Giáo trình Công nghệ sinh học - Chương 3: Các phương pháp và ứng dụng của công nghệ sinh học động vật, người và y sinh - Nguyễn Thị Phương Thảo

92 trang huongle 4491

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Công nghệ sinh học - Chương 3: Các phương pháp và ứng dụng của công nghệ sinh học động vật, người và y sinh - Nguyễn Thị Phương Thảo", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_cong_nghe_giao_trinh_cong_nghe_sinh_hoc_chuong_3.pdf

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học - Chương 3: Các phương pháp và ứng dụng của công nghệ sinh học động vật, người và y sinh - Nguyễn Thị Phương Thảo

Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 1
Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
 M«, tÕ bµo t¸ch rêi khái c¬ thÓ nÕu ®•îc ®Æt trong m«i tr•êng ®¶m b¶o dinh d•ìng vµ nhiÖt ®é thÝch hîp th× tÕ bµo sÏ sèng vµ tiÕp tôc ph©n chia. Qu¸ tr×nh cã thÓ diÔn ra liªn tôc nÕu sau tõng thêi gian nhÊt ®Þnh tiÕn hµnh röa vµ bæ sung dung dÞch nu«i cÊy míi.  C¸c m«, tÕ bµo ®éng vËt hay sö dông trong nu«i cÊy : ph«i ng•êi, ph«i gµ, thËn khØ, ph«i lîn, mµng èi ng•êi
Đặc điểm của tế bào động vật •10-100 microns •Có hình cầu trong dung dịch •Không có thành tế bào •Màng plasma mỏng, dễ vỡ và dễ bị biến đổi •Bề mặt tích điện âm Sinh trưởng trên bề mặt tích điện dương ví dụ: Collagen
Chu kỳ tế bào G1 Phase Tế bào bước vào pha tổng hợp hoặc Thoát khỏi chu kỳ tế bào để tiến hành phân hoá (reversible or irreversible) Các tế bào rất nhạy cảm để tác động điều khiển ở thời điểm này S Phase: Tổng hợp AND G2 Phase: Tế bào chuẩn bị cho nguyên phân Mitosis
 Nuôi cấy cơ quan (Organ Culture): là quá trình nuôi cấy toàn bộ phôi, cơ quan hoặc mô được cắt ra khỏi cơ thể bằng giải phẫu mẫu sống (vivisection) hoặc ngay sau khi não dừng hoạt động . Đặc điểm: Kiến trúc và các chức năng sinh lý bình thường được duy trì. Các tế bào vẫn ở trạng thái phân hóa (fully differentiated). Tốc độ sinh trưởng chậm. Cần mẫu tươi cho mỗi lần thí nghiệm. Hạn chế khi nuôi cấy trên qui mô lớn.
 Nuôi cấy mô (Tissue Culture): Nuôi cấy những mẩu cắt ra từ các mô cắt rời Một số chức năng bình thường có thể vẫn được duy trì. Tổ chức ban đầu của mô bị phá huỷ. ◦ Có thể dung cho nuôi cấy với qui mô lớn.
 Nuôi cấy tế bào (Cell Culture): Mô hoặc một phần của mẫu được làm tan rã ra, chủ yếu là bằng xử lý enzyme, thành dịch huyền phù tế bào. Nguồn nguyên liệu này được sử dụng cho nuôi cấy đơn lớp hoặc nuôi cấy huyền phù. Phát triển dòng tế bào qua một số thế hệ Có thể nuôi cấy trên qui mô lớn Các tế bào có thể bị mất đi một số đặc tính phân hoá.
How do you isolate cells for culture?
 Nuôi cấy đơn lớp tế bào:  ưu điểm: dễ dàng thay đổi môi trường và rửa tế bào trước khi bổ sung môi trường mới Các tế bào liên kết nhau thể hiện dễ dàng hơn Linh hoạt (Flexible) và có thể sử dụng đối vơi tất cả các loại tế bào  Nhược điểm: Khó triển khai trên qui mô lớn Cần nhiều không gian hơn so với nuôi cấy huyền phù Khó định lượng các thông số cho mẫu để điều khiển sự sinh trưởng tế bào ◦ Việc đo Oxygen và pH gặp khó khăn
 Nuôi cấy các tế bào phát triển theo kiêu liên kết bám dính (Anchorage Dependent Cultures)  Sự nhân lên của các tế bào liên kết bám dính chỉ có thể xảy ra khi tạo được bề mặt nuôi cấy phù hợp. Quá trình liên kết của các tế bào liên quan một loạt các bước: Sự bám của các yếu tố dinh kết với bề mặt nuôi cấy (Cold insoluble globulin or other attachment glycoproteins) Sự liên kết giữa tế bào với bề mặt nuôi cấy Sự dính kết các tế bào với bề mặt được bao phủ . (các chất heparan sulfate đa dạng được tổng hợp bởi tế bào ) Sự phát triển lan rộng của các tế bào đã liên kết  Bề mặt nuôi cấy phải có tính hút nước và được tích điện tối ưu trước khi qúa trình dính kết xảy ra.
 Nuôi cấy huyền phù tế bào (Anchorage-independent (Suspension) ) Có khả năng sinh trưởng và phân hoá mà không cần quá trình gắn kết các tế bào với nhau. Có thể sử dụng các thiết bị nuôi cấy trên qui mô lớn Spinner Flasks, Stirred-Tank Bioreactors, Air lift Bioreactors
Líp máng tÕ bµo tr•íc khi xö lý b»ng Trypsin
Líp máng tÕ bµo mét phót sau khi xö lý b»ng Trypsin
TÕ bµo sau 3 ngµy nu«i cÊy
Líp máng tÕ bµo sau 7 ngµy nu«i cÊy
Một số khái niệm dòng tế bào Dòng tế bào (Cell Lines) – là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu Dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Lines) –là dòng tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ và có khả năng duy trì khả năng phân bào trong thời gian rất dài hoặc vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính.
Sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy
Giới thiệu một số dòng tế bào nuôi cấy và nguồn gốc của chúng CELL LINE* CELL TYPE AND ORIGIN 3T3 Fibroblast (mouse) 293 Kidney epithelium (human) BHK21 fibroblast (Syrian hamster) MDCK epithelial cell (dog) HeLa cancer epithelial cell (human) PtK1 epithelial cell (rat kangaroo) L6 myoblast (rat) PC12 chromaffin cell (rat) (neuroblastoma cell) SP2 plasma cell (mouse) COS kidney (monkey) CHO ovary (chinese hamster) DT40 (chick) lymphoma cell for efficient targeted recombination R1 embryonic stem cells (mouse) E14.1 embryonic stem cells (mouse) H1, H9 embryonic stem cells (human) S2 macrophage-like cells (Drosophila) BY2 undifferentiated meristematic cells (tobacco)
Our cell line CHO –K1
Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật
Môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường gồm: các muối vô cơ, dinh dưỡng, các chất đệm (phenol red). Các Ions (Na, K, Ca, Mg, Cl, P), vi lượng (iron, zinc, selenium), đường (glucose is the most common), amino acids, vitamins. Huyết thanh Kháng sinh
 Hầu hết tế bào sinh trưởng tốt ở pH 7.4 ◦ Một số fibroblasts cần pH 7.4-7.7 ◦ Các tế bào biến nạp pH 7.0-7.4 ◦ Các tế bào Epidermal đôi khi cần pH 5.5  Sử dụng chỉ thị Phenol Red indicator ◦ Có mầu tím ở pH 7.8 ◦ Mầu hồng ở pH 7.6 ◦ Mầu đỏ ở pH 7.4 ◦ Da cam ở pH 7.0 ◦ Vàng ở pH 6.5
 Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh  Sản xuất các hợp chất sinh học ◦ Vacxin virus ◦ Hoạt chất sinh học ◦ Interferon ◦ Kháng thể đơn dòng  Tạo các nguyên liệu cấy ghép  Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy  Sản xuất các virus diệt côn trùng ◦ Bacolovirus
Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
 Nh©n b¶n (cloning) v« tÝnh ®éng vËt: Sö dông nh©n cña tÕ bµo sinh d•ìng (tÕ bµo soma) vµ tÕ bµo trøng ®· lo¹i bá nh©n ®Ó t¹o ph«i v« tÝnh trong èng nghiÖm. Sau ®ã cÊy ph«i nµy vµo tö cung cña con c¸i ®Ó nu«i ph«i v« tÝnh thµnh c¬ thÓ hoµn chØnh. Nh©n b¶n v« tÝnh ®éng vËt thµnh c«ng ®· chøng minh ®•îc tÝnh toµn năng cña tÕ bµo ®éng vËt.
 Sự phân hoá tế bào  Ở động có vú, sau khi trứng được thụ tinh sẽ phân chia liên tục và biệt hóa theo một hướng xác định để đầu tiên tạo nên phôi và sau đó tạo nên tất cả các loại tế bào của động vật trưởng thành. Trong thời gian từ trứng thụ tinh - hợp tử - trở thành một cơ thể trưởng thành, có 2 quá trình diễn ra song hành: ◦ Sinh trưởng: ◦ Phát triển:
 Sinh trưởng: là quá trình tăng không thuận nghịch số lượng và kích thước tế bào: từ 1 tế bào ban đầu chúng sẽ phân chia nguyên nhiễm liên tiếp: 1 tế bào 2 tế bào 4 tế bào 8 tế bào 16 tế bào .vv 200 tỷ tế bào. Cơ thể con người có tới 200 tỷ tế bào nhưng gần như tất cả đều có số lượng và chất lượng gen giống nhau.
 Phát triển: là quá trình biến đổi về chất trong tế bào dẫn tới sự thay đổi về hình thái, chức năng của tế bào. Qúa trình này thực chất là sự biến đổi các tế bào phôi sinh ban đầu giống nhau thành các tế bào chuyên hóa của các mô cơ quan khác nhau. Thí dụ như tế bào thận, tế bào gan, tế bào máu  Qúa trình này còn được gọi là biệt hóa hay phân hóa.
là sự trở về trạng thái phôi sinh của các tế bào đã biệt hoá rồi từ đấy lại phân hóa tiếp tục theo định hướng khác. ở thực vật, khi nuôi cấy mô tế bào trong môi trường nhân tạo, từ các tế bào đã phân hóa như ở mô lá, mô thân lại có thể phản phân hóa trở về dạng tế bào ban đầu rồi từ đấy lại phân hóa tiếp tục theo định hướng khác. Thí dụ, từ mô lá có thể tái sinh thành rễ, chồi. Khác với thực vật, các tế bào đã biệt hóa của động vật rất khó phản phân hóa để trở về dạng tế bào phôi sinh ban đầu và phân hóa tiếp theo định hướng khác. Chính vì thế công trình nhân bản thành công một con cừu từ nhân của tế bào tuyến vú (tế bào thân thể đã biệt hóa) đã chức minh được tế bào động vật còn có khả năng phản phân hoá.
 Nảy chồi:Thủy tức  Phân mảnh:hải quì, giun đốt  Tái sinh: Sao biển,  Trinh sản: ong, thằn lằn kỳ giông  Mẫu sinh: cá  Phụ sinh: cá  Trinh sản giả: (trứng chỉ chứa vật chất di truyền từ mẹ)
 In 1885, August Weismann, University of Freiberg: giả thuyết: thông tin di truyền của một tế bào bị giảm bớt khi chúng biệt hóa (germ plasm theory)  1888. Wilhelm Roux kiểm chứng bằng thí nghiệm: phá hủy 1 tế bào trong phôi hai tế bào của ếch, kết quả tế bào còn lại hình thành ½ phôi  1894. Hans Dreisch tách tế bào phôi của phôi 2-4 tế bào của nhím biển và quan sát được sự hình thành các ấu trùng nhỏ: kết quả này bác bỏ học thuyết của Weismann-Roux theory.
Hans Spemann (Uni. of Freiburg)  1901: tách phôi 2 tế bào của sa giông thành 2 phần và chúng phát triển thành 2 ấu trùng hoàn chỉnh  1902: tách phôi ở giai đoạn 2 tế bào, mỗi tế bào phát triển thành cá thể trưởng thành  1914: chứng minh tế bào của phôi 16 tế bào có thể phát triển trực tiếp thành ấu trùng
 1938 : xuất bản : "Embryonic Development and Induction “ nói về thí nghiệm tiền chuyển nhân thực hiện năm 1928 trên đối tượng salamander  Mô tả các bước thực hiện: "fantastical experiment," : tách nhân của tế bào đã biệt hóa và chuyển vào trứng sau thụ tinh và được loại bỏ nhân:  Đề xuất ý tưởng: nhân dòng từ nhân tế bào trưởng thành  Tuy nhiên do vấn đề kỹ thuật mà ông đã không thành công
Thí nghiệm nhân bản động vật đầu tiên  1952, Robert Briggs and Thomas J. King (Philadelphia cancer research center) tạo dòng 1 con ếch bằng cách cấy nhân tế bào giai đoạn muộn của phôi vào chứng chưa thụ tinh đã loại nhân. Trứng phân chia nhưng không phát triển  1962: John Gurdan (Uni. Oxford) tạo dòng thành công ếch trưởng thành và thành thục sinh dục từ tế bào ruột của một con ếch trưởng thành khác đã biệt hóa.  1963: thuật ngữ :” clone” ra đời ◦ Nhà văn David Rorvik: xuất bản: The Cloning of a Man
 In 1984, Steen Willadsen (Đan mạch) tạo dòng cừu thành công bằng việc sử dụng các tế bào phôi đã phân hóa ở giai đoạn 8 tế bào vào trứng chưa thụ tinh đã loại nhân. 3 trong số 4 phôi được chuyển vào vòi trứng của cừu cái và phát triển thành những chú cừu con giống nhau về di truyền. ◦ Chứng minh khả năng tạo dòng động vật có vú bằng phương pháp chuyển nhân, tuy nhiên ông vẫn sử dụng tế bào phôi, không phải tế bào trưởng thành
 1986: Willadsen: thành công tạo dòng 1 con bò bằng cách sử dụng tế bào phôi đã phân hóa 1 tuần.  Các thí nghiệm của ông đã chứng minh thông tin di truyền không bị giảm bớt khi tế bào biệt hóa  Willadsen không công bố chính thức các kết quả nghiên cứu này nhưng đã ảnh hưởng đến Ian Wilmut's trong nỗ lực nhân bản từ các tế bào trưởng thành.
 July 1995, Ian Wilmut and Keith Campbell of the Roslin Institute in Scotland nhân bản thành công 2 con cừu từ phôi phất triển được 9 ngày  July 5, 1996, nhân bản thành công cừu Dolly từ tế bào sinh dưỡng  25/4/1998: Science News công bố Dolly giao phối với David, sinh ra 1 cừu cái có tên Bonnie (13/4/1998), sau đó tiếp tục sinh ra 3 chú cừu con khỏe mạnh (24/3/1999)  14/2/2003: sau 6 năm Dolly bị viên phổi nặng và được tiêm thuốc gây chết  In July 1997, nhân bản Polly từ tế bào da nuôi cấy in vitro và chứa gen ngườii
- 8/1993: Jerry Hall và Robert Stillman (Uni. George Washington): nhân được 48 phôi từ 17 phôi người ở giai đoạn 2-8 tế bào - 2001: nuôi cấy thành công tạo phôi người ở giai đoạn 6 tế bào bởi Advanced cell Technology - 2004: nhân bản chuột từ tế bào khứu giác
 Nhân bản sinh sản  Tạo những cá thể động vật hoàn chỉnh  Nhân bản trị liệu  Dùng để nghiên cứu hoặc trị liệu
 Tách phôi /cắt phôi  Chuyển nhân 2n  Chuyển tế bào sinh dưỡng (chuyển cả tế bào)  Dung hợp (giống chuyển nhân)  Trinh sản
Do nhãm nghiªn cøu J. Wilmut, A.E Schnicke, J.Mc Whir, A.J Kind vµ K.H.S Campbell c«ng bè trªn t¹p chÝ Nature (27/2/1997).
 Lấy nhân của tế bào thượng bì tuyến vú của con cừu Dorset cho dung hợp vào tế bào trứng đã loại bỏ nhân (1n) của một cừu khác (cừu Black face –mặt đen) hình thành nên tế bào trứng chứa nhân tế bào soma (2n).  Nuôi cấy tế bào trứng này cho phát triển thành phôi.  Sau đó cấy vào tử cung của một cừu khác (mặt đen) để “chửa” hộ.  Sau 5 tháng cừu cái này đã sinh ra cừu con và được đặt tên là Dolly có các đặc điểm giống hệt như cừu cho nhân (Dorset – mặt trắng)
Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 48
 Bước 1: Chuẩn bị trứng nhận nhân  Bước 2: Chuẩn bị tế bào cho nhân  Bước 3: Chuyển nhân  Bước 4: Hoạt hóa phôi  Bước 5: Nuôi và cấy phôi
TÕ bµo sinh d•ìng TÕ bµo trøng ch•a (Somatic cell-2n) thô tinh (Oocyte) (Metaphase II) LÊy nh©n (nucleus) cña tÕ TÕ bµo trøng ch•a thô tinh ®· lo¹i bá bµo sinh d•ìng nh©n (Enucleated Oocyte) §•a nh©n cña tÕ bµo sinh d•ìng vµo tÕ bµo trøng ®· lo¹i bá nh©n Nh©n cña tÕ bµo sinh d•ìng vµ tÕ bµo trøng ®· lo¹i bá nh©n ®•îc dung hîp víi nhau (Fusion) Ph«i míi h×nh thµnh ®•îc nu«i cÊy in vitro trong 1 – 2 ngµy råi ®•a vµo nu«i trong èng dÉn trøng cña c¬ thÓ c¸i Ph«i d©u (Morulae) hoÆc tói -B¶o qu¶n ®«ng ph«i (Blastocyste) l¹nh ®Ó cloning l¹i khi cÇn TruyÒn cÊy vµo tö cung cña con vËt c¸i chöa hé §Î con S¬ ®å t¹o dòng tõ tÕ bµo sinh d•ìng
July 1998 Cloned cloned calves Cloned mouse mule
December 2001 Five cloned female December 2001 piglets, named Noel, The world's first Angel, Star, Joy and cloned kitten, Mary named Cece
Lîn Millie, Christa, Alexis, Carel vµ Dotcom ®•îc sinh vµo ngµy H•¬u Dewey ®•îc nh©n b¶n 05/05/2000 qua nh©n b¶n sö vµo th¸ng 05/2003 t¹i Mü dông c¸c tÕ bµo tr•ëng thµnh. ¶nh. MÌo Tabouli vµ Baba Ganoush ®•îc Chó ngùa nh©n b¶n nh©n b¶n b»ng c¸ch chuyÓn nhiÔm s¾c MÌo "Carbon Copy" (03/2002) Prometea thÓ (05/2004)
“CC” Carbon Copy  2001 – Cat cloned 2002 – Rabbits cloned 2003 – Mule cloned 2004 – Bull serial-cloned
 Nhân dòng các nguồn gen quí hiếm  Mô hình nghiên cứu về gen của người  Mô hình nghiên cứu quá trình biệt hóa của tế bào  Bioreactor: sản xuất sản phẩm trị liệu  Dị ghép:  Liệu pháp tế bào  Hỗ trợ sinh sản  (?Tìm ví dụ minh họa cho các ứng dụng trên)
Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
C«ng nghÖ tÕ bµo gèc
Kh¸i niÖm vÒ tÕ bµo gèc (Stem cells) Lµ c¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng ph©n chia liªn tôc trong nu«i cÊy vµ ph¸t triÓn thµnh c¸c tÕ bµo chuyªn ho¸.
®Æc tr•ng c¬ b¶n cña tÕ bµo gèc cã kh¶ n¨ng tù t¸i t¹o míi cã thÓ biÖt ho¸ thµnh nh÷ng tÕ bµo vµ tæ chøc chuyªn biÖt ®¶m nhiÖm nh÷ng chøc n¨ng ®Æc biÖt. cã thÓ ph©n lËp vµ duy tr× ®•îc ë tr¹ng th¸i ch•a bÞªt ho¸. cã thÓ t¨ng sinh vµ biÖt ho¸ khi ®•îc chuyÓn vµo ®éng vËt cã hÖ thèng miÔn dÞch ®· bÞ tæn th•¬ng.
Lo¹i tÕ bµo gèc Kh¶ n¨ng Nguån gèc TÕ bµo toµn n¨ng Mçi tÕ bµo cã thÓ ph¸t C¸c tÕ bµo lÊy tõ tÕ bµo hîp tö vµ triÓn thµnh mét c¬ thÓ c¸c tÕ bµo ph«i ë giai ®o¹n 4 – 8 Totipotent míi tÕ bµo (1-3 ngµy) Cã thÓ h×nh thµnh nªn Mét sè tÕ bµo lÊy tõ blastocyst TÕ bµo ®a tiÒm n¨ng h¬n 200 lo¹i tÕ bµo (tÕ bµo nót ph«i vµ d•ìng ph«i) chuyªn ho¸ t×m thÊy Pluripotent (5 ®Õn 6 ngµy) trong c¬ thÓ Tª bµo vµi tiÒm n¨ng Lµ c¸c tÕ bµo ®· ph©n (tÕ bµo mÇm) ho¸ nh•ng cã thÓ h×nh LÊy tõ m« thai, m« m¸u vµ c¸c thµnh mét sè m« m« tr•ëng thµnh kh¸c Multipotent chuyªn ho¸ kh¸c
Day 2 2-cell embryo Day 3-4 Day 1 Multi-cell embryo Fertilized egg Day 5-6 Day 11-14 Blastocyst Tissue Differentiation
 TÕ bµo gèc ph«i (Embryogenic Stem Cells)  TÕ bµo gèc tr•ëng thµnh (Mature Stem Cells)
tÕ bµo gèc tr•ëng thµnh tÕ bµo gèc cña bµo thai cã mÆt trong nhiÒu tæ chøc chØ cã ë mét sè vÞ trÝ, trong mét cña c¬ thÓ mÆc dï víi mét sè l•îng rÊt Ýt. mature body sè tæ chøc nhÊt ®Þnh cña bµo tissues, umbilical cord, Embryonic; Blastocystic placenta cã kh¶ n¨ng biÖt ho¸ thÊp cã thÓ t¹o nªn nh÷ng côm tÕ h¬n vµ chØ s¶n xuÊt ra nh÷ng bµo cã thÓ biÖt ho¸ tù nhiªn tÕ bµo ®Æc hiÖu cho lo¹i tæ t¹o ra nhiÒu lo¹i tÕ bµo (®a chøc céi nguån cña chóng. n¨ng). §•îc ph©n lÇn ®Çu n¨m 1960s Ph©n lËp lÇn ®Çu n¨m 1998 §· ¸p dông trÞ liÖu thµnh c«ng ChØ ¸p dông thö ngiÖm trªn ®éng trªn 50 bÖnh nh©n vËt, ch•a thö trªn ng•êi
TÕ bµo gèc Ph«i Cã hai lo¹i:  TÕ bµo gèc bµo thai (ES embryonic stem cell) lÊy tõ tÕ bµo blastocysts  TÕ bµo mÇm bµo thai(EG embryonic germ cell) lÊy tõ bµo thai 9 tuÇn  ES ph©n chia 300-450 lÇn/2n¨m EG 40-80 lÇn /2n¨m Who did it first?  In 1998, U. Wisconsin research team isolates stem cells from IVF-blastocysts
Nguån cung cÊp c¸c tÕ bµo gèc ph«i + c¸c ph«i n¹o + ph«i thô tinh in vitro
 Dễ nuôi cấy  Có thể tạo thành tất cả các loại tế bào trong cơ thể  Nếu lấy từ SCNT không có phản ứng đào thải của hệ miễn dịch  Có thể duy trì thời gian dài trong nuôi cấy  If IVF, available ◦ More than 400,000 unwanted pre-embryos in U.S.
 Nếu lấy từ IVF, có thể bị đào thải  Khó điều khiển quá trình phân hoá  Yêu cầu nhiều bước trung gian để định hướng sinh ra loại tế bào mong muốn
 Mục đích: ◦ Chữa và điều trị bệnh ◦ Khai thác khả năng tự sửa chữa của gen  Ứng dụng: ◦ Bệnh nhân có thể dùng tế bào gốc của bản thân để trị bệnh. ◦ Không cần tìm người hiến tương thích  Giống trường hợp cấy ghép nhưng không bị đào thải
 Không có quá trình thụ tinh  SCNT stem cells được nuôi sống trong đĩa peptri giống như các loại tế bào khác  SCNT stem cells không có khả năng phát triển thành con người
Ví dụ bệnh tiểu đường
TÕ bµo gèc c¸ thÓ tr•ëng thµnh  Cã nhiÒu trong tæ chøc cña ®éng vËt vµ ng•êi: n·o, tuû x•¬ng, m¸u, tuû r¨ng, tuû sèng, vâng m¹c, gan.
Từ các mô trưởng thành
Nguồn cung cấp tế bào gốc trưởng thành Từ mô dây rốn & nhau thai
Khả Năng Phân Hoá của MSC
Ví dụ bệnh bạch cầu
. Cã thÓ nu«i cÊy ngoµi c¬ thÓ lµm nguån tÕ bµo cung cÊp cho cÊy ghÐp. . Sự đào thải cơ quan hoặc mô được hạn chế nếu bệnh nhân được tiếp nhận chính tế bào của mình . Một số loại rất dễ phân lập ( tế bào gốc máu) . Phân hoá một phần . Dễ điều khiển để kích thích sự sinh trưởng của các loại tế bào chuyên hoá
Thời gian duy trì trong nuôi cấy ngắn Khó phân lập và tách chiết Chỉ phân hoá thành một số loại tế bào chuyên hoá Không phổ biến, hầu như rất hiếm ở người cao tuổi Sự phát triển và tăng trưởng cần được định hướng khi cấy vào cơ thể nhận. Khả năng bị đào thải như một mô lạ là khá cao Sự nhiễm bởi viruses, bacteria, fungi, and Mycoplasma. ◦ Only 25% of cloned oocytes became embryos ◦ Only 5% (1 out of 20) survived to become a cell line ◦ Genetic donor was same as egg donor (i.e.,
Cßn ®ang ®îc nghiªn cøu: “v× sao cã tÕ bµo gèc kh«ng biÖt ho¸ trong khi c¸c tÕ bµo l©n cËn ®· biÖt ho¸”? Cã bao nhiªu lo¹i? Cã ë tæ chøc nµo? Cã kh¶ n¨ng biÖt ho¸ ®a n¨ng kh«ng? Ichưa biết các tế bào gốc nuôi cấy in vitro (ngoài phôi) có thể hiện đầy đủ các chức năng như tế bào tự nhiên hay không sinh được nuôi ngoài phôi Các tế bào gốc cần được cho phân hoá thành tế bào thích hợp trước khi dùng để trị bệnh. Gần đây đã phát hiện một số bất thường về số lượng và cấu trúc của nhiêm sắc thể trong ba dòng ESC của người.
1968, cấy ghép thành công tế bào tuỷ cho bệnh nhân bj suy giảm hệ thống miễn dịch (SCID-Severe combined immunodeficiency) Từ 1970’s, cấy ghép tuỷ được ứng dụng để chữa bệnh immunodeficiencies và leukemias (bạch cầu)
 1954 – John Enders nhận giải thưởng Nobel về y tế về công trình nuôi cấy virus bại liệt trong tế bào thận của người  In 1998, James Thomson (University of Wisconsin- Madison) phân lập đám tế bào lớp trong của phôi non và phát triển dòng tế bào gốc phôi người đầu tiên.  1998, John Gearhart (Johns Hopkins University) phát triển tế bào mầm thai từ các tế bào trong các mô sinh dục của thai (Tế bào mầm nguyên thuỷ-primordial germ cells).  Các dòng tế bào đa tiềm năng(Pluripotent stem cell “lines”) được phát triển từ hai nguồn trên
 2001 – phôi người lần đầu tiên được nhân dòng (chỉ nhân đến giai đoạn 6 tế bào) bởi Advanced Cell Technology (USA)  2004* – First human cloned blastocyst created and a cell line established (Korea) *Hwang, W.S., et al. 2004. Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst. Science 303: 1669-1674.
 Trong nghiªn cøu c¬ b¶n: ◦ Tim hiÓu c¸c t¸c nh©n tham gia vµo qu¸ trình x¸c ®Þnh h•íng biÖt ho¸ tÕ bµo ◦ N¾m ®•îc c¬ chÕ ®iÒu khiÓn c¸c gen biÖt ho¸ TB ◦ ®iÒu khiÓn mét TB ®· qua thao t¸c gen ph¸t triÓn thµnh c¬ thÓ  §èi t•îng ®Ó thö nghiÖm vÒ an toµn d•îc phÈm
. TÕ bµo trÞ liÖu ◦ Sö dông tÕ bµo gèc t¹o m¸u: ◦ Sö dông tÕ bµo gèc ph«i thai:  §iÒu trÞ ®¸i th¸o ®•êng  T¸i t¹o hÖ thèng thÇn kinh b»ng tÕ bµo gèc  §iÒu trÞ bÖnh lý tim m¹ch  §iÒu trÞ thùc nghiÖm b»ng gen.
Sö dông tÕ bµo gèc t¹o m¸u: ®iÒu trÞ bÖnh cña c¬ quan t¹o m¸u vµ c¸c c¬ quan kh¸c ◦ Ung th• m¸u: chiÕu x¹ hoÆc ho¸ chÊt ph¸ háng tÕ bµo t¹o m¸u råi thay thÕ tÕ bµo gèc t¹o m¸u. ◦ TÕ bµo gèc t¹o m¸u cã t¸c dông ®iÒu trÞ nhiÒu bÖnh ung th• kh¸c: ung th• phæi, tuyÕn tiÒn liÖt, ung th vó cã kh¶ n¨ng chèng khèi u, tÕ bµo bÖnh lý.
Sö dông tÕ bµo gèc bµo thai: ®iÒu trÞ c¸c bÖnh cña c¸c tæ chøc kh¸c nhau: tÕ bµo gèc (tÕ bµo mÇm bµo thai) tÕ bµo chuyªn biÖt: bÖnh parkinson, ®¸i ®•êng, bÖnh tim m¹ch, bÖnh s•ng khíp. ◦ BÖnh ®¸i th¸o ®•êng: tÕ bµo gèc cã thÓ sinh ra tÕ bµo beta s¶n xuÊt insulin. ◦ Parkinson: tÕ bµo gèc biÖt ho¸ thµnh tÕ bµo s¶n xuÊt dopamin, c¸c tÕ bµo nµy cã thÓ thiÕt lËp l¹i hÖ thÇn kinh trung •¬ng. ◦ Tim m¹ch: Thay thÕ tÕ bµo c¬ tim tæn th•¬ng: tÕ bµo gèc sÏ ph¸t triÓn thµnh tÕ bµo néi m¹c m¹ch m¸u vµ tÕ bµo c¬ tr¬n t¹o thµnh m¹ch m¸u. §©y lµ hai lo¹i tÕ bµo quan träng cÊu tróc lªn c¬ tim.
TriÓn väng øng dông cña c«ng nghÖ tÕ bµo gèc
Thần kinh-Neural Võng mạc-Retinal Xương-Bone Sụn-Cartilage Biểu mô -Epithelial
Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật (buổi sau) 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng