›
›

Giáo trình Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp E.coli

pdf 19 trang huongle 2170
Download
Bạn đang xem tài liệu "Giáo trình Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp E.coli", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_cong_nghe_di_truyen_chuong_6_bieu_hien_cua_dna_ta.pdf

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ di truyền - Chương 6: Biểu hiện của DNA tái tổ hợp E.coli

  1. Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở E. coli
  2. Protein nguyên thể (native)
  3. Protein dung hợp (fusion protein) • Đoạn gene mã hóa 2 hoặc nhiều protein.
  4. Vector biểu hiện • Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ. • Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào. • Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gene được tạo dòng. • Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG. • Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng chính xác với promoter.
  5. Hệ thống biểu hiện ở prokaryote
  6. Promotor 1. lacZ promotor: pUC, M13 vector, vector lamda hoặc Bluescript - Điều hòa bởi lacI repressor 2. Lambda PL promotor 3. T7 promotor 4. araBAD promotor
  7. Hệ thống điều hòa bởi 2 promotor
  8. Vector biểu hiện với lacZ
  9. Vector biểu hiện với lacZ
  10. Trình tự gắn với ribosome (ribosomal binding site) • Cần thiết để khởi đầu dịch mã • ở E. coli thường có trình tự -GAGG- đứng trước codon khởi đầu dịch mã. • Trình tự Shine-Dalgarno ở E. coli: AGGAGGU • Trình tự Kozak ở Eukaryote: (gcc)gccRccAUGG
  11. Lợi thế của protein dung hợp • Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch mã nếu dung hợp ở đầu N-ter • Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide • Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein • Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch
  12. Các thẻ (tag) đánh dấu • GST (glutathion-S-transferase): – Kết hợp và bảo vệ protein – Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực • Maltose binding protein – Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch – Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose) • Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel
  13. Phát hiện protein dung hợp • Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện di trên gel. • Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung hợp – Nuôi dòng vi khuẩn – Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ) – Tách chiết dịch bằng SDS – Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS PAGE) – Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting
  14. Protein Ladder 1 2 3 4
  15. Western blot (anti-His tag conjunged HRP) SP1 SP2 4oC 4oC 16oC 30oC 16oC - 30oC - 70kD 40kD
  16. Tinh sạch protein 1. Thể vùi (inclusion) 2. Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh sạch thể vùi - Hòa tan thể vùi 3. Thu nhận protein
  17. Tinh sạch protein