Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Khái niệm thư viện DNA

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Khái niệm thư viện DNA

1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) BM CNSH TV – Khoa CNSH 1
2. CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) . Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn . Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen . Các phương pháp lai phân tử . Phương pháp PCR, ứng dụng . Kỹ thuật xác định trình tự DNA . Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 2
3. Khái niệm thư viện DNA •Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sử dụng để thu thập và lưu trữ thông tin •Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là các phân tử DNA Thư viện DNA là tập hợp ngẫu nhiên các đoạn DNA (có tính đại diện đặc thù cho hệ gen của một sinh vật) được chèn vào các vector nhân dòng
4. Có hai loại thư viện mẫu chính đó là: 1. Thư viện genome (Genomic library): chứa toàn bộ các đoạn DNA có trong nhân của một tổ chức hay cơ thể. Genomic library có thể được nhân dòng bằng plasmid hoặc genome của thực khuẩn thể. 2. Thư viện cDNA (cDNA library): chứa các đoạn cDNA có tính đại diện đặc thù cho toàn bộ mARN của một mô. Thư viện cDNA được tạo ra bằng cách tổng hợp nên cDNA từ mRNA.
5. Các bước trong tạo thư viện mẫu đã nhân dòng 1. Tạo các đoạn DNA ngẫu nhiên từ hệ gen hay cDNA 2. Chèn các đoạn DNA vào vector nhân dòng thích hợp. 3. Nhân các đoạn DNA tạo ra trong hệ thống tế bào chủ (chứa vector nhân dòng tương ứng) 4. Chọn lọc các dòng có chứa vector mang đoạn DNA mục tiêu.
6. Thiết kế thư viện mẫu cho đọc trình tự.
7. • Mỗi một đoạn DNA cài trong một vector biến nạp trong 1 tế bào vi khuẩn Sách (Book) • Tập hợp tất các các dòng vi khuẩn Thư viện
8. Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng Kích thước của đoạn DNA tùy thuộc vào mục đích sử dụng thư viện • Để lập bản đồ, xác định các gen hay tách dòng gen từ hệ gen có kích thước lớn cần các đoạn DNA lớn và sử dụng các vectơ như phage, cosmid, BAC hay YAC • Để xác định trình tự, lập bản đồ chi tiết cần các đoạn DNA có kích thước nhỏ, sử dụng vectơ nhân dòng là plasmid • Các đoạn DNA phải có tính ngẫu nhiên để đảm bảo tính đại diện cho hệ gen.
9. Tạo đoạn DNA có kích thước phù hợp cho nhân dòng • Làm gãy nhiễm sắc thể • Cắt bằng RE • Ở genom người dựng RE có vùng nhận biết gồm 8 Nu (NotI, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt có chiều dài lớn • Thông thường dùng RE có vùng nhận biết gồm 4 Nu (AluI, HaeIII) • Cắt không hoàn toàn (partial digest) bằng cách sử dụng phối hợp nhiều RE
10. Bảng. Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số vector nhân dòng Khả năng chứa đoạn Stt Vector DNA(kb) Plasmit <10kb 1. Bacteriophage 9-20kb 2. Cosmit 33-47kb 3. BAC 100-300kb 4. YAC 100-1000kb 5.
11. Trong một thư viện sẽ chứa bao nhiêu dòng ? • Theo lý thuyết: Số dòng tối thiểu cần thiết để tạo thư viện(n) = độ lớn của hệ gen (b) độ lớn TB của đoạn ADN (a)
12. Ví dụ: thiết kế thư viện hệ gen của người, dùng các vector khác nhau: Kích thước genome : 3 x 109 bp • Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases) > Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human) • Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb > Average insert of 17,000 bases = 1.8 x 105 clones required to cover one human genome • Cosmid = Take inserts of 35-50 kb > Average insert of 50,000 bases = 60,000 clones required to cover one human genome • BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb > Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome • YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater > Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genome
13. Trên thực tế, số dòng sẽ lớn hơn bởi quá trình cắt và ghép vào vector là ngẫu nhiên. • Một số dòng sẽ có mặt hơn một lần trong thư viện do hiện tượng lặp đoạn • Một số trình tự nào đó sẽ bị mất nếu chỉ sử dụng số dòng tối thiểu. • Clarke and Carbon (1976) đề nghị công thức tính mới nhằm tính xác suất để một đoạn DNA được nhân dòng trong một thư viện mẫu. N = ln(1-P) ln(1-a/b) • Trong đó: P: xác xuất nhân dòng một đoạn DNA bất kỳ; a: kích thước đoạn DNA cần nhân (bp), b : độ lớn hệ gen (bp)
14. Câu hỏi • Cần bao nhiêu dòng để 99 % một đoạn trình tự có mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector?
15. Học thuyết trung tâm exon DNA Double-stranded intron Precursor RNA AAAAAAAAAAn mRNA AAAAAAAAAAn Single-stranded Reverse transcription Protein AAAAAAAAAAn double-stranded cDNA
16. cDNA Một cDNA (complementary DNA) là một bản DNA copy của một RNA, thường là mRNA. cDNA mRNA Mạch kép Mạch đơn Ổn định Không ổn định Dễ dàng thao tác Khó thao tác hơn Cần được phiên mã Có thể được sử dụng trực thành RNA để tổng tiếp để tổng hợp protein hợp protein
17. KỸ THUẬT TẠO THƯ VIỆN cDNA
18. Khái niệm Tại sao phải lập ngân hàng cDNA • Gene chỉ chiếm một phần nhỏ trong genome • Ở các mô khác nhau và giai đoạn sinh trưởng khác nhau chỉ có một số gene nhất định hoạt động • DNA ở sinh vật nhân Quá trình phiên mã và dịch mã ở sinh vật chuẩn có chứa intron nhân chuẩn (Eukaryote)
19. • cDNA (complementary DNA, copy DNA) là phân tử DNA được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ sợi RNA (chủ yếu là mRNA) khuôn, nhờ enzyme sao chép ngược reverse transcriptase.
20.  Thư viện cDNA  Tập hợp tất cả các mRNA thu được từ một loại tế bào, ở các giai đoạn phát triển khác nhau tạo nên tập hợp cDNA được tách dòng gọi là ngân hàng cDNA của tế bào  Tổng hợp các ngân hàng cDNA của từng loại tế bào và mô của một sơ quan ngân hàng cDNA của cơ quan đó  Vì không phải tất cả các gene của một cơ thể đều hoạt động trong một tế bào tại thời điểm chiết xuất mRNA, do vậy, thư viện cDNA luôn luôn nhỏ hơn thư viện genome. Nếu biết loại tế bào nào sinh ra protein nghiên cứu thì việc tách gene đó thông qua khảo sát thư việc cDNA sẽ dễ dàng hơn nhiều so với việc khảo sát thư viện genome.
21. NHÂN TẾ BÀO Nguyên lý tạo cDNA Đoạn DNA của gene TB nhân chuẩn Như theo định nghĩa, là Phiên mã phân tử DNA được tổng mRNA hợp theo nguyên tắc bổ sơ cấp Loại bỏ sung từ sợi RNA (chủ yếu intron là mRNA) khuôn, nhờ mRNA enzyme sao chép ngược reverse transcriptase. Tách mRNA từ tế bào và bổ sung Như vậy, muốn tổng hợp ỐNG NGHIỆM reverse được cDNA cần phải tách transcriptase; tổng hợp mạch DNA được mRNA khỏi RNA tổng số và cần có sự Mạch cDNA Phân hủy mRNA tham gia của enzyme sao Tổng hợp mạch chép ngược reverse DNA thứ 2 cDNA của gene transcriptase. (không có intron)
22. Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA • Bước 1: Chuẩn bị mRNA • Bước 2: Tổng hợp cDNA • Bước 3: Tạo thư viện cDNA
23. Các bước cơ bản ngân hàng cDNA (tiếp ) • Bước 1: Chuẩn bị mRNA: – Tách chiết RNA tổng số – Tách mRNA ra khỏi hỗn hợp RNA tổng số dựa vào đặc điểm của mRNA trưởng thành ở sinh vật nhân chuẩn là có đuôi polyA ở đầu 3’.Có nhiều phương pháp để tách mRNA ra khỏi RNA tổng số. VD: sử dụng sắc mang cellulose-oligo(dT), sử dụng hạt Mg- oligo(dT) (hình)
24. Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA tổng số Các bước thu mRNA từ hỗn hợp RNA sử dụng sắc ký cột mang cellulose-oligo(dT) tổng số sử dụng hạt Mg-oligo(dT)
25. Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA (tiếp ) • Bước 2: Tổng hợp cDNA với sự tham gia của enzyme sao chép ngược reverse transciptase và các nguyên liệu và hóa chất cần thiết khác. Bước này gồm 2 giai đoạn: (1) tổng hợp cDNA mạch đơn, (2) tổng hợp cDNA mạch kép.
26. Các bước cơ bản tạo ngân hàng cDNA (tiếp ) • Bước 3: Nhân dòng các cDNA Các cDNA được nhân dòng và tập hợp thành các thư viện cDNA (xem lại bài nhân dòng gene)
27. Một số phương pháp tạo cDNA
28. Phương pháp tạo cấu trúc kẹp tóc • Dùng các mRNA làm khuôn với sự có mặt của enzym sao chép ngược (inverse transcriptase) cùng với các nguyên liệu (dNTP) để tổng hợp nên DNA bổ sung hay cDNA sợi đơn có cấu trúc kẹp tóc. • Dùng enzyme RNase H (hoặc alkali) phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA • Bổ sung DNA polymerase và các nucleotid tự do để tổng hơp sợ cDNA thứ 2 (phần móc cong trở thành primer cho DNA polymerase) • Xử lý với S1 nuclease để cắt bỏ đoạn có cấu trúc kẹp tóc thu được phân tử cDNA có cấu trúc xoắn kép
29. Phương pháp RACE • RACE (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối cDNA • Quá trình sao chép ngược được thực hiện nhờ PCR (RT-PCR) nhân nhanh trình tự RNA thành dạng cDNA. • Gồm 2 quy trình: – Nhân nhanh đầu 5’ (5’ RACE) – Nhân nhanh đầu 3’ (3’ RACE)
30. 3’ RACE • mRNA được phiên mã ngược sử dụng mồi (dT17) c ó gắn neo ở đầu 5’ của nó. Neo này mang trình tự cắt giới hạn để phục vụ cho nhân dòng. • Quá trình nhân nhanh được thực hiện nhờ (dT17) c ó gắn neo và mồi đặc hiệu cho cDNA mục tiêu.
31. 5’ RACE • mRNA được phiên mã ngược sử dụng mồi đặc hiệu. • Sản phẩm cDNA sau đó được kéo dài nhờ terminal transferase để tạo đuôi poly(dA) ở đầu 3’ của cDNA. • Quá trình nhân nhanh được thực hiện nhờ mồi dT17 có gắn neo (oligo (dT17)/anchor system) tương tự như trong quy trình đối với 3’RACE và mồi đặc hiệu
32. So sánh thư viện genome và thư viện cDNA 1. Thư viện cDNA chỉ chứa trình DNA nhiễm sắc thể tự được phiên mã ở mRNA chứ không phải toàn bộ bộ gene Phiên mã 2. Thư viện cDNA có thể không chứa toàn bộ gene của cơ thể. Cắt bằng enzyme giới hạn mRNA sơ cấp Thư viện genome cần chứa tất Các đoạn Tạo cả các gene của cơ thể. DNA mRNA 3. Nếu gen được biểu hiện mạnh trưởng thành ở một mô, thư viện cDNA có mRNA thể chứa nhiều bản sao của Nhân dòng DNA Phiên mã ngược và gen đó. Các gen không biểu nhân dòng cDNA hiện hoặc biểu hiện ở mức thấp có thể không có mặt trong thư viện cDNA. Thư viện genom thường chứa tất cả các dòng của gen nếu như gen đó xuất hiện nhiều trong hệ gen sinh vật. Các dòng đoạn DNA Các dòng cDNA trong trong thư viện genome thư viện cDNA
33. Ứng dụng của thư viện cDNA • Cung cấp các trình tự cho phân tích, khuếch đại, nhân dòng và thể hiện gen • Thiết kế các mẫu dò, mồi khi đã biết trình tự để cung cấp cho các nghiên cứu, chuẩn đoán tiếp theo (lai, blot, PCR, trị liệu gen ) • Tổng hợp hoạt chất thông qua điều khiển sự thể hiện của một gen nào đó trong tế bào chủ đặc thù.
34. Ứng dụng của thư viện cDNA • Xác định trình tự các base và phân tích gene • Thiết kế các mẫu dò cho các gene mục tiêu trên nhiễm sắc thể • Nghiên cứu sự biểu hiện của gene • Tổng hợp protein nhân tạo