Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Nhân dòng DNA

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Nhân dòng DNA

1. CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) . Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn . Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen . Các phương pháp lai phân tử . Phương pháp PCR, ứng dụng . Kỹ thuật xác định trình tự DNA . Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 1
2. Nhân dòng DNA • Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất các đoạn DNA. • Hai cách: ▪ sử dụng tế bào chủ ▪ dùng PCR • Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn DNA mục tiêu vào trogn tế bào chủ BM CNSH TV – Khoa CNSH
3. Vector nhân dòng DNA  Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn DNA/gen đã được tách dòng  Trong thực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc.  Do enzyme DNA polymerase làm nhiệm vụ tái bản DNA không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào trên DNA mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái bản” (origins of replication) Các đoạn DNA (các gen) muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào một vectơ (cloning vectors). Vector nhân dòng thực chất là một phân tử DNA có gốc tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn. BM CNSH TV – Khoa CNSH
4. Tiêu chuẩn của một vector nhân dòng • Chỉ có một địa điểm nhận biết cho một RE nào đó. – Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này. Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết. • Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc – Thí dụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo mầu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu của chúng. • Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế bào chủ mới. – Trong một số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm vector nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau như E.coli và Bacillus subtilis. Các vector hai chức năng này phải có số điểm tái bản lớn hơn 1. BM CNSH TV – Khoa CNSH
5. Các loại vector nhân dòng DNA vectors Chromosome-based Plasmid-based Virus-based YAC Phage-based MAC BAC Hybrid Eukaryotic virus- based (phagemid, cosmid ) BM CNSH TV – Khoa CNSH
6. Các loại vector nhân dòng DNA • Các loại vector nhân dòng khác nhau được sử dụng cho các thí nghiệm nhân dòng khác nhau. • Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích thưứoc và loại DNA cần nhân dòng BM CNSH TV – Khoa CNSH
7. Plasmid • Các tế bào vi khuẩn có thể chứa các DNA ngoài DNA nhiễm Sắc thể gọi là các plasmid. • Plasmid thường ở dạng các DNA nhỏ mạch vòng. • Một số plasmid có mặt trong tế bào với nhiều bản sao. BM CNSH TV – Khoa CNSH
8. Ưu điểm của plasmid vectors: . Kích thước nhỏ (3-20kb) . Genome đã được giải mã . Số bản copy cao . thấp (1 – 10) hoặc cao (100 – 1000) copies/tế bào . Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc . kanamycin resistance gene (kanR) . tetracycline resistance gene (tetR) . ampicillin resistance gene (ampR) . . .Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE BM CNSH TV – Khoa CNSH
9. Một số plasmid vector . pBR plasmid . pUC BM CNSH TV – Khoa CNSH
10. Nhóm plasmid pBR 4363bp “p” : plasmid “BR” : tên của hai nhà khoa học F. Bolivar và R.Rodrigues “332”: số thứ tự. BM CNSH TV – Khoa CNSH
11. Nhóm plasmid pUC • Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322 • Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40 % DNA) được cắt bỏ còn phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại. • Ngoài ra, các vị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn ADN ngoại lai (cũng là các vị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung vào một vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS).
12. Thành phần của một plasmid Older cloning vector • Gốc tái bản • Marker chọn lọc • Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS/polylinker)
13. Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS / polylinker) • Là một đoạn DNA với nhiều vị trí nhận biết duy nhất cho các enzyme giới hạn. Việc cắt plasmids với một trong các RE trong vùng MCS không ảnh hưởng gì đến các đặc tình cần thiết khác của vector • Gene cần nhân dòng được gắn vào vector nhân dòng ở một vị trí giới hạn trong vùng polylinker
14. BM CNSH TV – Khoa CNSH
15. Hạn chế của plasmid vectors • Không nhân dòng được các đoạn DNA kích thước lớn • Thường nhân đoạn 4 - 10 kb • Hiệu suất biến nạp thường không cao BM CNSH TV – Khoa CNSH
16. Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của một số vector nhân dòng STT Vector Khả năng chứa đoạn DNA (kb) 1 Plasmid <10 kb 2 Bacteriophage 9 – 20 kb 3 Cosmid 33 – 47 kb 4 BAC 100 – 300 kb 5 YAC 100 – 1000 kb BM CNSH TV – Khoa CNSH
17. Nhân dòng DNA • DNA cloning cho phép chọn lọc và sao chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù của DNA (hoặc RNA) và sản xuất với một lượng không giới hạn • Là bước đầu tiên trong một loạt các thí nghiệm về kỹ thuật di truyển – Tạo thư viện DNA – PCR – DNA sequencing BM CNSH TV – Khoa CNSH
18. Các bước cơ bản của nhân dòng gen Xử lý vector với 1. Tách chiết DNA từ mẫu nghiên cứu, enzyme cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn để cắt giới hạn hình tạo ra các đoạn DNA là nguyên liệu thành đoạn bổ Đoạn DNA cần nhân cho quá trình nhân dòng (tách dòng) sung với dòng đã được xử lý đoạn DNA enzyme giới hạn 2. Gắn các đoạn cắt vào một vector nhân cần nhân dòng Nối đoạn DNA với vector nhờ enzyme 3. Chuyển nạp các vector nhân dòng sau DNA ligase phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật chủ để nhân bản các đoạn DNA đã được gắn cùng với vector Phân tử DNA tái tổ hợp 4. Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành Chuyển vào tế bào vi khuẩn từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng. Từ đây có thể Phân tử DNA tái tổ hợp chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm. Nhiễm sắc thể vi khuẩn BM CNSH TV – Khoa CNSH
19. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 1: Cắt DNA mẫu và plasmid bằng RE Xử lý enzyme EcoRI Xử lý enzyme EcoRI BM CNSH TV – Khoa CNSH
20. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 2: Nối mẫu DNA vào pUC19 Mẫu DNA đã Vector plasmid được xử lý bằng được xử lý bằng EcoRI EcoRI Quá trình lai thực hiện nhờ DNA ligase BM CNSH TV – Khoa CNSH
21. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 3. Biến nạp • Biến nạp (transformation): là quá trình chuyển DNA ngoại sinh vào trong 1 tế bào • Có một số phương pháp để biến nạp DNA vào vi khuẩn, 2 phương pháp thường sử dụng đó là : – Phương pháp hóa học sử dụng CaCl2 và sốc nhiệt để thúc đẩy DNA đi vào trong tế bào – Dùng xung điện (electroporation) để kích thích quá trình tế bào tiếp nhận DNA BM CNSH TV – Khoa CNSH
22. Biến nạp theo phương pháp dùng CaCl2 và sốc nhiệt Chia thành các ống tế bào khả biến Li tâm Hòa tủa trong dung dịch CaCl2 Nuôi cấy vi Đặt trong đá Bảo quản ở -80oC khuẩn E.coli đến pha log Plasmid tái tổ hợp Cấy trải trên môi trường Sốc nhiệt chọn lọc Khuẩn lạc mọc trên môi trường Bể ổn nhiệt 42oC Đặt trong đá chọn lọc BM CNSH TV – Khoa CNSH
23. Biến nạp bằng xung điện Li tâm Li tâm Hòa tủa trong dung Hòa tủa trong dung dịch H2O vô trùng dịch H2O vô trùng Tế bào khả Nuôi cấy vi Đặt trong đá biến được sử khuẩn E.coli dụng ngay đến pha log Plasmid tái tổ hợp Cấy trải trên Xung điện môi trường chọn lọc Khuẩn lạc mọc trên Đệm môi trường chọn lọc BM CNSH TV – Khoa CNSH
24. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 4. Chọn lọc • Nuôi dịch khuẩn vừa biến nạp trên môi trường chọn lọc. BM CNSH TV – Khoa CNSH
25. Các sản phẩm thu được sau biến nạp plasmid + đoạn DNA Plasmid không mang Không mang plasmid ngoại đoạn DNA ngoại Không kháng ampicillin Kháng ampicillin Kháng ampicillin Làm thế nào để phân biệt và chọn lọc được sản phẩm mong muốn? BM CNSH TV – Khoa CNSH
26. Chọn lọc trắng xanh Dựa vào hệ thống lac Operon: điều khiển phản ứng đối với lactose trong tế bào E. coli BM CNSH TV – Khoa CNSH
27.  - galactosidase &  -glucuronidase  - galactosidase Lactose Galactose + Glucose  - glucuronidase -D-glucuronid + H2O Glucuronic acid + Glucose X-Gal Không màu X-Gluc 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-glucuronid   - - glucuronidaza galactosidase _cleanup1.jpg 5-Brom-4-chlor-indigo Màu xanh sẫm 5-Brom-4-chlor-indigo
28. Gene LacZ ở trạng thái hoạt động DNA promotor LacZ gene RNA pol. RNA LacZ mRNA Ribosome Protein β-galactosidase X-gal BLUE colonies X-gal WHITE colonies BM CNSH TV – Khoa CNSH
29. BM CNSH TV – Khoa CNSH
30. Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc promotor LacZ RNA pol. promotor operator LacZ RNA pol. Repressor IPTG IPTG IPTG promotor operator LacZ RNA pol. IPTG IPTG beta-galactosidase X-gal X + galactose MÀU TRẮNG MÀU XANH BM CNSH TV – Khoa CNSH
31. Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc Insert P O LacZ X X X Không chứa plasmid X Plasmid + đoạn DNA ngoại X Plasmid + đoạn DNA ngoại Khuẩn lạc TRẮNG Khuẩn lạc XANH BM CNSH TV – Khoa CNSH
32. Như vậy: • Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã chuyển nạp thì tồn tại được trên môi trường và sinh khuẩn lạc (vì có plasmid chuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh ). • Do cấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hoá  -galactozidase) sẽ là vùng bị cắt để gắn DNA ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn DNA ngoại lai, còn khuẩn lạc có mầu trắng chính là khuẩn lạc có chứa 1 đoạn DNA cần nhân dòng được ghép vào. BM CNSH TV – Khoa CNSH
33. Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19 Bước 4: (tiếp ) • Chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trường lỏng có bổ sung ampicillin để nhân nhanh sinh khối. • Tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả nối DNA vào plasmid (khẳng định sự có mặt của đoạn DNA mong muốn trong plasmid) bằng các phương pháp như PCR, sử dụng RE. BM CNSH TV – Khoa CNSH
34. Movie on making recombinant DNA BM CNSH TV – Khoa CNSH