Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại

1. CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (9 TIẾT) . Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn . Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen . Các phương pháp lai phân tử . Phương pháp PCR, ứng dụng . Kỹ thuật xác định trình tự DNA . Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 1
2. Kiến thức ôn tập • Cấu trúc phân tử DNA 8/26/2014 2
3. Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ Purines Pyrimidines 8/26/2014 3
4. Structureii). Structure of the of DNA the polynucleotide DNA double chainhelix 5’ 3’ • polynucleotide chain •8/26/2014 3’,5’ -phosphodiester bond 4
5. Nucleoside [structure of deoxyadenosine] Nucleotide 8/26/2014 5
6. 8/26/2014 6
7. Học thuyết trung tâm:The Central Dogma DNA RNA Protein Function Replication Translation Work Transcription 8/26/2014 7
8. Phân loại Gene intergenic region non-coding coding genes genes Chromosome (simplified) Messenger RNA Structural RNA Proteins transfer ribosomal other RNA RNA RNA Structural proteins Enzymes 8/26/2014 8
9. 2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE) . Khái niệm: là các enzyme có khả năng nhận dạng và cắt DNA ở những vị trí đặc hiệu. – Restriction enzymes = Restriction endonuclease Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic acid) – Trình tự nhận biết của RE được gọi là trình tự giới hạn .Ví dụ: trình tự nhận biết của EcoRI 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 9
10. Lịch sử phát hiện • 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của một số bacteriophages. • 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản thân để tránh bị phá huỷ • 1970: Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của tế bào chủ để tự bảo vệ. 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 10
11. Restriction Endonucleases Why don’t bacteria destroy their own DNA with their restriction enzymes? 8/26/2014 11
12. Methylation 8/26/2014 12
13. Phân loại các RE • Loại I: Cắt tại điểm cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotide • Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn. • Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó khoảng 20 nucleotide. 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 13
14. Cách gọi tên Ví dụ: EcoRI Genus (Tên chi) Escherichia Species (Tên loài) coli Strain (Chủng) R Thứ tự tìm ra enzyme I (số La Mã) 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 14
15. Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II Trình tự nhận biết là các Don't nod palindrome. Đây là đoạn DNA Dogma: I am God mạch kép, 2 mạch bổ sung có Never odd or even Too bad – I hid a boot trình tự giống nhau khi đọc theo Rats live on no evil star cùng chiều 5’ 3’ hoặc ngược lại No trace; not one carton Was it Eliot's toilet I saw? Murder for a jar of red rum Some men interpret nine memos Campus Motto: Bottoms up, Mac Go deliver a dare, vile dog! Madam, in Eden I'm Adam xứng Oozy rat in a sanitary zoo đối Ah, Satan sees Natasha Trục Trục Lisa Bonet ate no basil Do geese see God? God saw I was dog Dennis sinned 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 15
16. Tần suất cắt Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ là 1/4n (n là chiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết). Số nucleotide của đoạn Xác suất xảy ra sự kiện nhận biết phân cắt bởi RE 4 1/ 44= 1/256 5 1/ 45= 1/ 1024 6 1/ 46= 1/ 4096 8 1/ 48= 1/ 65.536 n 1/ 4n 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 16
17. Các kiểu cắt Tạo 5’ overhangs đầ u u sole 3’ overhangs Tạo đầu blunt ends bằng 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 17
18. Ví dụ một số RE loại II 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 18
19. Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen • Tạo DNA tái tổ hợp • Lập bản đồ giới hạn 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 19
20. Tạo DNA tái tổ hợp • DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau thông qua vi thao tác của con người • Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym ligase. Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo nên DNA tái tổ hợp 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 20
21. Bản đồ giới hạn • Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzyme giới hạn. • Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau. • Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự khác nhau giữa các cá thể trong loài. 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 21
22. Phương pháp lập bản đồ giới hạn • Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR tạo ra một lượng DNA cần thiết. • Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp. • Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ. 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 22
23. VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn ADN nghiên cứu (kích thước 17kb). Kết quả cho 3 đoạn ADN (6kb, 3kb, 8kb). Điều này chứng tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn 3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi. Khi cắt sợi ADN nghiên cứu bằng enzym 2, kết quả cho 2 đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ enzym này chỉ có một điểm cắt trên sợi 17kb. Khi cắt bằng tổ hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 8kb, hai đoạn này là sản phẩm của sự hoạt động của enzym 1. Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb, 1 kb). Từ đây suy ra đoạn 3kb phải nằm ở giữa sợi. 8/26/2014 23
24. Restriction enzyme animation 8/26/2014 24
25. Bµi tËp Nhân dòng một đoạn ADN có chiều dài 900 bp sau đó phân cắt với 3 enzyme, chạy điện di cho các kết quả sau đây: Enzyme Độ lớn các đoạn phân cắt (bp) EcoRI 200, 700 Hind III 300,600 BamHI 50,350,500 EcoRI + Hind III 100,200,600 EcoRI + BamHI 50,150,200,500 HindIII + BamHI 50,100,250,500 Hãy vẽ bản đồ giới hạn từ những số liệu trên? 8/26/2014 25