Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Kỹ thuật xác định trình tự DNA

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Kỹ thuật xác định trình tự DNA

1. CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA BM CNSH TV BM– Khoa-CNSHTV CNSH
2. KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA BM-CNSHTV
3. Khái niệm Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA. BM-CNSHTV
4. Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật đã được giải mã trình tự BM-CNSHTV
5. Các phương pháp xác định trình tự Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977) Xác định trình tự tự động  Xác định trình tự thế hệ mới BM-CNSHTV
6. Phương pháp Maxam-Gilbert • Là phương pháp phân giải hóa học • Sử dụng hóa chất để biến đổi DNA ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau Walter Gilbert BM-CNSHTV
7. Các loại hóa chất sử dụng  Dimethyl sulfat methyl hóa G.  Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.  Hydrazin gây biến đổi tại C và T.  Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C.  Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. BM-CNSHTV
8. Chemical used for Chemical used Base Chemical used for altered base for strand specificity base alteration removal cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine BM-CNSHTV
9. J2 nucleic acid sequencing Maxam and Gilbert chemical method DNA labeled at one end with 32P G C T G C T A Base modification G C T G C T A CH3 Release or displace- ment of reacted bases G C T C T A Strand scission G C T C T A BM-CNSHTV
10. BM-CNSHTV
11. BM-CNSHTV
12. Hạn chế của phương pháp Maxam- Gilbert • Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt. • Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác. • Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến hành xác định trỡnh tự. • Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn, khoảng 250 bp BM-CNSHTV
13. Phương pháp Sanger • Còn gọi là phương pháp kết thúc mạch (chain termination method) hay phuong pháp dideoxyribonucleotide (dideoxyribonucleotide method) BM-CNSHTV
14. Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method) •Phương pháp enzyme •Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung. Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu. •DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại • Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid) BM-CNSHTV
15. Cho phép kéo dài mạch ở đầu 3’ Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’ BM-CNSHTV
16. Sự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTV
17. Sự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTV khi xuất hiện ddNTP
18. Các bước thực hiện 1. Chuẩn bị DNA khuôn sợi đơn 2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng 3. Thực hiện phản ứng 4. Điện di kết quả Thu nhận kết quả giải trình tự DNA BM-CNSHTV
19. Thành phần phản ứng Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống chứa các thành phần như sau: − DNA khuôn mạch đơn − Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh dấu phóng xạ) − dNTPs − ddNTP (mỗi ống phản ứng bổ sung 1 trong 4 loại ddNTP là ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) − DNA polymerase − Dung dịch đệm thích hợp BM-CNSHTV
20. DNA khuôn mạch đơn chưa biết DNA khuôn và mồi trình tự Mồi Chia thành 4 ống phản ứng Bổ sung DNA Các đoạn kết thúc Các đoạn kết thúc Các đoạn kết thúc polymerase bằng ddG bằng ddC bằng ddT Phân tách mạch mới được tổng hợp ra khỏi mạch khuôn Lớn nhất Nhỏ nhất BM-CNSHTV
21. BM-CNSHTV
22. VD bản gel điện di xác định trình tự theo phương pháp Sanger BM-CNSHTV
23. Bài tập tại lớp Cho biết thông tin về trình tự DNA thông qua bản gel điện di bên BM-CNSHTV
24. Ưu điểm của phương pháp Sanger • Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô lớn. • Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng hoá của các chất hoá học, không có phản ứng phụ. • Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng DNA mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của DNA cấu trúc bậc 2. • Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài, khoảng 300 ~ 400 bp. BM-CNSHTV
25. Bài tập về nhà Giả sử đoạn DNA cần xác định trình tự có trình tự như sau: 3’ ATTCTCAATGCTATGCTA 5’ Nêu các bước tiến hành xác định trình tự theo phương pháp Sanger. BM-CNSHTV
26. Xác định trình tự DNA tự động Nguyên lý: • Hoạt động trên cơ sở của phương pháp Sanger. Nhưng : • Quá trình tổng hợp DNA thực hiện nhờ kỹ thuật PCR • Các chất đánh dấu phát huỳnh quang được đưa vào mạch DNA tổng hợp mới nhờ sử dụng các mồi được gắn chất đánh dấu phát huỳnh quang ở đầu 5’ hoặc các ddNTP được gắn chất phát huỳnh quang. • Hệ thống xác định trình tự DNA phát hiện sự phát huỳnh quang từ 4 chất nhuộm khác nhau được sử dụng để phân biệt A, C, G và T trong các phản ứng kéo dài. Mỗi chất nhuộm hấp thu ánh sáng ở các bước sóng ở bước sóng khác nhau. Có 4 màu và do đó 4 loại base có thể được phát hiện và phân biệt được với nhau. Máy cũng như hệ thống phần mềm sẽ thu nhận thông tin về màu sắc và từ đó chuyển đổi sang thông tin về trình tự của DNA. • Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số liệu BM-CNSHTV
27. Các bước tiến hành • Chuẩn bị DNA khuôn • Nhân DNA bằng PCR • Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự sequencer, chạy máy • Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên hai mạch và đồ thị. BM-CNSHTV
28. BM-CNSHTV
29. Bigdye terminator Sequencing với BigDye terminator BM-CNSHTV
30. Điện di gel BM-CNSHTV
31. Điện di mao quản BM-CNSHTV
32. Điện di gel Điện di mao quản Applied Biosystems PRISM Applied Biosystems PRISM 377 3700 (Gel, 34-96 lanes) (Capillary, 96 capillaries) BM-CNSHTV
33. Sequencing (Sanger) – kết quả BM-CNSHTV
34. BM-CNSHTV
35. Xác định trình tự thế hệ mới BM-CNSHTV
36. Pyrosequencing Pyrosequencing là một phương pháp xác định trình tự DNA dựa trên nguyên lý đọc trình tự qua "tổng hợp“ dựa vào khả năng phát hiện sự giải phóng pyrophosphate mỗi khi một nucleotide được gắn vào mạch. - Nguyên tắc: Pyrosequencing là dựa trên khả năng phát hiện hoạt tính của DNA polymerase với một enzym phát quang (chemiluminescent.) - Về bản chất, phương pháp cho phép đọc trình tự của một sợi đơn của DNA bằng cách tổng hợp sợi bổ sung dọc theo nó, và phát hiện những bazơ đã thực sự được gắn vào ở mỗi bước. Các mẫu DNA được cố định, và các dung dịch của A, C, G, và T nucleotide được thêm vào và bỏ đi sau mỗi phản ứng một cách tuần tự. BM-CNSHTV
37.  Việc thêm một nucleotid vào đầu cuối của sợi là có thể nhận biết bởi nó được kèm theo sự giải phóng một phân tử pyrophosphate, là phân tử sau đó được chuyển hóa thành tín hiệu phát sáng nhờ enzyme sulfurylase. Ánh sáng sản xuất bởi phản ứng xúc tác luciferase-được phát hiện bởi một máy ảnh và phân tích trong một chương trình  Mỗi dNTP được thêm vào riêng rẽ một cách tuần tự. nucleotidase enzyme (apyrase ) cũng có trong thành phần phản ứng nên những dNTP không được gắn vào mạch sẽ được phân hủy trước khi các dNTP tiếp theo được bổ sung. BM-CNSHTV
38. BM-CNSHTV
39. Hiện nay, một hạn chế của phương pháp là độ dài của mỗi lần đọc chỉ xung quanh 300-500 nucleotide, Điều này có thể làm cho quá trình lắp ráp bộ gen khó khăn hơn, đặc biệt là cho các hệ gen có chứa một lượng lớn ADN lặp đi lặp lại. Đến năm 2007, pyrosequencing là phổ biến nhất là sử dụng cho resequencing hoặc đọc trình tự của bộ gen mà hệ gen của loài họ hàng gần gũi đã hoàn tất. BM-CNSHTV