μM (m) Cassia auriculata – Hoa Dịch chiết methanol 0,023mg/mL Avartaki [74] Cecropia obtusifolia Lá Dịch chiết buthanol 14μg/mL (Cecropiaceae) – Guarumo [74] Chinese aloe Lá Aloeresin A 11,94mM(s) (Asphodelaceae) – Lô 2,16mM (m) hội Trung Quốc [74] Cleistocalyx operculatus Nụ hoa Dịch chiết nƣớc ức chế 68,2±3,4% (Myrtaceae) – Vối [80] * bởi 100mg 26
  37. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái Commelina communis Phần Isoquercitrin 2,4x10-4M (Commelinaceae) – trên Isorhamnetin-3-O-rutinoside 5,1x10-4M Thài lài [74] * không Isorhamnetin-3-O-β-D-glucoside ≥1,0x10-3M Glucoluteolin ≥1,0x10-3M Chrysoriol-7-O-β-D-glucoside ≥1,0x10-3M Orientin ≥1,0x10-3M Vitexin 4,2x10-4M Isoorientin ≥1,0x10-3M Isovitexin ≥1,0x10-3M Swertisin 3,7x10-4M Flavocommelin ≥1,0x10-3M 1-Deoxynojirimycin 1,5x10-4M DMDP 5,8x10-5M Crataegus oxyacantha Lá Apigenin 21,85μM (Rosaceae) – Sơn tra Vitexin 25,11μM [74] * Isovitexin 23,26μM Luteolin 13,07μM Orientin 23,30μM Isoorientin 19,68μM Curcuma longa - Nghệ Demethoxycurcumin 23,0 μM [56] * Bisdemethoxycurcumin Cuscuta reflexa 7’-(3’,4’-dihydroxyphenyl)-N- 103,58μM (Convolvulaceae) - [(4methoxyphenyl) ethyl] Giant dodder [74] propenamide 7’-(4’-hydroxy,3’-methoxyphenyl)- 45,67μM N-[(4-butylphenyl)ethyl] propenamide 6,7-dimethoxyl-2H-1-benzopyran-2- 0,44mM one 2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)- 0,24mM 3,5-dihydroxy-7-O-β-D- glucopyranoside-4H-1-benzopyrane- 4-one Derris indica Rễ 30,40-dihydroxy-4H-furol [2,3-h]- 25,6±0,341 μg/mL 27
  38. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái (Fabaceae) – Bánh dày -chromen-4-one [71] * 3,30,40-trihydroxy-4H-furol [2,3-h]- 37,9±2,6μg/mL -chromen-4-one Karanjin 26,3±1,8μg/mL Pongapin 21,4±0,7μg/mL Pongaglabrone 8,6±0,1 μg/mL Pongamol 58,2±0,2μg/mL Ovalitenone 29,7±0,5μg/mL Pongachromene 22,8±5,5μg/mL Fisetin tetramethyl ether 19,7±0,3μg/mL 3-Methoxy-7-hydroxy-30,40- 36±1,8 μg/mL methylenedioxyflavone 7-Omethylchrysin 28,7±1,8μg/mL 7,4’-dimethoxy-5-hydroxyflavone 4,4±0,1 μg/mL Pinnatin 36,5±5,9μg/mL Pongapinone-B 1,2±0,2 μg/mL Piperonylic acid 18,4±2,2μg/mL Derris scandens Scandenin A 25,17±0,6μg/mL (Fabaceae)–Dây tử quy Scandenone 34,74±0,6 μg/mL [71] * Scandinone 33,83±1,3 μg/mL 4,5,7-rihydroxybiprenylisoflavone 45,14±1,13μg/mL Dịch chiết chloroform 6,28±1,02 μg/mL Dịch chiết n-hexane 10,63±0,31μg/mL Dorstenia psilurus Rễ Dorsilurin F 4,13±0,12 μM (Moraceae) - Đầu nƣa Dorsilurin G 7,51±0,17 μM [74] * Dorsilurin H 24,01±0,46 μM Dorsilurin I 21,49±0,71 μM Dorsilurin J 16,91±0,68 μM Dorsilurin K 43,95±0,46 μM Dorsilurin C 11,17±0,15 μM Duranta repens Toàn bộ 7-O-D-glucopyranosyl-3,5- 65,5±2,5 μM (Verbenaceae) – Thanh cây dihydroxy-3’-(4″-acetoxy-3″- quan [74] * methylbutyl)-6,4’-dimethoxyflavone 3,7,4’-trihydroxy-3’-(8″-acetoxy-7″- 757,8±65,5 μM 28
  39. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái methyloctyl)-5,6-dimethoxyflavone (-)-6β-hydroxy-5β, 8β, 9β, 10α- 577,7±19,0 μM cleroda-3,13-dien-16,15-olid-18-oic acid Ecklonia stolonifera Lá Dịch chiết nƣớc 0,026mg/mL (Laminariaceae) - Tảo Dịch chiết methanol 0,022mg/mL nâu [71] * Elaeodendron Vỏ thân Dịch chiết aceton 50,62±0,351μg/ml transvaalense cây (Celastraceae) - Burtt Davy [71] Euclea undulata Vỏ rễ Dịch chiết aceton 49,95±0,007μg/mL (Ebenaceae) – Guarri lá cây nhỏ [74] Fagara tessmannii Vỏ thân Vanillic acid 69,4±0,8μM (Rutaceae) – Uzazi [74] cây 2,6-dimethoxy-1,4-benzoquinone 900±3,5μM 3β-acetoxy-16β-hydroxybetulinic acid 7,6±0,6μM Ferula mongolica Rễ Baigene A 56,06μM (Umbelliferae) [74] Baigene B 32,21μM Baigene C 63,68μM 7’-Methoxybaigene C 79,87μM Mongolin B 60,0μM 4’-Methoxydshamirone 82,41μM Baigene B 20,5μM Dshamirone 29,15μM Mongolin C 4,36μM Mongolin D 9,31μM Grateloupia elliptica Tảo 2,4,6-tribromophenol (S) 60,3μM (Halymeniaceae) [71] 2,4,6-tribromophenol (B) 130,3μM 2,4-dibromophenol (S) 110,4μM 2,4-dibromophenol (B) 230,3μM Gypsophila Rễ Segetalic acid 23,1±1,8μM oldhamiana 28-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→4)- 65,5±4,5μM (Caryophyllaceae) – α-L-arabinopyranosyl-(1→3)-β-D- 29
  40. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái Xia-cao (C) hoặc Dae- xylopyranosyl-(1→4)-α-L- na-mul (K) [79] rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D- fucopyranosyl ester 3-keto,16α-hydroxy,24-noroleanolic 15,2±1,8μM acid Hyssopus officinalis Lá 1-O-beta-D-6’-O- 3x10-3M (Lamiaceae) – Herb cinnamoylglucopyranosyl-3-(3″,5″- Hyssop [71] dimethoxyl-4″-hydroxyphenyl)- 1,2,3-propanetriol 1-O-beta-D-glucopyranosyl-3- 3x10-3M (3″,5″-dimethoxyl-4″- hydroxyphenyl)-1,2,3-propanetriol Ipomoea balatas Rễ Peonidin (m) 200±4,1μM (Convolvulaceae) – 6-O-Caffeoylsophorose (s) 874±39μM Khoai lang [74] * 6-O-Caffeoylsophorose (m) 699±17,1μM Lobelia chinensis Radicamines A 6,7x10-6M (Campanulaceae) – Radicamines B 9,3x10-6M Bán biên liên [74] * Machilus philippinensis Lá Kaempferol-3-O-α-L- 6,1±0,28μM (Lauraceae) [74] rhamnopyranoside 3″,4″-di-E-p- coumaroic acid ester 3″-E,4″-Z-di-p-coumaroic acid ester 1,0±0,01μM Quercetin-3-O-rhamnopyranoside 33,05±2,68μM Kaempferol-3-O-rhamnopyranoside 228,11±9,5μM Malmea depressa Rễ Dịch chiết buthanol 21μg/mL (Annonaceae) – Elemuy [71] Malpighia emarginata Quả Aceronidin (leucocyanidin-3-O-β-D- 100μM (Malpighiaceae) – Cùm glucoside) rìa [74] * Mangifera indica Vỏ Dịch chiết ethanol 314μg/mL (Malpighiaceae) – Xoài [71] * Morus alba Lá 6-hydroxyapigenin 12μM 30
  41. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái (Moraceae) – Dâu tằm 6-hydroxyapigenin-7-O-β-D- ≥500μM [74] * glucopyranoside 6-hydroxyluteolin-7-O-β-D- 300μM glucopyranoside 6-hydroxyapigenin-7-O-(6-O- ≥500μM feruloyl)-β-D-glucopyranoside 6-hydroxyluteolin-7-O-(6-O- ≥500μM feruloyl)-β-D-glucopyranoside Origanum majorana L. Lá 6-hydroxyapigenin 12 μM (Lamiaceae) – Kinh 6-hydroxyapigenin-7-O- -D- >500 μM giới [71] * glucopyranoside 6-hydroxyluteolin-7-O- -D- >300 μM glucopyranoside 6-hydroxyapigenin-7-O-(6-O- >500 feruloyl)- -D-glucopyranoside 6-hydroxyluteolin-7-O-(6-O- >500 μM feruloyl)- -D-glucopyranoside Penares schulzei – Vỏ cây Schulzeines A 48-170nM Marine sponge [74] Schulzeines B 48-170nM Schulzeines C 48-170nM Pharbitis nil Pelargonidin 60μM (Convolvulaceae)- Hắc sửu [74]* Phyllanthus amarus Toàn bộ Dịch chiết n-hexane 32μg/mL (Phyllanthaceae) - Diệp cây hạ châu đắng [74] * Pine (Pinaceae) – Vỏ cây Dịch chiết vỏ cây (Pycnogenol) 5μg/mL Thông [74] Pine needle (Pinaceae) Vỏ cây Dịch chiết ethanol 155μg/mL – Thông lá kim [74] Piper longum Quả Dịch chiết methanol 112,9±30,5μg/mL (Piperaceae) – Tiêu dài Pipataline 32,1±0,36μg/mL [74] * Pellitorine 34,39±0,97μg/mL Sesamine 36,39±0,58μg/mL 31
  42. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái Brachystamide B 34,09±4,89μg/mL Guineensine 19,26±1,7μg/mL Deoxynojiirimycin 12,23±1,41μg/mL Piper umbellatum Cành Piperumbellactams A 98,07±0,44μM (Piperaceae) – Lân hoa cây Piperumbellactams B 43,8±0,56μM gié [71] * Piperumbellactams C 29,64±0,46μM Psidium guajava Lá Dịch chiết nƣớc 60,8±2,1μg/mL (Myrtaceae) - Ổi [71] * Pteronia divaricata Toàn bộ Dịch chiết acetone 31,22±0,154μg/mL (Compositae) [74] cây Salacia reticulata Rễ Mangiferin (s) 87μg/mL (Hippocrateaceae) – Mangiferin (m) >300μg/mL Kotahla Himbutu [74] (-)-epicatechin (s) 277μg/mL (-)-epigallocatechin (s) 130μg/mL (-)-4’-O-Methylepigallocatechin (s) >300μg/mL Salacinol (s) 0,84μg/mL Kotalanol (s) 0,58μg/mL Scutellaria baicalensis Rễ Baicalein 2,6x10-4M (Lamiaceae) – Hoàng cầm [71] * Sophora flavescens Rễ Kushenol A 45μM (Fabaceae) - Khổ sâm (-)-kurarinone 68μM [71] * Sophoraflavanone G 37μM 2’-methoxykurarinone 155μM Kurarinol 179μM Isoxanthohumol 358μM Kuraridin 57μM Maackian 185μM Spiraea cantoniensis Hoa Quercetin 3-O-(6-O-caffeoyl)-β- 0,085mM (Rosaceae) - Thủ cầu galactoside [74] Kaemferol 3-O-(6-O-caffeoyl)-β- 0,35mM galactoside Kaemferol 3-O-(6-O-caffeoyl)-β- 0,47mM galactoside 32
  43. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái Syagrus romanzoffiana Hạt 13-hydroxykompasinol A 6,5μM (Arecaceae) – Queen scirpusin C 4,9μM palm (cọ nữ hoàng) Dịch chiết ethanol có loại chất béo ức chế 55% tại [75] nồng độ 10 μg/mL Dịch chiết buthanol ức chế 73% tại nồng độ 10 μg/mL Kompasinol A 11,2 μM Scirpusin A 8,3 μM Pentahydroxystilbene 19,2 μM Piceatannol 23,2 μM Resveratrol 23,9 μM Syzygium cumini Hạt Dịch chiết ethanol 70% 24,6±0,7μg/mL (Myrtaceae) – Trâm vối Dịch chiết acetone 19,5±0,4μg/mL [71] * Dịch chiết ethylacetate 16,6±0,3μg/mL Dịch chiết n-buthanol 8,3±0,2μg/mL Syzygium malaccense Vỏ Casuarine 6-O-β-glucoside 5,7μg/mL (Myrtaceae) - Điều đỏ [74] * Terminalia chebula – Hoa Chebulanin 690μM Kha tử [71] * Chebulagic acid 97μM Chebulinic acid 36μM Terminalia superb Vỏ thân Gallic acid 5,2±0,2μM (Combretacea) – Chiêu Methyl gallate 11,5±0,1μM liêu [71] Ellagic acid 194,1±0,2μM Ellagic acid 3,30-dimethyl ether 184,6±0,9μM Ellagic acid-4-o-b-Dxylopyranoside- 118,7±0,1μM 3,30-dimethyl ether Tourmefortia Phần Dịch chiết methanol 3,13mg/mL hartwegiana trên mặt (Boraginaceae) – Bò đất cạp [74] * Tussilago farfara Nụ hoa 3,4-Dicaffeoylquinic acid 0,91mM (Asteracerae) - Khoản 3,5-Dicaffeoylquinic acid 0,90mM đông hoa [63] 4,5-Dicaffeoylquinic acid 0,89mM 33
  44. Bộ phận Thực vật Dịch chiết/Hoạt chất IC50 thu hái 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-b-D- 0,14mM glucopyranose (chuẩn) Viburnum dilatatum Quả Cyanidin 3-sambubioside 3,19mM (Caprifoliaceae) – San 5-Caffeoyl quinic acid 82,18mM dẹp [74] Cyanidin 3-glucoside 25,55mM 5-Caffeoyl-4-methoxy quinic acid 11,12mM Cyaniding 63,29mM Quercetin 29,41mM Chú thích: (m): Maltase, (s): Sucrase, DMDP: 2R,3R,4R,5R2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine, DNJ: 1-deoxynojirimycin, *: thực vật có ở Việt Nam. Việc khai thác nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam có tác dụng hạ đƣờng huyết là một hƣớng nghiên cứu hiện rất có tiềm năng phát triển nhằm mục đích hỗ trợ cho bệnh nhân ĐTĐ, tránh đƣợc các biến chứng nguy hiểm, bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng. 34
  45. CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu và đối tƣợng nghiên cứu - Nguyên liệu: 24 đối tƣợng thực vật Việt Nam (danh sách tại Bảng 2.1). Các mẫu thực vật đƣợc thu hái theo mùa, tƣơng ứng với từng bộ phận thu hái khác nhau mà thời điểm thu hái cũng khác nhau, lúc ra hoa, kết trái, phát triển sinh dƣỡng nhƣ lá, thân , một số mẫu đƣợc mua tại các địa phƣơng. Bảng 2.1. Các mẫu thực vật đƣợc điều tra, nghiên cứu Stt Mẫu thực vật Tên khoa học Bộ phận Nơi thu hái thu hái 1 Actisô Cynara scolymus L. Hoa Sa Pa 2 Bàng Terminalia catappa L. Lá Hải Phòng 3 Bầu đất Gynura procumbens (Lour.) Merr. Thân+lá Hà Nội 4 Cam thảo đất Scoparia dulcis L. Lá Hải Dƣơng 5 Chó đẻ răng cƣa Phyllanthus urinaria L. Thân+lá Bắc Giang 6 Chuối hột Musa balbisiana Colla Củ Hải Dƣơng 7 Cỏ nhọ nồi Eclipta prostrata (L.) Thân+lá Hải Dƣơng 8 Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. Don Thân+lá Hà Nội 9 Hƣơng nhu tía Ocimum tenuiflorum L. Lá Hải Dƣơng 10 Khoai lang tím Ipomoea batatas (L.) Lam Thịt củ Nam Định Aloe vera L. 11 Lô hội (L.) Burm.f., 1768 Thân lá Hà Nội (L.) Burm.f., 1768 12 Lƣợc vàng Callisia fragrans (Lindl.) Woodson Thân+lá Thanh Hóa 13 Mã đề Plantago asiatica L. Thân+lá Hải Dƣơng 14 Nhàu Morinda citrifolia L. Quả Huế 15 Ổi Psidium guajava L. Vỏ thân Hà Nội 16 Rau mùi Coriandrum sativum L. Hạt Hƣng Yên 17 Rau muống tía Ipomoea aquatica Forssk Thân+lá Hà Nội 18 Tía tô Perilla frutescens (L.) Britt. Lá Hải Dƣơng 35
  46. Stt Mẫu thực vật Tên khoa học Bộ phận Nơi thu hái thu hái Tầm gửi trên cây Macrosolen cochinchinensis (Lour.) 19 Lá Vĩnh Phúc mít Blume Cleistocalyx operculatus (Roxb.) 20 Vối Lá Bắc Giang Merr.& Perry 21 Xoài Mangifera indica L. Lá Hải Dƣơng 22 Chè đắng Ilex kaushue S.Y.Hu Lá Cao Bằng Gymnema sylvestre (Retz.) R. Br. ex 23 Dây thìa canh Lá Quảng Trị Schult. Cleistocalyx operculatus (Roxb.) 24 Vối Nụ Bắc Giang Merr.& Perry Theo tham khảo các mẫu thực vật đã đƣợc xác định về hoạt tính hạ đƣờng huyết tại Việt Nam là: lá chè đắng, dây thìa canh, nụ vối [21]. Các mẫu đƣợc xác định tên khoa học bởi PGS.TS.Trần Ninh, Bộ môn Thực vật, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. - Đối tượng động vật: chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lƣợng từ 18– 22g, đƣợc cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ƣơng (trong các thí nghiệm của luận án, “chuột” đƣợc hiểu là “chuột nhắt”). 2.1.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm 2.1.2.1. Hóa chất: Tất cả các hóa chất đều đảm bảo độ tin cậy cho thí nghiệm - Dung môi hữu cơ: n-hexane, methanol, ethanol, ethylacetate, chloroform, n-buthanol, là các dung môi tinh khiết của Merck, Trung Quốc. - STZ (streptozotocin) của hãng Sigma. - Kit ELISA định lƣợng Insulin của hãng Crystal Chem Inc. - Kit LabAssay TM Glucose (Mutarotase-GOD Method) của Wako. - Enzym α-glucosidase chiết tách từ ruột non của chuột (Sigma-Aldrich). - Silicagel 60 (0,04 – 0,063 mm) của hãng Merck. - Bản mỏng tráng sẵn pha thƣờng DC-Alufolien 60 F254 của hãng Merck. - Hóa chất dùng cho định tính thành phần hóa học flavonoid, alkaloid, tannin, steroid, saponin của Sigma và Trung Quốc. 36
  47. - Các hóa chất dùng pha đệm đạt độ tinh khiết: đệm citrate phosphate 0,01M, đệm phosphate pH 6,9, đệm maleate pH 6,9. 2.1.2.2.Thiết bị thí nghiệm Bảng 2.2. Các thiết bị đƣợc sử dụng trong nghiên cứu Stt Tên thiết bị Hãng (nƣớc sản xuất) Thiết bị chiết xuất 1 Máy cất quay chân không WB 4000 HEIDOLPH (Đức) 2 Bộ chiết Soxhlet DURAN-SCHOTT (Đức) 3 Bình chiết mẫu, bình chiết phân đoạn Đức, Việt Nam, Trung Quốc 4 Tủ sấy, tủ ấm MEMMERT (Đức) 5 Tủ hút OPEP (Đức) Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học 6 Tủ lạnh, tủ lạnh sâu SANYO (Nhật) 7 Máy đo đƣờng huyết ONETOUCH JOHNSON&JOHNSON (Mỹ) 8 QueULTRA thử đƣờng huyết ONETOUCH Trung Quốc 9 HệULTRA thống phân tích ELISA BIO-RAD(Mỹ) 10 Máy ly tâm lạnh để bàn SIGMA 3K 30 SIGMA (Đức) 11 Máy đo pH HORIBA F-51BW HORIBA(Nhật) 12 Cân phân tích SATORIUS (Đức) 13 Máy đo quang phổ UVmini-1240 SHIMADZU (Nhật) Thiết bị xác định cấu trúc 14 Cột sắc ký: các cỡ khác nhau PHARMACIA (Mỹ) 15 Máy đo quang phổ BIONET-3 BIONET (Mỹ) 16 Máy đo điểm chảy IA 9300 ELECTROTHERMAL (Anh) Máy đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 17 BRUCKER (Đức) ADVANCE 500 MHZ 37
  48. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc chúng tôi sử dụng kết hợp trong quá trình thí nghiệm hoàn toàn phù hợp với nội dung nghiên cứu đƣợc tóm tắt trong sơ đồ Hình 2.1. 24 mẫu TV Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss Chiết xuất Nuôi béo (HFD) Nuôi thƣờng (ND) CaoCao cồn cồn CaoCao nƣớc nƣớc Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết Tiêm STZ Tiêm đệm Tiêm STZ chọn lọc Chuột ĐTĐ type 2 Chuột không ĐTĐ Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học Chọn lọc các đối tƣợng TV có tác dụng hạ đƣờng huyết tốt nhất D ịc Dịchh chi chiếtết TV TV Bào chế Chế phẩm Thivoda Ảnh hƣởng lên Nghiên cứu Tinh sạch Hoạt tính hình thái tế bào tác dụng hạ và xác ức chế và chức năng đƣờng huyết định cấu enzym α- glucosidase gan chuột trúc một số hợp Nghiê n cứu tác Hoạt tính Xác định chất dụng hạ đƣờng ức chế độc tính huyết trên chuột enzym α- cấp LD50 nhắt ĐTĐ type 2 glucosidase Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 38
  49. 2.2.1. Phƣơng pháp chiết xuất 2.2.1.1. Xử lý mẫu Mẫu thu về đƣợc loại bỏ phần héo úa, rửa sạch, phơi trong bóng râm cho khô, sấy ở 600C cho đến khi mẫu có khối lƣợng không đổi, nghiền mẫu thành bột bằng thuyền tán. Bột mẫu đƣợc bảo quản trong túi polyetylen, để mẫu nơi khô ráo. Riêng mẫu lô hội do thân chứa nhiều gel nên rửa sạch, để cho ráo nƣớc, thái lát mỏng sau đó chiết xuất bằng dung môi. 2.2.1.2. Chiết mẫu bằng nước nóng Bột nguyên liệu đƣợc chiết bằng nƣớc nóng 600C theo tỷ lệ 1:10 (khối lƣợng bột : thể tích nƣớc) trong thời gian 8 tiếng. Tiến hành lọc nóng, thu đƣợc dịch lọc lần 1. Tƣơng tự, phần bã còn lại tiếp tục đƣợc chiết với nƣớc nóng 600C theo tỷ lệ 1:7; 1:5 (tính theo nguyên liệu khô ban đầu) thu dịch lọc lần 2, lần 3. Dịch chiết của cả ba lần đƣợc gộp lại, cô quay chân không thu cao thô nƣớc nóng tổng số (CNN) . 2.2.1.3. Chiết mẫu bằng cồn 600 Mẫu đƣợc ngâm trong cồn 600 lần lƣợt theo các tỷ lệ 1:10; 1:7; 1:5 (khối lƣợng bột nguyên liệu : thể tích cồn) [85]. Tổng thời gian ngâm chiết là 15 ngày. Tiến hành lọc thu dịch chiết, gộp lại, cô quay chân không thu đƣợc cao thô cồn tổng số (CC). 2.2.1.4. Chiết thu phân đoạn trong các dung môi có độ phân cực tăng dần Từ cao thô nƣớc nóng tổng số tiến hành chiết lần lƣợt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethylacetate, n-buthanol [28]. Qui trình tách chiết đƣợc trình bày trong hình 2.2. Các dịch chiết đƣợc cô quay chân không thu hồi dung môi, thu các cao phân đoạn tƣơng ứng: cao chiết bằng n-hexane: CHe, ethylacetate: CEtA, n-buthanol: CBuOH, nƣớc cuối còn lại: CNC. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn thể hiện trên Hình 2.2. 39
  50. Mẫu (bột khô) Nƣớc nóng Lọc Dịch lọc Bã Cô quay chân không Chiết nƣớc nóng Cao nƣớc nóng (CNN) Nƣớc nóng : n-hexane Chiết phân đoạn Dịch n-hexane Nƣớc Cô thu hồi Chiết phân đoạn dung môi 0 Cao n-hexane (CHe) Buthanol 60 Dịch ethylacetate Nƣớc Chiết phân đoạn Cao ethylacetate(CEtA) Dịch n-buthanol Nƣớc Cô thu hồi dung Cô cạn môi Cao n-buthanol (CBuOH) Cao nƣớc (CNC) Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn bằng các dung môi hữu cơ 2.2.2. Phƣơng pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 Hiện có nhiều mô hình gây tăng đƣờng huyết khác nhau trên các đối tƣợng động vật thực nghiệm nhƣ chuột nhắt, chuột cống, thỏ bằng các hóa chất nhƣ streptozotocin (STZ), alloxan [39, 100, 112]. Đề tài luận án chúng tôi đã áp dụng mô 40
  51. hình gây chuột nhắt ĐTĐ type 2: nuôi chuột béo bằng chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với tiêm STZ với liều 120mg/kg của nhóm tác giả Sawant và tập thể [107]. 2.2.2.1. Nuôi chuột nhắt béo bằng chế độ ăn giàu chất béo (HFD- high fat diet) Chuột đƣợc mua từ viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng, đƣợc nuôi ở điều kiện bình thƣờng (12 giờ tối, 12 giờ sáng, nhiệt độ 28 – 300C), trong các lồng riêng để tránh lây chéo xảy ra theo đƣờng hô hấp. Chuột đƣợc cho ăn thức ăn tiêu chuẩn trong 1 tuần đầu để thích nghi với điều kiện môi trƣờng mới. Sau đó đƣợc phân thành 2 nhóm là nhóm ăn thường (ND-normal diet) đƣợc cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (6% chất béo, 20% protein, 60% carbohydrate, 14% các thành phần khác, vitamin và muối khoáng) và nhóm ăn thức ăn giàu chất béo (30% chất béo, 20% protein, 40% carbohydrat, 5% vitamin, các muối khoáng) và bổ sung thóc nảy mầm gọi là nhóm nuôi béo (HFD-high fat diet). Các nhóm chuột đƣợc nuôi trong 8 tuần tại Phòng thí nghiệm chuột bạch của Bộ môn Tế bào–Mô phôi-Lý sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. Tại thời điểm 0 giờ và 8 tuần, tiến hành cân chuột để theo dõi sự tăng trọng của cơ thể. 2.2.2.2. Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 thực nghiệm Để tạo chuột ĐTĐ type 2, các con chuột bị nhịn đói khoảng 12 – 14 giờ, sau đó tiến hành thí nghiệm theo nhƣ bố trí trên Bảng 2.3 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2 Nhóm Tiêm hóa chất Liều tiêm Kết quả thí nghiệm chuột STZ (pha trong đệm citrate HFD 120mg/kg HFD+STZ 0,01M; pH 4,3) HFD đệm citrate 0,01M; pH 4,3 10ml/kg HFD+đệm STZ pha trong đệm citrate ND 120mg/kg ND+STZ 0,01M; pH 4,3) ND đệm citrate 0,01M; pH 4,3 10ml/kg ND+đệm Sau khi tiến hành tiêm STZ, các con chuột tiếp tục đƣợc nuôi bằng chế độ dinh dƣỡng nhƣ ban đầu. Đo nồng độ đƣờng huyết lúc đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau 14 ngày lấy máu định lƣợng đƣờng huyết và insulin. 41
  52. 2.2.2.3. Định lượng đường huyết Định lƣợng đƣờng huyết bằng kỹ thuật enzym, glucose bị oxi hóa nhờ xúc tác của các enzym có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy One Touch Profile Meter của hãng Johnson&Johnson. Nguyên lý: Khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, glucose trong máu sẽ phản ứng với oxi trong không khí nhờ xúc tác của glucooxydase tạo gluconic acid và hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide vừa tạo ra sẽ oxi hóa thuốc nhuộm trên bề mặt vùng phản ứng làm biến đổi màu của giấy thử vùng phản ứng, do oxi hóa O-Dianisidin tạo thành phức chất màu vàng nâu. Máy đo đƣờng huyết sẽ cho kết quả từ 20-600 mg/dl (1,1-33,3 mmol/l). Tiến hành: Chuột đƣợc nhịn ăn 8 tiếng trƣớc khi đo đƣờng huyết. Dùng tay vuốt nhẹ đuôi chuột theo hƣớng đến tận cùng đuôi, sát trùng tại vị trí lấy máu, lau sạch lại bằng bông khô. Dùng kim chích máu ở đuôi chuột, bỏ giọt máu đầu, nặn tiếp lấy giọt máu tròn, cắm que thử vào máy, phủ kín giọt máu này lên vùng phản ứng của que thử, sau một vài giây, đọc kết quả trên màn hình của máy thử. 2.2.2.4. Nghiệm pháp dung nạp glucose Vào ngày thứ 14 sau khi tiêm STZ, mỗi nhóm chọn ra 5 con chuột để nghiên cứu khả năng dung nạp glucose: Nhóm 1: HFD+STZ Nhóm 2: HFD+đệm Nhóm 3: ND+STZ Nhóm 4: ND+đệm Chuột bị nhịn đói 12 tiếng trƣớc khi thí nghiệm. Cho tất cả các con chuột uống glucose với liều 5g/kg cân nặng, pha trong dung dịch nồng độ 20%. Định lƣợng đƣờng huyết tại các thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ sau khi cho uống dung dịch glucose [96]. 42
  53. 2.2.2.5. Định lượng insulin máu chuột bằng kỹ thuật ELISA Nguyên tắc: Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzym (ELISA - Enzym Linked Immunosorbent Assay) Tiến hành: Sử dụng kit Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Xử lý số liệu: Từ dãy insulin chuẩn tiến hành đo mật độ quang tại bƣớc sóng 450nm, xây dựng phƣơng trình và đồ thị hồi qui tuyến tính để tìm mối liên quan giữa OD450nm và nồng độ insulin chuẩn. Định lƣợng nồng độ insulin huyết thanh chuột dựa trên giá trị OD450nm của cơ chất. Chuột nhắt đƣợc xác định ĐTĐ type 2 (chuột ĐTĐ type 2) khi có nồng độ glucose cao (xấp xỉ 18 mmol/l) và nồng độ insulin từ 0,5 – 2,0 ng/ml [107]. 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết trên chuột nhắt ĐTĐ type 2 2.2.3.1. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao thô 24 mẫu thực vật trên chuột nhắt ĐTĐ type 2 Mục đích thí nghiệm: Điều tra khả năng hạ đƣờng huyết trên chuột nhắt ĐTĐ type 2 của cao thô chiết bằng nƣớc nóng (CNN) và cồn 600C (CC) 24 mẫu thực vật. Từ đây khu trú các mẫu thực vật dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Lô thí nghiệm: Chuột ĐTĐ type 2 đƣợc phân lô (mỗi lô 5 con chuột) để nghiên cứu khả năng hạ đƣờng huyết của 48 loại cao thô thực vật bao gồm 24 CNN và 24 CC. Thí nghiệm đƣợc tiến hành thành 4 đợt. Tiến hành thí nghiệm: Vào thời điểm 0 giờ trƣớc khi thí nghiệm, tiến hành đo đƣờng huyết chuột ở lô đối chứng và lô thí nghiệm. Lô chuột ĐTĐ type 2 đối chứng cho uống nƣớc muối sinh lý với liều 10ml/kg. Chuột ĐTĐ type 2 thí nghiệm đƣợc cho uống cao chiết các mẫu thực vật với liều 500mg/kg/ngày vào các buổi sáng hàng ngày. Thí nghiệm đƣợc kéo dài trong 20 ngày. Đƣờng huyết chuột đƣợc xác định tại các thời điểm 0 giờ, 3 ngày, 7 ngày, 10 ngày và 20 ngày, lúc chuột đói. Kết thúc thí nghiệm, xác định các mẫu thực vật có tác dụng hạ đƣờng huyết. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo Bảng 2.4. 43
  54. Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của 24 mẫu thực vật lên chuột nhắt ĐTĐ type 2 Lô Lô Đợt TN Thí nghiệm trên chuột Đợt Thí nghiệm trên chuột chuột chuột 1 Lô đối chứng 1 Lô đối chứng 2 CNN hoa actisô 2 CNN lá chó đẻ răng cƣa 3 CC hoa actisô 3 CC lá chó đẻ răng cƣa 4 CNN lá bàng 4 CNN củ chuối hột 5 CC lá bàng 5 CC củ chuối hột 6 CNN thân + lá bầu đất 6 CNN tía tô I 7 CC thân + lá bầu đất II 7 CC tía tô 8 CNN lá cam thảo đất 8 CNN cỏ nhọ nồi 9 CC lá cam thảo đất 9 CC cỏ nhọ nồi 10 CNN rau muống tía 10 CNN hạt rau mùi 11 CC rau muống tía 11 CC hạt rau mùi 12 CNN chè đắng 12 CNN lá xoài 13 CC chè đắng 13 CC lá xoài 1 Lô đối chứng 1 Lô đối chứng 2 CNN lá dây thìa canh 2 CNN lá mã đề 3 CC lá dây thìa canh 3 CC lá mã đề 4 CNN thân + lá dừa cạn 4 CNN quả nhàu 5 CC thân + lá dừa cạn 5 CC quả nhàu 6 CNN lá hƣơng nhu tía 6 CNN vỏ thân ổi III 7 CC lá hƣơng nhu tía IV 7 CC vỏ thân ổi 8 CNN củ khoai lang tím 8 CNN lá tầm gửi trên cây mít 9 CC củ khoai lang tím 9 CC lá tầm gửi trên cây mít 10 CNN lá lô hội 10 CNN nụ vối 11 CC lá lô hội 11 CC nụ vối 12 CNN thân + lá lƣợc vàng 12 CNN lá vối 13 CC thân + lá lƣợc vàng 13 CC lá vối 44
  55. 2.2.3.2. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân đoạn mẫu lá vối, lá chè đắng trên chuột nhắt ĐTĐ type 2 Mục đích thí nghiệm: Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các cao chiết phân đoạn CHe, CEtA, CBuOH các mẫu lá chè đắng, lá vối. Cho chuột uống cao chiết các phân đoạn với liều tƣơng đƣơng 500 mg/kg/ngày của cao nƣớc [9]. Lô thí nghiệm: Chuột đƣợc bố trí lô thí nghiệm theo Bảng 2.5. Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu phân đoạn mẫu lá vối và lá chè đắng Lô Cao chiết cho chuột uống Lô Cao chiết cho chuột uống 1 Lô đối chứng 6 CHe lá chè đắng 2 CHe lá vối 7 CEtA lá chè đắng 3 CEtA lá vối 8 CBuOH lá chè đắng 4 CBuOH lá vối 9 CNC lá chè đắng 5 CNC lá vối Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc kéo dài trong 20 ngày. Đƣờng huyết chuột lúc đói đƣợc đo tại các thời điểm 0 giờ, 7 ngày, 10 ngày và 20 ngày. Chọn lọc các phân đoạn có tác dụng hạ đƣờng huyết tốt trên chuột để xác định thành phần hóa học. 2.2.3.3. Khả năng hạ đường huyết của chế phẩm Thivoda trên chuột nhắt ĐTĐ type 2 Từ cao nƣớc nóng tổng số các mẫu thực vật, phối trộn chúng tạo các chế phẩm có thành phần khác nhau nhằm chọn lọc một chế phẩm tác dụng hạ đƣờng huyết tốt nhất, chế phẩm này đƣợc đặt tên là Thivoda. Thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của chế phẩm: cho chuột nhắt ĐTĐ type 2 uống chế phẩm Thivoda liều 500mg/kg chuột/ngày. Đƣờng huyết chuột lúc đói đƣợc đo tại các thời điểm 0 giờ, 7 ngày, 10 ngày và 20 ngày. 2.2.4. Xác định chỉ số hóa sinh 2.2.4.1. GOT (glutamate oxalo acetate transaminase ) Tên gọi khác: L-aspartate: 2-oxoglutarate amino transferase (EC 2.6.1.1) [60] 45
  56. - GOT là enzym có trong mọi tổ chức nhƣng nhiều hơn cả là ở cơ tim, gan và cơ xƣơng. - GOT xúc tác phản ứng: L-glutamate + oxaloacetate L-aspartate+α-ketoglutarate 2.2.4.2. GPT (glutamate pyruvate transaminase) Tên gọi khác: L-alanine : 2-oxoglutarate amino transaminase (EC 2.6.1.2) [39,65] - GPT xúc tác phản ứng: L-alanine + α-keto glutarate pyruvate + glutamate 2.2.4.3. Cholesterol Tiến hành theo phƣơng pháp của Deeg R. và Zlegenhorn J. trên máy xét nghiệm hóa sinh máu bán tự động [53]. - Nguyên tắc: Cholesterol esterase Cholesterol este Cholesterol + Acid béo (1) Cholesterol oxidase Cholesterol + O2 Cholesten-3-on + H2O2 (2) Hydroperoxidase 2H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHBS Quinoneimin + 2H2O (3) Quinoneimin có màu đỏ, độ hấp thụ ở 520nm tỷ lệ với nồng độ cholesterol toàn phần trong mẫu thử. 2.2.4.4. Triglyceride - Nguyên tắc: Lipase Triglyceride Glycerol + Acid béo (1) Glycerol kinase Glycerol Glycerol 1 phosphate + ADP (2) G1P oxidase Glycerol 1 phosphate + O2 Dihydroxyaceton phosphate + H2O2 (3) Hydroperoxidase 2H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHBS Quinoneimin + 2H2O (4) [84] 2.2.4.5. HDLc, LDLc HDL cholesterol (HDLc) chiếm 18% lipid của HDL, ở ngƣời giới hạn HDLc đƣợc sử dụng để đối chiếu là mức 35mg/100ml. Khi dƣới 35mg thì rủi ro nhồi máu cơ tim xảy ra gấp 7 lần mức trên 35mg và chỉ tiêu HDLc rất có ích cho việc dự phòng các hậu quả của xơ vữa động mạch. LDLc còn gọi là cholesterol xấu, nó là 46
  57. yếu tố gây xơ vữa động mạch và dễ bị ứ đọng trên bề mặt các mô. Ở ngƣời bình thƣờng LDLc = 3,1 – 4,1 mmol/l. Khi tăng trên 4,9 mmol/l là mức cần điều trị [76]. Các xét nghiệm hóa sinh đều đƣợc tiến hành tại Trung tâm chẩn đoán Y khoa VIPLAB. 2.2.5. Phƣơng pháp làm tiêu bản đúc cắt gan chuột Mẫu sau khi đƣợc cố định 12-24 giờ trong dung dịch Boin đƣợc rửa dƣới vòi nƣớc chảy từ 6-12 giờ để khử chất cố định trong mẫu, sau đó đƣợc chuyển qua cồn tăng dần nồng độ 700, 800, 900, 960, 1000I, 1000II để khử nƣớc, mỗi lọ cồn để mẫu 2 giờ. Tiếp tục cho mẫu qua lần lƣợt cồn 1000 + Toluen với các tỷ lệ 3:1, 1:1, 1:3, Toluen I, Toluen II, mỗi cốc để khoảng 4 giờ để khử cồn và làm trong mẫu. Sau đó cho mẫu lần lƣợt qua Toluen + Parafin tỷ lệ 3:1, 1:1, 1:3 để trong tủ ấm 370C khoảng 12 giờ để cho mẫu ngấm dần parafin rồi cho Parafin I, Parafin II trong tủ ấm 56-580C trong thời gian 4 giờ. Mẫu đƣợc đúc trong Parafin chứa 3-5% sáp ong và đƣợc cắt trên máy cắt microtom quay tay của Mỹ với chiều dày lát cắt là 7 micromet. Các lát cắt đƣợc gắn trên lam kính đã đƣợc bôi 1 lớp albumin mỏng, sau đó đƣợc chuyển tiêu bản vào trong tủ ấm khoảng 12 giờ để cho mẫu gắn chặt vào lam kính. Nhuộm tiêu bản bằng phƣơng pháp nhuộm kép Hematocylin-Eosin theo trình tự sau: Cho tiêu bản lần lƣợt qua Toluen I (20 phút), Toluen II (15 phút) để khử Parafin sau đó lần lƣợt qua cồn + Toluen tỷ lệ 1:1, cồn 1000, cồn 900, cồn 800 và cồn 700, mỗi cốc để 5 phút để khử Toluen và ngấm nƣớc vào mẫu. Sau đó rửa tiêu bản qua nƣớc cất rồi cho tiêu bản vào Hematocylin trong thời gian từ 7-10 phút, tráng tiêu bản qua nƣớc cất rồi nhuộm tiếp bằng Eosin trong thời gian khoảng 20 phút. Tráng qua nƣớc cất hoặc chuyển tiêu bản trực tiếp qua cồn tăng dần nồng độ 700, 800, 900, 960, 1000I, 1000II, mỗi lần 3 phút để khử nƣớc trong tiêu bản. Tiếp tục cho tiêu bản qua cồn + Toluen tỷ lệ 1:1, Toluen I, Toluen II trong 3 phút để khử cồn. Dán Lamelle lên tiêu bản bằng bôm Canada và sau đó chuyển tiêu bản vào trong tủ ấm để bảo quản mẫu. Phân tích tiêu bản và chụp ảnh trên kính hiển vi Olympus. Thí nghiệm thực hiện tại Bộ môn Tế bào- Mô phôi-Lý sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên. 47
  58. 2.2.6. Xác định khả năng ức chế enzym α-glucosidase Qui trình tiến hành phản ứng thể hiện trên Hình 2.3. Ống nghiệm (5ml) 50μl dịch mẫu (đƣợc pha loãng từ 2-5 lần bằng đệm phosphate pH 6,9) Dung dịch enzym gốc 50μL enzym (20U/ml) gồm maltase và sucrase pha trong đệm maleate Ủ ở 370C trong 10 phút 0,1M, pH 6,9 50μL cơ chất (1% maltose trong đệm maleate) maltose 1% (50mg/5 ml đệm) 0 Trộn đều, ủ ở 37 C trong 30 phút Đun sôi trong 10 phút, giữ đá trong 10 phút 500μL PVPP (100mg/mL) 850μL Glucose kit Ủ trong 5’ ở nhiệt độ phòng Đối chứng (-): Đệm + Đệm + Cơ chất + Kit Đối chứng (+): Đệm + Enzym + Cơ chất + Kit Mẫu trắng: Mẫu + Đệm + Cơ chất + Kit Mẫu (+): Mẫu + Enzym + Cơ chất + Kit 2ml nƣớc cất Cách tính % ức chế α-Glucosidase Đọc ở 505 nm A= Đối chứng (+) - Đối chứng (-) B= Mẫu (+) - Mẫu trắng % ức chế = (A-B)/A*100% Hình 2.3. Thử nghiệm hoạt tính ức chế α-glucosidase bởi Glucose Kit α-D-glucose và β-D-glucose trong dung dịch đƣợc duy trì cân bằng với một tỷ lệ cố định, glucose oxidase (GOD) chỉ phản ứng với β-D-glucose, mà không phản ứng với α-D-glucose. α-D-glucose phải đƣợc chuyển thành β-D-glucose nhờ mutarotase. LabAssayTMGlucose là kit phản ứng định lƣợng glucose dựa trên 48
  59. phƣơng pháp enzym với sự kết hợp của mutarotase và glucose oxidase. Khi mẫu (gồm cao chiết thực vật hoặc các chất tinh sạch) đƣợc trộn với enzym, cơ chất và chất phản ứng tạo màu, dạng α-D-glucose đƣợc chuyển thành β-D-glucose bởi mutarotase. β-D-glucose bị oxi hóa nhờ GOD, qua đó có tạo H2O2. Với sự có mặt của peroxidase (POD), H2O2 đƣợc định lƣợng nhờ tạo thành sắc tố màu đỏ do phản ứng oxi hóa kết hợp với 4-Aminoantipyrine và phenol [77]. Dƣới đây là sơ đồ phản ứng : α-D-glucose m utarotase β-D-glucose GOD β-D-glucose + O2 + H2O H2O2 + Gluconic acid POD 2H2O2 + 4-Aminoantipyrine + phenol Sắc tố đỏ + 4H2O 2.2.7. Xác định thành phần hóa học một số mẫu thực vật 2.2.6.1. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học trong một số cao thô thực vật a. Định tính saponin - Phản ứng tạo bọt Pha mẫu thử trong cồn với một lƣợng thích hợp. Lấy 2 ống nghiệm: ống 1 cho vào 5 ml dung dịch NaOH 0,5N (pH 13), ống 2 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N (pH 1). Sau đó cho vào mỗi ống 5 ml dịch chiết mẫu thử. Lắc mạnh hai ống, nếu thấy có nhiều bọt và bền vững trong môi trƣờng kiềm là có mặt saponin steroid, còn nếu thấy có nhiều bọt và bền vững trong môi trƣờng acid là saponin triterpenoid. - Phản ứng màu Lấy vài mg mẫu cho vào ống nghiệm. Sau đó thêm 1 ml anhydric acetic và 1 giọt H2SO4 đặc. Kết quả nếu ống nghiệm có màu xanh có chứa saponin steroid, ống có màu đỏ có chứa saponin triterpenoid. b. Định tính flavonoid Mẫu thử đƣợc pha trong ethanol với một lƣợng thích hợp để làm các phản ứng: - Phản ứng Shinoda: Cho mẫu vào 2 ống nghiệm: ống 1 làm đối chứng, ống 2 nhỏ từ từ vài giọt HCl, thêm một chút bột Mg vào, để 1- 2 phút rồi đun nóng. Phản ứng dƣơng tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu đỏ tƣơi hay màu đỏ cam. 49
  60. - Phản ứng với dung dịch kiềm NaOH 10%: cho mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống làm đối chứng, ống kia cho thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng cho màu vàng đậm là có mặt flavonoid. - Phản ứng với dung dịch H2SO4 : tƣơng tự nhƣ đối với phản ứng NaOH 10%, phản ứng dƣơng tính khi cho màu vàng, đỏ, nâu đỏ. c. Định tính alkaloid Mẫu thử đƣợc pha trong dung dịch H2SO4 2-5% để làm các phản ứng: - Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (HgCl2 và KI trong nƣớc): alkaloid cho kết tủa trắng hay vàng nhạt. - Phản ứng với thuốc thử Dragendorff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acetic acid): alkaloid cho kết quả màu vàng cam cho đến đỏ. d. Định tính tanin - Phản ứng với vanillin: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng còn ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanillin/H2SO4. Phản ứng dƣơng tính khi có màu đỏ đậm. - Phản ứng với FeCl3: mẫu pha cồn nhỏ dung dịch FeCl3 1% nếu ống nghiệm có màu lục tía, xanh lam đen là dƣơng tính. e. Định tính steroid: phản ứng Lieberman-Burchard Hòa tan một lƣợng mẫu nhất định trong dung dịch chloroform chia làm 2 ống: + Ống 1: đối chứng + Ống 2: cho 1 ml dung dịch anhydric acetic và 1 ml dung dịch chloroform 0 đã đƣợc làm lạnh ở 0 C. Thêm một giọt H2SO4, kết quả dƣơng tính khi xuất hiện màu xanh, lục, hồng, da cam, đỏ bền. f. Định tính glycoside: phản ứng Keller-Killian Dung dịch A: 50 ml dung dịch acetic acid 10% và 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% Dung dịch B: H2SO4 đặc và 0,5 ml dung dịch FeCl3 5%. Lấy 0,01 g cắn mẫu thử đã cô cạn cho vào mỗi ống nghiệm. Thêm 1 ml dung dịch A cho hòa tan hết mẫu ống nghiệm và cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu nâu đỏ giữa hai lớp chất lỏng [21]. 50
  61. 2.2.6.2. Phương pháp phân lập các chất a. Sắc ký lớp mỏng Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng. Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp phụ là silicagel. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích đƣợc hòa tan trong một dung môi thích hợp và đƣợc hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch. Sau khi chạy sắc ký xong phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254nm và 368nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu. b. Sắc ký cột Phân lập hoạt chất từ các phân đoạn có tác dụng hạ đƣờng huyết bằng kỹ thuật sắc ký cột mở pha thƣờng và pha đảo. Nguyên tắc của sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha: một cố định và một di động. Trong đó, pha tĩnh đƣợc nhồi vào một cột thủy tinh, pha lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột. Mẫu đƣợc tách đƣợc đƣa vào một đầu của cột. Các phần khác nhau của mẫu sẽ đi qua cột với tốc độ khác nhau, các phân tử có kích thƣớc nhỏ sẽ đi sâu vào mạng lƣới của chất nhồi, còn các phân tử có kích thƣớc lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối lƣợng rất lớn sẽ không di chuyển đƣợc vào các mao quản. Kết quả là thứ tự các chất ra khỏi cột theo khối lƣợng phân tử giảm dần [115]. 2.2.6.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học a. Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. b. Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) Kỹ thuật phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phƣơng pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion phân mảnh khác mà dựa vào đó 51
  62. ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hóa học các hợp chất. Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phổ ESI-MS gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này đƣợc thực hiện với năng lƣợng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI- MS, do đó phổ thu đƣợc chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trƣng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lƣợng thấp, dễ bị phá vỡ. c. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic Resonance ) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay đƣợc dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau này đƣợc biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trƣng của các phân tử còn đƣợc xác định dựa vào tƣơng tác spin các hạt nhân từ với nhau (spin coupling). - Phổ 1H-NMR: Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton đƣợc xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trƣng của độ dịch chuyển hóa học cũng nhƣ tƣơng tác cặp đôi spin mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hóa học của các hợp chất. - Phổ 13C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng đƣợc tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0-240ppm). - Phổ DEPT: Phổ này cho ta những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH3 nằm về một phía và CH2 về một phía trên phổ DEPT 1350. Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH. 52
  63. Ngoài ra, ngƣời ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ 2 chiều rất hiện đại khác, ví dụ nhƣ : HMQC, HOMOCOSY, HMBC + Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): các tƣơng tác trực tiếp H-C đƣợc xác định nhờ vào các tƣơng tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR. Các tƣơng tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ. + Phổ 1H-1H COSY (1H- 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): phổ này biểu diễn các tƣơng tác H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền kề nhau. Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử đƣợc nối ghép lại với nhau. + Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tƣơng tác xa của H và C trong phân tử [88, 101]. 2.2.8. Bào chế chế phẩm Thivoda Từ cao nƣớc nóng tổng số các mẫu thực vật, phối trộn chúng tạo các chế phẩm có thành phần khác nhau nhằm chọn lọc một chế phẩm tác dụng hạ đƣờng huyết tốt nhất, chế phẩm này đƣợc đặt tên là Thivoda. Chế phẩm này bao gồm các thực vật: lá dây thìa canh, lá vối, nụ vối, lá chè đắng, thân và lá chó đẻ răng cƣa. Các dƣợc liệu đƣợc sắc bằng nƣớc dựa theo phƣơng pháp cổ truyền để lấy các chất có tác dụng sinh học. Đem dịch chiết cô đặc thành cao. Cho thêm bột thuốc hay tá dƣợc vừa đủ, làm thành viên nhỏ và làm khô [20, 24, 26]. Chia làm các bƣớc: a. Chế biến cao: Dụng cụ nấu thƣờng là thùng nhôm, không dùng dụng cụ bằng sắt, giữa lòng thùng có đặt 1 ống để múc nƣớc thuốc ra. Xếp bột thảo dƣợc vào thùng xung quanh ống đã đặt sẵn. Trên mặt dƣợc liệu cần đặt 1 cái vỉ để khi sôi thì dƣợc liệu không nổi lên trên. Cho nƣớc vào ngập dƣợc liệu trên 5 – 10 cm nấu từ 4 – 6 giờ và nấu 2 lần. Sau khi thu dịch chiết cần phải cô đặc với nguyên tắc là cô ở nhiệt độ càng thấp càng tốt và thời gian càng ngắn càng tốt. Cách cô chế phẩm là dùng chậu nhôm hoặc men, chƣng cách thủy hoặc đặt vào cát nóng cho thuốc dần cô lại. Nếu chƣa sử dụng ngay thì cần bảo quản bằng 53
  64. cách đổ lên trên bề mặt cao một lớp cồn 950, cô đặc thành cao lỏng theo tỷ lệ 1/1 hoặc 2/1. b. Tạo hạt: Sau khi thu cao của từng loại dƣợc liệu khác nhau sẽ cân với tỷ lệ 1:1:1:1:1 rồi trộn đều. Đun nóng để các cao hòa quyện đều với nhau tạo thành cao tổng, trộn cao lỏng với thuốc bột làm sẵn hoặc tá dƣợc (tinh bột, đƣờng sucrose, glucose, lactose ) theo tỷ lệ qui định thành khối dẻo không dính tay. Để kích thƣớc hạt và màu sắc đƣợc đồng đều ngƣời ta thƣờng chia khối dẻo thành các miếng nhỏ, với độ dày <0,5cm, rộng khoảng 0,5 – 1cm và dài khoảng từ 2 – 3cm. Đem sấy khô ở 600C trong tủ sấy trong vòng 24 giờ để nƣớc bay hơi hoàn toàn. Thu đƣợc các miếng nhỏ màu nâu đen, có mùi thơm của dƣợc liệu. Sử dụng thuyền tán hoặc máy nghiền để nghiền nhỏ các cao khô thành hạt. c. Làm khô: đem các hạt ƣớt sấy khô ở 60 độ C trong khoảng 8 đến 10 giờ cho đạt độ thủy phân của thuốc chiêu ở mức thấp nhất. Để đảm bảo các hạt tƣơng đối đồng đều, rây lại qua rây số 2000 và 710 để loại hạt to quá hoặc nhỏ quá. d. Đóng viên Phần bột mịn thu đƣợc sẽ đƣợc đóng gói vào các viên nang số 0 nhờ dụng cụ đóng thuốc thủ công tự chế. Hình 2.4 là sơ đồ thể hiện qui trình bào chế chế phẩm Thivoda Cao thô nụ Cao thô lá Cao thô chó Cao thô dây Cao thô lá vối vối đẻ răng cƣa thìa canh chè đắng Sấy cốm Khối đồng nhất Kiểm nghiệm Tá dƣợc thành phẩm Sửa hạt Trộn trơn Vô nang Hình 2.4. Qui trình bào chế chế phẩm Thivoda Chế phẩm Thivoda đƣợc bào chế dƣới dạng cốm thành phẩm đƣợc đóng nang, nang đƣợc sử dụng là nang số 0 đƣợc sản xuất tại công ty SUHEUNG CAPSULE (Đồng Nai). 54
  65. Bảo quản: Chế phẩm Thivoda phải đƣợc bảo quản trong các lọ kín, đóng từng liều với số lƣợng 120 viên/hộp, có nhãn đúng qui định. Để nơi khô mát. 2.2.9. Xác định độc tính cấp của chế phẩm Thivoda Nguyên tắc: xác định đƣợc LD50 - liều gây chết 50% động vật thí nghiệm [19] . Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ƣơng. Động vật thí nghiệm: - Chuột nhắt trắng chủng Swiss (18-20g) do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng cung cấp. - Điều kiện chăm sóc: Động vật thí nghiệm đƣợc nuôi trong điều kiện chuồng thoáng mát, đảm bảo vệ sinh, chế độ ăn uống theo nhu cầu của chuột. Thử sơ bộ: - Pha hỗn dịch thử có nồng độ khoảng 0,83 g mẫu thử/ml nƣớc cất - Thăm dò ở mức liều không làm chết chuột thí nghiệm: dùng 5 con chuột, cho mỗi chuột uống 0,4 ml mẫu thử (tƣơng đƣơng mức liều 16,7 g mẫu thử/kg chuột) - Thăm dò mức liều làm chết 100% số chuột thí nghiệm: dùng 5 con chuột, cho mỗi chuột uống 1,2 ml mẫu thử chia làm 3 lần uống, mỗi lần uống 0,4 ml cách nhau 2 giờ (tƣơng đƣơng mức liều 50,0 g mẫu thử/kg chuột). Thử nghiệm chính thức: - Các mức liều thử nghiệm: Mức liều 1: 16,7 g mẫu thử/ kg chuột Mức liều 2: 25 g mẫu thử/ kg chuột Mức liều 3: 33,3 g mẫu thử/ kg chuột Mức liều 4: 41,7 g mẫu thử/ kg chuột Mức liều 5: 50,0 g mẫu thử/ kg chuột - Cách xử lý và chuẩn bị mẫu thử: pha hỗn dịch thử có nồng độ khoảng 0,83 g mẫu thử/ml nƣớc cất (hỗn dịch thử). Tiến hành thí nghiệm: 55