Giáo trình Công nghệ sinh học-Kỹ thuật nhân giống in Vitro

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học-Kỹ thuật nhân giống in Vitro

1.  Giáo trình công nghệ sinh học Kỹ thuật nhân giống in vitro
2. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro o 0 o Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bao gồm: + Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành + Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. + Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành + Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm (in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm (in vivo). Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa, khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp. *Cơ sở khoa học Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản phân hoá. - Tính toàn năng của tế bào: Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều 1
3. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô) thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản phân hoá. - Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào + Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết ) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt. + Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào. Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân thì giai đoạn tạo mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân trước đó. Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được biểu diễn theo sơ đồ sau: Phân hoá tế bào Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. *Các ứng dụng Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối 2
4. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền. Ứng dụng: - Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống. - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại cây trống khác nhau. + Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt + Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa các loại cây trồng khác. + Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus + Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn. Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền, cúc ), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà phê ), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây ), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa sợi ) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất. *Các bước trong nhân giống in vitro Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro. Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975) Khoai tây: mầm (Morel, 1952) Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976) Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975) Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978) Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được 3
5. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962) Chất hữu cơ: đường sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA ), Xytokinin (BA, Kin, 2P ), Gibberelin (GA3) Bước 3: nhân nhanh Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-270C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh. Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu: - Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây ) - Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi 4
6. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng thích hợp. * Các phương pháp nhân giống in vitro Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau: * Ưu điểm - Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm. - Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài - Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch virus - Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng theo ý muốn - Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 36-1012/năm, như vậy không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn. - Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh của thời vụ. 5
7. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp - Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong thời gian dài ở điều kiện in vitro * Nhược điểm - Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn - Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà. Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiện tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh. - Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao. - Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống + Tính bất định về mặt di truyền + Sự nhiễm mẫu + Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy + Hiện tượng thuỷ tinh hoá 6
8. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 4: Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus? Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh? o 0 o * Tác hại của virus: Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng và phức tạp mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến. Người ta thường phân vi sinh vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho con người và vi sinh vật có hại cho con người. Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus là một loại rất nguy hiểm. Đối với cả con người và các loài động thực vật khác khi đã nhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể. Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hại của virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp. Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến, trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.), qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.). Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm chất của nông sản. Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus truyền bệnh 7
9. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp * Cơ sở lý luận của phương pháp: Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950), Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới. Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh. Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây (trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm). Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau: - Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô phân sinh đỉnh. - Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus. - Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác trong cây. - Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép virus. * Kỹ thuật làm sạch virus in vitro: - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước <0,3mm, nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác nhau để thu nhận cây sạch bệnh. - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao: ở nhiệt độ cao 36-370C thì một số loài virus không còn khả năng nhân lên. Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏi mẫu. Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5- 8
10. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp 1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,1-0,2mm. Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-370C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39-400C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao. - Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus. - Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh. Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus: Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần thực hiện các bước sau đây: + Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi cấy 8-10 cây trong bình 250ml. + Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml. + Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ 20-220C. + Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus. 9
11. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau: + Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy về sau đó khử trùng bằng HgCl 2 nồng độ 0,1% trong 7 phút. + Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền chồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki, 0,2pp IAA). + Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppm Ki). + Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi trường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA). + Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con được trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất cho cây con phát triển. Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm sóc bình thường. 10
12. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Nụ hoa Tạo thể tiền chồi Nhân nhanh Vườn ươm Cây giống Vườn sản xuất * Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus: Sau khi đã nuôi cấy thành công cây sạch bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì nguồn giống sạch bệnh là vô cùng quan trọng. Chính vì vậy, ở giai đoạn này việc chuẩn đoán bệnh virus tái nhiễm là không việc không thể thiếu, để từ đó phát hiện ra các cá thể nhiễm bệnh và loại ra khỏi nguồn giống. Có một số phương pháp chuẩn đoán bệnh virus như sau: - Phương pháp chuẩn đoán bằng mắt (thông qua triệu chứng bệnh): Đây là phương pháp đơn giản nhất cho phép có thể xác định bệnh virus thông qua biểu hiện của cây trồng. Phương pháp này đòi hỏi phải có kinh nghiệm quan sát và so sánh do có thể nhầm lẫn với một số loại bệnh không phải virus gây ra. Phương pháp này cũng không thể cho phép xác định chính xác loại bệnh virus đang nhiễm. 11
13. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp - Phương pháp chuẩn đoán bằng cây chỉ thị: Vào những năm 1940, phương pháp này được coi là phương pháp nhạy và chính xác nhất để xác định bệnh virus. Nhờ phương pháp này đã xác định được 2 virus phổ biến là X và A (Leviel 1986). Phương pháp này dựa trên những biểu hiện đặc trưng của cây chỉ thị khi nhiễm bệnh. Người ta đã tìm ra khoảng 200 cây chỉ thị chủ yếu thuộc họ cà (Solanaceae), họ rau dền (Amaranthaceae), họ rau muối (Chenopodaceae), họ đậu (Fabaceae), họ cúc (Asteraceae), trong đó họ cà chiếm ưu thế. Tuy nhiên phương pháp này vẫn bộc lộ một số nhược điểm như: + Thời gian chuẩn đoán kéo dài do phải qua một quá trình ủ bệnh mới xuất hiện triệu chứng. + Việc xuất hiện các triệu chứng đặc trưng còn phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, v.v. + Phương pháp lây nhiễm cho cây chỉ thị khá phức tạp, có loại phải truyền qua côn trùng truyền bệnh (các vecto truyền bệnh) rất phức tạp. + Tốn khá nhiều công để trồng trọt, chăm sóc cây chỉ thị, nuôi dưỡng côn trùng truyền bệnh. Cần có nhà nuôi cấy cách ly. Kinh phí đầu tư lớn. + Việc chuẩn đoán bệnh cuốn lá bằng phương pháp này khó tiến hành. + Phương pháp này chỉ sử dụng khi số lượng cá thể ít. Ví dụ như bệnh hoa lá dưa leo (Cucumic Mosaic Virus) sử dụng cây chỉ thị là cây Chenopodium quinoa. - Phương pháp huyết thanh: Phương pháp này được đánh giá là nhanh và hiệu quả. Có thể cho kết quả sau 48 giờ. Do đó chi phí cho xét nghiệm là ít. Muốn xem phản ứng huyết thanh người ta trộng lẫn huyết thanh đặc hiệu cho mỗi loại virus với dịch cây cần chuẩn đoán bệnh. Kết quả thu được kết tủa ở dạng bông hay dạng mây mờ (phản ứng kháng nguyên + kháng thể). Phương pháp này đã có nhiều cải tiến như làm sạch protein virus trước khi tiêm vào thỏ; tạo ra kháng thể đơn dòng có tính đặc hiệu rất cao đã nâng cao chất lượng của huyết thanh. - Phương pháp chuẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử: Kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ một đến hàng chục vạn lần, có thẻ quan sát được các sợi, thể hạt của virus. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế do: + Chi phí cho thiết bị khá lớn. + Số lượng mẫu hạn chế, phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khá phức tạp. + Không phát hiện được virus cầu do chúng khá giống cơ quan tử của tế bào. - Phương pháp chuẩn đoán bằng test ELISA (enzym linked immunosorbent assay): Test ELISA là một tiến bộ trong lĩnh vực chuẩn đoán bệnh virus hại cây trồng. Phương pháp có độ đặc hiệu cao. Chính xác, nhậy, nhanh, dễ tiến hành nên nhanh chóng trở thành phương pháp thông dụng. Test ELISA được Enguall và Permann (1971;1972) đề cập đầu tiên trong lĩnh vực nhân y. Từ năm 1986 nó được sử dụng như một test có độ nhạy rất cao để chuẩn đoán virus ở thực vật (Clark, Adams và Barbara 1976). Với khả năng phát hiện 12
14. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp nhạy, mọi virus nhất là virus cuốn lá hại khoai tây (nồng độ thấp), phương pháp này là tốt nhất, dễ sử dụng (Casper 1977). Nguyên lý của phương pháp vẫn dựa vào phản ứng kháng nguyên và kháng thể, nhưng kháng thể được liên kết với một enzym (enzym linked). Phức enzym – kháng thể- kháng nguyên sẽ dễ nhận biết do một phản ứng màu nhờ hính sự có mặt của emzym xúc tác. Phản ứng màu thường là sử dụng các phản ứng phân giải 4- nitrophenolphosphat bởi photphataza. Khi tách phosphat, α-nitrophenol sẽ có màu vàng. Mỗi enzym có thể xúc tác cho hàng ngàn phân tử cơ chất nên tín hiệu màu được khuếch đại rất rõ. Phản ứng test được tiến hành khi gắn trên các mặt bản thử plastic, nên có tên gọi là immunosorbent. Như vậy, trên bản thử lỗ nào có màu vàng, nơi ấy có mặt phức kháng nguyên – kháng thể - enzym, tức là có virus. Cho đến nay có thể nói test ELISA là công cụ chính trong việc chuẩn đoán bệnh virus. Bằng phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán chính xác cả mặt định tính và định lượng. - Chuẩn đoán bằng kỹ thuật phân tích ADN: Phương pháp này cho kết quả nhanh và chính xác. Phương pháp thông dụng gọi là phương pháp PCR. Nguyên lý chung của phương pháp là xác định trực tiếp sự có mặt của phần lõi axit nucleic của virus. Phần lõi này có trình tự rất đặc hiệu tùy theo mỗi loại virus. Từ đó mà có thể là phát hiện trực tiếp qua bảng phản ứng PCR. Sử dụng các cặp mồi là các đoạn nucleotid (dài từ 10-30 nu) có trình tự bổ sung với hai đầu (phía 3’) của hai sợi đoạn ADN cần nhân. Sau thời gian cho phản ứng trên máy PCR khoảng 3 giờ có thể lấy mẫu và đánh giá kết quả. Nếu mẫu sạch virus tức là không có khuôn ADN của virus thì cặp mồi không bắt cặp, quá trình nhân ADN không xảy ra. Còn ở mẫu bệnh, sự nhân ADN diễn ra mạnh mẽ (sau 30 chu kỳ có thể nhân hàng trăn triệu đoạn ADN). Có thể nhận biết ADN qua phương pháp điện di. Từ đây cso thể kết luận mẫu có nhiễm bệnh hay không. Tuy nhiên, một số virus có cấu tạo phần axit nucleic là ARN, trong trường hợp này cần phải chuyển ARN virus sang dạng ADN (cADN) sau đó phát hiện ADN này bằng phương pháp PCR. Phương pháp này được coi là vũ khí vô cùng lợi hại của con người. Phương pháp này có thể phát hiện virus ở nồng độ rất thấp với độ chính xác rất cao. Chính vì vậy, phương pháp này đã được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ sản xuất các giống sạch bệnh virrus hiện nay. 13
15. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 5: Trình bày kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng của chúng trong công tác giống cây trồng? o 0 o * Khái niệm về cây đơn bội: Các cây trồng khác nhau thường có mức bội thể khác nhau. Có thể là đơn bội (n), lưỡng bội (2n), tứ bội (4n), v.v. Tuy nhiên phổ biến trong tự nhiên là lưỡng bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, với các loại cây trồng này kiểu hình thể hiện ra ngoài là sự tác động tổng hợp của nhiều kiểu gen, phụ thuộc và tính trạng là lặn hay trội. Trong công tác chọn giống người chú ý nhiều tới thể đơn bội (n), bởi lẽ cây trồng ở dạng đơn bội thường rất khó tồn tại trong tự nhiên. Nó chỉ sống được trong điều kiện nhân tạo của con người. Cây đơn bội mang bộ NST (n), vì vậy để cho nó sống được người ta phải tiến hành đồng hợp tử tuyệt đối, tức là tạo ra alen hoàn toàn giống nhau. Những biểu hiện của cây đơn bội (kiểu hình) thể hiện chính xác kiểu gen mà nó đang có, kể cả các gen lặn. Đây sẽ là nguồn vật liệu di truyền vô cùng quý giá trong công tác chọn giống. * Các đường hướng tạo cây đơn bội: Cơ thể thực vật trong tự nhiên chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội. Nếu như chúng phát triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n). Tuy nhiên trong tự nhiên rất hiếm gặp các cây đơn bội, vì vậy các nhà khoa học đã tiến hành nghien cứu bằng các con đường khác nhau nhằm tạo ra cây đơn bội làm nguồn vật liệu cho công tác chọn giống. Vào năm 1924, Blakeslee và cộng sự đã chứng minh được rằng có thể thu được các dòng nhị bội thuần đồng hợp bằng cách nhị bội hóa các thể đơn bội. Đến năm 1964, hai ông Guka & Maheshwari (Ấn Độ) đã lần đầu tiên tạo thành công cây đơn bội bằng nuôi cây bao phấn cà độc dược. Tiếp sau đó với các đóng góp của Nitsch và Noieel (1973-1976) đã càng khẳng định việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy là hoàn toàn có thể thành công. Cho đến nay, đã có khoảng 170 loài cây trồng được tạo ra bằng con đường đơn bội. Việc tạo cây đơn bội có thể có nhiều hướng khác nhau: - Tạo cây đơn bội (dòng thuần) bằng con đường tự phối. Đây là một hướng có thể coi là thủ công và rất mất thời gian. Thường phải mất đến 5-7 thế hệ mới tạo được dạng đồng hợp tử. Đây cũng là một phương pháp khó thực hiện và tốn kém. - Tạo cây đơn bội bằng in vitro. Đây là phương pháp chiếm ưu thế bởi sự tiện dụng và nhanh chóng của phương pháp này. Chỉ mất 1 thế hệ để tạo ra cây đơn bội. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây khi nuôi cấy bao phấn, hạt phấn và gần đây, người ta còn nuôi cây kích thích các tế bào trứng (noãn chưa thụ tinh) phát triển thành cây đơn bội. Đặc biệt với cây ngô đã nhanh chóng tạo hàng loạt cây đơn bội ứng dụng trong công tác giống cây trồng. 14
16. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp * Khả năng ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng: Cây đơn bội có thể ứng dụng vào nhiều mục đích khác nhau: - Nghiên cứu di truyền về mối tương tác của các gen. - Tạo đột biến ở mức đơn bội. - Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối phục vụ công tác giống cây trồng. Sơ đồ các hướng ứng dụng cây đơn bội: Dòng thuần ổn định (F1,F2) Chọn giống ưu thế lai dòng đồng hợp tử tuyệt đối Nhị bội hóa số lượng NST (Tự phát, xử lý, colchicine) Cá thể đơn bội Lai với các thể đơn bội khác bằng dung hợp tế bào trần Nuôi cây tế bào trần (lai Soma) của các thể đơn bội Gây đột biến, chọn lọc in vitro Tái sinh cây Nguyên liệu khởi đầu cho chọn giống * Kỹ thuật tạo cây đơn bội: - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn, hạt phấn: + Nguyên lý: Nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích các hạt phấn này phát triển thành cây đơn bội. 15
17. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Sự phát sinh cây đơn bội từ hạt phấn được gọi là sự sinh sản đơn tính đực (androgensis). Khi nuôi cấy hạt phấn đơn nhân in vitro có thể có 3 phương thức sinh sản đơn tính đực như sau: Sinh sản đơn tính đực trực tiếp như ở thuốc lá, cà độc dược. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo phôi 1n, phôi này sẽ phát triển thành cơ thể 1n (cây 1n). Sinh sản đơn tính đực gián tiếp như ở lúa, ngô. Khi đó hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tạo mô sẹo 1n, nhân nhanh thành chồi 1n, phát triển thành cây 1n. Sinh sản đơn tính đực hỗn hợp: Qua trình này diễn ra tương tự như sinh sản đơn tính đực gián tiếp, nhưng sự thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết như ở cây cà chua. + Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn: Bước 1: Chọn bao phấn. Giai đoạn phát triển của hạt phấn có vai trò quyết định trong việc tạo cây đơn bội, tốt nhất là hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào giảm nhiễm lần một. Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn. Bước 2: Xử lý nụ hoa. Xử lý nhiệt độ thấp cho nụ hoa sau khi cắt khỏi cây và trước khi tách bao phấn để cấy sẽ kích thích sự phân chia của tiểu bào tử để tạo cây đơn bội. Chế độ xử lý lạnh phụ thuộc vào loại cây. Ví dụ: lúa Japonica xử lý ở 100C trong 2-3 tuần; lúa Indica xử lý ở 70C trong 1 tuần; thuốc lá xử ý ở 2-3 ngày. Bước 3: Chọn môi trường thích hợp. Môi trường nuôi cấy thích hợp là điều vô cùng quan trọng. Với mỗi loại cây trồng khác nhau thì lại có môi trường thích hợp khác nhau. Chẳng hạn, với họ hòa thảo cần nhiều auxin, đặc biệt 2,4 D ở nồng độ cao để khởi động sự phân chia đầu tiên (lúc mì 10-5mol 2,4 D trong 12 ngày); Cây họ cà cần ít hơn, khoảng 10-6mol. Về hàm lượng đường cũng khác nhau, ở ngô là 60- 120g saccarose/l, lúa 50-60 g saccarose/l, cây họ cà 20-40g saccarose/l, v.v. Ngoài ra một số hỗn hợp tự nhiên như dịch chiết khoai tây, nước dừa tỏ ra có tác dụng tốt trong nuôi cấy bao phấn. Còn các nguyên tố đa lượng và vi lượng ít ảnh hưởng trong nuôi cấy bao phấn. Bước 4: Chọn lọc cây đơn bội. Không phải tất cả các cây tái sinh khi nuôi cấy bao phấn đều là cây đơn bội, vì vậy để xác định cây đơn bội có thể sử dụng một số phương pháp như đếm số lượng NST, đo gián tiếp hàm lượng ADN của tế bào, trồng cây tái sinh và so sánh với cây mẹ về hình thái, kích thước, khả năng sinh trưởng. + Kỹ thuật nuôi cây cấy hạt phấn: Các bước nuôi cấy hạt phấn tương tự như nuôi cấy bao phấn, tuy nhiên hạt phấn được rời khỏi bao phấn trước khi nuôi. Các hạt phấn này thước được nuôi cấy trong môi trường lỏng kèm theo chế độ lắc hay nuôi cấy trong môi trường bán lỏng. 16
18. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Sơ đồ tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn: Cây đơn bội Phôi hóa Tạo callus Cây đơn bội Nuôi cây bao phấn môi trường dinh dưỡng đặc hiệu - Tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh: Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi là sự sinh sản đơn tính cái hay trinh nữ sinh (gynogensis). Đã có nhiều thành công trong việc nuôi cây bao phấn và hạt phấn để tạo cây đơn bội. Tuy nhiên, khi đi sâu vào nghiên cứu và thực hiện người ta thấy rằng, nuôi cấy bằng bao phấn và hạt phấn đã bộc lộ nhiều nhược điểm như tỷ lệ bạch tạng là rất cao. Đặc biệt với các loại cây như hành, củ cải đường, hướng dương, v.v. đã không cho kết quả như mong muốn. Trên cơ sở đó, vòa những năm 70 các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu giải quyết cây đơn bội bằng nuôi cấy noãn chưa thụ tinh và đã thu được nhiều thành tựu. Tỷ lệ tạo cây đơn bội bằng trinh nữ sinh biến động ở các loại cây khác nhau. Đối với hành, củ cải đường tỷ lệ này là 5-20%; ở lúa là 1,5-12%; ở dâu tằm là 3-6%, Tuy nhiên kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách tế bào trứng rất khó và dễ gây thương tổn. Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này, người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy, 17
19. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Trong các cây ngũ cốc, ở cây ngô việc nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tương đối đơn giản và thu được nhiều thành công hơn cả. 18
20. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 6. Kỹ thuật tách, nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast) o 0 a. Khái niệm tế bào trần Tế bào trần (protoplast) là tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào chỉ còn phần nguyên sinh chất, nhân, các cơ quan tử khác và màng sinh chất là ranh giới phân biệt bên trong và bên ngoài tế bào trần. b. Phương pháp tách tế bào trần * Nguyên tắc: - Sử dụng hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza để phân giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần. - Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào được tách ra, tế bào trần phải được phóng thích vào môi trường có áp suất thẩm thấu cao để tránh nước xâm nhập vào không bào, gây vỡ tế bào chất bằng việc bổ sung các chất gây áp suất thẩm thấu như saccarose, manitol, sorbitol, Ca2+ - Nồng độ chất áp suất thẩm thấu và thời gian lưu giữ tối đa thay đổi cho phù hợp với từng loại cây trồng. Đây là phương pháp dùng phổ biến và có hiệu quả cao: Có thể thu được từ 1g lá tươi có thể thu được 6÷12 triệu tế bào trần. * Các bước tiến hành - Chọn nguyên liệu: ex ivtro: mô lá non (cần phải khử trùng), in vitro: lá, mô sẹo, tế bào huyền phù. - Xử lý gây co nguyên sinh chất (CaCl2, đường monitol 0,5÷0,7M) - Xử lý hỗn hợp enzym cellulolaza và hemicellulolaza, pectinaza - Tách và làm sạch protoplast: lọc, ly tâm. - Kiểm tra khả năng sống (fluorescein diacetate) và tạo huyền phù protoplast có mật độ phù hợp (104 ÷107/ml) Ví dụ về kỹ thuật tách tế bào trần + Ở cây thuốc lá Nguyên liệu thực vật: lá thứ 3 từ trên xuống. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 1% macerozyme 0,02% driselaza0,05% Thời gian ủ: 16h (ngâm qua đêm) + Ở cây ngô Nguyên liệu thực vật: tế bào hạt phấn. Hỗn hợp enzym: cellulolaza 2% macerozyme 0,1% pectolyaza 0,05% 19
21. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Thời gian ủ: 4÷12h (ngâm qua đêm) Các tế bào trần sau khi tách thành tế bào được lọc qua rây có kích thước 50÷80μm, rồi rửa bằng dung dịchkhông có enzym bằng ly tâm. c. Quá trình tái sinh của tế bào trần và các yếu tố ảnh hưởng * Quá trình tái sinh: - Nuôi cấy protoplast: thường chia 2 giai đoạn 20
22. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp + Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia tạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng. Môi trương cần giàu dinh dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ dưỡng. + Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc. Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus. - Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast: + Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bào protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá. + Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụ các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù một số loài cây thuộc họ hoà thảo. Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ hình thành sau khoảng 3÷5 tuần. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n. 21
23. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Protoplast TÕ bµo Embryogenes M« / khèi m« Organogenesi H×nh thµnh cÊu tróc ph«i Ph¸t sinh chåi / rÔ C©y hoµn chØnh Protoplast tái sinh vỏ tế bào Callus phát triển từ microcallus và phân chia tạo microcallus Callus trên môi trường tái sinh 22
24. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp * Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần - Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu một số thay đổi so với quy trình nuôi cấy mô bình thường như: sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để kích thích sự phân chia tế bào. + Ammonium nitrate, Calcium: kích thích sự phân chia tế bào. + Bổ sung các thành phần hữu cơ: insitol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamin, glycine, fonic acid và biotin. + Casein hydrolysate, D-Ca- pantothenate, choline chloride, cysteine, malic acid, ascorbic acid, adenine sulfate, riboflavin và glutamine: có tác dụng tăng nhanh sự tổng hợp vỏ tế bào và kích thích sự phân chia tế bào. + Auxin (NAA và 2,4D 0,45÷10,7μM) và Cytokinin (BA, zeatin 2÷5μM; nước dừa 20÷40ml/l. + Đường manitol, sorbitol 0,3÷0,7M; Sucrose và glucose 0,2÷0,6M. - Điều kiện nuôi cấy + Cường độ chiếu sáng: nuôi cấy protoplast trong tối hoặc trong điều kiện ánh sáng đã lọc bớt. + Chất lượng ánh sáng: ánh sáng trắng là tốt nhất, ánh sáng xanh và đỏ gây ức chế sự hình thành chồi. + Nhiệt độ: các protoplast thường được nuôi cấy ở 20÷250C. * Dung hợp protoplast: có 2 phương pháp - Dung hợp bằng hoá chất + Năm 1972, Calson tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào protoplast dung hợp trong môi trường bổ sung NaNO3. + Năm 1974, Melchers phát hiện ra môi trường dung hợp tế bào trần gồm 50mM Ca2+, 0,4M manitol, pH 10,5 tỏ ra thích hợp cho dung hợp tế bào trần nhiều loài cây trồng khác nhau. + Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylenglycol) có tác dụng làm tăng hiệu quả dung hợp của protoplast. Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20÷40% w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịch Ca2+ có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast sẽ dung hợp với nhau. Do PEG độc với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi và bổ sung thêm vào đó DMSO (dimethyl sulfuside). - Dung hợp bằng xung điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần vào một điện trường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực. Khi có một xung điện cao (750÷1000V) trong một thời gian rất ngắn (1÷200 mili giây) vùng tiếp xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trình dung hợp sẽ xảy ra. 23
25. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Xung điện Hình ảnh dung hợp tế bào trần nhờ xung điện ở cây yến mạch d. Ứng dụng của protoplast * Dung hợp protoplast - Khi các tế bào trần dung hợp với nhau và tạo thành một tế bào lai mang trong mình vật chất di truyền tất cả các bố mẹ. Các tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào soma nên gọi là lai soma. - Chọn lọc các thể lai soma + Do lai ngẫu nhiên nên có thể A+B→AB A+A→AA B+B→BB + Các cách chọn lọc thể lai vô tính • Phương pháp tế bào học • Phân tích isoenzym • Lai ADN, PCR • Trồng cây tái sinh và đánh giá các đặc điểm nông sinh học * Chọn dòng tế bào - Xử lý đột biến tế bào trần rồi đưa chúng vào tình trạng stress để thanh lọc nhằm chọn ra các dòng có tính chống chịu với điều kiện bất thuận. Các tế bào sống sót 24
26. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp trong các test thanh lọc sẽ được tái sinh thành cây để khảo sát tính chống chịu của chúng. - Một số hệ thống chọn lọc: + Chọn lọc dòng tế bào kháng kháng sinh, các dòng tế bào kháng sâu bệnh, chịu thuốc trừ cỏ, chịu điều kiện bất thuận, và các dòng tế bào có khả năng sinh trưởng trên các amono acid đặc thù trong số những acid amin khác. + Chọn các dòng tế bào có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp. * Biến nạp di truyền - Nhận biết gen thông qua chức năng sinh học ( tính trạng liên quan đến đặc điểm hình thái, đặc điểm chức năng ). Xác định điều kiện đặc trưng cho quá trình biểu hiện và kìm hãm gen. - Gen gắn với các vectơ: thông thường người ta sử dụng các loại plasmid mang gen kháng sinh để tiện lợi cho việc chọn lọc sản phẩm biến nạp sau này. - Chuyển gen vào protoplast: có nhiều phương pháp chuyển gen bằng hoá học, xung điện, súng bắn gen, thông qua vi khuẩn Agrobacterium. - Chọn lọc sản phẩm biến nạp. - Đánh giá kết quả và theo dõi biểu hiện của gen biến nạp. Protoplast ngay sau khi tách Tế bào giống ,loài B Tế bào giống, loài A Tế bào lai soma mang đặc của cả hai giống, loài A và B 25
27. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Câu 7. Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro o 0 o a. Mục đích của bảo quản nguồn gen in vitro Mục đích cơ bản của việc bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lý cho hiện tại và trong tương lai. b. Các phương pháp bảo quản nguồn gen truyền thống Có 2 phương thức bảo quản nguồn gen cây trồng - Bảo quản Insitu là bảo quản tại chỗ, cây được duy trì tại điều kiện sinh thái tự nhiên của chúng. - Bảo quản Ex-situ là bảo quản các mẫu trong điều kiện nhân tạo tối ưu. Bảo quản ex xitu đóng vai trò quan trọng trong xây dựng các ngân hàng gen và được sử dụng rộng rãi cho bất kì loại cây trồng nào. Những hình thức bảo quản ex xitu khác nhau + Bảo quản cây trong vườn ươm tạo thành field bank. + Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed bank. + Bảo quản in vitro tạo thành in vitro bank. + Bảo quản ADN tạo thành DNA bank. Trong bốn phương thức trên, phương thức bảo quản in vitro có vai trò quan trọng vì bảo quản trong một không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ một số lượng lớn cá thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với các cây trồng nhân vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp. c. Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro Có hai phương pháp bảo quản in vitro: bảo quản sinh trưởng tối thiểu và bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời - Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu. + Nguyên lý: mẫu được bảo quản trong điều kiện bảo quản sao cho tốc độ sinh trưởng của mẫu giảm tới mức tối thiểu. + Đặc điểm: • Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ ức chế sinh trưởng của mẫu cấy để giảm tới mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản. • Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh trưởng nhưng với tốc độ rất chậm. • Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo dài một vài năm. + Đối tượng: phương pháp này thường áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn các cây nhân giống in vitro (chuối, dứa, khoai tây, khoai lang ). Mẫu đưa vào bảo quản thường ở các dạng phôi, chồi, mầm, cây con. + Các bước tiến hành: • Chuẩn bị mẫu: mẫu phải đảm bảo sạch bệnh. 26
28. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp • Đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy có bổ sung các nhân tố nhằm ức chế sinh trưởng. Các nhân tố gây ức chế sinh trưởng thường dùng là: Giảm nhiệt độ của phòng nuôi. Với loài cây chịu lạnh nhiệt độ bảo quản từ 0÷50C. Ví dụ: chồi cây thông và cây táo giữ được 52 tuần ở 20C, khoai tây bảo quản ở 6÷120C có thời gian cấy chuyển là 25÷52 tuần. Những loài cay nhiệt đới thường bảo quản ở nhiệt độ cao hơn. Ví dụ: chuối giữ được 15 tháng ở 150C, cọ dầu bảo quản ở 180C. Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy ABA (axit abcisic), CCC (Clo Cholin Clorit). Chất gây áp suất thẩm thấu: manitol, sorbitol, saccarose. Thay đổi điều kiện nuôi cấy: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi Ví dụ: nuôi cấy khoai tây ở 220C và môio trường có 5÷10mg/l ABA thì thời gian cấy chuyển kéo dài tới 12 tháng; cây sắn nuôi cấy ở 200C trong môi trường có 4% saccarose có thể kéo dài thời gian cấy chuyển tới 15 tháng. • Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu bảo quản cần được chuyển sang môi trường mới pha chế và đặt trong điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mới. Ví dụ: bảo quản sinh trưởng chậm cây khoai tây Thời gian chuẩn bị mẫu: 8 tuần. Thời gian bảo quản: 2 năm. Nhiệt độ: 100C. Thời gian chiếu sáng:16h. Cường độ chiếu sáng: 1500lux. Độ ẩm: 60÷70%. - Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời + Nguyên lý: bảo quản mẫu bằng cách làm mẫu ngừng sinh trưởng tạm thời. + Đặc điểm: • Đặc điểm của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nitơ lỏng, và trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng. • Có thể bảo quản mẫu được 20÷30 năm hoặc lâu hơn.Trước khi đưa vào bảo quản mẫu cần được xử lý để tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu. + Đối tượng: mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi cấy + Các bước tiến hành: • Nuôi cấy in vitro và tách mẫu ở pha tăng trưởng mạnh để đưa vào bảo quản. • Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy: mẫu được xử lý bằng dung dịch 5÷10% prolin, manitol 3÷6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO 1M+ glycerol 1M+ đường saccarose 2M • Xử lý lạnh đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chất (-30÷-400C) • Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -1960C (trong nitơ lỏng). 27
29. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Mẫu sau thời gian bảo quản khi lấy ra được phá băng ở nhiệt độ 37÷400C. Mẫu sẽ được phục hồi sinh trưởng và có thể tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh. 28
30. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 8. Vì sao có thể chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? o 0 o Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Trong thập niên của những năm 1880 mở ra kỷ nguyên của cây trồng chuyển gen khi con người đã phát hiện ra khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất, trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính mong muốn. Đây là phương pháp chủ yếu và thành công nhất trong chuyển gen thực vật: Đậu tương ; cà chua; khoai tây; bông . Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u vết thương của A.tumefaciens. Khi cây bị thương, vi khuẩn này đã nhập vào chỗ bị thương và gây u. Tiến hành phân tích thành phần các chất trong khối u thì thấy có nhiều hợp chất lạ. Phân tích hoá sinh các hợp chất lạ thì phát hiện ra đó là các phức hợp axit amin arginin-xetoaxit, những hợp chất đó không có ở thực vật, vi khuẩn đã sử dụng những hợp chất đó trong quá trình đồng hoá. Như vậy vi khuẩn đã chuyển vào trong tế bào thực vật tác nhân gây u và những tác nhân đó tổng hợp lên những hợp chất mới. Nhờ những thành tựu của kỹ thuật ADN tái tổ hợp, những phương pháp nghiên cứu mới về ADN, người ta đã làm sang tỏ cơ chế gây bệnh của vi sinh vật đất. Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng rãi là nhờ những ưu điểm sau: 1. Không đòi hỏi dụng cụ đặc biệt 2. Số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu 3. Dễ thao tác invitro, dễ làm 4. Đây là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp 29
31. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp 1. Hoạt động của Agrobacterium tumefaciens Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí tổn thương trên cây hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó. Những chất được tổng hợp và bài tiết ra từ tế bào khối u, được vi khuẩn sử dụng làm nguồn cácbon và nitơ duy trì sự tồn tại và phát triển của chúng. Bệnh khối u do vi khuẩn A.tumefaciens gây ra được phát hiện cách đây khoảng một thế kỷ và suốt thời gian dài, nhiều nghiên cứu tập trung khám phá nhằm tìm ra cơ chế gây “ung thư” của chúng với mục đích dựa vào đó có thể tìm ra những phương sách chữa bệnh ung thư ở người cũng như ở động vật. Những ý tưởng đó đã bất thành và một loạt các nghiên cứu cũng bị dừng lại khi cơ chế gây khối u ở thực vật được khám phá chính là kết quả của quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào thực vật. Tuy nhiên, sự khám phá và hiểu biết về cơ chế gây khối u đó đã mở ra một hướng chuyển gen mới mà ở đó con người đã lợi dụng vi khuẩn để chuyển những gen mong muốn vào thực vật. Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành các chất độc có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon). Chất này có tác dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật. Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u. Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng gen ipt kích thích cho sự hình thành xytokinin. Tỷ lệ auxin/xytokinin kích thích sự hình thành callus tạo lên các khối u. 2. Đặc diểm cấu trúc của Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium gồm các loài chính sau: A. tumefaciens gây bệnh u sùi thân. A. rhisogenes gây bệnh tóc rễ. A. rubi gây u ở các loại dâu đất, mâm sôi. 30
32. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp A. radiobacter sản sinh kháng sinh đặc trưng (agrocin 84) ngăn cản tác hại của các loài Agrobacterium kể trên. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u rất lớn hình thành trên thân cây hoa Hồng, B: một dãy khối u nằm trên nhánh của cây Nho Trong đó nhóm A. tumefaciens được sử dụng nhiều nhất cho việc chuyển gen. Từ lâu người ta đã phát hiện hiện tượng hình thành các u ở thân khi cây bị nhiễm vi sinh vật đất A. tumefaciens qua các vết thương. Phân tích các u cho thấy trong u có sự hình thành một số vật chất mới như: nopaline, octoine gọi chung là opine. Các chất này không tồn tại ở các cây bình thường khác. 31
33. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Điều đặc biệt là khối u không ngừng tăng trưởng kể cả khi đã diệt vi khuẩn. Điều này cho phép kết luận: vi khuẩn đã chuyển vào cây tác nhân gây khối u dưới dạng vật chất di truyền. Khi xem xét các vi khuẩn A. tumefaciens chúng cũng giống các loại vi khuẩn thông thường khác là đều chứa các plasmid (một dạng DNA vòng nằm ngoài nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng nhân bản độc lập). Nhưng plasmid của A. tumefaciens có kích thước rất lớn. Các thực nghiệm cho thấy, khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn A. tumefaciens không mang plasmid thì không gây bệnh u và u chỉ xuất hiện khi xử lý vết thương bằng vi khuẩn có mang plasmid. Như vậy, plasmid của A. tumefaciens chính là tác nhân gây bệnh. Chắc chắn plasmid này đã chuyển vào tế bào thực vật các vật chất di truyền gây bệnh u cho cây, do vậy người ta gọi chúng là Ti-plasmid (Tumor inducing plasmid). Ti-plasmid đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid nhập vào gen của cây. Ti-plasmid là một plasmid lớn với kích thước khoảng 200kb. Trên Ti-plasmid có đoạn T-DNA (tumor DNA) được giới hạn bằng bờ phải (right border) và bờ trái (left border). Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tương tự nhau. T-DNA là một đoạn có kích thước 25kb chứa các gen tổng hợp opine và đoạn này sẽ 32
34. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp được chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ nhiễm sắc thể của tế bào cây chủ và gây ra bệnh u. Ngoài T-DNA, trên Ti-plasmid còn có vùng vir (vir region) chịu trách nhiệm hoạt động lây nhiễm, chuyển nạp (conjugative transfer) và tiêu hóa opine (opine catabolism). Quá trình chuyển nạp gen của vi khuẩn như sau: khi cây bị thương tiết ra chất độc vết thương thường là các chất có bản chất phenol: acetosyringone (AS) và hydroxyacetosyringone (OH-AS). Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng vết thương đồng thời chúng cũng hoạt hóa các gen ở vùng vir của plasmid hoạt động. Gen của vùng vir có nhiều loại tạo E, D, C, G, B, A và tạo ra các protein enzym tương ứng. Các protein này có hai chức năng chính: cắt đứt bờ trái và bờ phải để giải phóng đoạn T-DNA; bao bọc và vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với bộ gen của cây chủ một cách an toàn. Như vậy, thực chất đã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn đất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên. acetosyingone 33
35. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Bộ gen của Ti Plasmid vi khuẩn Vi khuẩn đất A.tumefaciens T-DNA LB Bờ Btrờá i trái RB E Bờ phải D Các gen gây u và C tổng hợp opine G vir B Ti A Các gen gây đồng hoá ori Vùng tái bản Cấu trúc Ti-plasmid 34
36. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp 3. Đặc điểm cấu trúc của Ti-plasmid cải tiến Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn đất để chuyển các gen mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo được chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây độc cho cây. Người ta đã tạo ra các dạng vector mới để chuyển gen là những vector liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (Binary vector). a. Hệ thống vector đồng liên hợp Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmid: Ti-plasmid đã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải. Thay vào những gen bị cắt bỏ là đoạn tương đồng với một đoạn trên plasmid thứ hai (plasmid trung gian) để phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmid. Plasmid trung gian là một plasmid tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh được ở Agrobacterium. Plasmid này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt đoạn tương đồng. Khi cho tương tác hai loại plasmid này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao đổi chéo giữa hai đoạn tương đồng và hình thành nên vector liên hợp. Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A. tumefaciens và hoạt động theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn đất. Do tần số đưa plasmid trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-7-10-5) nên vector này ít được sử dụng (John Draper, 1882). b. Hệ thống vector kép Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector (plasmid) cùng có mặt và hoạt động trong Agrobacterium. Một plasmid tách dòng từ E.coli trong đó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển. Plasmid thứ hai là Ti-plasmid cải tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại vùng vir, 35
37. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp plasmid này được gọi là plasmid hỗ trợ. Hệ thống vector này cũng hoạt động theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn đất Agrobacterium một cách rất hữu hiệu. Cơ chế chuyển gen vào tế bào thực vật 4. Kỹ thuật đĩa lá (Leaf disk technique) Để thực hiện việc chuyển gen nhờ vi khuẩn người ta sử dụng kỹ thuật đĩa lá. Tạo các đĩa lá của thực vật cần chuyển gen sau đó xử lý các đĩa lá trong dung dịch vi khuẩn A.tumefaciens mang các plasmid chứa gen mong muốn đã được thiết kế lại trong vài chục phút, trong dung dịch có bổ sung acetosyringone để tăng cường khả năng hoạt hoá gen vùng vir qua đó thúc đẩy thêm quá trình chuyển gen. Sau giai đoạn này rửa sạch lá bằng dung dịch kháng sinh cefotaime để diệt hết khuẩn. Nuôi cấy đĩa lá trên môi trường tái sinh và tạo cây. Chọn lọc các cây mang gen chuyển vào qua sự phát hiện các gen bị chỉ thị. Phát hiện các gen chuyển vào qua phân tích ADN và đánh giá sự thể hiện của gen qua biotest. 36
38. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Quy trình chuyển gen vào thực vật bằng kỹ thuật đĩa lá nhờ vi khuẩn A.tumefaciens Quy trình chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefaciens 1- Thiết kế vector mang gen 2- Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli. 3- Chuyển vector mang gen biến nạp từ E.coli sang A.tumefaciens. 4- Lây nhiễm A.tumefaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực vật để tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào đích. 5- Chọn lọc các mô, tế bào được biến nạp thành công. 6- Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây biến nạp hoàn chỉnh. Sau đó, từ những cây chuyển gen thu được, cần đánh giá sự ổn định di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính để thu được con cái mang gen mong muốn. Đồng thời đánh giá tác động của môi trường đối với cây chuyển gen để đưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường. 37
39. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Các bước nuôi cấy và Chuyển gen nhờ và chọn lọc cây chuyển gen Agrobacterium 38
40. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 9: Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp o 0 o 1. Kỹ thuật biến nạp qua protoplast Phương pháp này ứng dụng tác động của sóng siêu âm để đưa các plasmid mang gen được thiết kế có thể xâm nhập vào tế bào chủ nhưng ở dạng tế bào trần. Nguyên tắc: Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm có hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi vào tế bào và thể hiện. Quy trình: 1. Tách protoplast từ mô thịt lá. Treo protoplast đã tinh sạch trong môi trường có chứa 21% sucrose, mật độ 106/ml. 2. Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập độ 3mm trong huyền phù protoplast và cho máy siêu âm phát với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn 110 millisecond. Năng lượng ra tương ứng với 15W và 0.32W/cm2 (acoustic power), 5- 10% năng lượng ra được chuyển qua nhiệt năng, làm cho huyền phù nóng thêm 2,3oC. Tổng thời gian tác động siêu âm từ 500-900 millisecond. 3. Protoplast được nuôi trên đĩa Petri trong môi trường thích hợp để xác định tỷ lệ chết do siêu âm phá vỡ màng. Ở điều kiện nói trên, khoảng 30-50% protoplast bị chết. Số protoplast còn lại tiếp tục phân chia và tái sinh. 4. Thử các phản ứng với gen chỉ thị (ví dụ GUS) hoặc đặt protoplast tái sinh trên môi trường chọn lọc (kanamycine) để xác định các protoplast đã được chuyển gen. 39
41. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Các bước: Tạo dung dịch tế bào huyền phù Tạo xung điện với hiệu điện thế cao Protoplast bị thủng một số chỗ ADN thâm nhập vào Nuôi cấy protoplast Tái sinh cây Chọn lọc cây chuyển gen 40
42. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp 2. Chuyển gen trực tiếp bằng phương pháp điện di Nguyên tắc: Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào mô thực vật bằng điện di do Ahokas(1989) đề xuất và Griesbach(1994) cải tiến. Mô thực vật, thường là đỉnh sinh trưởng, được đặt giữa 2 cực của một hệ điện di. DNA ngoại lai được hoà sẵn trong agarose, di chuyển theo điện trường xâm nhập vào mô thực vật(qua vách và màng tế bào) tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào, nhờ vậy gen ngoại lai được chuyển và biểu hiện. Cải tiến quan trọng của Griesbach là toàn bộ quá trình chuyển gen được thực hiện trong điều kiện vô trùng, hoàn toàn không cần thiết phải sử dụng các thao tác cấy mô tế bào thực vật. Quy trình: 1. Protocorm kích thước khoảng 2mm, chồi nách kích thước tương tự, phôi hạt hay phôi soma có thể dùng để chuyển gen. 2. DNA ngoại lai hoà trong 0.5%agarose, đệm 0.1 ×TAE. Nồng độ DNA là 1mg/ml. Khoảng 150ml hỗn hợp agarose – ADN đệm đã làm lỏng ở 100oC và để cho đóng rắn trong một ống micropipette. Ống này nối với cực âm của nguồn điện. Một ống micropipette tương tự được đổ 150µl hỗn hợp agarose - đệm, nhưng không chứa ADN và nối với cực dương của nguồn điện. Phần trống còn lại của hai ống được nạp gần đầy bằng đệm 0.1 × TAE. 3. Thời gian chuyển gen dưới 10 phút Cường độ dòng điện 0.5 milliampe – 1.0 milliampe cho đỉnh sinh trưởng hay 1 protocorm. 4. Rửa các cation tích luỹ với số lượng lớn ở đỉnh sinh trưởng hoặc protocorm bằng cách ngâm hoặc rửa một số lần trong nước cất sau khi kết thúc điện di. 5. Trường hợp protocorm và phôi soma cần giữ điều kiện vô trùng trong quá trình chuyển gen để sau đó tiếp tục nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, tái sinh cây hoàn chỉnh. Trường hợp đỉnh sinh trưởng cây đang trồng trong chậu: để đỉnh sinh trưởng lớn và theo dõi gen chuyển ở các lá hình thành sau đó hoặc các thế hệ sau. 3. Kỹ thuật sử dụng súng bắn gen Đây là phương pháp phổ biến được áp dụng thành công để chuyển gen trực tiếp vào thực vật. Nguyên tắc là phải tạo một luồng khí để đẩy các viên đạn có kích thước nhỏ mang các gen mong muốn( các viên đạn này thường được làm bằng Au hoặc volfram). Chúng có V= 1300m/s xuyên qua các lớp tế bào, mô để xâm nhập vào genom thực vật. Ưu điểm của phương pháp này là có thể chuyển gen vào nhiều đối tượng( tế bào, mô, mô sẹo), tần xuất thành công khá cao(ở cây 41
43. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp một lá mầm). Hơn nữa việc thiết kế vector khá đơn giản. Tuy nhiên khi tái sinh cây lại dễ bị thể khảm. Hiện nay người ta đã chế tạo ra nhiều loại súng bắn gen mới, hiện đại (Sautter, 1991; Finter ở đại học Ohio của Mỹ). Những năm gần đây, ở Việt Nam nhiều tác giả thuộc viện CNSH, viện di truyền, viện lúa đồng bằng sông Cửu Long cũng đã sử dụng súng bắn gen Corb – PIG vào mô sẹo các plasmid pMOW, PRQ6 mang gen kháng rầy, chống nấm bạc lá lúa thu được nhiều dòng lúa chuyển gen có nhiều đặc tính tốt. chuyển gen bằng sung bắn gen 4. Kỹ thuật chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Phương pháp này sử dụng vi tiêm nhỏ, kính hiển vi và các vi thao tác. Các vi tiêm đó đã chuyển vector mang gen vào protoplas hoặc các tế bào đơn (chưa hình thành vỏ cứng). Phương pháp này có ưu điểm là đưa được các gen chính xác vào tế bào song phương pháp này mới chỉ thành công ở động vật. 42
44. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp 5. Kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn (polen tuber) Phương pháp này còn được xem là phương pháp chuyển không qua nuôi cấy mô. Chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn được nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) báo cáo thành công trên cây lúa, tiếp theo các công trình sơ bộ với ADN tổng hợp của hai tác giả Trung Quốc Duan và Chen (1985). Đây là phương pháp lợi dụng ống phấn để chuyển vector mang gen đi cùng tế bào sinh dục đực( tinh tử) để kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang gen ngoại lai được chuyển vào. Sau đó, hợp tử sẽ phát triển thành hạt. Hạt nảy mầm và phát triển thành cây chuyển gen và được di truyền cho các thế hệ sau. Chuyển gen qua ống phấn tốt nhất thực hiện ngay sau khi quá trình thụ tinh xảy ra ở noãn, nhưng tế bào sinh dục cái chưa kịp phân chia. Nếu làm được như vậy sự chuyển gen sẽ được thực hiện đối với một tế bào sinh sản cái (trứng) duy nhất và sau khi tái sinh cây sẽ tránh xuất hiện thể khảm. Trong thí nghiệm của Ray Wu, tỷ lệ hạt chuyển gen/hạt thí nghiệm là 20%. Quy trình trên cây lúa: 1. Lúa trồng trong chậu với các điều kiện nước, phân, nhiệt độ, chiếu sáng thích hợp. Khi lúa trỗ, chọn các hoa có hai vỏ trấu mở hoàn toàn và đánh dấu để khỏi nhầm lẫn với các hoa khác. 2. Dùng một kéo sắc cắt bỏ 2/3 đến 3/4 phần trên của hoa. Vòi nhị cái như vậy cũng bị cắt ngắn. 3. Dùng một ống mao quản (đường kính trong 0.2mm) đặt vào chỗ cắt 2-3 µl dung dịch ADN nồng độ 50 µg/ml, trong đệm TE. 4. Bao bông lúa đã thành thục. Thường sau đó bảo quản ở 4oC. 5. Gieo hạt tạo cây và xác định sự có mặt của gen ngoại lai. Chú ý: Cần cắt hoa lúa sao cho không làm tổn thương bầu nhị, nhưng chỗ cắt trên vòi nhị cái phải tương đối gần với noãn để ADN có thể xâm nhập dễ dàng. Thời gian hoa nở đến lúc cắt phải đủ để hạt phấn mọc, phát triển qua vòi nhị và thụ tinh. Thường khoảng 1-2 giờ. Về nguyên tắc phương pháp này có thể áp dụng cho nhiều loại cây không chỉ ở lúa. Ở Việt Nam, phương pháp này đang được Viện nghiên cứu cây bông và Viện CNSH thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông. 43
45. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyên đề 10. Các hướng tạo cây chuyển gen o 0 o I/. Chuyển gen kháng sâu: Cơ chế chung là chuyển các đoạn gen có tác dụng diệt sâu (VD: gen nội độc tố Bt từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis); hoặc chuyển các gen tạo ra chất ức chế enzyme phân giải protein làm hạn chế khả năng tiêu hoá thức ăn sâu hại (VD: chất ức chế tripsin) 1. Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringiensis và cơ sở khoa học của việc chuyển gen kháng sâu vào cây trồng: Từ hơn 30 năm nay con người đã sử dụng vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm thuốc trừ sâu vi sinh. Vi khuẩn này sống trong đất và được tìm thấy ở hầu hết các nơi trên thế giới. Trong quá trình tạo bào tử, vi khuẩn này sản xuất ra các protein kết tinh (delta-endotoxin) rất độc với côn trùng nhưng không độc với động vật có xương sống. Tinh thể protein do vi khuẩn tạo ra sau khi xâm nhập vào côn trùng, trong điều kiện pH cao trong ruột giữa sẽ phân giải các tinh thể giải phóng các protein. Vào giai đoạn này protein chưa có hoạt tính độc, nhưng các protease đặc biệt trong dịch ruột phân huỷ protein chỉ còn lại bộ lõi kháng protease có khối lượng phân tử 68000 dalton chứa 1200 acid amin, bộ lõi này hoàn toàn có hoạt tính. Bộ lõi này kết hợp với chất nhận đặc thù ở tế bào biểu mô nằm dọc theo ruột giữa và tự lồng vào màng nguyên sinh của tế bào. Tích tụ các protein này làm cho tế bào bị rò rỉ chất dinh dưỡng và chết. Côn trùng ngừng ăn và chết đói trong vòng 24 tiếng đồng hồ. Vi khuẩn này có thể sản sinh ra 4 loại độc tố hại côn trùng khác nhau: ngoại độc tố ,,  toxin và nội độc tố  toxin. Trong đó, nội độc tố  toxin là quan trọng nhất. Từ năm 1987, các nhà nghiên cứu ở Bỉ đã tách được gen mã hoá protein này (Bt toxin). Các gen này thường định vị trên vi khuẩn plasmit của vi khuẩn và được gọi tên chung là gen ICP (insecticidal crystal protein). Do vi khuẩn Bacillus thuringiensis là vi khuẩn phức tạp có hơn 30 serotype nên chúng có chứa các gen ICP khác nhau và tạo nên những độc tố khác nhau. Người ta sử dụng chữ Cry (crystal) để biểu thị cho gen sản xuất toxin diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Người ta phân nhóm gen  endotoxin thành 6 nhóm chính, ký hiệu từ Cry I đến Cry VI. Trong mỗi nhóm phân thành các nhóm phụ ký hiệu từ A đến G. Mỗi nhóm gen có tác dụng diệt một nhóm côn trùng khác nhau. 44
46. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Cry I Diệt ấu trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera): sâu cuốn lá, sâu đo, sâu róm, sâu đục gân lá Cry II Diệt ấu trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) và bộ Hai cánh (Diptera): ruồi đục quả Cry II Gây độc cho ấu trùng bộ Cánh cứng (Coleoptera): câu cấu, xén tóc đục thân Cry IV Gây độc cho ấu trùng bộ Hai cánh (Diptera) Cry V Diệt ấu trùng bộ Cánh vảy (Lepidoptera) và bộ cánh cứng (Coleoptera) Cry VI Diệt tuyến trùng Các gen này được tách, xác định trình tự, tổng hợp, thiết kế vào các vectơ chuyển gen và chuyển vào nhiều loại cây trồng khác nhau, đặc biệt là bông, ngô, đậu tương, lúa tạo ra các giống cây trồng kháng sâu có ý nghĩa. Các nhà khoa học còn tiếp tục nghiên cứu, cải tiến các gen Cry để nâng cao độc tính của gen bằng cách tinh giảm đoạn gen chuyển vào, chỉ chuyển đoạn mã hoá cho protein gây độc và thay thế các codon cho phù hợp với quá trình phiên mã và dịch mã ở thực vật. Kết quả làm cho tính độc tăng lên nhiều lần. Gần đây người ta phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein – các protein sinh dưỡng diệt côn trùng). Các gen vip 1, vip 2, vip 3 mã hoá cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn Bt và Bc (Bacillus cereus) đã được chiết tách, nhân bản, xác định trình tự và thử hoạt tính sinh học. Kết quả cho thấy protein do gen vip mã hoá có hoạt lực và phổ tác dụng mạnh hơn các protein do gen Cry mã hoá. VD: gen vip 3 mã hoá cho protein vip 3 có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với gen Cry IA, có phổ hoạt động rộng diệt được cả sâu xanh hại ngô và sâu hại thuốc lá, Phối hợp chuyển đồng thời gen Cry và vip vào thực vật có khả năng làm tăng hoạt tính, tăng phổ hoạt động diệt sâu, đồng thời duy trì độ ổn định kháng sâu của cây qua nhiều thế hệ. Ngoài khuynh hướng kháng sâu bằng gen Cry, còn có hướng chuyển gen mã hoá cho các protein ức chế hoạt động của enzym protease làm hỏng quá trình tiêu hoá của côn trùng. Gen này được tách chiết từ cây khoai môn khổng lồ của vùng nhiệt đới, cây này tạo ra một lượng chất ức chế cao trong củ. Chất ức chế tinh khiết có tác dụng làm giảm khả năng sinh trưởng của sâu non do làm mất hoạt tính của protease nên sâu bị chết đói. Tương tự, gen mã hoá chất ức chế tripsin của đậu bò cũng được chuyển vào cây thuốc lá để phòng trừ sâu hại lá. 45
47. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp 2. Một số ví dụ cho cây trồng chuyển gen kháng sâu: a) Chuyển gen Bt vào lúa: Có khoảng 5% sản lượng hạt lúa bị thất thu do sâu đục thân [IRRI, 1996] ở châu Á. Trên phạm vi toàn cầu, sự thất thu năng suất lúa trung bình hàng năm là khoảng 10 triệu tấn do các loài sâu đục thân Scirpophaga incertulas, Chilo suppressalis và sâu cuốn lá Cnaphalocrocis medinalis [Herdt, 1991]. Cây lúa chuyển gen kháng sâu đầu tiên được công bố vào năm 1993 [Fujimoto và ctv.]. Sau đó, nhiều cấu trúc gen Bt với các loại promoter khác nhau đã được chuyển thành công vào một số giống lúa và đã có rất nhiều dòng lúa chuyển gen có khả năng kháng tốt đối với một số loài sâu hại, đặc biệt có một số dòng lúa kháng được đối với 8 loài sâu hại khác nhau thuộc 4 họ Pyralidae, Noctuidae, Stayridae, và Hesperiidae [Shu và ctv., 2000]. Theo ISAAA (2002), việc ứng dụng cây lúa Bt trong sản xuất nông nghiệp ở nước ta sẽ đem lại lợi ích nhiều trăm triệu USD trong thời gian 2000-2020. Cách thức tiến hành chuyển gen kháng sâu vào cây lúa như sau: người ta tách đoạn gen tạo ra toxin từ tế bào vi khuẩn. Các đoạn gen này được biến đổi một chút để sử dụng được trong cây, lồng vào ADN của plasmide và nhân lên nhiều bản ở E.coli, sau đó ADN được bọc lên viên đạn vàng. Phôi hạt lúa được tách ra từ hạt, đặt lên môi trường dinh dưỡng trong đĩa petri, rồi đặt trực tiếp vào đầu súng và bắn. Các phôi này nuôi cấy trong môi trường chọn lọc để chọn những phôi có gen Bt và chuyển sang môi trường tái sinh cây. b) Chuyển gen kháng sâu vào cây ăn quả (cây hồng): Quy trình chuyển gen lấy từ website Cây Hồng ( Paulownia fortunei ) là cây có tiềm năng kinh tế lớn, tăng trưởng rất nhanh, cây thay lá hàng năm và có bộ rễ đâm sâu.Tuy nhiên, ngoài dịch sâu hại chính do bọ cánh cứng, nhận thấy sâu hại thuộc bộ Cánh phấn cũng là vấn đề nhất là cây ở giai đoạn còn nhỏ do một số tác nhân như Agrotis ypsilon , Agrotis toxionis , Heliothis , Euxoa segetum Vì vậy các tác giả Lê Tấn Đức, Phan Tường Lộc, Phạm Thị Hạnh, Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và chuyển gen cry IA(c) kháng sâu với đối tượng cây trồng này. Chủng vi khuẩn sử dụng: Sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid ITB mang gen cryIA(c) (gen kháng sâu). Môi trường giữ giống là LB có kháng sinh Kanamycin 100 mg/l. Để nhân giống phục vụ nghiên cứu chuyển gen, vi khuẩn được nuôi cấy lắc qua đêm trong môi trường AB (Chilton và cộng sự, 1974)]. Quy trình chuyển gen: Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được lắc qua đêm để gây nhiễm mảnh lá, sau đó các mảnh lá được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi (môi trường MS có 0,1 mg/l NAA và 10 mg/l BA) có bổ sung chất Acetosyringone nồng độ 100 µM trong hai ngày. Sau đó rửa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh Cefotaxime 500 mg/l trong thời gian 30 phút, chuyển các 46
48. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp mảnh lá sang môi trường tái sinh tạo chồi có chứa 4 mg/l chất chọn lọc là Phosphinothricin (PPT) và 500 mg/l Cefotaxime. Cấy truyền 2 tuần/ lần trên cùng loại môi trường. Sau 6 tuần, mẫu lá có chồi tái sinh được cấy truyền sang môi trường cho ra rễ có chứa 4 mg/l PPT. Một số cây ra rễ tốt được đưa ra trồng ở vườn ươm. Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy tái sinh là môi trường MS (1962) chứa 30 g/l đường, 9 g/l Agar với chất kích thích sinh trưởng BA (1, 5, 10 mg/l) tổ hợp với NAA (0,1 - 0,5 - 1 mg/l). Mỗi bình tam giác chứa khoảng 6 - 8 mẫu và mỗi nghiệm thức có trung bình 30 mẫu. Các mẫu được đặt trong điều kiện 9 giờ chiếu sáng/ngày, nhiệt độ 27 - 28 C. Sau 3 tuần cấy truyền một lần. Một số thành tựu trong chuyển gen kháng sâu vào cây trồng: Cây trồng Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu hiện Chống côn trùng bộ Cà chua Bt Qua Agrobacterium Lepidoptera Chống sâu đục quả Bông Bt Qua Agrobacterium (Heliothis zea) Chống sâu đục thân ngô Ngô Bt Bắn gen vào phôi non châu Âu Xung điện nạp gen vào Chống sâu đục thân 5 Lúa Bt protoplast vạch, sâu cuốn lá p-lec (pea Chống sâu đục quả Thuốc lá Qua Agrobacterium lectin) Heliothis virescens Chống côn trùng cánh Thuốc lá CpTi Qua Agrobacterium vảy Lepidoptera II/. Chuyển gen kháng nấm bệnh và vius: 1. Chuyển gen kháng virus: Bệnh virus là bệnh gây hại cho cây trồng mà hiện nay vẫn chưa chữa trị được. Do đó, biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa bệnh virus là tạo ra loại cây trồng kháng được virus. Công nghệ chuyển gen là giải pháp hữu hiệu. a) Cơ chế chuyển gen kháng virus: Cơ chế chung là chuyển các đoạn gen có tác dụng cản trở sự truyền virus; hoặc cản trở sự nhân lên của virus trong tế bào; hoặc chống lại sự biểu hiện của bệnh. Hầu hết các gen được chuyển vào cây đều được phân lập từ virus. Có nhiều đường hướng tạo cây kháng virus bằng kỹ thuật chuyển gen: chuyển các đoạn mã hoá protein vỏ; chuyển gen tạo các ribozyme (enzym phân giải virus); chuyển các gen đối bản (antisens) với ARN của virus, các đối bản này sẽ khoá lại sự sao chép và phiên mã của ARN virus. Trong đó việc chuyển gen mã hoá protein vỏ virus là kỹ thuật phổ biến nhất (cơ chế bảo vệ chéo). Bằng kỹ thuật này người ta đã tạo được giống kháng được 36 loại virus đại diện cho 16 nhóm khác nhau (Larkin 1995). 47
49. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Chuyển gen mã hoá vỏ protein của virus: Virus có cấu tạo 2 phần, gồm lõi acidnucleic (ADN hoặc ARN) và vỏ protein. Khi có mặt gen mã hoá protein vỏ sẵn trong tế bào sẽ gây hiệu ứng ngăn chặn sự lột vỏ của virus khi xâm nhập tế bào chủ, kìm hãm sự nhân lên của virus. Dựa trên cơ chế này, người ta đã chuyển gen mã hoá vỏ protein của nhiều lại virus vào các đối tượng cây trồng khác nhau tạo nên các giống kháng virus như: đu đủ kháng bệnh đốm vòng PRSV, cây chống chịu virus khảm alfalfa (AMV), virus khảm dưa chuột (CMV), khoai tây kháng virus X, xoăn lá khoai tây, chuối kháng virus gây bệnh bó đọt Chiến lược tạo giống kháng virus thứ hai là sử dụng gen mã hoá replicase của virus. Replicase là một enzyme giúp virus tổng hợp acid nucleic trong tế bào vật chủ. Cây được chuyển gen chứa một đầu nhất định của gen replicase sẽ tổng hợp phân tử ARN nhỏ chứa một điểm nhận biết để liên kết với replicase. Do đó phân tử này cạnh tranh với ARN của virus trong quá trình liên kết với enzyme replicase. Nếu tế bào thực vật sao mã đủ loại ARN này thì có khả năng ức chế quá trình nhân của virus. Khả năng thứ ba là sử dụng các gen có trình tự ngược chiều (anti sense) với các gen nhất định của virus. Gen có trình tự ngược sao mã mARN có trình tự bổ sung với ARN của virus. ARN ngược chiều can thiệp trực tiếp vào sự biểu hiện gen của virus bằng cách kết hợp với ARN của virus tạo thành phân tử kép, ngăn cản quá trình dịch mã hay sự vận chuyển ARN từ nhân ra tế bào chất. b) Ví dụ: Những cây trồng chuyển gen kháng virus trồng diện tích lớn trên thế giới gồm thuốc lá, cà chua, bí đỏ và đu đủ (James và Krattiger, 1996; James, 1997) Một số thành tựu khác trong chuyển gen kháng virus: Cây Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu hiện trồng Cà chua CP-TMV Thông qua Agrobacterium Kháng virus khảm thuốc lá Lúa CP-stripe Xung điện protoplast Kháng lại virus sọc 2. Chuyển gen kháng nấm: 3. Chuyển gen kháng vi khuẩn: III/. Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ: Trong nền nông nghiệp hiện nay, việc sử dụng thuốc trừ cỏ đang trở nên phổ biến, thay thế cho các phương pháp làm cỏ truyền thống khác. Tuy nhiên chúng ta cũng phải đặt ra câu hỏi: “thuốc trừ cỏ tiêu diệt cỏ dại thì có tiêu diệt cả cây trồng hay không?” Để việc sử dụng thuốc trừ cỏ không làm ảnh hưởng đến cây trồng, chúng ta phải tạo ra các loại cây trồng có tính kháng thuốc trừ cỏ. Công nghệ chuyển 48
50. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp gen đã có thể làm được điều này. Chúng ta sẽ đưa các gen kháng được thuốc trừ cỏ vào bộ gen của cây trồng. 1. Cơ chế chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ: Trước hết, chúng ta phải hiểu cơ chế tác động của thuốc trừ cỏ. Thuốc trừ cỏ có thể kìm hãm sinh tổng hợp thực vật, kìm hãm sinh hô hấp, kìm hãm sự chuyển hoá acidnucleic, gây rối loạn phân chia tế bào, kìm hãm sinh tổng hợp lipid, kìm hãm sinh tổng hợp amino acid Cơ chế chung của việc chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ đó là chuyển vào cây trồng những gen có khả năng sản xuất dư thừa loại protein (enzyme) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ, bảo đảm đủ lượng cần thiết cho các chức năng của tế bào khi có mặt của thuốc; hoặc làm giảm khă năng liên kết của protein mẫn cảm với thuốc bằng cách thay đổi cấu trúc protein; hoặc trang bị cho cây khả năng làm mất hoạt tính chuyển hoá của thuốc trừ cỏ. Sản xuất dư thừa protein (enzyme) mẫn cảm với thuốc trừ cỏ đã được áp dụng với nhiều cây trồng để tăng tính kháng thuốc trừ cỏ, Ví dụ Phosphinothricin (tên thương phẩm là Basta) và bialaphos. Phosphinothricin ức chế enzyme tổng hợp glutamin (glutamin synthaza – GS). Ức chế GS gây ra sự tích luỹ amonia nhanh chóng trong cây làm cho cây chết. Tăng sự tổng hợp GS trong cây lên nhiều lần có thể khắc phục được tác động của thuốc trừ cỏ. De Block (1987) đề xuất một chiến lược liên quan tới một enzyme có khả năng khử độc của thuốc trừ cỏ Basta. Gen Bar phân lập từ Steptomyces hygroscopicus tham gia vào quá trình sinh tổng hợp bialaphos và mã hoá enzyme phosphinothricin axetyltranferase (PAT). Enzyme này axetyl hoá nhóm NH2 tự do của phosphinothricin và làm cho cây không bị ngộ độc. Đột biến của gen protein mục tiêu làm mất khả năng liên kết của thuốc trừ cỏ cũng tăng khả năng kháng hay chịu thuốc trừ cỏ, chẳng hạn như thuốc trừ cỏ glyphosate, atrazine và sulphonylurea. 2. Ví dụ: Một số cây trồng chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ được trồng trên quy mô lớn: đậu tương, ngô, bông, cải dầu, thuốc lá Một số thành tựu trong chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ: Cây Gen ngoại Phương pháp chuyển gen Tính trạng biểu hiện trồng Lúa Bar Chuyển qua protoplast Kháng thuốc trừ cỏ Basta trong môi trường đệm (phosphinothrricin) PEG Lúa Bar Bắn gen vào tế bào nuôi Kháng thuốc trừ cỏ Basta cấy dạng huyền phù (phosphinothrricin) Lúa mỳ Bar Bắn gen vào callus đang Kháng thuốc trừ cỏ Basta hình thành phôi. (phosphinothrricin) 49
51. LípC©ytrång49C-Nhãm4 C«ngnghÖsinhhäcn«ngnghiÖp Ví dụ về chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ Glyphosate và Glufosinate: Glyphosate và Glufosinate là những loại thuốc diệt cỏ kiểm soát hầu hết các loại cây xanh khác. Hai loại thuốc diệt cỏ này rất hữu hiệu trong việc kiểm soát có dại và ít ảnh hưởng trực tiếp lên vật nuôi cũng như không tồn tại lâu trong đất. Chúng có hiệu quả cao nhất và an toàn nhất trong số những hoá chất dùng trong nông nghiệp. Tuy nhiên chúng vẫn ảnh hưởng xấu tới cây trồng. Những loại thuốc diệt cỏ này nhắm vào một số enzyme chủ yếu trong quá trình trao đổi chất của cây trồng, phá vỡ quá trình sản xuất ra thức ăn cho cây và cuối cùng là tiêu diệt nó. Cây trồng kháng thuốc diệt cỏ Glyphosate: Cơ chế hại của thuốc là kìm hãm hoạt động của một enzyme enol pyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS), biến đổi sản phẩm quang hợp thành acid mạch vòng sikimic. Khi acid này không hình thành sẽ gây rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất ở thực vật, dẫn đến cây chết. Người ta tìm ra gen mã hoá EPSPS từ vi sinh vật hoặc từ một số thực vật có hoạt tính rất cao, sau đó cải biến chúng và chuyển nạp cho cây trồng. Kết quả tạo ra cây có hàm lượng hoạt tính của enzyme EPSPS cao hơn gấp 4 lần so với cây bình thường và hoàn toàn chống chịu được với thuốc Glyphosate. Ngoài ra, người ta còn có thể đưa vào cây trồng một gen của vi sinh vật khác tạo ra enzyme làm suy biến Glyphosate. Cây trồng kháng thuốc Glufosinate: Thuốc diệt cỏ Glufosinate chứa thành phần kích hoạt phosphinothrcin tiêu diệt thực vật bằng cách phong toả enzyme chịu trách nhiệm trong quá trình chuyển hoá nitơ và giải phóng chất độc amoniac, một dẫn xuất của quá trình chuyển hoá của thực vật. Cây trồng biến đổi gen chịu được Glufosinate có chứa một gen của vi khuẩn tạo ra loại enzyme giải phóng chất phosphinothrcin và ngăn chặn chúng không bị phá huỷ. 50