›
›

Giáo trình Chuyển Gene - Nguyễn Thái Thủy

pdf 81 trang huongle 2360
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Chuyển Gene - Nguyễn Thái Thủy", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_chuyen_gene_nguyen_thai_thuy.pdf

Nội dung text: Giáo trình Chuyển Gene - Nguyễn Thái Thủy

  1. CHUYEÅN GENE Nguyeãn Thaùi Thuûy, MSc. National Sales Manager Bio-Rad Laboratories VN Email: thai_thuy@bio-rad.com
  2. NOÄI DUNG Giôùi thieäu kyõ thuaät chuyeån gene Caùc phöông phaùp chuyeån gene ñang ñöôïc söû duïng. Lipofection Electroporation Biolistics Microinjection
  3. GIÔÙI THIEÄU KYÕ THUAÄT CHUYEÅN GENE 1928 – Baùo caùo ñaàu tieân veà chuyeån gene: vi khuaån coù theå thu nhaän sinh chaát naøo ñoù töø moâi tröôøng soáng laøm chuùng thay ñoåi. Chuyeån gene = chuyeån gene/genome töø sinh vaät naøy vaøo genome sinh vaät khaùc.
  4. GIÔÙI THIEÄU KYÕ THUAÄT CHUYEÅN GENE Chuyeån toaøn boä nuclear
  5. TAÏI SAO PHAÛI CHUYEÅN GENE Nghieân cöùu: Bieåu hieän gene trong teá baøo soáng Ñieàu hoøa bieåu hieän gene Taàm soaùt caùc höôùng trò lieäu Sinh hoïc ung thö
  6. TAÏI SAO PHAÛI CHUYEÅN GENE ÖÙng duïng: duøng teá baøo soáng ñeå saûn xuaát caùc vector di truyeàn, protein taùi toå hôïp phuïc vuï cho caùc muïc ñích chuyeân bieät: heo saûn xuaát noäi taïng ngöôøi phuï vuï caáy gheùp, protein trò lieäu taùi toå hôïp theá heä thöù ba ñöôïc taïo ra vaø söû duïng ngay trong teá baøo chuû, thöïc vaät khaùng coân truøng, choáng chòu nhieät ñoä cao, choáng chòu laïnh, choáng chòu haïn vaccine DNA trò lieäu gene
  7. Taïi sao phaûi chuyeån gene Cloning: Cöøu vôùi genome xaùc ñònh
  8. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP CHUYEÅN GENE Khueách taùn thuï ñoäng: vi khuaån thu nhaän DNA khoâng caàn baát kyø xöû lyù ñaëc bieät naøo. Khueách taùn ñöôïc hoå trôï: ví duï teá baøo vi khuaån 0 xöû lyù CaCl2 keøm soác nhieät ôû 42 C. Vector vi khuaån/virus: ví duï Agrobacterium tumefaciens hay CaMV chuyeån DNA vaøo thöïc vaät Lipofection Electroporation Biolistics Microinjection
  9. LIPOFECTION Söû duïng hoùa chaát höõu cô toång hôïp lipid-polyamines thieát keá ñaëc bieät ñeå chuyeån nucleic acid vaøo teá baøo ñoäng vaät höõu nhuõ. Caáu taïo bao goàm ñaàu öa nöùôc (+) vaø ñuoâi kî nöôùc (-). Ñaàu (+) baùm vôùi nucleic acid (-) Lipid micelle phaûn öùng vôùi maøng teá baøo ñeå chuyeån nucleic acid vaøo beân trong teá baøo. Söû duïng ñeå chuyeån DNA/RNA vaøo trong raát nhieàu loaïi teá baøo. Ñoäc tính ñoái vôùi teá baøo thaáp
  10. LIPOFECTION
  11. ELECTROPORATION Electroporation ( chuyeån gene xung ñieän) söû duïng ñieän tröôøng maïnh trong thôøi gian ngaén laøm taïm thôøi maát tính oån ñònh cuûa maøng teá baøo. Trong thôøi gian naøy, maøng teá baøo coù khaû naêng thaám cao ñoái vôùi caùc phaân töû hieän dieän trong moâi tröôøng xung quanh. Nhôø ñoù, DNA/ RNA coù theå ñöôïc chuyeån vaøo teá baøo.
  12. ELECTROPORATION Electroporation
  13. CAÙC ÖU ÑIEÅM CUÛA ELECTROPORATION Khoâng söû duïng hoùa chaát, khoâng laøm thay ñoåi caáu truùc, chöùc naêng cuûa teá baøo ñích Deã thöïc hieän Thôøi gian ngaén Khoâng ñoäc haïi Hieäu quaû cao Coù theå aùp duïng cho nhieàu loaïi teá baøo
  14. ÖÙNG DUÏNG CUÛA ELECTROPORATION Chuyeån caùc gene marker Saùt nhaäp caùc gene chöùc naêng Chuyeån thuoác, protein, moài phaân töû, caùc chaát chuyeån hoùa, khaùng theå ñeå khaûo saùt chöùc naêng vaø caáu truùc cuûa teá baøo.
  15. CÔ CHEÁ • Teá baøo ñöôïc cho vaøo cuvette cuøng vôùi DNA • Cho xung ñieän qua cuvette vaø ñieän tröôøng taïo caùc loã treân maøng teá baøo. • DNA ñi vaøo trong teá baøo qua caùc loã • Khi xung ñieän taét, caùc loã treân maøng teá baøo ñoùng laïi, giöõ laïi caùc DNA beân.
  16. HEÄ THOÁNG GENE PULSER Xcell PC module (Pulse Controller) CE module (Capacitance Extender) Main unit ShockPod
  17. CHÖÙC NAÊNG Taïo hai loaïi xung: daïng haøm muõ giaûm, daïng soùng vuoâng. Ñaùp öùng toái öu vôùi nhieàu loaïi teá baøo, eukaryote hay prokaryote.
  18. CHÖÙC NAÊNG PulsTrac ñaûm baûo cung caáp hieäu ñieän theá chính xaùc. 3ohm resistor Charger Capacitor Cuvette Charging Circuit Discharge Circuit
  19. CHÖÙC NAÊNG ARQ giaûm khaû naêng taïo tia löûa ñieän ôû ñieän theá cao, baûo veä maãu vaø thieát bò Ion tích tuï treân beà maët maãu taïo hieän töôïng tia löûa ñieän
  20. CHÖÙC NAÊNG PC module ñieàu chænh thôøi gian xung ñieän phuø hôïp vôùi ñieän trôû cuûa maãu nhôø ñieän trôû noái song song vôùi cuvette maãu. Nhôø vaäy caùc maãu coù ñieän trôû cao ( vi khuaån) khoâng bò cheát do xung ñieän daøi. 3ohm resistor Charger Resistor in Capacitor Cuvette parallel Charging Circuit Discharge Circuit Pulse Controller
  21. CHÖÙC NAÊNG Chöông trình ñaõ thieát TB ÑVHN TB VK TB Naám laäp saün cho moät soá teá CHO E. coli S. cerivisiae baøo thoâng duïng. Cos7 A. tumefaciens P. pastoris 3T3 P. aeruginosa C. albicans 293 S. aureus S. pombe HeLa B. cereus D. discoideum BHK21 S. pyogenes A549 L. plantrum CV1 K562 HL60 Jurkat HuT78
  22. BIOLISTICS- BAÉN GENE Chuyeån nucleic acid vaøo trong teá baøo baèng caùch baén vi ñaïn phuû nucliec acid vaøo chuùng. Helios Gene Gun PDS-1000/He
  23. ÖU ÑIEÅM Phöông phaùp ñôn gæan, nhanh, linh ñoäng Khoâng phuï thuoäc loaïi teá baøo Söû duïng ít DNA Chuyeån moät hoaëc nhieàu gene Coù theå chuyeån ñoaïn DNA lôùn Khoâng chuyeån gene khoâng mong muoán hoaëc protein Ít thao taùc treân teá baøo Ñoä laäp laïi cao
  24. Helios Gene Gun Suùng caàm tay – coù theå aùp duïng thöïc ñòa Aùp suaát 100 – 600 psi Vuøng ñích nhoû cho pheùp ñònh vò muïc tieâu chính xaùc
  25. ÑOÁI TÖÔÏNG In vitro – teá baøo ñoäng vaät, thöïc vaät nuoâi caáy, cô quan In vivo – ñoäng vaät, thöïc vaät, giun, coân truøng, naám men, taûo, vi khuaån vaø caùc vi sinh vaät khaùc In situ – Moâ thöïc vaät, cô quan nuoâi caáy
  26. LÓNH VÖÏC NGHIEÂN CÖÙU Bieåu hieän gene Lieäu phaùp gene Mieãn dòch di truyeàn Sinh hoïc ung thö Haøn veát thöônmg Beänh nhieãm truøng Ñaùnh daáu maøu caùc neuron
  27. QUY TRÌNH
  28. Vi ñaïn vaøng Vi ñaïn baèng vaøng vì: . Vaøng khoâng gaây ñoäc cho teá baøo . DNA gaén leân vaøng khoâng bò phaân huûy
  29. Chuaån bò oáng ñaïn
  30. CÔ CHEÁ HOAÏT ÑOÄNG
  31. CHUYEÅN GENE in vitro b-gal expression in CHO cells
  32. THOÂNG SOÁ CHO in vitro Aùp suaát Helium 100 – 200 psi Kích thöôùc vi ñaïn 1.6 µm Soá löôïng DNA 0.5 – 2.5 µg DNA/mg gold (0.06 – 1.25 µg DNA/cartridge) Soá löôïng vi ñaïn 0.125 – 0.5 mg/tube
  33. CHUYEÅN GENE in vivo 0.5mg vi ñaïn vaøng 400 psi, 24 hours sau baén gene
  34. THOÂNG SOÁ CHO in vivo Aùp suaát Helium 200 – 400 psi Kích thöôùc vi ñaïn vaøng 1.6 µm Soá löôïng DNA 1.0 – 2.5 µg DNA/mg gold (0.12 – 1.25 µgDNA/cartridge) Soá löôïng vi ñaïn vaøng 0.25 – 0.5 mg/tube
  35. CHUYEÅN GENE ÔÛ GIUN
  36. CHUYEÅN GENE ÔÛ LAÙ CAÂY • Chuyeån cDNA virus vaøo khoai taây. Tuija Kekarainen and Jari P. T. Valkonen, Department of Plant Biology, Swedish
  37. MAÃU CAÉT NAÕO CHOÀN FERRET Dr. Donald Lo / Duke University
  38. HEÄ THOÁNG PDS-1000/He in vitro, ex vivo (vaø in vivo cho moät soá thöïc vaät, vi sinh vaät) Aùp duïng cho teá baøo ñoäng vaät, cô quan nuoâi caáy, teá baøo vaø moâ thöïc vaät nuoâi caáy, phaán hoa, coân truøng, taûo, naám vaø vi khuaån Aùp suaát trong khoaûng 450 - 2200 psi Vuøng baén lôùn – nhieàu teá baøo ñöôïc chuyeån
  39. ÑOÁI TÖÔÏNG • In Vitro – Teá baøo vaø cô quan ñoäng vaät nuoâi caáy, teá baøo thöïc vaät • Ex vivo – moâ vaø phaán hoa thöïc vaät • In vivo - moät soá thöïc vaät, coân truøng, taûo, naám, vi khuaån vaø moät soá vi sinh vaät
  40. LÓNH VÖÏC NGHIEÂN CÖÙU • Bieåu hieän gene • Coâng ngheä sinh hoïc noâng nghieäp vaø phaùt trieån muøa vuï – vaccine cho thöïc vaät • Khaùng beänh
  41. PDS-1000/He
  42. CHUAÅN BÒ MAÃU
  43. PDS-1000/He Rupture Disk
  44. PDS-1000/He Naïp Macrocarrier 1 2 3 4
  45. PDS-1000/He Naïp Teá Baøo Ñích
  46. PDS-1000/He Baén
  47. THOÂNG SOÁ Vacuum Target dist Helium Kích thöôùc vi ñaïn ins Hg cm psi Vi Khuaån 29 6 1100 M5 Tungsten Naám Men 28 6 1300 0.6m vaøng Taûo 29 6 1300 0.6m vaøng TB Thöïc Vaät 28 9 1100 1.0m vaøng TBÑoâng Vaät 15 3 1100 1.6m vaøng
  48. Luùa Maïch Chuyeån Gene Peggy G. Lemaux and colleagues / UC Berkeley
  49. PDS-1000/Hepta • Boä chuyeån ñoåi cho 7 ngoõ ra • Taïo vuøng baén lôùn • Thích hôïp soá löôïng lôùn maãu • Aùp duïng cho teá baøo vaø cô quan ñoäng vaät nuoâi caáy, teá baøo vaø moâ thöïc vaät, naám men vaø vi khuaån
  50. So Saùnh Helios va øPDS Helios Gene Gun PDS1000/He PDS1000/He Hepta Ñieàu kieän thí In situ, in vitro In vitro, ex vivo in vitro, ex vivo nghieäm In vivo, ex vivo in vivo (plants) in vivo (plants) Kích thöôùc vuøng nhoû (2cm2) lôùn (40cm2) Lôùn nhaát (~75cm2) baén Aùp suaát 100-600psi 450-2200psi 450-2200psi Loaïi ñích Ñoäng vaät: moïi loaïi moâ Ñoäng vaät: teá baøo vaø Ñoäng vaät: teá baøo vaø cô coù theå tieáp xuùc tröïc cô quan nuoâi caáy quan nuoâi caáy tieáp; da, cô quan; teá baøo, moâ, cô quan nuoâi Thöïc vaät: thöïc vaät Thöïc vaät: teá baøo vaùch caáy nhoû nguyeân veïn, teá moûng baøo vaø moâ nuoâi caáy Thöïc vaät: treân ñoàng Naám men, vi khuaån, ruoäng, nhaø kính, moâ Naám men, vi khuaån, Vi sinh vaät vaø teá baøo nuoâi caáy Vi sinh vaät Naám men, vi khuaån, Vi sinh vaät
  51. MICROINJECTION ÑAËC HIEÄU Nhaém ñeán moät teá baøo Thao taùc vaät lyù teá baøo Cho vaøo hoaëc laáy ra caùc thaønh phaàn cuûa teá baøo
  52. THAØNH PHAÀN Kính hieån vi
  53. THAØNH PHAÀN Kính hieån vi, boä vi thao taùc
  54. THAØNH PHAÀN Kính hieån vi, boä vi thao taùc, boä vi tieâm
  55. Thaønh phaàn cuûa heä thoáng Vi thao taùc: • motor töï ñoäng – 3 truïc – Di chuyeån 25mm – Ñoä phaân giaûi 40nm Boä ñieàu khieån Tay ñieàu khieån joystick – Joystick treo – Coù boä nhôù vò trí
  56. Thaønh phaàn cuûa heä thoáng • Boä giao dieän ñieàu khieån Vi tieâm kyõ thuaät soá: • Boä neùn beân trong • 2 keânh aùp suaát -350 ñeán +5600 hPa – Giöõ – Tieâm/chuyeån
  57. Thaønh phaàn cuûa heä thoáng Vi Tieâm Ñoàng Boä: • syringe micrometer • 2 vaän toác • Töông thích nhieàu theå tích • Duøng daàu hoaëc nöôùc
  58. ÖÙNG DUÏNG Taïo ñoäng vaät chuyeån gene Vi tieâm teá baøo coá ñònh Thuï tinh nhaân taïo
  59. TEÁ BAØO KHOÂNG COÁ ÑÒNH • 2 microtools – Giöõ – Bôm/chuyeån • Aùp suaát thaáp – Döông (tieâm) – Aâm (giöõ, huùt)
  60. VI TIEÂM TIEÀN NHAÂN Hôïp töû ôû giai ñoaïn tieàn nhaân cuûa teá baøo ñoäng vaät höõu nhuû ñöôïc tieâm dung dòch DNA. Tieâm DNA vaøo trong tieàn nhaân Hôïp töû phaùt trieån thaønh caùc theå coù theå bieåu hieän chuyeån gene
  61. CHUYEÅN TEÁ BAØO MAÀM Phoâi chöa bieät hoùa chöùa khoaûng 100 teá baøo maàm ñöôïc chuyeån vaøo moät soá teá baøo maàm mang ñoät bieán gene quan taâm Phoâi phaùt trieån thaønh caù theå mang theå khaûm.
  62. CHUYEÅN NHAÂN Teá baøo tröùng ñöôïc laáy toaøn boä nhaân ra baèng vi huùt Chuyeån nhaân teá baøo sinh döôõng vaøo teá baøo tröùng Keát quaû taïo doøng voâ tính (cöøu Dolly 1996)
  63. intracytoplasmic sperm injection (ICSI) Teá baøo tröùng ñöôïc vi tieâm tinh truøng Thuï tinh nhaân taïo
  64. TEÁ BAØO COÁ ÑÒNH • phase contrast • Goùc thao taùc 45 ñoä • 1 vi thao taùc • 1 vi tieâm kyõ thuaät sooâ1
  65. Biolistics Gene Pulser Xcell Helios Gene Gun PDS-1000/He Electroporation MicroPulser Cuvettes ElectroCompetent Cells Gene Transfer XenoWorks GT Reagents Microinjection Competent Cells Lipid Lipid Transfection
  66. ÖÙng duïng môùi: RNAi trong öùc cheá HBV ôû chuoät. McCaffrey, A. P. et al. Cô cheá töï nhieân coù ôû haàu heát eukaryotes giuùp ñieàu hoaø bieåu hieän gene lieân quan ñeán quaù trình bieät hoùa, hay choáng laïi söï xaâm nhaäp cuûa virus. • RNAi: RNA interference, RNA maïch ñoâi baùm vaøo mRNA laøm baát hoaït bieåu hieän gene. • siRNA: small interfering RNA
  67. RNAi vaø Central Dogma A B
  68. Cô Cheá RNA 21-25 nt siRNA hoaëc dsRNA (>25 nt) Böôùc 1: dsRNA> 25nt vaøo trong teá baøo, Dicer endonuclease caét dsRNA thaønh siRNAs (MacRae et al.2006), hoaëc chuyeån caùc siRNA <25 nt vaøo trong teá baøo Dicer siRNA Böôùc 2: siRNAs gaén vôùi phöùc hôïp protein RISC (RNA-induced silencing RISC complex) vaø loaïi boû bôùt moät maïch Nhaän bieát ñôn RNA. muïc tieâu RISC Phaân caét Böôùc 3: RISC-siRNA gaén ñaëc hieäu boå xuang vôùi mRNA ñích vaø phaân caét mRNA naøy. mRNA bò phaân huûy
  69. Quy Trình Thí Nghieäm RNAi siRNA Chuyeån voâ teá baøo ñích Phaùt hieän vaø phaân tích Protein Expression Gene Expression • 2-D Analysis • qRT-PCR • Western Blots • Microarrays • Bio-Plex assays • Northern Blots
  70. Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : qRT-PCR Phaân tích Protein Expression (2D, Bio-Plex, Western blotting) Phaân tích RNA (Chaát Microarray Chuaån bò RNA löôïng, hieäu suaát) •Aurum Total RNA Kits •Experion System •SmartSpec Plus •VersaFluor fluorometer Chuyeån RNAi • siLentFect • Transfectin •Gene Pulser Xcell iScript cDNA kits Reverse iQ Supermixes Transcription & iTaq Supermix amplification iProof polymerase PCR instrument Phaân tích •Real time PCR Systems (iQ 5, Chromo 4, MyiQ)
  71. Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : Microarray Taïo microarray Chuyeån RNAi Chuaån bò RNA Phaân tích RNA (soá slides löôïng, hieäu suaát) •BioOdyssey Calligrapher •Gene Pulser Xcell •Aurum Total RNA Kits •Experion System MiniArrayer •siLentFect Lipid Reagent •TransFectin (vector-based) •SmartSpec Plus •VersaFluor Xaùc ñònh laïi qRT-PCR Label probes baèng Cy3 & CY5 Scan möùc ñoä bieåu hieän Lai treân Phaân tích microarray •GeneGazer Software •VersArray analyzer 5.0 • VersArray ChipReader • VersArray Hybridization Chamber
  72. Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : ñieän di SDS-PAGE vaø blotting Chuaån bò maåu Ñaùnh giaù soá löôïng vaø protein hieäu suaát SDS-PAGE •Protein Prep kits Experion System •Mini-PROTEAN 3 Cell •Premixed Sample Buffers SmartSpec Plus •Ready Gel Precast Gels VersaFluor Fluorometer •Criterion Cells + Precast Gels Protein Assays (Bradford, RC DC, ) •PROTEAN Plus and PROTEAN Cells Chuyeån RNAi •Protein Standards •Power supplies Gene Pulser Xcell • siLentFect Lipid Reagent (siRNA) •TransFectin or HEKFectin (vector-based) Blotting/Transfer •Protein Blotting Membranes •Protein Blotting Cells •Protein Blotting Buffers Chuïp aûnh vaø phaân tích Ñaùnh daáu/ phaùt hieän • Molecular Imager FX Pro Systems • Immun-Star Chemiluminescent Kits • VersaDoc systems • Immun-Blot Colorimetric Assay Kits • ChemiDoc XRS system • Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot Kit • Gel Doc XR system • Opti-4CN Substrate and Detection Kits • Quantity One 1-D Analysis Software • Colorimetric Blotting Substrates; Conjugated 2o Antibodies
  73. Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : ñieän di 2D Chuaån bò maãu protein 1st dimension IEF 2nd dimension SDS-PAGE •Aurum serum protein mini kits •PROTEAN IEF Cell •Mini-PROTEAN 3 Cell •Aurum Affi-Gel Blue mini kits •ReadyStrip IPG Strips •Ready Gel Precast Gels •Aurum ion exchange mini kits •Power Supplies •Criterion Cells + Precast Gels •ReadyPrep 2-D Starter kit •PROTEAN Plus and PROTEAN Cells Phaân tích Protein •Premixed Sample Buffers Expression (Bio- •Protein Standards Plex, Western •Power Supplies blotting, etc); or qRT-PCR, Microarrays Chuyeån RNAi Gene Pulser Xcell • siLentFect Lipid Reagent (siRNA) •TransFectin or HEKFectin (vector-based) Nhuoäm gel •Silver stain •Coomassie Blue •SYPRO Ruby •Dodeca stainers Xaùc ñònh caùc spot Caét caùc spot quan Chuïp aûnh vaø phaân tích baèng Mass Spec taâm •Molecular Imager FX Pro systems •EXQuest Spot Cutter •VersaDoc systems, PDQuest software
  74. Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : Bio-Plex (qRT-PCR, Microarrays, Northern blots) Western Chuaån bò maãu protein Bio-Plex Assays blotting •Bio-Plex Cell Lysis Kit •Bio-Plex Phosphoprotein Assays •Bio-Plex Total Target Assays • siLentFect Chuyeån RNAi • Transfectin • HEKFectin • Gene Pulser Xcell Phaân tích bieåu hieän Bio-Plex Suspension Array System
  75. Chuoät ñöôïc chuyeån plasmid mang boä gene HBV vaøo gan: bieåu hieän beänh, HBV coù sinh saûn Chuoät ñöôïc chuyeån theâm plasmid coù siRNA chuyeân bieät cho HBV mRNA: öùc cheá sinh saûn HBV.
  76. Trieån voïng: ñieàu trò HBV, beänh nhieãm virus Vaán ñeà caàn giaûi quyeát: phöông phaùp chuyeån gene öùng duïng cho ñieàu trò khoâng aûnh höôûng ñeán teá baøo chuû.