Giáo trình Công nghệ ADN Tái tổ hợp - Đinh Đoàn Long

54 trang huongle 4150

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Công nghệ ADN Tái tổ hợp - Đinh Đoàn Long", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_cong_nghe_adn_tai_to_hop_dinh_doan_long.pdf

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ ADN Tái tổ hợp - Đinh Đoàn Long

§§§¹i§¹i häc khoa häc tù nhiªn §§§¹i §¹i häc quèc gia hµ néi Khoa sinh häc bé m«n di truyÒn häc CÔNG NGH Ệ ADN TÁI T Ổ H ỢP §§§INH§INH §§§OµN§OµN LONG Di Di truyÒn Di häc ph©n tötö tövµ tÕ tÕ tÕbµo
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 3
Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp (recombinant DNA) ®−îc dïng ®Ó chØ c¸c ph©n tö ADN ®−îc t¹o ra tõ hai hay nhiÒu ph©n ®o¹n ADN xuÊt xø tõ c¸c nguån gèc kh¸c nhau. Trong thùc tÕ, c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp ®«i khi ®−îc dïng ®ång nghÜa víi c¸c thuËt ng÷ nh©n dßng ph©n tö (molecular/DNA cloning), hay kü thuËt di truyÒn (genetic engineering). Nh−ng thùc chÊt c¸c thuËt ng÷ nµy cã kh¸c nhau. 4
Kh¸i niÖm chung Môc ®Ých 1. Ph©n lËp c¸c gen tõ hçn hîp nhiÒu gen trong tÕ bµo, ®Ó cã thÓ ph©n tÝch vµ nghiªn cøu tõng gen riªng lÎ. 2. Nh©n mét dßng gen ®· ®−îc ph©n lËp lªn mét sè l−îng lín, ®Ó ®¸p øng ®ñ cho nhu cÇu nghiªn cøu. 3. Kh¶ n¨ng t¹o ra nh÷ng gen/tæ hîp gen míi. VËt liÖu t¸ch dßng gen 1. ADN 2. mARN (sö dông kü thuËt RT-PCR). 5
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 7
ADN t¸i tæ hîp thùc hiÖn nh− thÕ nµo? C¸c b−íc c¬ b¶n thùc hiÖn ADn t¸i tæ hîp 1. Chän nguån gen cÇn t¸ch dßng chøa tr×nh tù quan t©m. 2. ChuÈn bÞ ADN ngo¹i lai cã c¸c ®Çu 3’, 5’ phï hîp. 3. Chän läc vÐct¬ (thÓ truyÒn) phï hîp. 4. C¶i biÕn ®Çu 3’ vµ 5’cña vÐct¬ vµ ph©n tö ADN ngo¹i lai. 5. Nèi ph©n tö ADN vÐct¬ vµ ADN ngo¹i lai. 6. §−a vÐct¬ t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ vµ nh©n lªn. 7. Sµng läc ®Ó chän c¸c dßng tÕ bµo mang vÐct¬ t¸i tæ hîp. 8. X¸c ®Þnh ®Æc tÝnh c¸c dßng, vµ sö dông c¸c dßng cho c¸c môc ®Ých nghiªn cøu kh¸c nhau. 8
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 9
T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch axit nucleic Mét sè nguyªn t¾c c¬ b¶n T¸ch chiÕt ADN C¸c dung m«i h÷u c¬ lµm mÊt n−íc, thay ®æi m«i tr−êng ®iÖn m«i → → kÕt→ tña protein & ADN. §é pH th−êng trung tÝnh hoÆc h¬i kiÒm (7,0 – 8,5). Phenol, chloroform, isoamylalcohol th−êng ®−îc dïng ®Ó kÕt tña protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1). Mét sè hîp chÊt chèng oxy hãa nh− 2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline lµm gi¶m nguy c¬ g©y biÕn tÝnh axit nucleic. SDS lµm vì mµng tÕ bµo. EDTA lo¹i c¸c ion kim lo¹i. CTAB lo¹i bá c¸c hîp chÊt polysaccharide / polyphenol ë thùc vËt. Lysozyme ®−îc dïng ®Ó ph©n gi¶i líp peptidoglycan ë vi khuÈn. C¸c dung m«i alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) ®−îc dïng ®Ó kÕt tña axit nucleic. C¸c muèi (vd. acetate) trung hßa ®iÖn tÝch vµ lµm gi¶m kh¶ n¨ng tan cña axit nucleic. To -20 oC / 0oC (1/2h – 24h). 10
T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch axit nucleic ADN vµ ARN trong n−íc BỔ SUNG LẮC LY TÂM PHENOL MẠNH Phenol ADN, ARN vµ Protein protein trong trong phenol pha n−íc DÙNG PHENOL LO ẠI PROTEIN KH ỎI D ỊCH CHI ẾT ADN VÀ ARN 11
T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch axit nucleic Mét sè nguyªn t¾c c¬ b¶n T¸ch chiÕt aRN §Ó t¸ch chiÕt mARN, ng−êi ta th−êng dïng cét Oligo dT – celluloza, hoÆc cét hÊp thô tõ tÝnh víi biotin-oligo(dT). §Þnh tÝnh vµ ®Þnh l−îng ADN dùa trªn ph−¬ng ph¸p ®iÖn di vµ ®o quang phæ ë c¸c b−íc sãng 260 vµ 280 nm. 1,0 A260 nm ≈ 50 µ g / ml dsADN 1,0 A260nm ≈ 40 µ g / ml ssADN / ARN 1,0 A260nm ≈ 33 µ g / ml dNTP / oligonucleotide 12
§IÖN DI PH¢N TÝCH AXIT NUCLEIC Gel polyacrylamid ADN 1 – 1000 bp Gel agarose ADN / ARN 20 bp – 20 kb PFGE ADN 10 kb – 10 Mb DGGE ADN/ARN Sai kh¸c mét vµi nucleotit §iÖn c ùc 0% Gradient biÕn tÝnh 70% C¸c giÕng tra mÉu 40% 40% ThÓ ®ét biÕn 1 dÔ biÕn tÝnh h¬n ADN kiÓu d¹i Gradient biÕn tÝnh Gradient biÕn ChiÒu dÞch chuyÓn ADN cña dÞch ChiÒu ThÓ ®ét biÕn 2 khã biÕn tÝnh h¬n 70% DGGE vu«ng gãc DGGE song song 13
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 14
VÒ vect¬ / thÓ truyÒn Vect¬ nh©n dßng Vect¬ biÓu hiÖn 1. KÝch th−íc cµng nhá, kÝch th−íc ®o¹n xen cµng lín. 2. Tr×nh tù nucleotit ®−îc biÕt ®Çy ®ñ. 3. Cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp trong tÕ bµo chñ. 15
C¸c ®Æc tÝnh chung cña vÐct¬ Vect¬ nh©n dßng vµ Vect¬ biÓu hiÖn 1. KÝch th−íc cµng nhá, kÝch th−íc ®o¹n xen cµng lín. 2. Tr×nh tù nucleotit ®−îc biÕt ®Çy ®ñ. 3. Cã tr×nh tù khëi ®Çu sao chÐp phï hîp tÕ bµo chñ. 4. NhËn biÕt nhê c¸c gen chØ thÞ hoÆc gen ®¸nh dÊu. 5. Cã vÞ trÝ g¾n ph©n tö ADN ngo¹i lai (vÞ trÝ ®a t¸ch dßng – polycloning site / MCS). 16
C¸c ®Æc ®iÓm c¬ b¶n cña vÐct¬ t¸ch dßng 17
vÐct¬ plasmid KÝch th−íc 1 – 200 kb, sîi kÐp, vßng. pBR332 do Bolivar vµ Rodiguez pBR332 (1977) thiÕt 4363 bp kÕ cho phÐp mang ®o¹n ADN cµi ®Õn 6 kb. 18
plasmid Nhãm pUC lµ nhãm vÐct¬ plasmid thuéc thÕ hÖ thø 3. Chøa c¶ ®iÓm khëi ®Çu sao chÐp cña phage M13 cho phÐp t¸ch dßng nhê vÐct¬ helper. Th−êng mang dÊu chuÈn lµ Amp r vµ LacZ . 19
Plasmid pUC 20
Plasmid pUC C¸c plasmid pUC sao chÐp theo kiÓu θ khi kh«ng cã vÐct¬ trî gióp (helper). Khi cã c¸c vÐct¬ helper (vd. M13), c¸c plasmid pUC sao chÐp theo kiÓu vßng l¨n, t¹o m¹ch ®¬n vµ gi¶i phãng ra ngoµi nhê protein vá virut. 21
Plasmid pM13 B¶n chÊt lµ ph©n tö ADN m¹ch ®¬n. Kh«ng lµm ph©n gi¶i tÕ bµo chñ khi gi¶i phãng khái tÕ bµo nªn t¸ch dßng thuËn tiÖn 22
vÐct¬ plasmid −u ®iÓm CÊu tróc ®¬n gi¶n, kÝch th−íc nhá. DÔ tinh s¹ch, dÔ ph©n tÝch ®o¹n t¸i tæ hîp. Cã thÓ nh©n lªn víi sè l−îng lín, tèc ®é nhanh. Nh−îc ®iÓm §«i khi, hiÖu suÊt biÕn n¹p vµo tÕ bµo chñ thÊp. Kh«ng hiÖu qu¶ khi biÕn n¹p ë eukaryote. Kh«ng t¸ch dßng ®−îc c¸c ph©n ®o¹n ADN kÝch th−íc lín (> 10 kb). 23
vÐct¬ Phage PhÇn lín xuÊt ph¸t tõ phage λλλ. KÝch th−íc kho¶ng 48,5 kb. Cã thÓ mang c¸c ®o¹n ADN cµi ®Õn ~20 kb. (virut cã thÓ ®ãng gãi ADN ®Õn 40-50 kb) Kh¶ n¨ng x©m nhËp tÕ bµo chñ nhanh. Cã thÓ t¸ch dßng ë c¶ prokaryote vµ eukaryote. 24
vÐct¬ phage −u ®iÓm Kh¶ n¨ng x©m nhËp tÕ bµo chñ nhanh. Cã thÓ t¸ch dßng ë c¶ prokaryote vµ eukaryote Cã thÓ mang c¸c ®o¹n cµi ®Õn ~ 20 kb. DÔ b¶o qu¶n do c¸c h¹t virut bÒn ë t o l¹nh (vd. 4 oC). Nh−îc ®iÓm KÝch th−íc lín h¬n plasmid, nªn ph©n tÝch phøc t¹p h¬n. Sè b¶n sao phage h×nh thµnh trong mçi tÕ bµo thÊp h¬n sè b¶n sao cña plasmid. 25
vÐct¬ cosmid Lµ vÐct¬ lai cña plasmid vµ phage λλλ, mang c¸c −u ®iÓm cña hai vÐct¬ nµy: (1) kh¶ n¨ng tù t¸i b¶n sè l−îng lín cña plasmid, (2) cã kh¶ n¨ng ®ãng gãi in-vitro nh− phage Cã kh¶ n¨ng mang c¸c ®o¹n ADN cµi cã kÝch th−íc ®Õn 35 – 45 kb. 26
vÐct¬ cosmid 27
vÐct¬ cosmid 28
vÐct¬ con thoi C¸c vÐct¬ plasmid, phage vµ cosmid cÇn c¸c tr×nh tù khëi ®Çu sao chÐp kh¸c nhau tïy theo tõng lo¹i tÕ bµo chñ (trõ E. coli ) C¸c vÐct¬ con thoi cã thÓ sao chÐp trong c¶ E. coli còng nh− nh÷ng tÕ bµo kh¸c, ch¼ng h¹n ë eukaryote C¸c vÐct¬ con thoi ®Æc biÖt cã hiÖu qu¶ khi nghiªn cøu ®Æc tÝnh c¸c gen ®ång thêi ë prokaryote (vd. E. coli ) vµ eukaryote (vd. Saccharomyces cerevisiae ) 29
NhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o nÊm men (YAC) §Ó cã thÓ t¸ch dßng c¸c ph©n ®o¹n gen kÝch th−íc lín ë sinh vËt nh©n chuÈn cã kÝch th−íc > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ë ng−êi cã kÝch th−íc ®Õn 2000kb), c¸c nhµ nghiªn cøu ®· ph¸t triÓn ®−îc vÐct¬ nhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o nÊm men cã thÓ mang c¸c ®o¹n cµi ADN dµi tõ 200 ®Õn 500 kb. VÐct¬ nµy ®−îc t¹o ra tõ nhiÔm s¾c thÓ nhá cña nÊm men ®−îc c¶i tiÕn di truyÒn. 30
NhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o vi khuÈn (BAC) VÒ c¬ b¶n gièng víi nhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o nÊm men nh−ng ®−îc t¹o ra tõ nh©n tè giíi tÝnh F. Gièng víi YAC, BAC cã thÓ mang c¸c ®o¹n cµi lín, nh−ng ngoµi ra cã kh¶ n¨ng sao chÐp trong E. coli gièng nh− c¸c vÐct¬ plasmid, λλλ, cosmid. VÐct¬ t¸ch dßng T i plasmid Vïng g©y khèi u (Onc) ADN T-ADN Vïng ph©n nh©n gi¶i nopaline VK A Vïng t¸i b¶n B pTiC58 D (Nopaline) Ti Vïng g©y plasmid ®éc vir C Agrobacterium tumefaciens Vïng tiÕp hîp plasmid 31
VÐct¬ t¸ch dßng T i plasmid Vïng g©y khèi u (Onc) CÊu tróc LB RB T- ADN Tms 2 Tms 1 Tmr nos TGGCGGATATATATGTGGTGTAAAC TGACAGGATATATGGCGGGTAAAC Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt Vïng Vir Ti SSBP plasmid ChuyÓn vµo tÕ VÕt nøt 1 VÕt nøt 2 bµo thùc vËt TT ADNADN Sù kÕt hîp cña gen biÕn n¹p víi gen nh©n thùc vËt Ngoµi ra, cßn cã c¸c vÐct¬ phagemid, c¸c vÐct¬ virut t¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen ë ®éng vËt, thùc vËt, 32
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 33
C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Cã thÓ chia c¸c enzym trong c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp thµnh 5 nhãm c¬ b¶n 1. C¸c enzym lµm ®øt g·y liªn kÕt phosphodieste. VÝ dô: c¸c enzym endonuclease (enzym giíi h¹n, DNaseI, Mungbean nuclease, RNase H, RNase T1 , RNase U2 , ), c¸c exonuclease (exonuclase III , exonuclase VII, ), c¸c enzym võa cã chøc n¨ng endonuclease vµ exonuclease ( nuclease Bal 31 , N. crassa nuclease , nuclease S1, ). 2. C¸c enzym nèi khung ph©n tö ADN (nèi c¸c ®o¹n ADN). VÝ dô: E. coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase, 3. C¸c enzym bæ sung hoÆc lo¹i nhãm phosphate ë ®Çu tËn cïng cña axit nucleic. VÝ dô: T4 polynucleotide kinase, alkaline phosphatase, tobacco acid pyrophosphatase , 34
C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp 5 nhãm enzym c¬ b¶n trong c«ng nghÖ ADN t¸i tæ hîp 4. C¸c enzym tæng hîp c¸c mèi liªn kÕt phosphodieste míi trong ph©n tö axit nucleic. VÝ dô: c¸c enzym ADN polymerase ( T4 DNA polymerase , T7 DNA polymerase , Taq DNA polymerase , ), RNA polymerase , Reverse transcriptase, Poly(A) polymerase, Terminal deoxynucleotidyl transferase, polynucleotide phosphorylase , 5. C¸c enzym tham gia b¶o vÖ, ®ãng gãi, xo¾n vµ gi·n xo¾n ph©n tö ADN. VÝ dô: DNA methylase, c¸c protein liªn kÕt ADN (RecA, SSB, DnaB ) , topoisomerase I & II , 35
Enzym giíi h¹n (restriction endonuclease) C¸c enzym giíi h¹n cã hai ®Æc tÝnh: 1. Kh«ng c¾t c¸c liªn kÕt phophodieste ë ®Çu tËn cïng, thay vµo ®ã lµ c¾t bªn trong ph©n tö ADN. 2. ChØ c¾t khi nhËn ra c¸c tr×nh tù ®Æc thï, th−êng gåm 4 – 8 nucleotit. Cã 3 nhãm chÝnh: Nhãm Ho¹t ®éng Cofactor C¬ chÊt I Enzym ®a chøc n¨ng ATP C¾t ngÉu nhiªn trªn ph©n tö nucleaza / methylaza, ®a Mg 2+ ADN sîi kÐp c¸ch tr×nh tù giíi tiÓu phÇn, ≈ 400.000 SAM h¹n ≈ 4000 - 7000 bp dalton II Endonucleaza / Mg 2+ C¾t ph©n tö ADN sîi kÐp thµnh methylaza 2 phÇn ë vÞ trÝ giíi h¹n III Enzym ®a chøc n¨ng ATP Cã tr×nh tù nhËn biÕt ®Æc hiÖu nucleaza / methylaza, ®a aMg 2+ gåm 5 hoÆc 6 bp, nh−ng c¾t tiÓu phÇn, ≈ 250.000 bSAM c¸ch tr×nh tù nµy ≈ 10 - 27 bp dalton vÒ phÝa ®Çu 3’ 36
Enzym giíi h¹n (restriction endonuclease) Enzym giíi h¹n lo¹i II ®−îc sö dông chñ yÕu v× nã c¾t t¹i vÞ trÝ giíi h¹n. Th−êng c¾t ë tr×nh tù ®äc theo chiÒu xu«i – ng−îc nh− nhau. VÝ dô: Eco RI. Ph¶i chän enzym giíi h¹n c¾t ë hai ®Çu gen nh−ng kh«ng c¾t bªn trong gen. 37
Enzym giíi h¹n (restriction endonuclease) Mét sè enzym giíi h¹n c¾t trªn m¹ch ®¬n. Tªn enzym Tr×nh tù nhËn biÕt Dde I C TNAG Hae III GG CC Hga I GACGC (N) 5 Hha I GCG C Hinf I G ANTC Hin PI G CGC Mnl I CCTC (N) 7 Rsa I GT AC Taq I T CGA 38
C¸c Enzym lµm ®øt g·y liªn kÕt phosphodieste ENDONUCLEASE DNase I. T¸ch tõ tuyÕn tôy bß, ph©n hñy mèi liªn kÕt phosphodieste bªn trong ph©n tö ADN m¹ch ®¬n t¹o thµnh c¸c ®o¹n oligonucleotit cã ®Çu 5’-P vµ 3’-OH tù do. øng dông: t¹o ra c¸c ph©n ®o¹n ADN hoÆc vÐct¬ ®Çu tï, Mungbean nuclease. T¸ch tõ c©y ®Ëu ®ç, ph©n hñy mèi liªn kÕt phosphodieste bªn trong c¶ ph©n tö ADN vµ ARN . Víi ADN m¹ch ®¬n, cã xu h−íng c¾t sau A vµ T, t¹o thµnh c¸c ®o¹n oligonucleotit cã ®Çu 5’-P vµ 3’-OH tù do. øng dông: “c¾t gät” c¸c plasmid, g¾n ph©n tö ADN vµo ®óng khung ®äc, theo ®óng chiÒu mong muèn, 39
C¸c Enzym lµm ®øt g·y liªn kÕt phosphodieste ENDONUCLEASE RNaseH . Ph©n hñy ARN khi cã cÊu tróc lai ADN/ARN t¹o thµnh c¸c ®o¹n oligonucleotit cã ®Çu 5’-P. Cã c¶ ë virut, vi khuÈn ®Õn ®éng vËt cã vó. ë vi khuÈn vµ eukaryote, cã ho¹t tÝnh endonuclase, cßn ë virut cã ho¹t tÝnh exonuclease tõ c¶ hai ®Çu 3’ vµ 5’. øng dông: (1) c¾t mét tr ×nh tù ®Æc hiÖu b»ng c¸ch t¹o ra ®o¹n lai ARN/ADN, (2) lo¹i ®i ®Çu poly(A) cña ph©n tö mARN trong ®iÖn di ®Ó lµm gi¶m hiÖn t−îng nhiÔu khi ph©n tÝch ARN, (3) lo¹i bá ph©n tö mARN khi tæng hîp cADN. 40
C¸c Enzym lµm ®øt g·y liªn kÕt phosphodieste EXONUCLEASE Exonuclease VII (Exo VII) . T¸ch tõ E. coli . ChØ c¾t ph©n tö ADN khi ë tr¹ng th¸i m¹ch ®¬n tõ c¶ hai ®Çu 3’ vµ 5’. Kh«ng c¾t thµnh tõng nucleotit riªng biÖt, mµ thµnh tõng ®o¹n 2 – 100 nucleotit. øng dông: C¾t bá ®Çu thõa trªn ph©n tö ADN sîi kÐp. Phèi hîp víi nuclease S1 ®Ó x¸c ®Þnh kÝch th−íc vµ lËp b¶n ®å c¸c tr ×nh tù intron. EXONUCLEASE vµ ENDONUCLEASE Nuclease S1 . T¸ch tõ Aspergillus oryzae . C¾t c¶ ARN vµ ADN khi ë tr¹ng th¸i m¹ch ®¬n . C¾t c¶ bªn trong (endo) lÉn bªn ngoµi (exo). Kh«ng c¾t ë tr¹ng th¸i kÐp ADN/ARN øng dông: (1) C¾t bá cÊu tróc kÑp tãc khi tæng hîp cADN (2) T¹o c¸c ph©n tö lai ADN/ARN kh«ng ®Çu thõa ®Ó x¸c ®Þnh chiÒu dµi vµ tr×nh tù m· hãa, (3) x¸c ®Þnh intron, 41
C¸c Enzym nèi khung ADN vµ ARN E. coli DNA ligase . Xóc t¸c h×nh thµnh liªn kÕt phosphodieste gi÷a hai ph©n ®o¹n ADN n»m kÒ, mét cã 5’-P, mét cã 3’-OH. CÇn cã tr×nh tù ®èi diÖn ë vÞ trÝ “nick translation”. øng dông: Nèi c¸c ®o¹n polynucleotit tæng hîp gi¸n ®o¹n. T4 DNA ligase . M· hãa bëi hÖ gen phage T4. Nèi c¸c ®o¹n ADN sîi kÐp víi nhau, kh«ng nèi ®−îc gi÷a c¸c ®o¹n ADN m¹ch ®¬n vµ gi ÷a ADN vµ ARN. Ho¹t tÝnh nèi m¹nh h¬n E. coli DNA ligase, v× kh«ng cÇn tr×nh tù ®èi diÖn ë vÞ trÝ “nick” øng dông: Nèi c¸c ®o¹n ADN sîi kÐp ®Çu dÝnh hoÆc tï. T4 ARN ligase . Cã kh¶ n¨ng nèi gi÷a ADN-ADN, ADN-ARN vµ ARN-ARN. Cã thÓ g¾n m¹ch ®¬n hoÆc sîi kÐp. øng dông: Dïng ®Ó nèi dµi c¸c ph©n tö ADN hoÆc ARN. G¾n c¸c tr×nh tù nucleotit ®¸nh dÊu (v.d. GFP, ) 42
C¸c Enzym tæng hîp liªn kÕt phosphodieste Reverse transcriptase . Enzym nµy thùc chÊt cã ba ho¹t tÝnh: (1) Tæng hîp ADN sö dông m¹ch ARN lµm khu«n, (2) Tæng hîp ADN sö dông m¹ch ADN lµm khu«n, vµ (3) RNase H. øng dông: Tæng hîp vµ x©y dùng th− viÖn cADN, ®¸nh dÊu ®Çu 3’ cña mét ph©n tö ADN, gi¶i m· tr×nh tù m· hãa Poly(A) polymerase . Bæ sung c¸c tiÓu phÇn AMP vµo ®Çu 3’ cña ph©n tö ARN . øng dông: (1) §¸nh dÊu ®Çu 3’ cña ph©n tö mARN, (2) L¾p ghÐp ®Çu poly(A) vµo c¸c ph©n tö mARN thiÕu ®Çu nµy ®Ó sö dông måi poly(T) tæng hîp cADN nhê enzym reverse transcriptase. 43
C¸c Enzym tæng hîp liªn kÕt phosphodieste Terminal deoxyribonucleotidyl transferase . §−îc t¸ch ®Çu tiªn tõ tuyÕn øc cña bª (Chang & Bollum, 1971). Xóc t¸c ph¶n −ng g¾n c¸c dNTP vµo phÝa ®Çu 3’ cña ADN mµ kh«ng cÇn m¹ch khu«n. Gäi t¾t lµ Terminal transferase . øng dông: (1) §¸nh dÊu ®Çu 3’ cña c¸c ph©n tö ADN. (2) T¹o c¸c ®Çu g¾n mong muèn cho vÐct¬ vµ c¸c ph©n tö ADN ngo¹i lai b»ng sö dông c¸c nucleotit bæ trî (rÊt h ÷u hiÖu trong viÖc tæng hîp vµ x©y dùng th− viÖn cADN). 44
C¸c Enzym b¶o vÖ ph©n tö ADN DNA methylase . C¸c enzym thuéc nhãm nµy gièng víi enzym giíi h¹n ë chç xóc t¸c ph¶n øng methyl hãa t¹i mét vÞ trÝ nhÊt ®Þnh trong mét tr×nh tù ®Æc tr−ng . vÝ dô M. dam methylaza →→→ GATC, M. EcoR I →→→ GAATTC, M. Hae III →→→ GGCC, M. Pst I →→→ CTGCAG, M. Taq I →→→ TCGA, øng dông: (1) B¶o vÖ c¸c tr×nh tù giíi h¹n bªn trong tr×nh tù m· hãa, (2) Thay ®æi tÝnh ®Æc hiÖu cña mét sè enzym giíi h¹n. VÝ dô : B×nh th−êng enzym giíi h¹n Scr FI c¾t c¸c tr×nh tù CCNGG; sau khi xö lý M. Hpa II, Scr FI chØ nhËn ra vµ c¾t c¸c tr×nh tù CCAGG vµ CCTGG. 45
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 46
T¸ch dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng hÖ gen Nh©n dßng gen lµ qu¸ tr×nh ph©n lËp mét gen →→→ vÐct¬ t¸ch dßng →→→ tÕ bµo chñ ®Ó nh©n lªn thµnh nhiÒu b¶n sao. Nh©n dßng gen ®· biÕt tr×nh tù 1. Ph©n lËp gen: T¸ch ADN tæng sè →→→ nh©n gen (PCR) b»ng sö dông måi ®Æc hiÖu →→→ kiÓm tra s¶n phÈm ®iÖn di trªn gel agarose/polyacrylamide →→→ c¾t b»ng enzym giíi h¹n thÝch hîp ë hai ®Çu (th−êng dïng chung víi vÐct¬). 2. Chän vÐct¬ t¸ch dßng: tïy kÝch th−íc ®o¹n gen vµ tÕ bµo chñ mµ cã thÓ chän c¸c vÐct¬ plasmid, phage, cosmid, YAC 3. T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp vµ nh©n dßng: sö dông DNA/RNA ligase (vd. T4 DNA ligase) g¾n vÐct¬ víi gen ph©n lËp. ChuyÓn vµo tÕ bµo chñ ®Ó nh©n lªn. 4. Chän läc c¸c dßng tÕ bµo mang vÐct¬ t¸i tæ hîp: b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy trªn m«i tr−êng chän läc, hoÆc sö dông c¸c gen chØ thÞ / gen ®¸nh dÊu. 48
T¸ch dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng hÖ gen Nh©n dßng gen ch−a biÕt tr×nh tù 1. T¸ch chiÕt mARN: T¸ch chiÕt ARN tæng sè →→→ t¸ch mARN nhê sö dông cét oligo(dT) cellulose. 2. T¹o c¸c ph©n tö cADN, nhê sö dông enzym phiªn m· ng−îc vµ kü thuËt RT-PCR, t¹o ra sè l−îng lín c¸c cADN. 3. C¸c tr×nh tù cADN ®−îc t¸ch dßng vµo c¸c vÐct¬ nh− trong tr−êng hîp t¸ch dßng gen ®· biÕt tr×nh tù ®Ó x©y dùng th− viÖn (ng©n hµng) cADN. 4. Chän läc c¸c dßng vÐct¬ t¸i tæ hîp mang tr×nh tù cADN ®−îc quan t©m nghiªn cøu 49
T¸ch dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng hÖ gen Cã hai lo¹i ng©n hµng gen: 1) Ng©n hµng hÖ gen vµ 2) Th− viÖn cADN . Ngân hàng ADN hệ gen 1. Có mt y tt c các trình t ADN h gen ca t bào. 2. Các on ADN có trình t nucleotit gi ng h gen ca t bào trong t nhiên, gm c các trình t iu hòa và các trình t không mã hóa (các trình t ADN m, trình t liên gen và các intron) 3. sinh vt nhân chu n, ph n ln là các trình t ADN không mã hóa cho protein, gm nhi u trình t lp li, các trình t liên gen, các trình t iu hòa. 4. S lư ng các dòng t bào mang các on cài nhi u. Th ư vi ện cADN 1. Ch là tp hp nh mt ph n ca h gen, gm các gen ư c bi u hi n. 2. Các trình t cADN ph n ánh trình t các sn ph m mARN ư c hoàn thi n sau quá trình phiên mã, không ph i là trình t th c s và y ca gen tươ ng ng trên phân t ADN h gen (không có các trình t iu khi n, nh ư promoter, operator, enhancer, v.v ). 3. Các protein ư c mã hóa bi cADN có th ư c tng hp (d ch mã) trong mt t bào ch mà ó không cn có b máy hoàn thi n phân t mARN (b i các intron ã ư c ct b). 4. S lư ng các dòng t bào mang các on cài nhi u. 50
Néi dung Kh¸i niÖm chung ADN t¸i tæ hîp ®−îc thùc hiÖn nh− thÕ nµo? T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch c¸c axit nucleic T¹o vÐct¬ t¸i tæ hîp C¸c lo¹i enzym sö dông trong ADN t¸i tæ hîp Nh©n dßng gen vµ x©y dùng ng©n hµng gen Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen 51
Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Mt nhóm contig C¸c vÞ trÝ c¾t cña enzym giíi h¹n Dòng 1 Dòng 2 Dòng 3 Dòng 4 Dòng 5 Dòng 6 Dòng 7 Dòng 8 Dòng 9 Dòng 10 Tập h ợp các dòng gen g ồm các trình t ự n ằm gối lên nhau (contig) Các dòng gen có kích th c Dòng 11 ln t 200 n 500 kb (có th c tách dòng b i các Dòng 12 véct ơ BAC và YAC) c dùng xây d ng các b n Dòng 13 contig. Các v trí c t gi i h n c a t ng dòng c xác Dòng 14 nh và a vào máy tính x p th ng hàng theo các locut gi a các on NST n m g i lên nhau. Khi b n vt lý c a h gen hoàn ch nh, m i NST c bi u di n bng m t b n contig duy nh t. 52
Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Cã mét sè ph−¬ng ph¸p ®Ó t×m dßng gen mong muèn trong ng©n hµng hÖ gen: (1) Th«ng qua sù biÓu hiÖn s¶n phÈm cña gen ®−îc t¸ch dßng (vd: c¸c enzym, protein cã ho¹t tÝnh, ), (2) Lai axit nucleic ®Ó t×m dßng tÕ bµo mang tr×nh tù mong muèn, (3) nhËn biÕt s¶n phÈm gen nhê ph¶n øng miÔn dÞch. Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh dßng gen th«ng qua sù biÓu hiÖn cña gen cã thÓ ¸p dông khi s¶n phÈm cña gen ë tr¹ng th¸i biÓu hiÖn chøc n¨ng. Vd: c¸c gen m· hãa enzym chuyÓn hãa hoÆc tæng hîp mét hîp chÊt dinh d−ìng nµo ®ã cã thÓ x¸c ®Þnh ®−îc nhê nu«i cÊy trªn c¸c m«i tr−êng chän läc. 53
Sµng läc c¸c dßng gen trong ng©n hµng gen Tuy vËy, ph−¬ng ph¸p lai axit nucleic lµ ph−¬ng ph¸p phæ biÕn nhÊt. §Ó ph¸t hiÖn c¸c tr×nh tù ADN, ng−êi ta sö dông c¸c mÉu dß ADN vµ ph−¬ng ph¸p thÈm t¸ch Southern, FISH, §Ó ph¸t hiÖn c¸c tr×nh tù mARN, ng−êi ta sö dông mÉu dß vµ ph−¬ng ph¸p thÈm t¸ch Northern. 54