Giáo trình Công nghệ Protein - Chương 3: Nồng độ Proton (pH)

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ Protein - Chương 3: Nồng độ Proton (pH)

1. CCáácc phươngphương phpháápp thuthu nhnhậậnn proteinprotein Các phương pháp chiết rút và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan của protein cần chiết rút. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết rút các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau. 1
2. NhiNhiệệtt đđộộ Để tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt. Một điều cần lưu ý là chỉ nên dùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt. Dịch protein enzyme được giữ ở 50 - 700C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thu nhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp. 2
3. NhiNhiệệtt đđộộ ĐĐểể thuthu nh nhậậnn ch chếế phphẩẩmm protein protein theo theo phương phương phpháápp kkếếtt ttủủaa thuthuậậnn nghnghịịchch bbằằngng ccáácc mumuốốii trungtrung ttíính,nh, ccầầnn titiếếnn hhàànhnh ởở nhinhiệệtt đđộộ ththấấp,p, đđốốii vvớớii dungdung môimôi h hữữuu cơ cơ c cầầnn ti tiếếnn h hàànhnh ởở nhinhiệệtt đ độộ dư dướớii 0 00CC trtráánhnh bibiếếnn ttíínhnh đđặặcc bibiệệtt llàà proteinprotein enzyme.enzyme. 3
4. NNồồngng đđộộ protonproton (pH)(pH) ProteinProtein llàà ccáácc chchấấtt lưlưỡỡngng ttíính,nh, vvìì vvậậy,y, trongtrong ccáácc dungdung ddịịchch acidacid vvàà kikiềềmm chchúúngng ssẽẽ bbịị phânphân lyly nhưnhư sau:sau: KiKiềềmm ProteinProtein COOHCOOH ProteinProtein COOCOO- ++ HH+ acidacid acidacid ProteinProtein NH2NH2 ProteinProtein NH3NH3+ KiKiềềm.m. 4
5. NNồồngng đđộộ protonproton (pH)(pH) Do các acid amin trong chuỗi polypeptide còn tồn tại nhiều nhóm chức tự do dưới dạng các ion hóa là nguyên nhân tạo ra tính đa điện của protein. Phân tử protein rất dài nên nhóm ion tự do tận cùng của chuỗi polypeptide không đáng kể, chủ yếu các nhóm chức tự do khác của chuỗi bên (R) quyết định tính chất tích điện của phân tử protein (nhóm cacboxyl của amino acid, OH của Tyrosine, - NH2 của lysine, guamidin của Arginine, inidazol của histidine) Mức độ ion hóa của các nhóm này phụ thuộc vào giá trị pH. Các nhóm acid ở dạng anion trong môi trường kiềm, các nhóm kiềm tồn tại ở dạng cation trong môi trường acid 5
6. NNồồngng đđộộ protonproton (pH)(pH) ở một giá trị pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm. Kết quả là ở giá trị nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ có tổng điện tích khác nhau. Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựa vào đặc tính này. Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấu đẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch. Mỗi một protein có một giá trị pH nhất định mà ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không. Giá trị đó gọi là điểm đẳng điện của protein. 6
7. NNồồngng đđộộ protonproton (pH)(pH) Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với các acid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp. 7
8. NNồồngng đđộộ protonproton (pH)(pH) Điểm đẳng điện của các acid amin trung tính có giá trị pH từ 5,6 - 7,0; đối với các acid amin có tính acid (dicarboxylic) là từ 3,0 - 3,2; đối với các acid amin có tính kiềm (diamino) là từ 9,7 - 10,8. Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein dễ bị kết tủa. Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzyme trong hỗn hợp. 8
9. NNồồngng đđộộ protonproton (pH)(pH) giống như trường hợp tác dụng của nhiệt độ trong việc tách chiết protein, có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH của môi trường. Dịch protein enzyme được giữ ở pH 5 trong thời gian xác định. Protein tạp bị biến tính cũng được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm. Ví dụ citochrom C cũng tan trong acid trichloracetic trong khi đó acid này làm kết tủa phần lớn protein. Như vậy các protein bền với acid có thể được tách chiết bằng cách này. 9
10. TTáácc nhânnhân hhóóaa hhọọcc Có thể dùng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ để tách chiết các protein enzyme. Phương pháp này được tiến hành dựa trện cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein enzyme các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tính. Dung môi hữu cơ thường dùng là etanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. 10
11. TTáácc nhânnhân hhóóaa hhọọcc Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần chú ý tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 50C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 00C và có thể đến -200C, như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme. Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh. 11
12. TTáácc nhânnhân hhóóaa hhọọcc Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme. Loại muối này lại rẽ tiền và phổ biến. Độ hòa tan của nó lại rất lớn (bảo hòan 767g/l ở 250C) nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau thì khác nhau. 12
13. TTáácc nhânnhân hhóóaa hhọọcc Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa. Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme. Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme. Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy từ để đảm bảo sự hòa tan của muối. Khi dùng dung dịch bảo hòa, trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu, người ta đưa ra bảng tính số lượng muối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhất định. 13
14. TTáácc nhânnhân hhóóaa hhọọcc Nếu thêm từng phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 (có nồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme. Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên. Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản. 14
15. PhPháá vvỡỡ ttếế bbààoo Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào). 15
16. PhPháá vvỡỡ ttếế bbààoo Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. 16
17. PhPháá vvỡỡ ttếế bbààoo Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào). 17
18. PhPháá vvỡỡ ttếế bbààoo Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào. Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày. Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào. Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. 18
19. PhPháá vvỡỡ ttếế bbààoo ĐĐểể viviệệcc phpháá vvỡỡ ccóó hihiệệuu ququảả,, ởở mômô ththựựcc vvậật,t, trưtrướớcc khikhi nghinghiềền,n, ngưngườờii tata thưthườờngng ththááii nhnhỏỏ mmẫẫuu đđểể vvààoo ngănngăn đđáá hohoặặcc chocho trươngtrương nưnướớc.c. (v(víí ddụụ nhưnhư đđốốii vvớớii mmẫẫuu hhạạtt khô).khô). CònCòn ởở ccáácc mômô ccủủaa đđộộngng vvậậtt nhưnhư gangan hohoặặcc ththậận,n, khikhi chichiếếtt proteinprotein enzymeenzyme ngưngườờii tata ccầầnn ccắắtt bbỏỏ ccáácc mômô liênliên kkếết.t. 19
20. PhPháá vvỡỡ ttếế bbààoo Muốn tách được các protein trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent). Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. 20
21. ChiChiếếtt rrúútt proteinprotein SauSau khikhi đđãã phpháá vvỡỡ ccấấuu trtrúúcc ccủủaa ccáácc ttếế bbààoo titiếếnn hhàànhnh chichiếếtt xuxuấấtt ccáácc proteinprotein enzymeenzyme bbằằngng ccáácc dungdung ddịịchch đđệệmm ththííchch hhợợp,p, dungdung ddịịchch mumuốốii trungtrung ttíínhnh hohoặặcc bbằằngng nưnướớcc đđốốii vvớớii proteinprotein enzymeenzyme nnộộii bbààoo hohoặặcc bbằằngng lyly tâmtâm ttááchch ttếế bbààoo đđốốii vvớớii ccáácc proteinprotein enzymeenzyme ngongoạạii bbàào:o: viviệệcc chchọọnn phươngphương phpháápp ttááchch chichiếếtt proteinprotein enzymeenzyme ttùùyy thuthuộộcc vvààoo ttíínhnh chchấấtt ccủủaa proteinprotein enzymeenzyme ccầầnn nghiênnghiên ccứứu.u. 21
22. TTááchch enzymeenzyme Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống. Việc điều chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầy tốn kém nếu không muốn nói là điều không tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng. 22
23. TTááchch enzymeenzyme Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác. Lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài nên chúng ta phải chọn nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. 23
24. TTááchch enzymeenzyme Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim dùng để tách enzyme rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác. Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé người ta có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein. Renin là chế phẩm enzyme có giá trị lớn trong công nghiệp. 24
25. TTááchch enzymeenzyme Ở thực vật: thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy. Ví dụ trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương có nhiều enzyme urease. Thóc nảy mầm chứa nhiều - amylase, ở củ khoai lang lại có nhiều - amylase. Người ta đã thu được một số chế phẩm enzyme thủy phân như papain, bromelain, fixin từ thực vật bậc cao. Papain thu được từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu được từ các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa, còn fixin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus. 25
26. TTááchch enzymeenzyme Qua các nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiết xuất các chế phẩm enzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu này không thể dùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm sau đây: Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được. - Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân. 26
27. TTááchch enzymeenzyme Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩm enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyên liệu từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn và hạn chế ở trên. Trước hết vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 – 100 giờ) vì vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm. 27
28. TTááchch enzymeenzyme EnzymeEnzyme vi vi sinh sinh v vậậtt c cóó hohoạạtt t tíínhnh r rấấtt m mạạnh,nh, vưvượợtt xaxa ccáácc sinhsinh vvậậtt khkháác.c. VVìì vvậậyy chchỉỉ ccầầnn mmộộtt lưlượợngng nh nhỏỏ enzymeenzyme c cóó ththểể chuychuyểểnn h hóóaa m mộộtt lưlượợngng llớớnn cơcơ chchấất.t. SSốố liliệệuu ttíínhnh totoáánn chocho bibiếết,t, trongtrong vòng vòng 24 24 gi giờờ,, vi vi sinh sinh v vậậtt c cóó khkhảả năng năng chuychuyểểnn h hóóaa m mộộtt lư lượợngng th thứứcc ăn ăn g gấấpp 30 30 4040 llầầnn so so v vớớii tr trọọngng lư lượợngng cơ cơ th thểể chchúúng.ng. T Trongrong khikhi đđóó,, hhệệ enzymeenzyme ccủủaa concon llợợnn trêntrên 5050 kgkg chchỉỉ ccóó ththểể chuychuyểểnn hhóóaa đưđượợcc vvààii kgkg ththứứcc ănăn trongtrong ngngàày.y. 28
29. TTááchch enzymeenzyme EnzymeEnzyme vi vi sinh sinh v vậậtt c cóó hohoạạtt t tíínhnh r rấấtt m mạạnh,nh, vưvượợtt xaxa ccáácc sinhsinh vvậậtt khkháác.c. VVìì vvậậyy chchỉỉ ccầầnn mmộộtt lưlượợngng nh nhỏỏ enzymeenzyme c cóó ththểể chuychuyểểnn h hóóaa m mộộtt lưlượợngng llớớnn cơcơ chchấất.t. SSốố liliệệuu ttíínhnh totoáánn chocho bibiếết,t, trongtrong vòng vòng 24 24 gi giờờ,, vi vi sinh sinh v vậậtt c cóó khkhảả năng năng chuychuyểểnn h hóóaa m mộộtt lư lượợngng th thứứcc ăn ăn g gấấpp 30 30 4040 llầầnn so so v vớớii tr trọọngng lư lượợngng cơ cơ th thểể chchúúng.ng. T Trongrong khikhi đđóó,, hhệệ enzymeenzyme ccủủaa concon llợợnn trêntrên 5050 kgkg chchỉỉ ccóó ththểể chuychuyểểnn hhóóaa đưđượợcc vvààii kgkg ththứứcc ănăn trongtrong ngngàày.y. 29
30. TTááchch enzymeenzyme Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng hợp được. Ví dụ cellulase, raxemase Phần lớn các thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và giá rẻ. Nhiều vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên các môi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm như các phế liệu của các ngành sản xuất. Hơn nữa, có thể dùng những nguyên liệu không phải thực phẩm, những dung dịch muối vô cơ để nuôi vi sinh vật. Vì vậy dùng vi sinh vật làm nguồn thu enzyme sẽ mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao 30
31. TTááchch enzymeenzyme ViVi sinhsinh vvậậtt sinhsinh ssảảnn phpháátt tritriểểnn vvớớii ttốốcc đđộộ ccựựcc kkỳỳ nhanhnhanh ch chóóng,ng, kh khốốii lư lượợngng l lạạii nh nhỏỏ,, k kííchch thưthướớcc b béé,, n nhưnghưng t tỷỷ llệệ enzymeenzyme trong trong t tếế bbààoo tươngtương đ đốốii l lớớnn nên nên quy quy tr trììnhnh s sảảnn xu xuấấtt ch chếế phphẩẩmm enzymeenzyme khkháá ddễễ ddààng,ng, hihiệệuu susuấấtt thuthu hhồồii cao.cao. LưLượợngng enzymeenzyme ccóó ththểể đưđượợcc ssảảnn xuxuấấtt rara trongtrong m mộộtt th thờờii gian gian ng ngắắn.n. Đ Đốốii v vớớii m mộộtt s sốố trưtrườờngng h hợợpp c cóó ththểể ddùùngng 100% 100% sinh sinh kh khốốii vi vi sinhsinh vvậậtt llààmm ngunguồồnn enzyme.enzyme. 31
32. TTááchch enzymeenzyme Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo những chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme. 32
33. TTááchch enzymeenzyme TuyTuy vvậậyy trongtrong ququáá trtrììnhnh chchọọnn ngunguồồnn nguyênnguyên liliệệuu ttừừ vivi sinhsinh vvậật,t, ccầầnn lưulưu ýý mmộộtt ssốố vivi sinhsinh vvậậtt ccóó khkhảả năngnăng sinhsinh đđộộcc ttốố đđểể ccóó bibiệệnn phpháápp xxửử lýlý ththííchch hhợợp.p. NNóóii chungchung ccáácc vivi sinhsinh vvậậtt mumuốốnn đưđượợcc ssửử ddụụngng llààmm ngunguồồnn nguyênnguyên liliệệuu ttááchch enzymeenzyme ccầầnn phphảảii thothoảả mãnmãn ccáácc điđiềềuu kikiệệnn sau:sau: KhKhảả năngnăng ttổổngng hhợợpp enzymeenzyme mmạạnhnh trongtrong mmộộtt ththờờii giangian ngngắắn.n. DDễễ ttááchch enzymeenzyme vvàà khôngkhông sinhsinh đđộộcc ttốố 33
34. TTááchch enzymeenzyme Trong điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượng enzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý cơ thể của chúng ( thường được gọi là sự tổng hợp enzyme "bản thể"). Nếu khi tăng hàm lượng một số chất hoặc thêm một số chất mới vào môi trường nuôi cấy, đặc biệt là cơ chất của enzyme, thì sự tổng hợp enzyme tương ứng tăng lên một cách đáng kể, khác thường có khi còn tổng hợp enzyme mới: hiện tượng trên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme. Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng. Sự tổng hợp một lượng đáng kể enzyme gọi là siêu tổng hợp enzyme. 34
35. TTááchch enzymeenzyme ĐĐểể thuthu đưđượợcc ngunguồồnn enzymeenzyme ddồồii ddààoo ttừừ vivi sinhsinh vvậật,t, ccầầnn phphảảii nuôinuôi ccấấyy chchúúng.ng. CCóó haihai phươngphương phpháápp nuôinuôi ccấấyy vivi sinhsinh vvậậtt đđểể thuthu enzyme:enzyme: 1.1. PhươngPhương phpháápp nuôinuôi ccấấyy bbềề mmặặtt ((phươngphương phpháápp nnổổii )) 2.2. PhươngPhương phpháápp nuôinuôi ccấấyy bbềề sâusâu (p(phươnghương phpháápp chchììm).m). 35
36. TTááchch enzymeenzyme Phương pháp nuôi cấy bề mặt Người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hoạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, cám mì, bắp xay nhỏ ). Để môi trường xốp người ta trộn thêm một lượng nhỏ mạt cưa Sau khi nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường được sấy nhẹ, nghiền nhỏ. Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô. Muốn có chế phẩm tinh khiết phải qua giai đoạn tách và tinh chế enzyme. 36
37. TTááchch enzymeenzyme PhươngPhương phpháápp nuôinuôi ccấấyy bbềề sâusâu NgưNgườờii tata chocho vivi sinhsinh vvậậtt phpháátt tritriểểnn trongtrong môimôi trưtrườờngng llỏỏng.ng. NguyênNguyên liliệệuu chchíínhnh vvàà phphổổ bibiếếnn llàà ddịịchch đưđườờngng glucose,glucose, fructose,fructose, maltose,maltose, saccharose saccharose ddịịchch ththủủyy phânphân cellulose,cellulose, tinhtinh bbộột t NguNguồồnn nitơnitơ hhữữuu cơcơ thưthườờngng ddùùngng llàà nưnướớcc chichiếếtt bbắắp,p, chichiếếtt malt,malt, ddịịchch ttựự phânphân nnấấmm men.men. CCầầnn chchọọnn pHpH phphùù hhợợpp vvớớii chchủủngng vivi sinhsinh vvậậtt vvàà ssựự ttổổngng hhợợpp enzymeenzyme theotheo mongmong mumuốốn.n. SauSau khikhi nuôi,nuôi, ttaa thuthu đưđượợcc canhcanh trưtrườờngng llỏỏngng ddạạngng thô.thô. 37
38. TTááchch enzymeenzyme Để làm tăng lượng enzyme ở vi sinh vật chúng ta cần chú ý tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, tổng hợp được enzyme cần thiết và với số lượng nhiều. Các chủng được phân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp một lượng nhỏ enzyme (enzyme bản thể), do đó cần tiến hành gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý, hóa học để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme. Vi sinh vật sau khi được tuyển chọn, cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởng tốt, tổng hợp nhiều enzyme. 38
39. TTááchch enzymeenzyme NgoNgoààii rara ccầầnn phphảảii chchọọnn môimôi trưtrườờngng vvìì ththàànhnh phphầầnn môimôi trưtrườờngng dinhdinh dưdưỡỡngng ccóó ảảnhnh hưhưởởngng trtrựựcc titiếếpp đđếếnn ssựự sinhsinh trưtrưởởngng vvàà ttổổngng hhợợpp enzymeenzyme ccủủaa vivi sinhsinh vvậật.t. TrongTrong ththàànhnh phphầầnn môimôi trưtrườờngng phphảảii ccóó đđủủ ccáácc chchấấtt đđảảmm bbảảoo đưđượợcc ssựự sinhsinh trưtrưởởngng bbììnhnh thưthườờngng ccủủaa vivi sinhsinh vvậậtt vvàà ttổổngng hhợợpp enzyme.enzyme. 39
40. TTááchch enzymeenzyme ĐĐặặcc bibiệệtt lưulưu ýý llàà đđểể tăngtăng ssựự ttổổngng hhợợpp enzymeenzyme ngưngườờii tata thưthườờngng ddựựaa vvààoo hihiệệnn tưtượợngng ccảảmm ứứng.ng. VVìì nnếếuu nhưnhư trongtrong ththàànhnh phphầầnn môimôi trưtrườờngng ccóó ccáácc chchấấtt ccảảmm ứứngng ththìì chchấấtt đđóó hayhay ssảảnn phphẩẩmm phânphân gigiảảii ccủủaa nnóó ssẽẽ kkììmm hãmhãm hohoặặcc llààmm yyếếuu ttáácc ddụụngng kkììmm totoảả ccủủaa chchấấtt kkììmm hãmhãm nhnhằằmm bbảảoo đđảảmm khkhảả năngnăng sinhsinh ttổổngng hhợợpp enzymeenzyme đđãã chocho khôngkhông bbịị ccảảnn trtrởở ChChấấtt ccảảmm ứứngng ttổổngng hhợợpp enzymeenzyme chocho thêmthêm vvààoo môimôi trưtrườờngng nuôinuôi thưthườờngng llàà cơcơ chchấấtt tươngtương ứứngng ccủủaa enzymeenzyme ccầầnn ttổổngng hhợợp.p. 40
41. TTááchch enzymeenzyme Ví dụ: Muốn tách - amylase ở nấm mốc (Asp. Oryzae), người ta cho vào môi trường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid có chứa liên kết - 1,6 glucozid. Muốn tách pectinase ở Asp. Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin. Đối với hemicellulase thì chất cảm ứng là hemicellulose; còn đối với proteinase chất cảm ứng có hiệu lực là protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ở Actinomyces fradiae). Chất cảm ứng cũng có thể là những chất giống cơ chất và những sản phẩm thủy phân của chúng. Ví dụ: thay cho protein thì peptid và thay cho tinh bột thì erithrodextrin đều có tác dụng cảm ứng. 41
42. TTááchch enzymeenzyme Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành enzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. Thông thường đối với - amylase, pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp (pH = 7 - 8) khác với pH tối ưu cho hoạt động của nó (pH = 4,7 - 4,9). Các enzyme đường hóa khác của nấm mốc như glucoamylase thì pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp và cho hoạt động là chung nhau (4,5 - 5,0). 42
43. TTááchch enzymeenzyme ĐĐộộ thôngthông khkhíí ccũũngng rrấấtt ccầầnn thithiếếtt chocho viviệệcc sinhsinh ttổổngng hhợợpp enzyme.enzyme. VVìì vvậậyy ởở môimôi trưtrườờngng bbềề mmặặtt ngưngườờii tata thưthườờngng thêmthêm chchấấtt xxốốpp nhưnhư trtrấấuu vvàào,o, còncòn ởở môimôi trưtrườờngng bbềề sâusâu (mô(môii trưtrườờngng ddịịchch ththểể)) ,, ththìì ngưngườờii tata thưthườờngng llắắcc (n(nếếuu enzymeenzyme ccầầnn llắắcc ththìì viviệệcc nnààyy ccựựcc kkỳỳ quanquan trtrọọng).ng). ĐĐộộ ẩẩmm ccũũngng rrấấtt quanquan trtrọọngng (ch(chỉỉ ccóó ttáácc ddụụngng ởở nuôinuôi ccấấyy bbềề mmặặt),t), phphụụ thuthuộộcc vvààoo ththàànhnh phphầầnn môimôi trưtrườờngng bbềề mmặặt.t. 43
44. TTááchch enzymeenzyme EnzymeEnzyme thưthườờngng chchứứaa ởở ccáácc ttếế bbààoo sinhsinh vvậậtt ggọọii llàà ccáácc enzymeenzyme trongtrong ttếế bbààoo (intracellular),(intracellular), nhưngnhưng nnóó ccũũngng ccóó ththểể đưđượợcc ccáácc sinhsinh vvậậtt titiếếtt rara môimôi trưtrườờngng ssốống.ng. ĐĐóó llàà ccáácc enzymeenzyme ngongoààii ttếế bbààoo (extracellular).(extracellular). EnzymeEnzyme vivi sinhsinh vvậậtt thưthườờngng chichiếếtt llàà enzymeenzyme ngongoạạii bbàào.o. 44