Giáo trình Công nghệ Enzyme enzyme technology

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ Enzyme enzyme technology

1. Cơng nghệ enzyme CƠNG NGHỆ ENZYME ENZYME TECHNOLOGY 29/09/2011 11:21 SA 1 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 2 Nguyễn Hữu Trí Cơng nghệ enzyme Cơng nghệ enzyme • “Without enzymes there can be no life”. • Do cĩ cấu hình gấp cuộn rất phức tạp nên mỗi enzyme • Enzyme: là các phức hợp protein hình cầu, trong tế chỉ xúc tác được phổ hẹp cơ chất, trong một giới hạn bào sống, thực hiện các xúc tác sinh hĩa chuyển đổi cơ chất và nhiệt độ. cơ chất một cách nhanh chĩng. • Trong ứng dụng cơng nghiệp, tạo sản phẩm cĩ chất • Cơng nghệ Enzyme : sự sản xuất enzyme cho các lượng cao, ít sản phẩm phụ, dễ tinh sạch, mục đích cơng nghiệp chế biến thực phẩm, y học, • Enzyme khơng độc và cĩ khả năng bị phân giải (thân phục hồi sinh học (bioremediation), thiện mơi trường). • Cĩ thể được tạo ra một lượng lớn nhờ vi sinh vật. • Tham gia giải quyết các vấn đề xã hội hiện đại: sản xuất lượng thực, thiếu hụt và bảo tồn năng lượng, cải thiện mơi trường, cùng với các ứng dụng y học. 29/09/2011 11:21 SA 3 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 4 Nguyễn Hữu Trí Cơng nghệ enzyme Vai trị xúc tác của enzyme • Sản xuất và sử dụng enzyme là lĩnh vực thành cơng nhất của CNSH và gia tăng 12% hằng năm trong suốt 10 năm qua. • Năng lượng hoạt hĩa tức là mức năng lượng các • Cĩ hơn 400 cơng ty khắp thế giới sản xuất enzyme, châu âu chất tham gia phản ứng phải đạt được. chiếm đa số (60%) • Chất cĩ tác dụng thúc đẩy tốc độ phản ứng hĩa học đựơc gọi là chất xúc tác. • Enzyme khơng làm lệch vị trí cân bằng mà nĩ chỉ làm phản ứng chĩng đạt trạng thái cân bằng. 29/09/2011 11:21 SA 5 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 6 Nguyễn Hữu Trí 1
2. Vai trị xúc tác của enzyme Vai trị xúc tác của enzyme Đặc điểm Chất xúc tác vơ cơ Chất xúc tác hữu cơ Phân tử nhỏ gồm vài Bản chất hĩa học Đại phân tử protein nguyên tố (Pt, HCl ) Phản ứng Saccharose + H2O glucose + fructose H2O2 H2O + 1/2O2 (calo/mol) (calo/mol) Tăng tốc độ phản 102 – 106 lần 106 – 1011 lần Khơng xúc tác 32.000 18.000 ứng Xúc tác vơ cơ (H+) 25.000 (Pt) 11.700 Enzyme (saccharase) 9.400 (catalase) 5.500 Cao ( 1000c) Thấp (36 – 450c) Các điều kiện: Acid hoặc kiềm mạnh pH sinh lý Cao (vài atm) Ap suất khí quyển (1 atm) Nhiệt độ thích hợp Cao ( 1000c) Thấp (36 – 450c) pH thích hợp nhất Acid hoặc kiềm mạnh pH sinh lý 29/09/2011 11:21 SA 7 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 8 Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế và phân loại Phân loại enzyme theo cấu tạo enzyme Apoenzym hay apoprotein: chỉ cĩ protein trong thành • Danh pháp: phần cấu tạo của nĩ. • Tên thơng thường: trypsin, pepsin, renin Coenzym: enzym cĩ protein kết hợp với phân tử kim • Tên hệ thống: tên cơ chất - tên kiểu phản ứng loại tạo thành phức hữu cơ – kim loại. Pyruvate – decarboxylase là enzyme khử CO2 của Các đồng yếu tố được gọi là nhĩm ngoại prosthetic. acid pyruvic. Cịn phức chất chứa cả hai yếu tố được gọi là enzym hồn chỉnh – holoenzym. Glucophosphate – isomerase là enzyme giúp chuyển gốc phosphate trong glucose. 29/09/2011 11:21 SA 9 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 10 Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế và phân loại Danh pháp quốc tế và phân loại enzyme enzyme Phân loại: • Lyase: xúc tác phản ứng cắt liên kết hóa học (chemical • Oxidoreductase: xúc tác phản ứng oxi hóa khử, bonds) chuyển electron, H, O. • Isomerase: xúc tác phản ứng chuyển hóa một cơ chất thành • Transferase: xúc tác phản ứng chuyển nhóm chức một dạng đồng phân của nó (isomer) năng từ chất cho sang chất nhận. • Ligase: xúc tác phản ứng liên kết 2 nguyên tử (C-O, C-S, C- • Hydrolase: xúc tác phản ứng thủy phân (Hydrolysis N, C-C, phosphoric ester, C-kim loại) reaction). 29/09/2011 11:21 SA 11 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 12 Nguyễn Hữu Trí 2
3. STT Nhĩm enzyme Phản ứng xúc tác 1 Oxidoreductase Chuyển e- , H+ hoặc nguyên tử H) A- + B  A + B- Danh pháp quốc tế và phân loại Transferase 2 Phản ứng chuyển nhĩm chức A-B + C  A + B - C enzyme 3 Hydrolase Phản ứng phân ly nhờ nước ( thuỷ giải) (chuyển nhĩm chức cho phân tử nước) : A-B + H2O  A-H + B-OH 4 Lyase Phản ứng chuyển hĩa nhờ bổ sung nhĩm chức vào liên kết đơi hoặc tạo liên kết đơi nhờ lấy đi nhĩm chức (phân giải khơng cĩ nước tham gia) X Y   A-B  A=B + X-Y Isomerase Chuyển nhĩm chức trong phân tử tạo các dạng đồng 5 phân X Y Y X     A-B  A-B 6 Ligase Tổng hợp liên kết C-C, C-S, C-O và C-N nhờ phản ứng trùng ngưng liên hợp với sự thủy giải ATP. 29/09/2011 11:21 SA 13 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 14 Nguyễn Hữu Trí Danh pháp quốc tế và phân loại Cường lực xúc tác lớn enzyme 1 gam Rennine cĩ thể gây đơng tụ 7,2 tấn sữa. ≈ 5.41 giây GIỜØ CatalaseFe3+ 5 5 4 10 H2O2 10 H2O + 5.10 O2 29/09/2011 11:21 SA 15 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 16 Nguyễn Hữu Trí Tính đặc hiệu của enzyme Đặc hiệu phản ứng • Oxy hố nhờ oxydase: • Đặc hiệu phản ứng RCHCOOH + 1/2O2 RCOCOOH + NH3 • Đặc hiệu cơ chất NH2 – Đặc hiệu tuyệt đối • Khử carboxyl nhờ decarboxylase: – Đặc hiệu tương đối RCHCOOH RCH2NH2 + CO2 – Đặc hiệu nhĩm NH2 – Đặc hiệu đồng phân quang học 29/09/2011 11:21 SA 17 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 18 Nguyễn Hữu Trí 3
4. Đặc hiệu tuyệt đối Đặc hiệu tương đối CH – O – CO - R LIPASE CH – O – H HOOC – R Urease 2 1 2 1 Urea CO2 + 2NH3 CH – O – CO - R2 HO - H CH – O – H + HOOC – R2 H2O NH2-CO-NH2 CH2 – O – CO - R1 CH2 – O – H HOOC – R3 Enzym cĩ khả năng tác dụng lên một kiểu nối hố học nhất Acetamide Urease Khơng xảy ra định trong phân tử cơ chất mà khơng phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành kiểu liên kết đĩ. NH2-CO-CH3 H2O 29/09/2011 11:21 SA 19 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 20 Nguyễn Hữu Trí Đặc hiệu nhĩm Đặc hiệu đồng phân quang học R’ Carboxyl peptidase R’ R – C – N – CH R – C – OH + NH2–CH COOH Fumarathydratase H2O O H COOH O COOH HO–CH CH–COOH CH2-COOH HOOC-CH + H2O R’ Carboxyl peptidase R’ L – malic Acid fumaric R – C – N – CH R – C - N – CH H2O O H CH2 O H CH2 COOH COOH 29/09/2011 11:21 SA 21 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 22 Nguyễn Hữu Trí Chymotrypsin Has A Site for Specificity Specificity of Ser-Protease Family Trypsin Chymotrypsin Elastase O O cut at Lys, Arg cut at Trp, Phe, Tyr cut at Ala, Gly O O N–C–C–N–C–C N–C–C–N–C–C O O –C–N–C–C–N– O O R H R’ –C–N–C–C–N– C –C–N–C–C–N– O- C C CH3 C C Ser C Shallow and Specificity non-polar NH3 pocket Catalytic Site + Site COO- Non-polar pocket charged pocket charged C Active Site negatively and Deep Asp 23 Nguyễn Hữu Trí 24 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 29/09/2011 11:21 SA Active Site 4
5. Enzyme Lịch sử phát triển enzyme • Cuối thế kỷ 18 đầu thế kỷ 19, sự phân giải các chất • Cơng nghiệp tổng hợp enzyme cần thiết cho ngành nhờ enzyme đã được ghi nhận nhưng cơ chế vẫn cơng nghệ thực phẩm và nước giải khát. Enzymes cũng được sử dụng trong phân tích y học và cơng chưa biết. nghiệp và ngày nay chúng được thêm vào bột giặt • Thế kỷ 19, Louis Pasteur phát hiện một chất cĩ khả (cellulase, protease, lipase). năng xúc tác trong quá trình lên men chuyển hĩa • Enzyme cĩ thể được tổng hợp bởi thực vật, động đường thành rượu gọi là ferment cĩ trong tế bào nấm vật, vi sinh vật hoặc nuơi cấy mơ động ,thực vật. men. • Các enzyme động thực vật cĩ thể được tổng hợp nhờ quá trình lên men vi sinh vật. Hầu hết các • 1877, Wilhelm Kuhne, sinh lý học người Đức đầu tiên enzyme được tổng hợp trong tropophase thì dùng thuật ngữ enzyme. amylases (bởi Bacillus stearothermophilus) được • Thế chiến thứ 1, Weitzman sản xuất aceton ở Anh. tổng hợp trong idiophase, vì vậy nĩ là chất biến dưỡng thứ cấp. 29/09/2011 11:21 SA 25 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 26 Nguyễn Hữu Trí Lịch sử phát triển enzyme Lịch sử phát triển enzyme • 1897, Eduard Buchner phát hiên khả năng lên men của • Lysozyme là enzyme được xác định cấu trúc đầu tiên dịch chiết nấm men. 1907, ơng nhận nobel prize cho và năm 1965. phát minh “cell free fermentation” • 1969, xây dựng qui trình công nghiệp sản xuất amino • 1926, James B. Sumner kết tinh enzyme urease và 1937 acid sử dụng enzyme. cho enzyme catalase. • 1972, Boyer et al. áp dụng kỹ thuật di truyền trong • 1930, Northrop và Staley kết tinh enzyem pepsin. công nghệ enzyme. • Thế chiến thứ 2, sản xuất kháng sinh theo qui mơ cơng • 1973, sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế nghiệp. bào. • 1984 đến nay, phát hiện hàng trăm loại enzyme khác nhau và ứng dụng rộng rãi. 29/09/2011 11:21 SA 27 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 28 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc lysozyme Cơng nghệ sản xuất enzyme từ vi sinh vật 29/09/2011 11:21 SA 29 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 30 Nguyễn Hữu Trí 5
6. Sinh vật như một hệ thống mở chế Ưu thế tạo enzyme • Enzyme thu nhận từ vi sinh vật cĩ hoạt tính cao • Sinh vật được xem như hệ thống mở liện quan mật • Chủ động về nguyên liệu nuơi cấy và giống vi sinh vật thiết đến quá trình trao đổi chất giữa tế bào và mơi • Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn nên cĩ thể trường bên ngồi. thu hoạch nhiều lần quanh năm • Quá trình trên là con đường chuyển hố chính đĩng vai trị quan trọng chu trình chuyển hố các chất trong • Cĩ thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo tự nhiên. hướng cĩ lợi vì vi sinh vật cĩ khả năng cảm ứng với • Các phản ứng trong và ngồi tế bào trong chu trình mơi trường rất nhanh chuyển hĩa trên được xúc tác bởi một chất xúc tác • Giá thành tương đối thấp vì mơi trường nuơi cấy sinh học cĩ bản chất protein, được gọi là enzyme. tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. • Tuỳ theo nơi xúc tác trong hoặc ngồi tế bào: enzyme nội bào và enzyme ngoại bào. • Vi sinh vật cĩ thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau. 29/09/2011 11:21 SA 31 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 32 Nguyễn Hữu Trí Nguồn enzyme chủ yếu từ vi sinh vật Nguồn enzyme chủ yếu từ vi sinh vật • • 1960, 70% enzyme từ thực vật và động vật Hoạt tính enzyme cao nhất • • Ngày nay, enzyme từ nguồn vi sinh vật chiếm 90% thị Tốc độ sinh sản nhanh trường • Sản xuất chủ yếu nhờ vào quá trình lên men chìm. • Vi sinh vật là nguồn enzyme duy nhất trên qui mơ cơng • Vi sinh vật sản xuất enzyme nhờ thơng tin di nghiệp. truyền của chính nĩ và nguồn gene được chuyển • Chuyên hĩa khối lượng lớn cơ chất. vào. • • Nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, dể kiếm, khơng bị biến Tốc độ sinh tổng hợp enzyme cĩ thể điều khiển đơng theo mùa. được. 29/09/2011 11:21 SA 33 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 34 Nguyễn Hữu Trí Tuyển chọn giống vi sinh vật cho Chọn lọc chủng sản xuất enzyme. enzyme cĩ hoạt tính cao • Các nhà di truyền học khi chọn lựa cho cơng nghiệp sản xuất enzyme phải tìm những đặc tính mong muốn tối ưu: – sản phẩm enzyme cao – khơng phụ thuộc chất cảm ứng – dễ dàng thu nhận • Cố gắng loại bỏ hoặc ức chế những đặc tính khơng mong muốn – những chất đồng biến dưỡng cĩ hại – mùi, màu 29/09/2011 11:21 SA 35 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 36 Nguyễn Hữu Trí 6
7. Bản chất sinh học của enzyme Cấu trúc enzyme Trung tâm hoạt động (active site) • Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật • Trung tâm hoạt động: nhĩm hĩa học tiếp xúc trực tiếp cơ chất; nhĩm hĩa học khơng tiếp xúc cơ • Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và khi chất nhưng tác dụng trực tiếp đến quá trình xúc đươc tách khỏi tế bào sống. tác. • Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ơn • Gồm các amino acid cĩ nhĩm hố học hoạt động hồ. mạnh; ion kim loại; nhĩm chức của coenzyme. • Enzyme tham gia xúc tác từ giai đoạn đầu đến giai • Enzyme thể cĩ một, hai, thậm chí 4 trung tâm hoạt đoạn giải phĩng hồn tồn năng lượng dự trữ. động. • Enzyme cĩ thể thực hiện một phản ứng đơn lẻ. • Phản ứng cĩ enzyme giúp tiết kiệm năng lượng. • Enzyme chịu sự điều khiển của gene và điều kiện phản ứng 29/09/2011 11:21 SA 37 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 38 Nguyễn Hữu Trí Cấu trúc enzyme Trung tâm hoạt động (active site) • Cơ chất cĩ cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động của enzyme mới cĩ thể kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức enzyme – cơ chất. • Các loại enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động cĩ cấu trúc khơng gian nhất định. • Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland: cơ chất làm thay đổi cấu trúc khơng gian của trung tâm hoạt động, giúp trung tâm hoạt đơng tham gia xúc tác. 29/09/2011 11:21 SA 39 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 40 Nguyễn Hữu Trí Các tiền chất enzyme Ý nghĩa quá trình xúc tác trong tế bào sinh vật • Tiền enzyme (proenzyme; zymogen): một số enzyme • Giảm năng lương hoạt hố gắn liền quá trình khơng cĩ khả năng xúc tác ngay sau khi được tổng tiến hĩa sinh vật. hợp mà phải trải qua một giai đọan biến đổi nhất định • Tăng tốc độ phản ứng sinh hĩa trong cơ thể, giúp (giai đoạn hoạt hố). tế bào tăng nhanh về số lương và khối lượng. • Tiền enzyme trải qua giai đoạn hoạt hố nhằm loại bỏ đoạn peptide che lấp trung tâm hoạt đơng enzyme. Pepsinogen pepsin Trypsinogen trypsin Chymotrypsinogen chymotrypsin 29/09/2011 11:21 SA 41 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 42 Nguyễn Hữu Trí 7
8. Cơ chế tác dụng của enzyme Cơ chế tác dụng của enzyme lên cơ chất • Trong phản ứng cĩ enzyme, cơ chất được hoạt hĩa mạnh, thay đổi tính chất hĩa học sản phẩm của phản ứng. • Quá trình xúc tác của enzyme gồm 3 giai đoạn: • Giai đoạn 1: enzyme kết hợp cơ chất bằng liên kết yếu tạo phức hợp tạm thời. • Giai đoạn 2: Cơ chất bị thay đổi cấu hình khơng gian. • Giai đoạn 3: sản phẩm được tạo ra và tách khỏi enzyme. 29/09/2011 11:21 SA 43 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 44 Nguyễn Hữu Trí Mô hình “chìa và khóa” của Fisher Mô hình “khớp cảm ứng” của Koshland (1894) (1958) Cơ chất Trung tâm hoạt động Cơ chất Cơ chất Cơ chất Trung tâm hoạt động Enzyme Enzyme Enzyme Enzyme 29/09/2011 11:21 SA 45 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 46 Nguyễn Hữu Trí Phương trình động học Michaelis - Phương trình động học Menten Michaelis - Menten • 1913, Michaelis và Menten xây dựng phương trình động học giải thích phản ứng xúc tác cĩ enzyme. • Phương trình thể hiện mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme. • V : vận tốc ban đầu của • Enzyme kết hợp cơ chất tạo phức ES. 0 phản ứng • Phức hợp chuyển hĩa tạo sản phẩm P, enzyme • V : vận tốc tối đa của được giải phĩng và tiếp tục xúc tác phản ứng max phản ứng mới. • [S]: nồng độ cơ chất. • . 29/09/2011 11:21 SA 47 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 48 Nguyễn Hữu Trí 8
9. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme Nhiệt độ • Nhiệt độ • Tốc độ phản ứng tỉ lệ thuận với nhiệt độ trong một giới • pH hạn nhất định. • Chất kiềm hãm • Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao • Chất hoạt hĩa nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. • Mỗi enzyme cĩ nhiệt độ tối ưu khác nhau • Nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme giảm enzyme bi biến tính. • Ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme yếu nhưng cĩ thể tăng trở lại khi tăng dần nhiệt độ. 29/09/2011 11:21 SA 49 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 50 Nguyễn Hữu Trí Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của nhiệt độ 29/09/2011 11:21 SA 51 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 52 Nguyễn Hữu Trí pH Ảnh hưởng nhiệt độ, pH • pH ảnh hưởng đến mức độ ion hĩa của enzyme và cơ chất. • Tùy enzyme sẽ cĩ pH tối ưu khác nhau. • Để đạt hiệu quả xúc tác, nghiên cứu và xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme là rất quan trọng. 29/09/2011 11:21 SA 53 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 54 Nguyễn Hữu Trí 9
10. Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của pH Enzyme Nguồn gốc pHop Pepsin Dịch vị 1,8 Trypsin Dịch tụy 8 Chymotrypsin Dịch tụy 8,1- 8,6 Amylase Nước bọt, dịch tụy 7,0 Lipase Dịch tụy 7,0 – 7,5 Phosphatase acid Tuyến tiền liệt 5,0 – 5,6 Phosphatase kiềm Xương, gan 8,6 – 9,1 29/09/2011 11:21 SA 55 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 56 Nguyễn Hữu Trí Chất kìm hãm và họat hĩa enzyme Chất hoạt hố: là chất làm tăng hoạt tính của enzyme, chúng cĩ bản chất hố học khác nhau. Chất kìm hãm: Là chất làm giảm hoạt tính của enzyme do làm giảm ái lực của enzyme với cơ chất hoặc làm enzyme mất khả năng kết hợp với cơ chất. 29/09/2011 11:21 SA 57 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 58 Nguyễn Hữu Trí Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính enzyme- Chất hoạt hĩa enzyme – chất kìm hãm • Giúp tăng hoạt tính enzyme ở nồng độ nhất định. • Chất kìm hãm làm giảm hoạt tính enzyme nhưng • Tác dụng ức chế khi vượt quá nồng độ này. khơng bị thay đổi bởi enzyme. Cơ chế kìm hãm cĩ thể • Giúp phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền thuận nghịch hoặc khơng thuận nghịch. enzyme hoặc phục hồi các nhĩm chức năng trong – Chất kìm hãm cạnh tranh trung tâm hoạt đơng của enzyme. – Chất kìm hãm khơng cạnh tranh – Kìm hãm bởi sản phẩm phản ứng 29/09/2011 11:21 SA 59 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 60 Nguyễn Hữu Trí 10
11. Kìm hãm cạnh tranh Kìm hãm khơng cạnh tranh Cĩ cấu trúc gần giống cơ chất, nĩ kết hợp với trung Cĩ cấu tạo hố học khác cơ chất, gắn với enzyme ở vị trí tâm hoạt động của Enzyme do đĩ chiếm chỗ của cơ chất khơng nhất định, cĩ thể ở ngồi trung tâm hoạt động và làm giảm hoạt tính Enzyme (H): E + S ES E + P E + I EI + S EI + S (I là chất ức chế cạnh tranh). 29/09/2011 11:21 SA 61 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 62 Nguyễn Hữu Trí Chất kìm hãm khơng cạnh tranh Kìm hãm bởi sản phẩm phản ứng • Kết hợp với enzyme ở vị trí ngồi trung tâm hoạt động Sản phẩm P sau phản ứng đĩng vai trị giống chất làm thay đội cấu trúc khơng gian phân tử kìm hãm khơng cạnh tranh. enzyme, dẫn đến giảm hoạt tính enzyme. • Trong trường hợp này, enzyme vẫn kết hợp cơ chất. • Mức độ kìm hãm khơng phụ thuộc vào sự tương quan giữa nồng độ cơ chất và chất kìm hãm. 29/09/2011 11:21 SA 63 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 64 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp xác định hoạt tính Phương pháp xác định hoạt tính enzyme enzyme • Xác định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm • Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI): lượng enzyme xúc tác tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng được 1mol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu enzyme xác định (phương pháp phổ biến) chuẩn • Xác định thời gian cần thiết để enzyme khảo sát biến • Katal: Lương enzyme cĩ khả năng xúc tác lám chuyển đổi một lượng cơ chất mất đi hay thu được lượng hĩa được một mol cơ chất sau một giây ở điều kiện sản phẩm nhất định. tiêu chuẩn. • Xác định nồng độ enzyme cần thiết trong một thời • Hoạt độ riêng: Số đơn vị WI (katal) ứng với một ml gian nhất định cĩ thể tạo thành sản phẩm hoặc biến dung dịch hoặc gram chế phẩm khơ. đổi một lương cơ chất nhất định. • Hoạt độ riêng của phân tử: Số phân tử cơ chất được • Lưu ý: Đảm bảo điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian, chuyển hĩa bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị chất hoạt hĩa hoặc chất làm bền enzyme. thời gian. 29/09/2011 11:21 SA 65 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 66 Nguyễn Hữu Trí 11
12. Qui trình sản xuất enzyme Thu nhận enzyme – Phá vỡ tế bào • Sinh tổng hợp enzyme • Phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lý: • Thu nhận enzyme: phá vỡ tế bào, tách enzyme, cơ đặc – Phương pháp đồng hĩa bằng máy xay sinh tố enzyme – Phương pháp đồng hĩa bằng máy đồng hĩa. • Tinh sạch enzyme – Phá vỡ tế bào bằng máy French press • Hình thành cơng thức chế phẩm enzyme (enzyme – Phương pháp nghiền với alumina hay cát product formulation) – Phương pháp nghiền với bi thủy tinh – Phương pháp siêu âm 29/09/2011 11:21 SA 67 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 68 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp đồng hĩa bằng máy Phương pháp đồng hĩa bằng máy xay sinh tố đồng hĩa (tế bào động vật) • Thích hợp phá các mơ mềm như gan, tim, cơ, • Thực hiện nhanh trong 5 – 10 phút ở nhiệt độ 40C. • Sau khi đồng hĩa, dịch đồng hĩa được li tâm ở 23 000 g trong 1 giờ ở 4 0C, thu dịch nổi. 29/09/2011 11:21 SA 69 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 70 Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ tế bào bằng máy French press Phương pháp nghiền với alumina • Hịa trộn tế bào vào dung dịch hay cát buffer thích hợp và nạp vào • Dùng chày nghiền tế bào với cát thạch anh, hoặc máy. cát nhơm (2 lần khối lượng tế bào). • Tế bào bên trong máy French • Hịa hỗn hợp nghiền trên vào dung dịch buffer press đang ở áp suất rất cao, thích hợp. (3 – 4 lần thể tích tế bào) nhach chĩng bị đẩy ra áp suất • Dịch trên được li tâm ở 23 000 g trong 1 giờ ở 4 0C, khí quyển. thu dịch nổi. • Sự thay đổi áp suất đột ngột làm tế bào bị vỡ. • Li tâm ở 23 000 g trong 1 h ở 4 0C, thu dịch nổi. 29/09/2011 11:21 SA 71 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 72 Nguyễn Hữu Trí 12
13. Phương pháp phá vỡ tế bào bằng Phương pháp nghiền với bi thủy tinh máy siêu âm • Thường dùng cho tế bào nấm men • Sĩng siêu âm tạo rung • Cho 0.1 – 3 g tế bào vào các ống polysterene. động mạnh phá vách tế • Thêm vào 1 thể tích buffer phù hợp. bào. • • Thêm vào 1- 3 g bi thủy tinh lạnh/ 1 gam tế bào. Mơ được cho vào 2 lần thể tích buffer. • Vortex 5 lần trong 1 phút. • Tiến hành siêu âm ở mức • 0 Li tâm ở 23 000 g trong 1 giờ ở 4 C, thu dịch nổi. cao nhất trong 2 phút. • Li tâm 23 000 g trong 1 giờ ở 4 0C thu dịch nổi. 29/09/2011 11:21 SA 73 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 74 Nguyễn Hữu Trí Thu nhận enzyme – Phá vỡ tế bào Thu nhận enzyme – Tách enzyme • 2. Phương pháp hĩa học: dựa trên khả năng tạo áp suất thẩm thấu hoặc khả năng oxy hĩa manh của chất • Phương pháp ly tâm: tách vật rắn ra khỏi dung dịch, thực hĩa học Khơng cần áp suất cao, ít chi phí nhưng hiện trong điều kiện nhiệt độ thấp, trong cơng nghiệp thường bị lẫn hĩa chất vào hỗn hợp. người ta thường dùng máy ly tâm liên tục • 3. Phương pháp sinh học (phương pháp enzyme) • Phương pháp lọc: tách phần rắn ra khỏi dung dịch. • Phương pháp tự phân: tạo điều kiên enzyme tối ưu • Lọc ép: dung dịch cần lọc cĩ khối lượng nhỏ cho một số enzyme phân giải thành phần thành tế bào. Thủy phân cả những chất khác và enzyme • Lọc chân khơng: sử dụng nhiều trong sản xuất và nghiên cứu • Phương pháp sử dụng enzyme từ ngồi tế bào: sử dụng enzyme hệ cellulase xử lý thành tế bào nấm men • Lọc theo dịng chảy cắt ngang: nguyên liệu chảy song và tế bào thực vật. song vật liệu lọc. • Lưu ý: Huyền phù tế bào vi sinh vật phải được ly tâm, • Lọc thơng thường lọc để thu enzyme ngoại bào. 29/09/2011 11:21 SA 75 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 76 Nguyễn Hữu Trí Thu nhận enzyme - Phương pháp Phương pháp nhiệt cơ đặc • Phương pháp nhiệt • Làm bốc hơi nước, cơ đặc dung dịch enzyme, • Phương pháp kết tủa giúp tăng hoạt tính enzyme. • Phương pháp thẩm tích (dialysis) • Trong cơng nghiêp: • Phương pháp siêu lọc (ultrafiltration) – Bốc hơi lớp mỏng – Bốc hơi ly tâm lớp mỏng – Bốc hơi ống dài 29/09/2011 11:21 SA 77 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 78 Nguyễn Hữu Trí 13
14. Phương pháp kết tủa Phương pháp thẩm tích • Kết tủa bằng muối (amonium sulphate; NaCl) • Thẩm tách dựa trên nguyên tắc sự khuếch tán các phân tử thẩm tích từ nơi cĩ nồng độ cao sang thấp. • Dung mơi hữu cơ (ethanol; acetone) • Dung dịch enzyme được chứa trong màng bán thấm và • Dùng polymer ngâm trong beaker cĩ chứa dung dịch buffer thích hợp. • • Kết tủa ở điểm đẳng điện Màng bán thấm cho phép các phân tử cĩ kích thước nhỏ hơn phân tử enzyme đi qua màng thơng qua sự khuếch tán qua các lỗ nhỏ trên màng. • Quá trình thẩm tách thực hiện ở 40 C kết hợp khuấy nhẹ. • Thay dung dịch buffer sau 1 – 2 giờ. • Sau khi thâm tích, dùng pipetteman hút dung dịch ra khỏi túi thẩm tích. 29/09/2011 11:21 SA 79 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 80 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp thẩm tích Phương pháp siêu lọc • Sử dụng màng lọc với kích thước lỗ lọc siêu nhỏ, áp suất cao (nitrogen pressure) được sử dụng 100 – 500 Kpa, khơng dùng khơng khí nhằm tránh sự oxi hĩa enzyme. • Ap dụng dịng chảy ngang cross – flow giúp tránh tắt nghẹt lỗ lọc. • Các phân tử enzyme quan tâm được giữ lại trong màng trong khí các phân tử kích thước nhỏ đi qua các lổ trên màng. • Loại bỏ dung mơi và phân tử kích thước nhỏ hơn kích thước enzyme. 29/09/2011 11:21 SA 81 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 82 Nguyễn Hữu Trí Một số màng siêu lọc thơng dụng Tinh sạch enzyme • Phương pháp kết tinh: dùng dung dịch amonium sulfate, khĩ thực hiên để cĩ enzyme cĩ độ tinh sạch cao. • Phương pháp sắc ký • Phương pháp điện di: chưa áp dụng trên qui mơ cơng nghiệp 29/09/2011 11:21 SA 83 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 84 Nguyễn Hữu Trí 14
15. Hình thành cơng thức chế phẩm Vi sinh vật Ứng dụng enzyme Aspergillus oryzae Amylases Aspergillus niger Glucamylase • Cơng việc mang tính bảo mật, thơng tin cơng thức chế phẩm được giữ kín bởi nhà sản xuất. Trichoderma reesii Cellulase • Bí mật cĩ thể được tiết lộ kèm theo nhiều điều kiện ràng buột trên hợp đồng. Saccharomyces cerevisiea Invertase • Là bước chính trong qui trình sản xuất enzyme. Kluyveromyces fragilis Lactase • Cơng thức chế phẩm bao gồm thành phần trong enzyme thành phẩm giúp bảo quản, duy trì hoạt tính enzyme, Saccharomycopsis lipolytica Lipase những chỉ dẫn và những qui định chặc chẽ về việc sử Aspergillus species Pectinases và proteases dụng chúng. • Qui định trên tùy thuộc vào mục đích sử dụng của Bacillus species Proteases enzyme. Mucor pusillus Rennet vi sinh 29/09/2011 11:21 SA 85 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 86 Nguyễn Hữu Trí Mucor meihei Rennet vi sinh Các enzyme và quá trình chế biến thực phẩm Các enzyme khơng thể thiếu được trong kỹ thuật chế biến thực Ngày càng cĩ nhiều sự sản xuất enzyme thực phẩm sử dụng cơng nghệ phẩm hiện đại. sinh học tái tổ hợp DNA- rDNA Các enzyme là một phần cần thiết của hầu hết quá trình lên men Việc sử dụng được chấp nhận của các enzyme bởi cơng nghệ rDNA thì dựa vào các điều kiện sau: thức ăn và thức uống, và trong khi hầu hết các enzyme sẽ cĩ nguồn gốc từ các vi sinh vật thì càng cĩ nhiều các quá trình • Enzyme được tạo ra bởi cơng nghệ sinh học rDNA thì giống với những đang được cải thiện bởi sự thêm vào các enzyme ngoại sinh enzyme trong tự nhiên • Sự chuẩn bị enzyme khơng bị nhiễm bất kỳ các chất độc nào mà cĩ thể được đưa vào trong suốt quá trình chế biến hay tinh sạch (Ví dụ các nội độc tố từ Escherichia coli) • Các vi sinh vật sống sĩt bắt nguồn từ cơng nghệ rDNA khơng hiện diện ở bước chuẩn bị cuối cùng Chymosin-men đơng tụ sữa là ví dụ đầu tiên cho cơng nghệ mới này và bây giờ nĩ được sử dụng vượt quá 80% thị trường ở Mỹ và Canada. 29/09/2011 11:21 SA 87 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 88 Nguyễn Hữu Trí Sử dụng cơng nghệ rDNA Sự cải thiện được tăng cường rõ ràng ở giá trị , sự tinh sạch và giá cả của enzyme sẽ đem lại lợi ích và cải thiện chất lượng thực phẩm cho người tiêu dùng Cố định enzyme 29/09/2011 11:21 SA 89 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 90 Nguyễn Hữu Trí 15
16. Enzyme tự do Enzyme cố định • Nhược điểm: • Lẫn vào sản phẩm • Hoạt tính giảm dần sau mỗi phản ứng xúc tác • Khơng bền nhiệt, acid, kiềm, dung mơi hữu cơ. Enzyme hịa tan được gắn vào chất mang. 29/09/2011 11:21 SA 91 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 92 Nguyễn Hữu Trí Lợi ích của việc sử dụng enzyme cố định Thuận lợi của xúc tác sinh học cố định • Giảm giá thành do enzyme được sử dụng lặp đi 1. Cho phép sử dụng lại của các enzyme thành phần. lặp lại, chế phẩm bền hơn trong các điều kiện 2. Lý tưởng cho tiến hành liên tục. pH,t, áp suất thẩm thấu tối ưu, bền nhiệt, cĩ thể 3. Sản phẩm khơng chứa enzyme. hoạt động trong điều kiện nghiên ngặt hơn. 4. Cho phép sự kiểm sốt chính xác hơn của các quá • Enzyme cố định thường ổn định hơn so với dạng trình xúc tác. hịa tan của nĩ và cĩ thể tái sử dụng ở dạng tinh 5. Cải thiện sự ổn định của enzyme. khiết, bán tinh khiết hoặc dạng tồn tế bào. 6. Cho phép phát triển của hệ thống phản ứng đa – Vd: glucose isomerase cố định cĩ thể được sử dụng enzyme. liên tục hơn 1000 giờ trong khoảng nhiệt độ 60 đến 65oC. 7. Cĩ thể xem xét đề nghị khả năng ứng dụng trong cơng nghiệp và y học. • Sản phẩm phản ứng khơng bị lẫn lộn với enzyme 8. Giảm các vấn đề thất thốt • Dễ dàng tổ chức sản xuất các sản phẩm lên men bằng enzyme ngoại bào 29/09/2011 11:21 SA 93 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 94 Nguyễn Hữu Trí Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính Đặc điểm enzyme cố định enzyme khơng hịa tan • Hoạt tính yếu hơn hoạt tính enzyme hịa tan cùng loại. • Phụ thuộc vào bản chất và tính chất hĩa học enzyme • Tuân theo định luật Michaelis – Menten: khơng hịa tan, tùy chất mang là polyanion; polycation, – Cĩ sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang. enzyme sẽ bị ảnh hưởng khác nhau. – Cản trở sự khuếch tán cơ chất và sản phẩm phản ứng • bổ sung dung dich cĩ lực ion cao hoặc dung dịch giảm tốc độ phản ứng đệm nồng độ cao. • Phụ thuộc vào sự khuếch tán cơ chất, sản phẩm và • ịa tan Cĩ tính bền nhiệt cao hơn enzyme h . các phần tử khác: tốc độ khuếch tán trên phụ thuộc • pH tối ưu dịch chuyển sang kiềm hoặc acid so với pH vào các yếu tố kích thước lỗ gel, trong lượng phân tử tối ưu của enzyme hịa tan cùng loại. cơ chất, chênh lệch nồng độ giữa mơi trường vi mơ • Cĩ thể bảo quản tốt hơn xung quan enzyme và enzyme tự do. Giới hạn khuếch • Tái sử dụng nhiều lần tán: rào khuếch tán bên ngồi và bên trong • Điện tích chất mang ảnh hưởng pH tối ưu enzyme 29/09/2011 11:21 SA 95 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 96 Nguyễn Hữu Trí 16
17. Các phương pháp cố định enzyme Chất mang dùng cố định enzyme • Chọn chất mang phù hợp để cố định enzyme • Kinh tế • Hoạt hĩa chất mang • Tính chất cơ lý bền vững, ổn định • Các phương pháp cố định enzyme • Cĩ tính bền về mặt hĩa học, khơng bi tan trong mơi trường phản ứng • Cĩ tính kháng khuẩn cao • Cĩ độ trương tốt, diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. • Cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, dạng hạt, màng hoặc dạng phim mỏng. 29/09/2011 11:21 SA 97 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 98 Nguyễn Hữu Trí Các loại chất mang trong cố định Polymer tự nhiên enzyme • Chất mang hữu cơ: Polymer tổng hợp và polymer • Chất mang polysaccharide: cellulose, agarose, tự nhiên dextran, sephadex, tinh bột, chitin, chitosan • Chất mang vơ cơ: sợi bơng thủy tinh, silicum oxide, Allumium oxide, mangesium oxide • Chất mang cĩ bản chất protein: gelatin, keratin, albumin 29/09/2011 11:21 SA 99 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 100 Nguyễn Hữu Trí Polymer tổng hợp Chất mang vơ cơ • Là những dang oxide cĩ cấu trúc lỗ và khả năng • Polyacrylamide; polyester, polyacry lic; hấp thu tốt polyvinylalcohol • Nhược điểm: giá thành cao, tan trong dung dịch • Ưu điểm: bền, tính chất cơ lý t ốt, hồn tồn trơ kiềm pH > 7.5 cố định những enzyme đặc biệt trước sự tấn cơng của vi khuẩn, độ trương tốt, kích thước siêu lỗ cĩ thể điều chính được • Nhược điểm: Giá thành cao, khơng tương thích sinh học, gây ơ nhiễm mơi trường. 29/09/2011 11:21 SA 101 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 102 Nguyễn Hữu Trí 17
18. Phương pháp hoạt hĩa chất mang Phương pháp hoạt hĩa bằng cyanogen halogenur • Hoạt hĩa bằng cyanogen halogenur • Hoạt hĩa bằng ethyl chloroformate • Hoạt hĩa bằng phương pháp azide • Hoạt hĩa bằng glutaraldehyde • Hoạt hĩa bằng phương pháp diazo • Hoạt hĩa bằng carbodiimide • Hốt hĩa bằng 3 – aminopropyltriethoxysilane 29/09/2011 11:21 SA 103 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21• TSAạo sản phẩm trung gian104 rất độc Nguyễn Hữu Trí Phương pháp hoạt hĩa enzyme Hoạt hĩa bằng phương pháp azide • Quy trình vẫn tạo ra sản phẩm trung gian, nhưng khơng cĩ độc tính • Sử dụng phương pháp azide cho các chất cĩ nhĩm chức –COOH của CM – cellulose polyacrylamide và nylon 29/09/2011 11:21 SA 105 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 106 Nguyễn Hữu Trí Hoạt hĩa bằng glutaraldehyde Hoạt hĩa bằng phương pháp diazo • Áp dụng cho các chất mang chứa nhĩm amine. • Dùng cho các chất mang nhĩm –NH2. Glutaraldehyde cĩ 2 nhĩm aldehyde hoạt hĩa. 29/09/2011 11:21 SA 107 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 108 Nguyễn Hữu Trí 18
19. Hoạt hĩa bằng Hoạt hĩa bằng carbodiimide 3-Aminopropyltriethoxysilane • Hoạt hĩa các chất mang nhĩm carboxyl Hoạt hóa vật liệu trơ như thủy tinh 29/09/2011 11:21 SA 109 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 110 Nguyễn Hữu Trí Các phương pháp cố định enzyme Phương pháp hĩa học – carrier bound • Phương pháp hĩa học trong cố định enzyme là phương pháp tạo liên kết enzyme với chất mang. Gồm 2 kiểu: – 1. Covalent immobilization(Cố định enzyme với chất mang bằng liên kết cộng hĩa trị) – 2. Non – covalent immobilization (Cố định enzyme với chất mang bằng liên kết khơng cộng hĩa trị – phương pháp hấp phụ): 29/09/2011 11:21 SA 111 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 112 Nguyễn Hữu Trí Covalent immobilization Covalent immobilization Multi point covalent attachment • Enzyme được cố định vào chất mang thơng qua sự liên kết • Liên kết cộng hĩa trí giữa nhĩm chức năng (functinal của nhiều cấu tử acid amin lên chất mang. group) của chất mang đã hoạt hĩa và nhĩm chức năng • Chất nền: thủy tinh xốp, polyacrylamide, cellulose, hạt từ trên acid amin của enzyme: -OH; -SH; -NH2; -COOH tính • Khĩ thu hồi lại chất mang • VD: glyoxyl – agarose: enzyme gắn vào chất mang thơng • Hiệu suất cố định enzyme thấp qua liên kết của vùng giàu lysine. • Động học enzyme thường bị thay đổi • Tính linh động và độ ổn định cao. 29/09/2011 11:21 SA 113 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 114 Nguyễn Hữu Trí 19
20. Non - covalent Covalent • Non – covalent (Phương pháp hấp phụ -Khơng cộng • Covalent (cộng hĩa trị): liên kết cộng hĩa trí giữa hĩa trị): Phương pháp liên kết ion (ionic exchange; van nhĩm chức năng (functinal group) của chất mang và der Waals; tương tác kỵ nước (strong hydrophobic nhĩm chức năng trên acid amin của enzyme: -OH; - interaction) SH; -NH2; -COOH VD: Ionic exchange: liên kết giữa chất mang truyền • Multi – point covalent attachment: đa vị trí cĩ khả thống và enzyme dễ bị phá vỡ khi thay đổi nồng độ năng tạo liên kết cơng hĩa trị giữa enzyme và chất muối và pH. mang. • Porous glass, agarose gel, hạt từ (magnetic particle) • Support: Porous glass, agarose gel, hạt từ (magnetic được phủ lớp ionic polymers:polyethylenimine (PEI); particle). dextran sulfate chứa nhiều nhĩm cĩ khả năng tạo liên • kết ion (ionic group) và cĩ cấu trúc linh động dễ dàng Spacer arm: ngắn tương thích enzyme. 29/09/2011 11:21 SA 115 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 116 Nguyễn Hữu Trí Liên kết cộng hĩa trị Covalent • Các chất mang thường sử dụng: polypeptide, polysacharide, agarose • Các liên kết đồng hĩa trị giữa chất mang và E cĩ thể phân loại như sau: • Diazo hĩa: chất mang- N=N- E. • Tạo cầu amit: chất mang-CO-NH- E. • Alkyl và Aryl hĩa: chất mang-CH2-NH2-E. • Tạo bazơ Schiff: chất mang-CH=N-E. • Trao đổi tiol disulfua: chất mang-S-S- E. • Ưu điểm: • Khuyết điểm – Bền, khơng bị ly giải – Đắt tiền và quy trình theo sản phẩm phức tạp – Cĩ nhiều lựa chọn – Cĩ thể làm thay đổi vị trí chất mang phù hợp hoạt động của enzyme 29/09/2011 11:21 SA 117 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 118 Nguyễn Hữu Trí Carrier free Carrier free • Enzyme tự động cố định trong khối protein của nĩ mà • Cross - linked enzyme (CLEs): Được tạo ra từ sự liên khơng cĩ sự hỗ trợ của chất mang với sự hiện diện kết chéo của các enzyme hịa tan của bifuntional reagents như glutaraldehyde • Cross - linked enzyme crystal (CLECs): được tạo ra từ • Cross - linked enzyme (CLEs sự liên kết chéo của các tinh thể enzyme tính ổn • Cross - linked enzyme crystal (CLECs định cao trong các điều kiện khắc nghiệt • Cross - linked enzyme aggregate (CLEAs) • Cross - linked enzyme aggregate (CLEAs): được tạo ra từ sự liên kết chéo của các protein ở trang thái tủa. • Tủa ( muối, dung mơi ) khuấy mạnh tạo liên kết dưới sự hiện diện của glutaraldehyde. 29/09/2011 11:21 SA 119 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 120 Nguyễn Hữu Trí 20
21. Liên kết chéo Carrier free Dựa trên liên kết cộng hĩa trị giữa các enzyme tạo thành khối khơng gian ba chiều. • Ưu điểm: • Khuyết điểm: – Liên kết enzyme chặt – Cĩ thể làm thay đổi – Kết hợp với các đáng kể vị trí hoạt phương pháp khác động tạo ra liên kết bền – Mất hoạt tính enzyme vững trong quá trình cố định 29/09/2011 11:21 SA 121 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 122 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp containment Phương pháp nhốt enzyme (entrapment) • Phương pháp nhốt enzyme (entrapment) • Enzyme được giữ lại trong một khoảng khơng nhỏ được tạo ra trong quá trình polymer hĩa. • Phương pháp giữ trong màng: microcapsule; Enzyme hịa tan vào dung dich monomer trước ultrafiltration khi được polymer hĩa bằng các tác nhân vật lý, hĩa học. • Chất nền (matrix): Alginate Polyacrylamide; polyvinyl alcohol 29/09/2011 11:21 SA 123 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 124 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp bẫy (nhốt) Phương pháp giữ trong màng 1.1 Microencapsulation (gĩi enzyme trong các bao cực nhỏ). Màng polymer • Enzyme microcapsule: quá trình polymer hĩa được thẩm thấu dày 200Ao(cellulose, polysacarit, phi tinh bột) gĩi enzyme bên tiến hành trên bề mặt của giọt enzyme phân tán trong trong. Màng này cho cơ chất và sản dung mơi với sự hỗ trợ của chất hoạt tính bề mặt phẩm enzyme đi qua nhưng khơng cho các đại phân tử đi qua (surfactant) • vỏ bọc bên ngồi. 1.2 Bẫy trong gel: việc bẫy enzyme • Màng siêu lọc (Ultrafilatration membrane): enzyme trong thể nền của gel đạt được được nhốt trong màng siêu lọc, cho phép cơ chất và bằng cách thực hiện phản ứng sản phẩm ra vào màng enzyme hoạt động cần polymer hĩa, tủa / làm đơng với sự hiện diện của enzyme. coenzyme. • Nhược điểm: dễ bị tắc lỗ màng do bọt khí; sự tụ tập các chất khơng mong muốn. 29/09/2011 11:21 SA 125 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 126 Nguyễn Hữu Trí 21
22. Hấp phụ enzyme lên chất khơng tan Hấp phụ enzyme lên chất khơng tan Một số chất mang được sử dụng + Hữu cơ: than hoạt tính, tinh bột, cellulose agarose • Ưu điểm: • Khuyết điểm: + Vơ cơ: Silic, thủy tinh xốp, oxyt của kim loại – Khơng thay đổi cấu – Dễ ly giải khi thay + Polymer tổng hợp: polyamit, nilon, polyacrylamide trúc enzyme hay đổi một số đặc + Chất trao đổi ion: amberit, dietyl-amino-etyl sephadex (DEAE – sephadex), DEAE – cellulose, carboxyl metyl cellulose (CM trung tâm tâm hoạt điểm như pH, t cellulose). động. – Khơng đặc hiệu – Khơng hoặc ít địi hỏi hĩa chất đi kèm – Đơn giản, rẻ tiền 29/09/2011 11:21 SA 127 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 128 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng trong sản xuất cơng nghiệp Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase • Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase • Ưng dụng của enzyme raffinase cố định • Ưng dụng của enzyme invertase cố định • Glucose isomerase tạo ra từ Arthrobacter và • Sản xuất L – amino acid nhờ enzyme aminoacylase streptomyces sp, nhạy với tác nhân kim loại cố cố định định enzyme trên collagen, bơng • Ưng dụng của lactase cố định • D- glucose D- fructose • Sản xuất kháng sinh 29/09/2011 11:21 SA 129 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 130 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng của enzyme raffinase cố định Ứng dụng của enzyme invertase cố định • Enzyme invertase nấm men được cố định trong than (tên thương hiệu Brimac TM) sản xuất siro • Sản xuất: Nuơi nấm mốc Mortierella vinacea var. nghịch đảo chất lượng tương đương, tránh sự faffinoseutilizer trong các hạt sấy khơ sử đậm màu, giảm nồng độ muối và tro trong sản dụng như enzyme cố định phẩm, hiệu xuất chuyển đổi cao. • Ưng dụng: Raffinase ( – galactosidase) cố định • Thời gian phản ứng giảm đáng kể: Enzyme giúp loại bỏ raffinose và stachyose từ sữa đậu invertase tự do (24 giờ), enzyme invertase cố định nành, tránh nguy cơ bị đầy hơi khi dùng thức (15 phút) uống này. 29/09/2011 11:21 SA 131 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 132 Nguyễn Hữu Trí 22
23. Sản xuất L – amino acid nhờ enzyme Ứng dụng của lactase cố định aminoacylase cố định • Sản xuất theo phương pháp hĩa học chỉ thu được • Giá thành cao enzyme lactase từ tế bào nấm amino acid ở dạng đồng phân D – khơng cĩ giá trị dinh men được nhà khoa học Ý cố định với các sợi dưỡng. cellulose triacetate . • L – amino acid tách khỏi hỗn hợp dựa vào sự khác biệt • Lactase dễ bị ức chế bởi sản phẩm tạo thành, chất về độ hịa tan. DL – acylomino acid quay trở lại lị phản béo, protein nhũ tương khi dùng xử lý huyết thanh ứng. sữa nhiễm vi sinh vật. 29/09/2011 11:21 SA 133 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 134 Nguyễn Hữu Trí Sản xuất kháng sinh Ứng dụng trong y học và phân tích • Penicillin amidase từ E. coli cố định trên sephadex • Một số bệnh di truyền về rối loạn chuyển hĩa ở người G200 hoạt hĩa bởi cyanogen bromide thủy phân do thiếu một loại enzyme đặc biệt thay thế bằng benzylpenicillin và phenoxymethylpenicillin sinh ra cách sử dụng enzyme cố định trong các vi hạt, sợi từ quá trình lên men giải phĩng ampicillin. hay gel nhằm tránh gây ra đáp ứng miễn nhiễm cơ thể. • VD: Tạo thận nhân tạo, enzyme urease cố định trong hạt resin hấp phụ hoặc than chì tạo thành các vi nang là nơi hấp phụ sản phẩm quá trình phân hủy urea ở thận 29/09/2011 11:21 SA 135 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 136 Nguyễn Hữu Trí Kỹ thuật tách chiết enzyme 29/09/2011 11:21 SA 137 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 138 Nguyễn Hữu Trí 23
24. Phá vỡ mơ và tế bào Phá vỡ mơ và tế bào (Disruption of tissues and cells) (Disruption of tissues and cells) Lựa chọn mơ • Vi sinh vật thường được chọn làm host organism • Dựa vào giá thành, tính sẵn cĩ và sự phong phú của • Ưu điểm: tốc độ sinh trưởng nhanh enzyme • Nhược điểm: thiếu cơ chế cải biên sau dịch mã • Recombinant DNA technology – xây dựng host cell và enzyme thường ở dang inclusion body. (expression system) • Cải biên gene biểu hiện giúp sản phẩm enzyme • Tránh hoặc hạn chế sử dụng các mơ giàu proteinase. tiết ra mơi trường ngồi tế bào. Vd: gan, lách, thận Ở vi sinh vật tạo mutant strain (dịng đột biến) thiếu một số proteinase (E. Coli, Bacillus subtilis) 29/09/2011 11:21 SA 139 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 140 Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ mơ – tách tế bào Phá vỡ tế bào động vật (disruption of tissue and separation of cells) • Nhiều loại tế bào cĩ trong cùng một mơ. • Mơ được cắt nhỏ (loại bỏ mỡ và mơ liên kết) • Huyền phù tế bào được chuẩn bị bằng phương pháp • Mơ mềm đồng hĩa trong thiết bị đồng hĩa cơ học hoặc phương pháp enzyme. • Mơ cứng cần được xay nhỏ trong máy xay trước • Phương pháp cơ học: ảnh hương tới sự nguyên vẹn tế khi cho vào thiết bị đồng hĩa. bào. • Ly tâm. • Phương pháp enzyme: collagenase từ Clostridium histolyticum, trypsin, estalase tách dựa vào điện tích, antigenicity, kịch thước, tỷ trọng. 29/09/2011 11:21 SA 141 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 142 Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ tế bào thực vật Phá vỡ tế bào nấm men • Thu nhân enzyme từ tế bào thực vật tương đối khĩ • Vách tế bào khăn do sự hiện diện vách tế bào, khơng bào (vacuole) • Nhiều proteinase và hợp chất phenolic. • Tạo đột biến gây ra sự thiếu hụt một vài proteinase • Việc phá vỡ khơng bào giải phĩng proteinases, pH • Ngăn chặn sự tạo proteinase bằng cách nuơi trên mơi dịch chiết thấp. trường khơng chứa cơ chất protein. • Khi cĩ oxygen, phenol oxidases xúc tác chuyển hợp • Phương pháp 1: ủ bánh men trong toluene (6% (v/w)) chất phenolic thành dạng polymeric pigment cĩ thể bất và 2 – mercaptoethonol (0.2 % (v/w)) ở 370 C trong 1 h hoạt (inactivate) enzyme trong dịch chiết tách thành phần vách tế bào EDTA (15 mM) pH 7.0 • Bổ sung chất khử 2 – mercaptoethanol chứa 5 mM 2 – mercaptoethanol, ủ qua đêm phá vỡ • Bổ sung polyvinylpolypyrollidone giúp hấp thu hợp vách tế bào ly tâm 15 000 rpm trong 30 phút chất phenolic. 29/09/2011 11:21 SA 143 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 144 Nguyễn Hữu Trí 24
25. Phá vỡ tế bào nấm men Phá vỡ tế bào vi khuẩn • Vách tế bào • Phương pháp 2: lắc với hạt thủy tinh (đường kính • 1 mm) 1ml dịch được ly tâm 2500 rpm ở 100 C. Phương pháp cơ học thường ảnh hưởng đến các thành phần của tế bào. • Nấm men Pichia pastoris được dùng như tế bào • chủ, recombinant protein được tiết vào mơi Vi khuẩn gram dương (Bacillus, Micrococcus, trường nuơi cấy. Streptococcus) : dùng enzyme lysozyme phá hủy vách tế bào, ủ với lysozyme từ trứng gà (0.2 mg/ml) ở 370 C trong 15 phút. • Vi khuẩn gram âm (E. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp.) : rửa tếbào với detergent (0.1% (v/v) N-lauroyl-sarcosine) xử lý với với sucrose (0.7 M), Tris (0.2 M), EDTA (0.04 M) 29/09/2011 11:21 SA 145 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 146 Nguyễn Hữu Trí Phá vỡ tế bào vi khuẩn Enzyme gắn trên màng tếbào • Dna trong dịch chiết cĩ cĩ độ nhớt cao gây khĩ khăn • Màng tế bào cần được xử lý với non – ionic trong việc tinh sạch enzyme detergent như Triton hay Tween. Các detergent Hoặc xử lý với deoxyribonuclease 1 (10 μg/ml) này ít gây ảnh hương lên cấu trúc protein nĩi Hoặc xử lý với protamine ( protein giàu arginine trong chung và enzyme nĩi riêng. cấu tạo) • Quy luật sử dụng detergent: 2 mg detergent dùng • Hoặc xử lý polymer tích điện dương cho 1 mg màng tế bào. (polyethyleneimine) • CD – circular dichroism được dùng để kiểm tra cấu trúc bậc 2 của enzyme tách chiết. 29/09/2011 11:21 SA 147 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 148 Nguyễn Hữu Trí Các ứng dụng cơng nghiệp của enzymes Ứng dụng của enzyme Ứng dụng Enzyme sử dụng Sử dụng Vấn đề Chất tẩy rửa - Đầu tiên là các protease, được - sử dụng cho các điều kiện trước khi ngâm và - phản ứng dị ứng của cơng nhân chế sinh học sản xuất ở dạng ngoại bào các ứng dụng lỏng trực tiếp. biến; ngày nay đã vượt qua từ vi khuẩn. - chất tẩy rửa cho máy rửa chén để loại kháng được bằng các cơng nghệ chứa. - Amylase cặn tinh bột Cơng nghiệp - Alpha-amylase nấm; bình - xúc tác cắt tinh bột từ bột thành đường, cĩ bánh kẹo thường bị bất hoạt ở 50oC, thể được sử dụng bởi nấm men. Sử dụng bị phá hủy trong quá trình trong sản xuất bánh mỳ trắng, bánh bao, nung nĩng. bánh mỳ nhỏ. - Proteinase - sản xuất bánh quy để hạ thấp mức protein trong bột. Cơng nghiệp -enzyme được tạo ra từ lúa - phân hủy tinh bột và protein để tạo đường rượu bia mạch suốt giai đoạn ngâm đơn, axit amin và peptide được sử dụng trong sản xuất bia. bởi nấm men để thúc đẩy tạo cồn. - các enzyme được sản xuất - ngày nay được sử dụng rộng rải trong sản cơng nghiệp: amylases, xuất rượu bia: cắt polysaccharide và glucanases, proteinase, protein trong làm malt; cải thiện các đặc beta glucanase, tính lọc; bia thấp calo, loại vẩn đục trong amyloglucosidase trữ bia. proteinase. Cơng nghiệp - Rennin, từ dạ dày từ động vật - sản xuất phơ mai, sử dụng để phân cắt - các động vật già khơng thể được sử chế biến nhai lại non (bê, cừu, dê protein. Ngày nay tìm thấy sự gia tăng sử dụng vì khi gia tăng tuổi tác thì bơ sữa con). dụng trong cơng nghiệp bơ sữa. sản xuất rennin giảm và được - các enzyme được tạo từ vi sinh - kích thích làm chin phơ mai mốc xanh (phơ thay thể bởi proteinase, pepsin, vật. mai vân xanh, Roquefort) khơng thích hợp cho sản xuất - Lipase. - bẻ gãy lactose thành glucose và galactose. phơ mai. Những năm gần đây - Lactase. sự gia tăng to lớn tiêu thụ phơ mai cùng với gia tăng sản xuất thịt bị đã dẫn tới gia tăng thiếu 29/09/2011 11:21 SA 149 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 150 hụtNguyrenninễvnà Hgiaữutăng Trígiá cả 25
26. ứng dụng Enzyme sử dụng Sử dụng Vấn đề Cơng nghiệp - Amylase, - chuyển tinh bột thành glucose và các chất ngọt (siro) Được sử dụng rộng Ứng dụng của enzyme tinh bột amyloglucosidases khác. rải ở Mỹ và và glucoamylases. - chuyển glucose thành fructose (các siro cao fructose Nhật nhưng ở - Glucose isomerase bắt nguồn từ các chất liệu tinh bột đã kích thích Châu Âu giới - các enzyme cố định. tính làm ngọt và thấp năng lượng). hạn để bảo vệ - sản xuất các siro cao fructose. nơng dân trồng củ cải đường. Cơng nghiệp dệt Enzyme Amylase - ngày nay được sử dụng rộng rải để loại tinh bột, - Các enzyme vi khuẩn. được sử dụng như một chất dính hoặc hồ vải trên các sợi vải của bề mặt vải nhất định để ngăn chặn các hư hại trong dệt. (theo cổ truyền, sự loại hồ dán sử dụng các hĩa chất mạnh là phổ biến). - thơng thường dành cho loại hồ vải bởi vì chúng cĩ khả năng chịu nhiệt lên tới 100-110oC. Cơng nghiệp - Các enzyme tìm ở phân - theo cổ truyền, được sử dụng để xử lý da thuộc để - việc chuẩn bị cĩ thuộc da chĩ và bồ câu. làm mềm lại bởi loại bỏ các thành phần protein mùi rất khĩ - các enzyme Trypsin từ nhất định. (quá trình gọi là ngâm mềm; ngâm chịu. lị mổ và từ vi sinh mềm mạnh được địi hỏi để làm cho miếng da vật. mềm, mịn, ngâm mềm nhẹ cho đế giầy. - hiện nay thay thế một lượng lớn các enzyme đã để cập ở trên trong ngâm mềm. cũng được sử dụng cho loại lơng từ da sống. Cơng nghê enzyme bắt đầu phát triển vào những năm Sử dụng trong y - Trypsin - giải phẩu loại các mơ hư, làm tan các cục máu học và - trypsin tuyến tụy. nghẽn. 1950, khi thế chiến II cần lượng lớn penicilline. dược29/09/2011học 11:21 SA - hổ trợ kiểm sốt phân151cắt, xử lý sưng tấy, Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 152 Nguyễn Hữu Trí - nhiều enzyme được sử dụng trong hĩa học lâm sàng như các cơng cụ chuẩn đốn. Ứng dụng của enzyme Ứng dụng của enzyme • Phần lớn enzyme cĩ thể được sản xuất bởi vi sinh • Phần lớn enzyme sử dụng trong cơng nghiệp là vật (nấm sợi, vi khuẩn và nấm men phần cịn lại từ enzyme ngoại bào (protease, amylase và (mức độ ít động vật và thực vật). hơn) cellulose, lipase ), thường khơng cần • Khi sử dụng tế bào vi vật trong lên men cĩ để xúc cofactor để hoạt động. tác lại cĩ một số nhược điểm: • Một số enzyme nội bào được sản xuất cơng nghiệp – Tiêu thụ cơ chất. bào gồm glucose oxidase cho bảo quản thực phẩm, – Hình thành các sản phẩm khơng mong muốn. asparaginase cho trị liệu ung thư và penicillin – Thu nhận và tinh sạch sản phẩm cĩ thể khĩ acylase cho sự biến đổi kháng sinh khăn. Hướng khắc phục: dùng enzyme cố định. 29/09/2011 11:21 SA 153 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 154 Nguyễn Hữu Trí Ứng dụng của enzyme • Nhờ cơng nghệ di truyền, cĩ thể chuyển gene mong muốn từ sinh vật này sang sinh vật chủ thích hợp sản xuất các enzyme cơng nghiệp chất lượng và độ tinh sạch cao. Ứng dụng trong thực phẩm • Vi sinh vật tái tổ hợp ngày càng được sử dụng rộng rải và là xu hướng chủ yếu trong tương lai. 29/09/2011 11:21 SA 155 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 156 Nguyễn Hữu Trí 26
27. Các enzyme được sử dụng ở quy mơ cơng nghiệp trong cơng nghệ thực phẩm Chế biến các chất ngọt từ tinh bột • Nguyên liệu: tinh bột Bắp, Lúa mì, bột Khoai mì, Khoai tây. 29/09/2011 11:21 SA 157 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 158 Nguyễn Hữu Trí • Giá cả: giá enzyme đã giảm đáng kể, mức chấp nhận được trong thập kỷ qua. • Gia tăng sử dụng enzyme tinh sạch cao và đặc hiệu cao. • gia tăng lợi nhuận từ mua bán enzyme rất nhiều. 29/09/2011 11:21 SA 159 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 160 Nguyễn Hữu Trí Protease thực vật – Bromelin (E.C.3.4.4.24) • Bromelin là nhĩm protease chứa nhĩm sulfhydryl, thu nhận từ thực vật thuộc họ Bromeliaceae. • Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. • pH hoạt động: pH 6 – 8; Mw: 33 000 Da. • Bromelin là một glycoprotein • Thịt dứa cĩ hoạt tính enzyme bromelin kể từ 3 tháng trước khi chín và hoạt độ cao nhất trong khoảng 20 ngày trước khi chín. 29/09/2011 11:21 SA 161 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 162 Nguyễn Hữu Trí 27
28. Bromelin – Quy trình thu nhận và Thu nhận bromelin tinh sạch bromelin Quả/thân/chồi xay nhuyễn/lọc dịch lọc ly • Thu dịch bromelin thơ tâm dịch ly tâm kết tủa thu tủa (chế phẩm • Phương pháp tách bromelin enzyme thơ) sấy khơ tinh sạch sản phẩm • Phương pháp kết tủa enzyme tinh khiết. • Phương pháp hấp phụ • Phương pháp siêu lọc 29/09/2011 11:21 SA 163 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 164 Nguyễn Hữu Trí Thu dịch thơ bromelin Phương pháp tách bromelin • Xay nhuyễn thân, quả dứa bằng máy xay • Phương pháp kết tủa protein: kết tủa phải được • Vắt kỹ thực hiện trong điều kiện lạnh • Lọc thu dịch lọc • Sử dụng aceton: dịch ép được làm lạnh từ 0 – 40 0 • Ly tâm 6000 rpm trong 10 phút thu dịch nổi C, aceton được giữ ở 20 C. • Ethanol: dich chiết và ethanol phải được giữ lạnh. Kết tủa thu được phải được rửa bằng acetone và làm khơ nhanh. • Amonium sulphate: amonium sulphate nồng độ bão hịa (70%) giúp kết tủa bromelin. Quá trình thực hiện ở nhiệt độ thấp. 29/09/2011 11:21 SA 165 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 166 Nguyễn Hữu Trí Phương pháp tách bromelin Phương pháp tinh sạch bromelin • Phương pháp hấp phụ: Kaolin khơ được trộn dung • Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích dịch nước dứa sau ly tâm theo tỷ lệ 25 mg kaolin/1ml • Hịa 1 g bromelin thơ trong 10 ml đệm sodium dịch khuấy từ ly tâm thu tủa bromelin – kaolin. phosphate 0.03 M pH 7.2 túi cellophane đựng • Phương pháp siêu lọc: loại bỏ các chất cĩ kích thước trong cốc chứa sẵn 1 lit đệm sodium phosphate nhỏ hơn phân tử bromelin giúp cơ đặc bromelin 0.03 M pH 7.2 khuấy từ trong 6 giờ thay dung dịch đệm ngồi túi mỗi 2 giờ. • Điều khiển nhiệt độ thích hợp nhằm tránh tắt nghẽn lỗ lọc. • Điều chỉnh nhiệt độ phù hợp • Điều chỉnh áp suất giúp tăng tốc độ dịng chảy giúp • Tinh sạch bằng phương pháp lọc qua sephadex G tăng hiệu suất lọc. – 50, G – 100. • Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký 29/09/2011 11:21 SA 167 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 168 Nguyễn Hữu Trí 28
29. Protease thực vật – Papain Hoạt tính enzyme và cơ chế xúc tác (E.C.3.4.4.10) • Papain là một sulfhydryl protease tách được từ nhựa đu • Papain cần nhĩm sulhydryl tự do để thể hiện hoạt tính. đủ xanh. • Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các • Quả xanh 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất. Trong amino acid. nhựa, nhồi thành phần chính là papain (95%) cịn chứa • Papain cĩ khả năng thủy phân sâu hơn. một số protein khác. • Papain cĩ tính đặc hiệu rộng: thủy phân hầu hết liên • Papain là endoprotease gồm 185 amino acid. Mw: 20. 900 kết peptide trừ liên kết với proline và với các glutamic Da. cĩ carboxyl tự do. • Papain cĩ cấu trúc khơng gian dạng hình cầu, gồm 2 • Khả năng thủy phân tùy thuộc vào trạng thái cơ chất nhân kỵ nước. • Papain cịn cĩ hoạt tính esterase, thiol esterase và • Vùng trung tâm hoạt động papain: Lys – Asp – Glu – Gly transferase. – Ser – Cys – Gly – Ser - Cys 29/09/2011 11:21 SA 169 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 170 Nguyễn Hữu Trí Protease động vật – pepsin Hoạt động xúc tác của pepsin (E.C.3.4.4.1) • Pepsin là enzyme quan trọng cĩ trong tuyến tiêu hĩa động vật, thuộc nhĩm enzyme thủy phân • Protease chỉ cĩ khả phân cắt 15% liên kết peptide • Cấu trúc: pepsin cĩ dạng hình cầu, cấu trúc bậc 4 gồm trong protein đoạn peptide bốn tiểu đơn vị. • Pepsin chỉ đặc hiệu cắt liên kết peptide giữa acid • Một trong 3 liên kết S – S trong phân tử cần thiết cho amine nhân thơm với amino acid khác. trung tâm hoạt động. • Pepsin cịn cĩ khả năng cắt các nối peptide giữa • Papain gồm 329 amino acid pI : pH 1.0 Leu –Val, Val – Cys, Glu – Asn, Leu – Glu ở mức độ thấp hơn. • Trung tâm hoạt động pepsin gồm một hoặc 2 nhĩm • carboxyl của acid glutamic, một nhân thơm của Pepsin phân cắt dễ dàng protein tan trong nước. tyrosine. • Pepsin bị ức chế bởi cơ chất dạng epoxide • Pepsin cĩ tính acid mạnh. Mw: 34. 500 Da • Tiền enzyme của pepsin là pepsinogen. 29/09/2011 11:21 SA 171 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 172 Nguyễn Hữu Trí Protease động vật – trypsin Hoạt động và tính đặc hiệu của (E.C.3.4.21.4) trypsin • Trypsin cĩ trong dịch tụy người và động vật. • Trung tâm hoạt động: -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro- • Trypsin là một protease kiềm tính hoạt động ở ruột. • Trypsin cắt liên kết peptide giữa carboxyl của lysine, • Tiền enzyme của trypsin là trypsinogen: hoạt hĩa nhờ arginine với nhĩm amine của các amino acid khác. enzyme đường ruột enterokinase. • Trypsin tác dụng tốt hơn với protein bị biến tính • Mw: 22.680 – 23.400 Da gồm 249 amino acid. • Trypsin chỉ phân cắt được 1/3 liên kết peptide trong • pH tối ưu: pH 8; pH thích hợp: 7.8 – 9.5, vẫn ổn định pH phân tử protein, tạo các peptide nhỏ và các amino thấp 3 – 5. acid. • Nhiệt độ hoạt động: nhiệt độ cơ thể và vẫn hoạt động • Trypsin cịn khả năng thủy phân ester. tốt trong khoản 30 – 400 C. • Trypsin được hoạt hĩa bởi: Ca, Co, Mn và bị ức chế bởi: Cu, Ag, Hg. 29/09/2011 11:21 SA 173 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 174 Nguyễn Hữu Trí 29
30. Amylase Amylase • Amylase là một enzyme đĩng vai trị chủ yếu trong • 6 loại amylase được chia thành 2 nhĩm: hoạt động thủy phân tinh bột trong quá trình nảy mầm Endoamylase: α – amylase và nhĩm enzyme khử của hạt ngũ cốc. nhánh Dextrin – 6- glucanhydrolase, amylopectin – 6 – • Cĩ 6 loại amyalse, các enzyme này khác nhau ở đăc glucanhydrolase và oligodextrin – 6 – glucanhydrolase tính, pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt: (dextrinaxe). – amylase,  – amylase, – amylase (glycoamylase): Exoamylase: β – amylase, γ – amylase. thủy phân - 1,4 - glycoside của tinh bột. • Amylase từ các nguồn khác nhau cĩ thành phần, tính • Dextrin–6-glucanhydrolase, amylopectin–6– chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu, các đặc điểm thủy glucanhydrolase và oligodextrin – 6 – glucanhydrolase phân khác nhau. (dextrinaxe): thuỷ phân - 1,6 - glycoside của tinh bột. 29/09/2011 11:21 SA 175 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 176 Nguyễn Hữu Trí Amylase Thu nhận amylase từ vi sinh vật • Phân lập, chọn giống vi sinh vật • Chọn cơ chất cảm ứng, thành phần mơi trường nuơi cấy thích hợp. • Tiêu chuẩn hĩa các điều kiện nuơi cấy: nhiệt độ nuơi, pH, độ ẩm ban đầu, độ thống khí 29/09/2011 11:21 SA 177 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 178 Nguyễn Hữu Trí Nuơi vi sinh vật tạo amylase bằng Nuơi vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp bề mặt phương pháp bề sâu • Nguyên liệu: cám mì, cám gạo, chất lượng nguyên liệu ảnh hưởng lớn hoạt lực amylase sinh ra. • Mơi trường dinh dưỡng: nguồn nguyên liệu giàu tinh • Độ ẩm tối thích: (nấm mốc: Asp. niger, Asp. awamort ) bột, chất cảm ứng cho sinh trường vi sinh vật tạo từ 58 – 60% amylase. Tùy loại vi sinh vật, người ta cĩ thể bổ sung • Nhiệt độ nuơi: thêm 1 số loại muối vơ cơ, trong đĩ các muối nitrate được vi sinh vật sử dụng như nguồn nitơ. • Giai đoạn nảy mầm của đính bào tử (3-4 giờ): 23 – 300 C 0 0 đối với nấm mốc, 32 – 380 C đối với vi khuẩn • Nhiệt độ nuơi: 30 -32 C đối với nấm sợi; 37 C đối với Bacillus subtilis. Nhiệt độ nuơi ảnh hưởng tới độ bền • Giai đoạn sinh trưởng nhanh của hệ sợi, hơ hấp xảy ra nhiệt của amylase tạo thành. mạnh, sinh nhiệt lớn (4-18 giờ) thổi khí vơ trùng nhiệt độ 28 -290 C và độ ẩm cao • Sục khí và khuấy trộn: phần lớn vi sinh vật tạo amylase là vi sinh vật hiếu khí, cần oxy hịa tan trong mơi • Giai đoạn tạo amylase mạnh (10 -20 giờ) trường để tăng trưởng. • Thời gian nuơi để thu amylase cực lớn tùy vào loại vi sinh vật 29/09/2011 11:21 SA 179 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 180 Nguyễn Hữu Trí 30
31. Pectinase • Enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. • Trong tự nhiên, hiện tượng này thương xảy ra khi trái cây chín. • Ưng dụng trong thực phẩm, giúp làm trong nước rau quả. • Kiểm sốt hoạt động pectinase giúp điều chỉnh độ nhớt sản phẩm • Pectinase được phân loại dựa trên cơ chế tác dụng của chúng 29/09/2011 11:21 SA 181 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 182 Nguyễn Hữu Trí Cellulase Lipase • Trong thiên nhiên cellulose bị phân hủy bơi vi sinh vật • Lipase là enzyme tham gia thủy phân glyceride tạo cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. monoglyceride và các acid béo. • Quá trình phân hủy này được xúc tác bởi enzyme • Phân loại: cellulase. • Pancreatic lipase thu từ tuyến tụy của heo. Enzyme • Vi sinh vật trong tự nhiên cĩ khả năng sinh tổng hợp này tham gia thủy phân triglyceride, dầu, chất béo, cellulase: nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn. acid béo đơn giản • Đĩng vai trị quan trong chuyển hĩa vật chất trong tự • Pregastric lipase: enzyme được sản xuất từ động vật. nhiên và cả trong cơng nghiệp thực phẩm, mơi trường. Enzyme tham gia thủy phân acid béo chuỗi ngắn trong chất béo của sữa • Lipase từ vi sinh vật: sử dụng nấm sợi và vi khuẩn sản xuất lipase theo qui mơ cơng nghiệp 29/09/2011 11:21 SA 183 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 184 Nguyễn Hữu Trí Lactose Lactase Enzyme lactase (-galactosidase) thu được từ nấm mốc • Một số người khơng thể hấp thu Aspergillus oryzae được lactose ở trong sữa tuy nhiên lactose vẫn ở trong hệ tiêu hĩa và được lên men bởi vi khuẩn. Hậu quả là làm cho cơ thể buồn nơn, co rút, sinh hơi, và tiêu chảy sau khoảng 4 giờ sau khi sử dụng sản phẩm sữa. • Lactase tiêu hĩa được lactose trong thực phẩm • Vì vậy các sản phẩm sữa khơng chứa lactose rất cần thiết 29/09/2011 11:21 SA 185 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 186 Nguyễn Hữu Trí © 2008 Paul Billiet ODWS © 2008 Paul Billiet ODWS 31
32. Amylase Amylase Dệt: rủ bỏ hồ vải (tầng lớp hồ để mặt vải trở nên mịn, dễ bắt màu) 29/09/2011 11:21 SA 187 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 188 Nguyễn Hữu Trí Pectinase Pectinase Thành phần Prozyme: Protease, Amylase, Cellulase, Lipase, Pectinase, Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E, Vitamin K3, Stay C rất cần thiết cho sự tiêu hĩa và tăng trọng của tơm. Pectinase cĩ khả năng thủy phân pectin. Sản xuất nước quả từ nguyên liệu quả nhờ cơ chế phá vỡ protopectin (chất làm liên kết tế bào), thủy phân protein, phá vỡ nguyên sinh chất của tế bào vỡ tế bào nước chảy ra, hiệu suất tăng. Làm trong nước quả ép (bia, rượu) 29/09/2011 11:21 SA 189 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 190 Nguyễn Hữu Trí Pectinase Chiến lược sản xuất enzyme tẩy rửa của Novo Nordisk A/S -Gene enzyme lipolase Humicola lanuginosa được chuyển vơ Aspergillus oryzae thích hợp cho mục đích thương mại hơn. - Enzyme làm tăng hiệu quả ở các điều Bảo quản thực phẩm : kiện giặt tẩy. Phối hợp với catalase kéo dài thời gian bảo quản của bột trứng, sữa khơ, làm ổn định bia. - Ổn định với nhiệt và pH liên quan tới giặt Chống rỉ các bao bì đựng nước giải khát CO2 ( do đuổi O2 ra khỏi sản phẩm khi thêm nước vào ). tẩy. 29/09/2011 11:21 SA 191 Nguyễn Hữu Trí 29/09/2011 11:21 SA 192 Nguyễn Hữu Trí 32
33. Chân thành cảm ơn 29/09/2011 11:21 SA 193 Nguyễn Hữu Trí 33