Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Phương pháp PCR, ứng dụng

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kĩ thuật nền của CNSH hiện đại-Phương pháp PCR, ứng dụng

1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) BM CNSH TV – Khoa CNSH 1
2. CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA BM CNSH TV – Khoa CNSH 2
3. PCR Polymerase Chain Reaction 3
4. Sự phát minh ra kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983. • Hai năm sau (1985), phát minh này được chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế. • Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải thưởng Nobel hóa học năm 1993. “Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại” (J. Watson) 4
5. Khái niệm Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNA thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y 5
6. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để nhân bản một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA. Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng 6
7. Sự tái bản DNA trong cơ thể sống 7
8. Thành phần của PCR • DNA khuôn: mang trình tự cần nhân lên • 2 mồi tổng hợp oligonucleotide (mồi xuôi và mồi ngược) • dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP • Polymerase chịu nhiệt • Mg2+: cofactor của enzyme • Dung dịch đệm: ổn định pH và lực ion của dung dịch phản ứng cho phù hợp với hoạt động của enzyme 8
9. Các giai đoạn trong phản ứng PCR Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và chúng được lặp lại từ 20-40 lần. Việc này được tự động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian ngắn. 1. Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95oC). 2. Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được giảm xuống (55-50oC) để các mồi gắn vào các sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base. 3. Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase (65- 75oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5. 9
10. Chu kỳ phản ứng PCR Chu kỳ nhiệt: Hçn hîp Bước 1: 94o C, 30 giây o ph¶n øng B¾t ®Çu chu kú míi Nh¾c ®i nh¾c l¹i n chu Bước 2: 94 C, 15 giây PCR (2) kú Bước 3: 55o C, 30 giây o G§ Bước 4: 72 C, 1.5 phút 1 Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 (oC) trong 35 lần NhiÖt®é G§ o G§ 3 Bước 6: 72 C, 10 min o 2 Bước 7: 4 C f- bảo quản Bước 8: Kết thúc Thêi gian (phót) Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lặp đi lặp lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn DNA nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau 10
11. Thực hiện phản ứng ống phản ứng PCR THERMOCYCLER
12. Biến t ính Gắn mồi K éo dài
13. Số bảnDNA copy copies DNA vs Cycle và số number chu kỳ nhiệt 2500000 (2n - 2n)x n = số chu kỳ 2000000 x = số bản sao của DNA khuôn 1500000 1000000 DNA copies Số bản copy Sốbản copy DNA 500000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 SốCycle chu number kỳ
14. 1 0 2 0 Khuôn DNA được biến đổi 3 2 4 4 thành 2 sợi đơn o 5 8 (94 C, 5 phút 6 16 7 32 8 64 9 128 Gắn mồi vào 10 256 chuỗi DNA 11 512 (30-65oC) 12 1024 30 giây 13 2048 14 4096 15 8192 16 16.384 17 32.768 Chu trình PCR 18 65.536 19 131.072 Tổng hợp 20 265.144 Tách thành sợi chuỗi mới 21 524.288 đơn DNA (65-75oC, 2-5 22 1.048.576 (94oC, 30 giây) phút) 23 2.097.152 24 4.194.304 25 8.388.608 26 16.777.216 27 33.544.432
15. PCR animation 16
16. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR . Ảnh hưởng của thành phần phản ứng . Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng . Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR
17. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng • DNA khuôn • Mồi • Enzyme • dNTPs • Mg2+
18. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của DNA khuôn Độ tinh sạch của DNA khuôn Không cần tinh sạch lắm Cần tránh các chất gây ức chế phản ứng Hàm lượng sử dụng: 0.1 – 1 mg cho 100 mL phản ứng Hàm lượng ít: không đủ cho phản ứng khuếch đại Hàm lượng cao: sản phẩm không đặc hiệu Độ dài của trình tự mục tiêu: quá dài có thể dẫn đến sai sót, hoặc không thực hiện được phản ứng Hàm lượng GC của DNA khuôn: liên quan đến sự hình thành cấu trúc thứ cấp
19. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi • Đặc điểm của mồi • Nồng độ mồi • Độ tinh sạch
20. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi . Đặc trưng của mồi . Đặc điểm của mồi thiết kế . Tính đặc hiệu: Dặc hiệu . Độ dài mồi cho trình tự mục tiêu cần . Hàm lượng GC nhân (tránh lai không đặc . Nhiệt độ tách chuỗi (Tm) hiệu) . Nhiệt độ gắn mồi . Tính ổn định: Hình thành . Chuỗi GC đầu 3’ dạng sợi đôi bền vững với . Cấu trúc thứ cấp DNA khuôn trong PCR . Cấu trúc kẹp tóc . Tính tương thích:Mồi . Tự mồi được dùng như một cặp . Tự mồi chéo nên cần hoạt động được . Các chuỗi lặp trong cùng điều kiện PCR . Độ ổn định đầu 3’ . Vùng thiết kế mồi của khuôn
21. Công thức tính Tm của mồi: Đối với mồi 20bazơ thì nhiệt độ gắn mồi Tm = [2 x (tổng số A + T) + 4 x (tổng số G + C)]0C VD: CAGCAAATATCTGTCCTTAC ==> Tm = 2x12+4 x 8 = 560C Đối với mồi 20 - 35bazơ thì nhiệt độ gắn mồi 0  Tm = 22 + 1,46 [2 (tổng số G+C) + (tổng số A + T)] C Đối với mồi 35 – 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi  Tm = 81,5 + 16,6lgC+ + 0,41 (%tổng số G+C) - 600/L  C: nồng độ cation hoá trị một (Na+) tính theo M, L: chiều dài mồi.  Cần xác định Tm lý thuyết rồi thử nghiệm tìm Tm tối ưu. *Các mồi có kích thước ít khác nhau, có Tm gần giống nhau tăng hiệu quả của PCR
22. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi Độ dài mồi: Mồi thường có kích thước 18-25 nts. Kích thước quá ngắn không đặc hiệu Kích thước quá dài giảm hiệu quả lai Nhiệt độ gắn mồi (Tm) Tm quá cao mồi khó gắn vào khuôn Tm quá thấp mồi bám không đặc hiệu Tm của mồi xuôi và mồi ngược nên tương đương Cần xác định Ta lý thuyết, sau đó chạy PCR với gradient nhiệt độ để tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu
23. Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến kết quả PCR
24. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi . Hàm lượng GC: . Nên nằm trong khoảng 40-60% . Không nên chứa polyG hoặc polyC sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi. . Chuỗi GC đầu 3’: . Đầu tận cùng 3’ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG. tăng khả năng bắt cặp chính xác (liên kết H của G và C lớn hơn) . Đầu tận cùng 3’ không nên có nhiều hơn 2 gốc liên tục G/C . Độ ổn định đầu 3’ (khoảng 5nts đầu 3’) . Không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì giá trị DG cao . bắt cặp không đặc hiệu. . Nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A khó bắt cặp
25. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi • Cấu trúc thứ cấp: mồi có cấu trúc thứ cấp PCR giảm hiệu quả, thậm chí không có sản phẩm
26. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi • Các chuỗi lặp – Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (VD: TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (VD: TTTT) tránh hiện tượng bắt cặp nhầm. – Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp. • Vùng thiết kế mồi của khuôn – Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa nhiều cấu trúc thứ cấp. Cấu trúc này mà ổn định ở nhiệt độ gắn mồi mồi không bắt cặp được
27. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của mồi . Nồng độ mồi . Nồng độ mồi quá thấp khả năng gắn mồi vào khuôn không hiệu quả ít hoặc không có sản phẩm. . Nồng độ mồi quá cao mồi bắt cặp không đặc hiệu sản phẩm không đặc hiệu. . Nồng độ mồi thường sử dụng 0.2 – 1 mM . Độ tinh sạch . Dung dịch mồi cần tránh có chứa các chất ức chế PCR và các DNA tạp nhiễm khác.
28. 0,20,2 µ µMM primers primers 0,60,6 µ µMM primers primers 11 µ µMM primers primers A8 B8 C8 D8 T-
29. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của enzyme DNA polymearase • Loại enzyme: có nhiều loại enzyme DNA polymerase, tùy thuộc vào mục đích và điều kiện nghiên cứu mà lựa chọn các loại enzyme phù hợp • Nồng độ enzyme: – Nồng độ quá thấp lượng sản phẩm ít – Nống độ quá cao sản phẩm không đặc hiệu – Thường sử dụng 1-2 đơn vị enzyme cho thể tích phản ứng 25 mL
30. Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của dNTPs, Mg2+ . dNTPs . Nồng độ của mỗi loại dNTP trong hỗn hợp phản ứng thường dùng là 200 mM. . Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP có thể làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. . Mg2+ . Lượng Mg2+ quá ít sản phẩm ít hoặc không có sản phẩm. . Lượng Mg2+ quá nhiều sản phẩm không đặc hiệu, tăng lỗi sao chép của DNA polymerase. . Nồng độ thường sử dụng: 2mM (có thể thay đổi trong khoảng 1-4 mM)
31. Ảnh hưởng của nồng độ Mg2+ đến kết quả PCR
32. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng . Số lượng chu kỳ phản ứng . Giai đoạn biến tính . Nhiệt độ biến tính . Thời gian biến tính . Giai đoạn gắn mồi . Nhiệt độ gắn mồi . Thời gian gắn mồi . Giai đoạn kéo dài . Nhiệt độ phản ứng kéo dài mạch . Thời gian phản ứng kéo dài mạch
33. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Ảnh hưởng của số lượng chu kỳ phản ứng . Số lượng chu kỳ phản ứng phụ thuộc vào: . Lượng DNA khuôn mẫu . Lượng sản phẩm mong muốn . Trong thực tế thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR vì: . Trong giai đoạn đầu, số lượng bản sao sẽ tăng theo cấp số nhân. . Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm do: . Sự phân hủy và cạn kiệt thành phần phản ứng . Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng . Các bản sao không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với nhau .
34. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Giai đoạn biến tính • Nhiệt độ biến tính: – Nhiệt độ quá thấp phân tử DNA không biến tính hoàn toàn hiệu quả khuếch đại thấp. – Nhiệt độ quá cao phân tử DNA bị phân hủy, DNA polymerase bị mất hoạt tính phản ứng không đặc hiệu hoặc không xảy ra. – Nhiệt độ biến tính thường sử dụng: 94 – 95oC
35. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Giai đoạn biến tính • Thời gian biến tính: – Thời gian quá ngắn phân tử DNA không được biến tính hoàn toàn hiệu quả khuếch đại thấp. – Thời gian quá dài phân tử DNA bị phân hủy, DNA polymerase bị mất hoạt tính phản ứng không đặc hiệu hoặc không xảy ra. – Thời gian biến tính thường sử dụng: • Giai đoạn biến tính ban đầu: 3-5 phút • Giai đoạn biến tính trong từng chu kỳ: 30-45 giây
36. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Giai đoạn gắn mồi • Nhiệt độ gắn mồi – Nhiệt độ quá thấp mồi bám không đặc hiệu sản phẩm không đặc hiệu. – Nhiệt độ quá cao mồi khó bắt cặp với DNA khuôn sản phẩm ít, hoặc không có sản phẩm. – Nhiệt độ gắn mồi sử dụng thường thấp hơn Tm của mồi. – Để tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, thường thiết lập phản ứng PCR theo thang nhiệt độ (các phản ứng chỉ khác nhau ở nhiệt độ gắn mồi).
37. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Giai đoạn gắn mồi • Thời gian gắn mồi – Thời gian quá ngắn mồi không đủ thời gian gắn vào khuôn – Thời gian quá dài tăng bắt cặp không chính xác – Thời gian gắn mồi thường sử dụng là 30 giây.
38. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Giai đoạn kéo dài • Nhiệt độ phản ứng kéo dài – Phụ thuộc vào loại enzyme và kích thước sản phẩm. VD: khi sử dụng Taq DNA polymerase • Đối với sản phẩm có kích thước 6 kb thường dùng 68oC để tránh enzyme bị biến tính.
39. Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng Giai đoạn kéo dài • Thời gian kéo dài – Thời gian quá ngắn trình tự mục tiêu nhân lên không hoàn chỉnh – Thời gian kéo dài mạch quá dài tạo thành sản phẩm không đặc hiệu – Tùy vào kích thước sản phẩm mong muốn và loại enzyme sử dụng mà thiết lập thời gian kéo dài mạch phù hợp. VD: đối với enzyme Taq DNA polymerase thời gian kéo dài thường sử dụng là 1 phút/1kb
40. 1 0 2 0 Khuôn DNA được biến 3 2 4 4 tính thành 2 sợi đơn o 5 8 (94 C, 5 phút) 6 16 7 32 8 64 9 128 Gắn mồi 10 256 vào chuỗi 11 512 DNA 12 1024 (30-65oC) 13 2048 30 giây 14 4096 15 8192 16 16.384 17 32.768 Chu trình 18 65.536 PCR 19 131.072 Tổng hợp 20 265.144 Tách thành chuỗi mới 21 524.288 sợi đơn DNA (65-75oC, 2-5 22 1.048.576 (94oC, 30 giây) phút) 23 2.097.152 24 4.194.304 25 8.388.608 26 16.777.216 27 33.544.432
41. Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR • Thiết bị tiến hành PCR cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác. • Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên mọi thí nghiệm trong cùng một nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại thiết bị. • Mọi dụng cụ, hóa chất sử dụng cho PCR cần phải sạch, tránh tạp nhiễm.
42. Bài tập • Nêu nguyên nhân và biện pháp khắc phục cho các trường hợp sau:
43. 1 2 Trường hợp không thấy tín Trường hợp sản phẩm hiệu vạch hoặc tín hiệu thấp 1: không có vạch không đặc hiệu 2: vạch mờ
44. a b Trường hợp tạo ra các vệt tín hiệu a: Xuất hiện vết chất có khối lượng phân tử nhỏ b: Xuất hiện vệt chất có khối lượng phân tử lớn
45. Các ứng dụng chủ yếu của PCR • Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn DNA • Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền và nhiễm trùng (ung thư, virus, vi khuẩn, nấm ) • Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm qua phát hiện các đoạn gene đặc trưng của nhiễm sắc thể giới tính. • Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm cơ sở cho việc phân tích các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật ), phát hiện các kiểu đột biến. • Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, xác định nhanh với độ chính xác cao các thủ phạm hình sự từ những dấu vết rất nhỏ: máu, nước dãi, sợi tóc • Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu năm. 47
46. Bệnh di truyền 644 bp 440 bp 204 bp Phân tích phân tử một gia đình có bệnh di truyền do gen lặn