›

Giáo trình Một số vấn đề của sinh học phân tử

pdf 181 trang huongle 6520
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Một số vấn đề của sinh học phân tử", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_mot_so_van_de_cua_sinh_hoc_phan_tu.pdf

Nội dung text: Giáo trình Một số vấn đề của sinh học phân tử

  1. Một số vấn đề của sinh học phân tử Võ Thị Hương Lan NXB Đại học quốc gia Hà Nội 2007. 181 tr. Từ khoá: ADN, GEN, genome, nhiễm sắc thể, ty thể, lục tạp, geomic, ADN, tái tổ hợp, ngân hàng các ADNc, cDNA, ADN genome , phản ứng PCR, kỹ thuật gen, phương pháp lai, Protein, tổng hợp protein, vận chuyển protein, tín hiệu tế bào, truyền tín hiệu tế bào, Thụ thể tyrosine kinase, Protein G, sinh trưởng, phát triển, hệ gen lưỡng bội, phôi, chu trình tế vào, phân chia tế bào. Tài liệu trong Thư viện điện tử ĐH Khoa học Tự nhiên có thể được sử dụng cho mục đích học tập và nghiên cứu cá nhân. Nghiêm cấm mọi hình thức sao chép, in ấn phục vụ các mục đích khác nếu không được sự chấp thuận của nhà xuất bản và tác giả. Mục lục LỜI NÓI ĐẦU U 5 Chương 1 ADN VÀ GEN 6 1.1 Khái niệm về gen 6 1.2 Genome (hệ gen) 10 1.2.1. Genome của tế bào prokaryot (tế bào nhân sơ) 11 1.2.2. Genome của tế bào eukaryot (tế bào nhân thực) 13 1.3 Cấu trúc sợi nhiễm sắc trong tế bào eukaryot 14 1.3.1. Histone trong cấu trúc nucleosome 15 1.3.2. Methyl hoá ADN 17 1.4 Các gen trong genome eukaryot 18 1.4.1. Các gen trong cùng một họ gen 20 1.4.2. Gen lặp đi lặp lại liên tục 21 1.4.3. Pseudogen (gen giả) 23 1.5 Thành phần ADN lặp lại trong genome eukaryot 23 1.5.1. ADN vệ tinh (satelitte DNA) và ADN tiểu vệ tinh (minisatelitte DNA) 23 1.5.2. Các đoạn ADN có khả năng di chuyển 24 1.6 Tương tác của T-ADN với genome thực vật 29 1.7 ADN trong ty thể và lục lạp 32
  2. 1.7.1. ADN ty thể 32 1.7.2. ADN lục lạp 33 1.8 Genomics 33 1.8.1 So sánh genome 33 1.8.2 Genome người 34 1.8.3 Nghiên cứu Genomics ở thực vật 35 Chương 2 HOẠT ĐỘNG CỦA GEN TRONG TẾ BÀO 38 2.1 Kiểm soát hoạt động của gen khi phiên mã 41 2.1.1 Kiểm soát khởi đầu phiên mã 42 2.1.2 Kiểm soát kết thúc phiên mã 50 2.1.3 Các protein điều khiển (regulatory proteins) 51 2.2 Kiểm soát sau phiên mã 53 2.2.1 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR của phân tử ARNm 53 2.2.2 Độ dài của đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững của phân tử ARNm 54 2.2.3 Độ bền vững của ARNm 54 2.2.4 ARN anti-sense 55 2.2.5 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing" 56 2.3 Kiểm soát ở giai đoạn dịch mã và sau dịch mã 57 2.4 Biến đổi phân tử ARNm trong tế bào eukaryot 59 2.4.1 Phản ứng cắt intron và nối exon 60 2.4.2 Các intron có khả năng tự cắt ra khỏi phân tử ARNm-Phản ứng self-splicing 62 2.4.3 Phản ứng trans-splicing nối hai exon của hai phân tử ARNm 64 2.4.4 Cấu trúc chung của phân tử ARNm 64 Chương 3 KỸ THUẬT ADN TÁI TỔ HỢP 66 3.1 Phân cắt, phân ly ADN 66 3.2 Đưa các đoạn ADN vào vector 67 3.2.1 Các vector sử dụng trong kỹ thuật tách dòng 68 3.2.2 Đưa ADN vào vector 70 3.3 Ngân hàng ADN 72 3.3.1 Ngân hàng các ADNc (cDNA library) 72 3.3.2 Ngân hàng ADN genome (genomic DNA library) 74 3.4 Sàng lọc một dòng từ ngân hàng ADN 76 3.4.1 Phương pháp sàng lọc chung 76 3.4.2 Phương pháp sàng lọc phân biệt "differential screening" 77 3.4.3 Phương pháp đi dọc nhiễm sắc thể “chromosome walking” 78 3.4.4 Nhảy bước trên nhiễm sắc thể “jumping on chromosome” 80 3.5 Các phương pháp lai 80 3.5.1 Phương pháp Southern blots 81 3.5.2 Phương pháp northern blots 82 3.5.3 Kỹ thuật lai in-situ 82 3.5.4 Điều kiện phản ứng lai 82 3.6 RFLP trong nghiên cứu genome và lập bản đồ gen 83 3.7 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 86 3.7.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 87 3.7.2 Một số dạng của phản ứng PCR 88 3.8 Kỹ thuật gen 89 3.8.1 Nghiên cứu vai trò của ADN điều khiển, chức năng của gen hoặc protein 89 3.8.2 Thay thế hoặc gây đột biến gen 92 3.8.3 Gây mất hoặc tăng cường chức năng của gen 93 3.8.4 Gen báo cáo “reporter gene” 96 3.8.5 Biến đổi genome thực vật 96
  3. Chương 4 TỔNG HỢP VÀ VẬN CHUYỂN PROTEIN 98 4.1 Vai trò của ARN vận chuyển (ARNt) trong tổng hợp protein 98 4.2 Tổng hợp protein ở bộ máy Ribosome 100 4.3 Vận chuyển protein 102 4.3.1 Vận chuyển vào mạng lưới nội chất 103 4.3.2 Vận chuyển protein cấu trúc màng (membrane proteins) 105 4.4 Biến đổi sau dịch mã và kiểm tra chất lượng protein trong khoang ER 108 4.4.1 Tạo cầu liên kết disulfide (S-S) và cuộn gấp trong khoang ER 108 4.4.2 Hình thành cấu trúc multimer từ các chuỗi peptide 109 4.4.3 Quá trình đường hoá protein 109 4.5 Vận chuyển từ mạng lưới nội chất đến Golgi và Lysosome 110 4.6 Vận chuyển từ Golgi đến bề mặt tế bào: Con đường tiết ngoại bào (exocytosis) 110 Chương 5 TRUYỀN TÍN HIỆU TẾ BÀO 112 5.1 Thụ thể trên bề mặt tế bào 114 5.2 Thụ thể nối với protein G 117 5.2.1 Protein G 117 5.2.2 Hoạt hoá hoặc ức chế cAMPase thông qua protein G 119 5.3 Protein kinase phụ thuộc cAMP (cAPK hoặc kinase A) 121 5.4 Thụ thể tyrosine kinase và các protein Ras 124 5.4.1 Thụ thể tyrosine kinase (RTKs) 124 5.4.2 Protein Ras và chuỗi các phản ứng truyền tín hiệu hoạt hoá bởi thụ thể tyrosine kinase 127 5.5 Tín hiệu thứ cấp Ca+2 trong chuỗi truyền tín hiệu 129 5.5.1 Inositol phospholipid 130 5.5.2 Inositol triphosphate (IP3) và sự vận chuyển Ca+2 ra khỏi ER 130 5.5.3 Calmodulin- protein tạo phức với Ca+2 ở trong tế bào 132 5.6 Khuếch đại các tín hiệu bên ngoài tế bào 133 5.7 Truyền tín hiệu qua các thụ thể nối với enzym trên bề mặt tế bào 135 5.7.1 Thụ thể guanylyl cyclase 135 5.7.2 Các oncogene và tín hiệu dẫn truyền từ thụ thể tyrosine kinase 136 5.7.3 Protein MAP kinase 136 5.8 Tyrosine kinase phối hợp với thụ thể. Thụ thể Tyrosine phosphatase 137 Chương 6 CHU TRÌNH VÀ PHÂN CHIA TẾ BÀO 139 6.1 Những đặc tính cơ bản của chu trình tế bào 139 6.2 Chu trình tế bào ở giai đoạn phát triển phôi sớm 143 6.3 Protein cyclin 145 6.4 Nấm men và hệ thống kiểm soát chu trình tế bào 147 6.5 Kiểm soát phân bào ở động vật 150 6.6 Vai trò của sợi vi ống tubulin trong phân bào 152 Chương 7 SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN 154 7.1 Kiểm soát xác định giới tính 155 7.2 Phát triển ở ruồi giấm Drosophila 158 7.3 Hoạt động của các gen có nguồn gốc từ mẹ trong quá trình hình thành trục đầu-đuôi và trục lưng-bụng 159 7.3.1. Nhóm gen quyết định phát triển của phần đầu và ngực ấu thể (anterior-group genes) . 160 7.3.2. Nhóm gen qui định phát triển phần đuôi (posterior-group genes) 162 7.3.3. Nhóm gen qui định phát triển trục lưng-bụng (dorsoventral-group genes) 162 7.3.4. Nhóm gen qui định phát triển các cấu trúc tận cùng của ấu thể (terminal-group genes)164
  4. 7.4 Hoạt động của các gen trong hệ gen lưỡng bội (phôi) 164 7.3.5. Các gen tạo đốt "gap" 166 7.3.6. Các gen cặp đốt "pair-rule" 166 7.3.7. Các gen phân cực đốt 167 7.5 Các gen chọn lọc 167
  5. 5 Lời nói đầu Với mong muốn chia sẻ cùng bạn đọc mối quan tâm về Sinh học phân tử, một lĩnh vực đang được học tập và nghiên cứu ở Việt Nam, chúng tôi xuất bản cuốn sách "Một số vấn đề cơ bản của Sinh học phân tử" nhằm giới thiệu những quá trình quan trọng xảy ra trong tế bào (trình bày trong chương 1, 2, 4, 5, 6 và chương 7) và một số kỹ thuật cơ bản được sử dụng để nghiên cứu những quá trình đó (chương 3). Những quá trình này được nghiên cứu ở mức độ phân tử phần nào làm sáng tỏ sự giống và khác nhau trong cấu trúc của genome, cấu trúc của một gen giữa tế bào prokaryot và eukaryot (chương 1). Những cấu trúc đó liên quan đến các cách thức kiểm soát hoạt động của các gen ở giai đoạn phiên mã, sau phiên mã và dịch mã để tổng hợp protein (chương 2). Quá trình tổng hợp protein, những biến đổi cấu trúc protein và những cách thức để nhận biết và vận chuyển protein đặc hiệu đến những vị trí đích khác nhau trong tế bào hoặc tiết ra bên ngoài được giới thiệu trong chương 4. Ngoài ra, chức năng và hoạt tính của những protein tham gia quá trình truyền tín hiệu được trình bày trong chương 5; của protein tham gia chu trình tế bào được trình bày trong chương 6 và những protein tham gia kiểm soát biệt hoá, phát triển, sinh trưởng và hình thành cơ thể được giới thiệu trong chương 7. Để có thể học được những kiến thức chuyên sâu trong lĩnh vực sinh học phân tử, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, các cô trong Khoa Sinh học Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay là Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội). Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn Phó Giáo sư Trương Nam Hải và Giáo sư Nguyễn Mộng Hùng đã có những nhận xét và góp ý quý báu cho cuốn sách. Lần đầu xuất bản, chắc chắn cuốn sách còn có những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự phê bình, góp ý của bạn đọc và đồng nghiệp. Với sự cảm ơn chân thành! Tác giả
  6. 6 Chương 1 ADN VÀ GEN 1.1 Khái niệm về gen Trải qua một thời gian dài, các khái niệm và định nghĩa về gen dần dần được hình thành dựa vào kết quả thí nghiệm, trước hết là các thí nghiệm di truyền cổ điển. Đầu tiên, từ phép lai giữa các cây đậu có những tính trạng khác nhau và theo dõi sự di truyền của chúng, Menden đã đưa ra kết luận mỗi tính trạng được quyết định bởi các allen của một gen. Một gen có thể có nhiều allen. Mức độ biểu hiện của tính trạng phụ thuộc vào sự kết hợp giữa hai allen. Đơn giản nhất là một gen có 2 allen (Aa). Khi đó tính trạng có thể biểu hiện ở 3 mức độ khác nhau: trội (AA), bán trội (Aa), hoặc lặn (aa). Tiếp theo đó, với một loạt các thí nghiệm tiến hành trên ruồi giấm Drosophila, Morgan và cộng sự đã nhận thấy một số tính trạng được quyết định không phải do các alen của một gen mà do nhiều gen. Điều quan trọng hơn nữa, dựa vào tần số trao đổi chéo giữa hai nhiễm sắc thể tương đồng trong quá trình phân bào giảm nhiễm (meiosis), Morgan có thể lập được bản đồ di truyền (genetic map) cho phép xác định vị trí của gen trên nhiễm sắc thể. Hai gen càng gần nhau thì tần số trao đổi chéo giữa chúng càng nhỏ. Trên thực tế, bản đồ di truyền cho biết vị trí của những gen liên quan đến các tính trạng hoặc các đột biến mà khoảng cách giữa chúng được tính bằng tần số trao đổi chéo (cM). Tuy nhiên, trao đổi chéo không xảy ra như nhau ở mọi vị trí trên sợi nhiễm sắc thể khiến cho khoảng cách giữa các vị trí trên bản đồ di truyền không phải lúc nào cũng tỷ lệ với tần số trao đổi chéo. Trước năm 1940, vị trí các gen trên nhiễm sắc thể được xem như các hạt cườm trong một chuỗi. Trao đổi chéo được xem là chỉ xảy ra giữa các gen mà không thể xảy ra trong một gen. Vì vậy, từ kết quả thí nghiệm, các nhà di truyền đã đưa ra 3 đặc tính để xác định một gen: 1. Gen qui định một tính trạng có thể quan sát được và chiếm một vị trí trên nhiễm sắc thể. 2. Gen được xem là đơn vị di truyền nhỏ nhất có thể bị đột biến. 3. Gen được xem là đơn vị di truyền nhỏ nhất mà trao đổi chéo không thể xảy ra trong một gen. Trao đổi chéo được thực hiện giữa các gen tương đồng. Từ những đặc tính này, rõ ràng hai tính trạng không giống nhau có thể phân biệt được thì phải do ít nhất hai gen khác nhau qui định. Rõ ràng, khái niệm về gen ban đầu này chỉ cho phép xác định mối tương quan theo kiểu một đột biến - một tính trạng - một gen. Trong thực tế, việc xác định tần số trao đổi chéo để tìm ra vị trí một gen gặp rất nhiều khó khăn do phải sàng lọc các cá thể đột biến từ số lượng cá thể rất lớn ở các thế hệ con cháu qua các phép lai khác nhau. Mặt khác, bằng phân tích trao đổi chéo, vị trí các gen có thể được xác định trên bản đồ di truyền nhưng không phản ảnh được chức năng riêng biệt của chúng. Nhược điểm này được khắc phục nhờ thí nghiệm bổ trợ chức năng (complementation tests). Ví dụ, khi kết hợp các tế bào nấm men Neurospora dạng đơn bội bị đột biến có cùng một biểu
  7. 7 hiện là mất khả năng mọc trên môi trường thiếu histidine, các nhà di truyền nhận được một số tế bào luỡng bội có thể phục hồi khả năng sinh sôi trên môi trường không có histidine. Kết quả phép lai giữa các dòng tế bào đột biến cho phép xác định tính trạng này liên quan đến hai gen khác nhau trong con đường sinh tổng hợp histidine. Dựa vào tần số trao đổi chéo, các gen này có vị trí phân bố ở những điểm khác nhau trên bản đồ di truyền. Như vậy, thí nghiệm bổ trợ chức năng cho phép phân biệt từng gen trong nhóm gen cùng qui định một tính trạng. Các nghiên cứu tiếp theo do các nhà di truyền Clarence P. Oliver và Melvin M. Green thực hiện trên ruồi giấm đã phát hiện thấy trao đổi chéo có thể xảy ra ngay trong một gen. Nói cách khác, một gen có thể chứa nhiều đột biến khác nhau. Nhà di truyền học Seymour Benzer đã xác định được 199 vị trí đột biến trên gen rIIA ở thực khuẩn thể T4. Đặc biệt nhờ vào việc khám phá ra cấu trúc ADN, Charles Yanofsky và cộng sự lần đầu tiên đã đưa ra bằng chứng rõ ràng về trao đổi chéo xảy ra giữa các nucleotide của một gen khi nghiên cứu gen mã cho enzym tổng hợp tryptophan ở E.coli. Nhờ các kết quả đặc biệt quan trọng trên mà khái niệm về gen đã được hoàn thiện hơn. Lúc này gen được xem là một đoạn nucleotide mang mã di truyền cho các acid amin của một sợi peptide. Từ khái niệm ban đầu cho rằng mỗi gen là một hạt cườm của một chuỗi (chuỗi đó chính là nhiễm sắc thể trong genome) và trao đổi chéo cũng như đột biến chỉ xảy ra giữa các hạt cườm thì các nhà di truyền học đã tìm được mối liên hệ tuyến tính giữa các mã di truyền bộ ba của một gen với trật tự acid amin trên sợi polypeptide. Hình 1.1: Hai protein được mã bởi một đoạn ADN duy nhất do điểm bắt đầu (hoặc kết thúc) quá trình phiên mã tổng hợp ARNm xảy ra ở các vị trí khác nhau ngay trên đoạn ADN đó tạo ra các sợi ARNm khác nhau (A) hoặc do điểm khởi đầu dịch mã tổng hợp protein phân bố ở các vị trí khác nhau trên một sợi ARNm (B). Tuy nhiên, khái niệm gen nêu trên không thể giải thích cho một số hiện tượng như sau: a/ Hiện tượng các gen gối lên nhau (overlapping genes): trên một đoạn ADN hai gen không nằm kế tiếp nhau mà gen này nằm gối đầu lên gen kia. Như thế, phần ADN có 2 gen nằm gối lên nhau chứa mã di truyền cho cả hai gen. Có thể xảy ra các trường hợp sau:
  8. 8 * Hai phân tử ARNm được phiên mã từ các vị trí bắt đầu hoặc kết thúc khác nhau trên một đoạn ADN. Kết quả là hai phân tử protein (được dịch mã từ hai sợi ARNm) có chứa một đoạn acid amin giống hệ nhau mặc dù hai protein đó các chức năng khác nhau trong tế bào (Hình 1.1A). * Một phân tử ARNm được phiên mã từ một đoạn ADN có thể dùng làm khuôn để tổng hợp hai chuỗi polypeptide khác nhau do điểm bắt đầu dịch mã (start codon) phân bố lệch nhau (hiện tượng lệch khung đọc). Hai protein này có thể khác nhau hoàn toàn về trình tự acid amin và chức năng trong tế bào (Hình 1.1B). b/ Một đoạn ADN mang mã di truyền của 2 gen nên được phiên mã tổng hợp nên 2 loại ARNm khác nhau. Điều này xảy ra khi mã di truyền phân bố theo các khung đọc khác nhau ngay trên đoạn ADN đó (Hình 1.2). Do đó, hai protein có thành phần acid amin và chức năng khác nhau hoàn toàn được tổng hợp. Một đột biến xảy ra tại một vị trí trên đoạn ADN này có thể gây ảnh hưởng đến một hoặc cả hai gen. Điều đó gây khó khăn cho việc xác lập bản đồ tính trạng. Hình 1.2: Hai gen mã cho hai protein cùng nằm trên một đoạn ADN do mã di truyền của hai gen này phân bố theo các khung đọc khác nhau c/ Đối với sinh vật eukaryot, một gen thường bao gồm các đoạn nucleotide chứa mã di truyền (exon) xen kẽ với các đoạn không chứa mã (intron). Các exon và intron đều được phiên mã sang phân tử ARN (gọi là phân tử tiền thân ARN thông tin-ARNm). Sau đó, các intron sẽ bị cắt bỏ đi, các exon được nối lại với nhau theo đúng thứ tự để tạo ra phân tử ARNm hoàn chỉnh. Có thể xảy ra trường hợp hoặc là chỉ một số intron hoặc là tất cả các intron đều bị loại đi khỏi phân tử ARNm. Mặt khác có thể xảy ra hoặc tất cả các exon hoặc chỉ một số exon được nối với nhau. Việc lựa chọn intron để cắt sẽ tạo ra các phân tử ARNm khác nhau mặc dù chúng đều xuất phát từ một loại ARNm tiền thân được phiên mã từ một khuôn ADN (Hình 1.3). Đây là hiện tượng cắt nối intron-exon luân phiên (alternative splicing).
  9. 9 Hình 1.3: Quá trình lựa chọn, cắt các intron (I) và nối các exon (E) theo các thứ tự khác nhau để tạo ra các phân tử ARNm chỉ giống nhau ở một số exon (E1 và E3). Chúng mã cho hai chuỗi polypeptide có chức năng khác nhau trong tế bào. d/ Gen mã cho polyprotein: Polyprotein là sản phẩm đầu tiên của việc dịch mã từ một phân tử ARNm, nhưng sau đó phân tử protein này bị cắt ra thành các đoạn peptide nhỏ hơn. Phân tử polyprotein không có hoạt tính. Chỉ có các đoạn peptide mới có các chức năng khác nhau. Ví dụ, các hormon adrenocorticotropic (ACTH), lipotropic (LPHs), hormon kích hoạt melanocyte (MSHs) và enkephalin được tạo ra từ một phân tử proopiomelanocortin ban đầu (Hình 1.4). Như vậy trên thực tế, một đoạn ADN sao chép ra một loại ARNm nhưng có nhiều loại protein được tạo thành. e/ Một số gen không mang thông tin di truyền cho protein: Một điều rõ ràng rằng các phân tử ARN ribosome (ARNr), ARN vận chuyển (ARNt) đều được sao chép từ ADN nhưng chúng không được dịch mã. Ngoài ra, trong nhân tế bào eukaryot còn tìm thấy các phân tử ARNsn kích thước nhỏ (small nuclear RNA) đảm nhiệm rất nhiều chức năng khác nhau như tham gia vào việc biến đổi phân tử ARNm (cắt intron và nối exon), kiểm tra lại thông tin di truyền trên chúng (cơ chế đọc sửa ARNm), tác động đến độ bền vững của ARNm trong tế bào chất hoặc tham gia vào cơ chế bất hoạt gen (ARNi-interference RNA - tạm dịch là ARN nhiễu). Do đó, các đoạn ADN mã cho các loại ARN này phải được xác định như các gen bởi lẽ đột biến trên chúng đều có thể liên quan đến việc xuất hiện các tính trạng lạ. Hình 1.4: Phân tử proopiomelanocortin được phân cắt để tạo ra các hormon MSH, LPH, CLIP và β-endorphin có hoạt tính. Từ các khái niệm về gen được hình thành và thay đổi dần để phù hợp với các kết quả thí nghiệm, sinh học phân tử ngày nay định nghĩa một gen như sau: Gen là một đoạn ADN cần thiết cho sự tổng hợp một polypeptide có hoạt tính hoặc một phân tử ARN cần thiết cho hoạt động của tế bào. Như vậy, một gen không phải chỉ bao gồm vùng chứa mã di truyền (codon region) mà còn gồm các đoạn ADN (các vùng ADN điều khiển (regulatory elements)) cần thiết cho việc phiên mã (Hình 1.5). Mặt khác, có những đoạn ADN có cấu trúc hay trình
  10. 10 tự nucleotide rất giống gen nhưng chúng không được phiên mã hoặc không biểu hiện chức năng gì nên chúng không thể được xem là gen. Hình 1.5: Cấu trúc gen mã cho protein ở tế bào nhân thực (eukaryote gene). Vị trí nucleotide đầu tiên được phiên mã sang phân tử ARN được ký hiệu là +1. Nucleotide nằm trước vị trí +1 được ký hiệu –1 (không có vị trí 0). Các nucleotide nằm trước vị trí ( +1) thuộc vùng promoter. Các intron nằm xen kẽ các exon. Intron bị loại khỏi phân tử ARNm bởi phản ứng cắt nối intron-exon (spilicing). Chiều phiên mã được chỉ bằng mũi tên. 1.2 Genome (hệ gen) Genome chứa toàn bộ thông tin di truyền lập trình đảm bảo hoạt động sống cho tế bào. Đa số genome vi khuẩn phân bố trên một nhiễm sắc thể có kích thước nhỏ và có dạng vòng khép kín. Ngược lại, phần genome trong nhân tế bào eukaryot thường rất lớn và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng. Thông tin di truyền không chỉ nằm trong trình tự nucleotide (genetic information) mà phụ thuộc rất nhiều vào cấu hình không gian của nhiễm sắc thể (di truyền ngoại sinh- epigenetic information). Trình tự nucleotide của toàn bộ genome đã được xác định đối với một số sinh vật mô hình (model organisms) đại diện cho mỗi giới sinh vật như vi khuẩn E.coli, nấm men, ruồi giấm, giun tròn, Arabidopsis và người. Bản đồ mà khoảng cách giữa các vị trí được tính bằng đơn vị nucleotide được xem là chính xác nhất. Bản đồ này được gọi là bản đồ vật lý (physical map). Ngoài ra còn có một số loại bản đồ khác. Ví dụ, bản đồ di truyền (genetic map) cho biết mối liên hệ về vị trí của các nhóm gen với nhau hay của các chỉ thị (markers) trên nhiễm sắc thể. Các chỉ thị này có thể là hình thái (biểu hiện tính trạng), sự đa dạng của protein (protein polymorphisms), đa dạng độ dài của các đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphisms-RFLPs), đa dạng độ dài các trình tự đơn giản (simple sequence length polymorphisms-SSLPs) và đa dạng các đoạn ADN được khuyếch đại ngẫu nhiên (randomly amplified polymorphic DNA-RAPD). Khoảnh cách giữa các vị trí trên bản đồ di truyền được tính bằng cM (centiMorgan) dựa vào tần số trao đổi chéo. Hai vị trí càng gần nhau thì càng khó xảy ra trao đổi chéo giữa chúng trong phân bào giảm nhiễm. Tuy nhiên, trao đổi chéo không xảy ra như nhau ở mọi vị trí trên nhiễm sắc thể nên đơn vị centiMorgan không phản ảnh chính xác khoảng cách giữa các vị trí trên bản đồ di truyền. Kết hợp giữa bản đồ vật lý và bản đồ di truyền cho biết chính xác khoảng cách giữa các gen (tính trạng), giữa các chỉ thị phân tử liên quan đến những tính trạng cần nghiên cứu. Genome không phải đơn thuần là tập hợp của các gen. Genome của vi khuẩn và sinh vật eukaryot bậc thấp thường không lớn và các gen phân bố sát nhau. Hầu hết các gen này chỉ có một bản sao trong genome và rất ít bị gián đoạn bởi các đoạn ADN không chứa mã di truyền (intron). Ngược lại, thành phần ADN chứa các gen chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ so với toàn bộ genome trong tế bào eukaryot bậc cao. Các gen trong tế bào eukaryot bậc cao thường chứa nhiều intron và phân bố xa nhau. Từ những năm 70, bằng các thí nghiệm gây bão hoà đột biến, các nhà di truyền học có thể xác định được số gen nằm trên một đoạn nhiễm sắc thể.
  11. 11 Ngày nay các kỹ thuật phân tích ADN hiện đại (các phép lai Southern, northern, microarray ), cho phép xác định số gen hoạt động trong một tế bào. Ví dụ, ở tế bào nấm men (sinh vật eukaryot bậc thấp) có khoảng 4000 gen hoạt động, còn tế bào động vật có vú khoảng 10.000 - 15.000 gen. Như vậy, nếu độ dài trung bình của một gen khoảng 10000 bp thì tổng số chiều dài các gen hoạt động trong một tế bào cũng chỉ chiếm 1-2% genome. Hay nói cách khác chỉ một phần rất nhỏ genome mang thông tin di truyền cần thiết cho hoạt động sống của tế bào. So sánh kích thước genome của một số loài gần nhau trong bậc thang tiến hoá (tức là có độ phức tạp loài tương tự như nhau) cũng như genome của những loài cách xa nhau (tức là có tính phức tạp khác nhau) cho thấy kích thước genome không phải luôn luôn tỷ lệ với tính phức tạp của loài. Ví dụ, genome của người có kích thước khoảng 3,3x109 bp, trong khi đó genome các loài lưỡng cư dài tương tự cỡ 3,1x109 bp hoặc của thực vật có thể đạt đến 1011 bp. Có lẽ nào loài lưỡng cư lại có tính phức tạp như cơ thể chúng ta? Mặt khác, ngay trong cùng một loài chúng ta cũng nhận thấy sự mâu thuẫn về kích thước genome. Ví dụ, ruồi sống trong nhà (Musca domestica) có genome cỡ 8,6x108 bp, lớn gấp 6 lần kích thước genome ruồi giấm (D.melanogaster) với genome cỡ 1,4x108 bp. Ngoài ra, kích thước genome của các quần thể lưỡng cư thay đổi từ 109 bp đến 1011 bp (khác nhau gấp 100 lần). Vì sao ngay trong cùng một loài kích thước genome lại biến thiên nhiều như vậy ? Kết quả bước đầu so sánh genome giữa các loài sinh vật với nhau cho phép rút ra ba đặc điểm nổi bật. Thứ nhất, các gen phân bố không theo qui luật trong genome. Thứ hai, kích thước genome thay đổi không tỷ lệ với tính phức tạp của loài và cuối cùng là số lượng nhiễm sắc thể cũng rất khác nhau ngay giữa những loài rất gần nhau. Nếu phân tích chi tiết đối với một gen nhất định thì vị trí các intron, các exon, các đoạn ADN điều khiển hoạt động của gen vv đều là những yếu tố quan trọng để so sánh tìm ra mối quan hệ giữa các loài. Ngoài ra, tổng số gen nói chung, số lượng các gen có nhiều bản sao trong genome, tỷ lệ các loại ADN lặp lại và thành phần của chúng cũng như sự di chuyển của các gen từ genome riêng biệt của các bào quan (ty thể, lục lạp) sang genome trong nhân đều chịu ảnh hưởng của thời gian, đều phản ánh quá trình tiến hoá của các loài. Mặt khác, để có được sự so sánh chính xác hơn, toàn diện hơn, cần xét đến cấu trúc sợi chromatin, cấu hình không gian ba chiều của nhiễm sắc thể cũng như của toàn bộ genome trong nhân. 1.2.1. Genome của tế bào prokaryot (tế bào nhân sơ) Genome trong tế bào prokaryot không lớn nên số lượng genome của các loài vi khuẩn được xác định trình tự ngày càng nhiều. Nhờ đó các thông tin dữ liệu về cấu trúc hệ gen prokaryot, sự phân bố các gen, cách thức kiểm soát hoạt động cũng như chức năng của chúng ngày càng phong phú và trở nên rõ ràng. Genome prokaryot có kích thước nhỏ hơn rất nhiều so với genome eukaryot. Bên cạnh nhiễm sắc thể chứa phần lớn thông tin di truyền, tế bào prokaryot còn có nhiều loại plasmid. Trước đây, plasmid được xem là những phân tử ADN dạng vòng chứa các gen không quan trọng. Ví dụ, plasmid thường mang gen liên quan đến tính chống chịu kháng sinh. Do đó, tế bào vẫn có thể tồn tại ngay khi thiếu vắng các gen này. Tuy nhiên, khái niệm plasmid được mở rộng ra khi thực nghiệm tìm thấy một số tế bào prokaryot có chứa phân tử ADN kích thước nhỏ, ở dạng thẳng và mang các gen tương tự như plasmid dạng vòng. Vì vậy, plasmid được hiểu là những đoạn ADN kích thước nhỏ mang một số gen không quyết định sự sống còn của tế bào. Hơn nữa, một loại plasmid đôi khi được tìm thấy trong các loại tế bào prokaryot khác nhau. Mặt khác, plasmid có khả năng biến nạp từ loại tế bào prokaryot này sang loại khác. Vì vậy, mặc dù có chứa gen nhưng plasmid dường như không được xem là một phần của genome.
  12. 12 Hầu hết genome prokaryot nhỏ hơn 5 Mb (5.000.000 nucleotide) và thường được phân bố trên một nhiễm sắc thể dạng vòng. Một số tế bào prokaryot có genome là phân tử ADN dạng thẳng. Đặc biệt, một số genome prokaryot là phân tử ARN hoặc kết hợp cả hai loại ADN và ARN. Ngoài ra, genome prokaryot có thể bao gồm các gen phân bố trên các đoạn thẳng ADN hoặc trên cả hai loại phân tử ADN dạng thẳng và dạng vòng. Ví dụ, nhiễm sắc thể dạng thẳng được phát hiện lần đầu tiên ở Borrelia burgdorferi vào năm 1989. Nhiễm sắc thể này dài 910 kb gồm 853 gen. Bên cạnh đó, tế bào Borrelia burgdorferi còn có tới 17 plasmid dạng vòng và dạng thẳng với tổng chiều dài là 533 kb liên quan tới 430 gen. Hầu hết các gen phân bố trên plasmid không quan trọng, chỉ có một số ít gen cần thiết cho quá trình tổng hợp purine và protein màng tế bào. Do đó, trong tổng số 17 plasmid, một vài plasmid chứa các gen này được xem là một bộ phận của genome trong tế bào Borrelia burgdorferi. Những dẫn liệu thực nghiệm nhận được khi phân tích genome và các plasmid ở Borrelia burgdorferi đã gây tranh cãi giữa các nhà sinh học khi so sánh genome Borrelia burgdorferi với Treponema pallium. Theo phân loại, đây là hai loài vi khuẩn có quan hệ gần gũi nhau. Giống như đa số các tế bào prokaryot khác, genome loài thứ hai là một phân tử ADN dạng vòng có kích thước 1138 kb với 1041 gen. Điều thú vị là không một gen nào ở Treponema pallium tương đồng với các gen phân bố trên plasmid của loài thứ nhất. Phải chăng các plasmid vừa được tự nhiên biến nạp vào Borrelia burgdorferi? Genome prokaryot không đóng gói trong cấu trúc nucleosome (như genome eukaryot) và không được bao bọc bởi màng nhân. Nhiễm sắc thể dạng vòng có cấu trúc không gian giống như những cánh hoa của bông hoa, mỗi cánh là một đoạn ADN có cấu trúc siêu xoắn (supercoil). Các cánh không đều như nhau và được đính vào lõi protein. Genome vi khuẩn có khoảng 40-50 cánh. Cấu trúc kiểu bông hoa này được gọi là nucleoid (Hình 1.6). Cấu trúc nucleoid giúp genome chỉ chiếm một thể tích rất nhỏ trong tế bào. Ngoài ra, cấu trúc không gian này của nhiễm sắc thể được duy trì nhờ các phân tử ARN kích thước nhỏ tương tác với protein. Do đó, ngay khi bị đứt gãy, cấu trúc siêu xoắn của nhiễm sắc thể cũng chỉ mở ra một cách cục bộ ở cánh bị tổn thương chứ không xảy ra trên toàn bộ genome. Hai enzym ADN gyrase và ADN topoisomerrase giữ vai trò chính cùng phối hợp với phức protein khác làm nhiệm vụ đóng gói ADN vi khuẩn. Thực nghiệm đã phát hiện được ít nhất 4 protein tham gia phức này, trong đó protein HU có chức năng tương tự như histone ở tế bào eukaryot. Mặc dù có cấu trúc rất khác với histone nhưng HU ở dạng tetramer tạo thành lõi được quấn quanh bởi đoạn ADN khoảng 60 bp. Như vậy, protein HU có chức năng tương tự histone trong việc qui định nghiêm ngặt cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, chúng ta chưa xác định được các lõi này có phân bố đều đặn hay chỉ tập trung tại "nhị hoa" nucleoid. Hình 1.6: Mô hình cấu trúc nucleoid ở E.coli gồm 40-50 vòng siêu xoắn kết đính với lõi protein và sợi ARN. Khi có đứt gãy xảy ra ở một vòng siêu xoắn, nhiễm sắc thể chỉ mở xoắn cục bộ ở vùng này (theo Snustad và Simmons, 2000).
  13. 13 Năm 1995, genome Haemophilus influenzae là genome đầu tiên được xác định toàn bộ trình tự. Đến năm 1998 đã có hơn 18 genome vi khuẩn khác được đọc hoàn toàn. Trong số này, Mycoplasma genitalium có kích thước nhỏ nhất gồm 580.070 bp và Mycobacterium tuberculosis có kích thước lớn tới 4.411.529 bp. E.coli được nghiên cứu chi tiết nhất và được xem là đối tượng mô hình của di truyền, hoá sinh và sinh học phân tử. Hệ gen E.coli gồm 4.639.221 bp với 4.288 trình tự có các đặc tính cấu trúc của gen mã cho protein (putative protein coding sequences). Một phần ba số trình tự này đã được xác định là các gen trong khi 38% chưa biết được chức năng. Các trình tự nucleotide được giả định là gen nhưng chưa biết sản phẩm protein mà chúng mã cho thì được gọi chung là khung đọc mở (open reading frame-ORFs). Một khung đọc mở thường bắt đầu bởi bộ ba mã di truyền cho methynonine (start codon) và kết thúc bởi một trong số ba mã dừng tổng hợp protein (stop codon). Mặc dù có kích thước nhỏ hơn nhiều so với genome eukaryot, nhưng genome prokaryot có mật độ phân bố các gen cao hơn, số đoạn ADN không chứa mã di truyền ít hơn. Nói cách khác, khoảng cách giữa các gen ngắn hơn. Ví dụ, khoảng cách trung bình giữa hai gen ở E.coli là 118 bp. Các gen và ORFs chiếm 87,8%; các gen mã cho ARNs chiếm 0,8%; còn thành phần ADN lặp lại không chứa gen chỉ chiếm có 0,7%. Mặt khác hầu hết các gen ở prokaryot đều tồn tại đơn bản (single-copy gen) và các gen không có intron. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của toàn bộ genome E.coli với các trình tự ADN lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu cho phép phát hiện 6 gen mới mã cho ARNt, 12 gen liên quan đến sinh tổng hợp và lắp ráp roi cũng như 2 gen mã cho các enzym tham gia vào con đường phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng. Rõ ràng việc so sánh trình tự hệ gen giữa E.coli và các sinh vật prokaryot khác đặc biệt có ý nghĩa trong việc xác định các gen mới cũng như chức năng của chúng. Ngoài ra, khi so sánh số lượng gen tham gia vào một quá trình sinh học ở các vi khuẩn khác nhau cho phép đánh giá số lượng gen tối thiểu cần thiết cho quá trình đó. Ví dụ, quá trình trao đổi chất liên quan đến khoảng 243 gen ở E.coli, 112 gen ở Haemophilus influenzae nhưng chỉ cần đến 31 gen ở Mycoplasma genitalium. Hơn nữa, việc so sánh số lượng gen phân bố trong những genome có kích thước nhỏ nhất như M.genitalium, M. pneumoniae cho phép đánh giá được số lượng gen tối thiểu cần thiết để duy trì sự sống cho cơ thể đơn giản nhất. M.genitalium có 470 gen và M. pneumoniae có 679 gen. So sánh các gen và chức năng của chúng ở hai loại vi khuẩn này cho phép ước tính số gen tối thiểu cần có để duy trì sự sống là 256 gen. Tuy nhiên nhờ kỹ thuật di truyền phân tử gây đột biến định hướng chính xác từng gen, thực nghiệm đã tăng dần số lượng gen cần bị đột biến và nhận thấy ít nhất cần có 300 gen để đảm bảo sự sống cho vi sinh vật đơn giản nhất. Ngoài ra, việc so sánh các gen giống và khác nhau giữa các vi khuẩn có quan hệ gần gũi trong tiến hoá đặc biệt có ý nghĩa để xác định những gen riêng biệt của từng loài, tức là những gen chỉ thị dùng để phân biệt loài này với loài kia. Ví dụ, trong số 470 gen có ở M.genitalium thì 350 gen cũng tồn tại ở Bacillus subtilis. Như vậy chỉ có 120 gen tạo nên sự khác biệt giữa hai loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, những nghiên cứu về cách thức hoạt động của các gen riêng biệt này, chức năng của từng sản phẩm protein mà gen mã cho cũng như các quá trình hoá sinh mà chúng tham gia chưa đưa đến kết luận rõ ràng về vai trò của 120 gen đặc thù cho M.genitalium. 1.2.2. Genome của tế bào eukaryot (tế bào nhân thực) Genome của tế bào eukaryot bao gồm các nhiễm sắc thể phân bố trong nhân và ADN phân bố trong một số bào quan như lục lạp, ty thể. Tuy nhiên, do hầu hết số lượng ADN cũng
  14. 14 như các gen tập trung chủ yếu trong nhân nên ADN (nhiễm sắc thể) phân bố trong nhân được các nhà sinh học quan tâm rất nhiều. Các nhiễm sắc thể là các phân tử ADN liên kết với protein, ở dạng thẳng. Không có mối liên hệ ràng buộc nào giữa ba thông số sinh học: số lượng nhiễm sắc thể, kích thước genome và tính phức tạp của loài. Ví dụ, nấm men S.cerevisiae được xem là sinh vật eukaryot bậc thấp nhưng lại có số lượng nhiễm sắc thể nhiều gấp 4 lần ruồi giấm D. melanogaster. Ngoài ra, kích thước genome kỳ nhông lớn gấp 30 lần hệ gen của người nhưng số lượng nhiễm sắc thể chỉ bằng một nửa. Hơn nữa, một số nhiễm sắc thể có kích thước rất nhỏ (các nhiễm sắc thể mini) nhưng có mật độ phân bố các gen rất cao. Ví dụ, hệ gen của gà gồm 39 nhiễm sắc thể, trong đó 6 nhiễm sắc thể bình thường chiếm 66% ADN nhưng chỉ có 25% các gen phân bố trên 6 nhiễm sắc thể đó. Ba mươi ba nhiễm sắc thể còn lại đều là nhiễm sắc thể mini chiếm 1/3 ADN và có tới 75% các gen. Những so sánh lý thú này cho thấy sự bí hiểm giữa tiến hoá và cấu trúc genome trong các sinh vật khác nhau mà hiện tại sinh học chưa giải thích được. Kích thước genome trong nhân eukaryot thay đổi từ 12 Mb (nấm men S.cerevisiae) đến 120.000 Mb (thực vật F.assyriaca). Genome bao gồm thành phần ADN không lặp lại và ADN lặp lại. Phần lớn các gen phân bố trong thành phần ADN không lặp lại và số lượng của chúng tăng cùng với tính phức tạp của loài. Tuy nhiên, điều đặc biệt lưu ý là tính phức tạp không chỉ phụ thuộc vào số lượng gen mà còn được xác định bởi thành phần ADN lặp lại. Vì vậy, không phải luôn luôn tồn tại mối tương quan tỷ lệ thuận giữa kích thước genome và tính phức tạp của loài. Ví dụ, kích thước genome của người khoảng 109 bp trong khi genome một số loài lưỡng cư hoặc thực vật có thể đạt đến 1011 bp. Genome của người đã được giải mã hoàn toàn (2001) bao gồm các thành phần ADN được trình bày trên hình 1.7. Hình 1.7: Các loại ADN trong genome người (theo Brown, 2001). 1.3 Cấu trúc sợi nhiễm sắc trong tế bào eukaryot
  15. 15 Trong nhân tế bào eukaryot, ADN liên kết với protein tạo ra cấu trúc gọi là chromatin (sợi nhiễm sắc). Có thể phân biệt các protein này làm hai nhóm chính: histone và non-histone. Thành phần protein non-histone thay đổi giữa các mô, tổ chức, giữa các loài. Mỗi loại protein non-histone chỉ chiếm một số lượng rất nhỏ so với tổng số protein non-histone hoặc với bất kỳ loại protein histone nào. Tuy nhiên các protein non-histone giữ một vai trò rất quan trọng qui định cấu trúc không gian đặc thù của từng vùng nhiễm sắc thể. Hoạt động của nhiều gen, đặc biệt các gen liên quan đến phát triển phôi, không chỉ phụ thuộc vào trình tự nucleotide mà còn phụ thuộc vào cấu trúc của nhiễm sắc thể. Thông tin di truyền chứa trong cấu trúc không gian của nhiễm sắc thể được gọi là thông tin di truyền ngoại sinh (epigenetic information). Sử dụng dung dịch có liên kết ion yếu, có thể tách ra khỏi nhân tế bào các sợi nhiễm sắc ở dạng sợi đơn, đường kính khoảng 30 nm, gồm các hạt nhỏ giống như chuỗi hạt cườm (đường kính hạt khoảng 10 nm). Các hạt nhỏ này được gọi là nucleosome. Chúng không phân bố đồng đều ở mọi vùng trên sợi nhiễm sắc. Khi sợi ADN bị cắt bởi nuclease, các nucleosome tách ra riêng biệt. Mỗi nucleosome gồm một đoạn ADN dài 146 bp quấn 2 vòng quanh lõi protein chứa 8 tiểu phần của 4 loại histone H2A, H2B, H3, H4. Phần đầu NH2 của histone không nằm trong cấu trúc nucleosome mà tồn tại tự do. Đoạn ADN nằm giữa hai nucleosome được gọi là ADN nối (linker DNA). Đoạn này có kích thước khoảng 50-70 bp. Protein histone H1 liên kết với ADN linker nằm giữa 6 nucleosome và đóng gói chúng lại thành một cấu trúc đặc biệt gọi là solenoid (giống như một bông hoa 6 cánh). Các solenoid quấn chồng lên nhau thành sợi xoắn. Nhờ cấu trúc đặc biệt đó nên thể tích ADN chiếm trong nhân giảm đi rất nhiều. Sợi ADN quấn quanh lõi histone trong cấu trúc nucleosome và được đóng gói trong các solenoid có độ trật tự rất cao. Một điều thú vị được đặt ra là các cấu trúc này thay đổi như thế nào khi một đoạn ADN được sử dụng để phiên mã (tạo ARNm) hoặc để sửa chữa khi xảy ra sai hỏng? Liệu khi đó chúng có bị phá vỡ tạm thời như trong quá trình tái bản ADN hay không? Các phân tử histone được giải phóng hay vẫn liên kết với ADN? Giải đáp những câu hỏi này có nhiều kết quả khác nhau cho thấy việc phiên mã không nhất thiết yêu cầu phá vỡ cấu trúc chromatin. Tuy nhiên chắc chắn có xảy ra những thay đổi trong các tương tác protein-ADN, histone-histone, histone-non histone. Điều đặc biệt có ý nghĩa là việc thêm bớt các nhóm chức trên từng phân tử protein tham gia liên kết tạo nucleosome khiến cho cấu trúc nucleosome thay đổi. Lõi histone có thể không bị phân rã thành các tiểu phần nhưng bị dịch chuyển một cách cục bộ trên sợi nhiễm sắc bởi các protein điều biến chromatin (remodelling chromatin proteins). Các protein này giúp cho việc tháo gỡ cục bộ sợi ADN khỏi cấu trúc nucleosome mà không ảnh hưởng đến các vùng khác. ADN được giải phóng ra khỏi nucleosome không có nghĩa chúng ở trạng thái tự do, vì như vậy ADN rất dễ bị phá hủy bởi các tác nhân khác nhau trong tế bào, đặc biệt bởi các nuclease. Lúc đó ADN thường liên kết với các protein đặc hiệu (các factor) cần thiết cho sự phiên mã hoặc các phức cần thiết cho quá trình sửa chữa ADN. Thí nghiệm cho thấy khi các factor phiên mã tương tác với ADN, chúng có khả năng ngăn cản histone liên kết với ADN. Điều này có thể lý giải việc tồn tại những vùng trơ với nuclease nằm xen các vị trí nhạy cảm trong một gen. Khi protein bám vào ADN, ADN được bảo vệ khỏi sự phân cắt của enzym. 1.3.1. Histone trong cấu trúc nucleosome Mỗi nucleosome có 146 bp ADN quấn hai vòng quanh lõi histone gồm 8 tiểu đơn vị 2x[H3-H4] và 2x[H2A-H2B]. Các histone của lõi có cấu trúc tương tự như nhau, gồm các đoạn peptide (domain) tận cùng đầu NH2 (N-terminal), domain chung giúp histone gấp khúc
  16. 16 và phần tận cùng COOH (C-terminal). Domain cần cho histone gấp khúc còn liên quan đến tương tác giữa các histone và giữa histone với ADN. Các nucleosome được gắn với nhau nhờ histone H1. Protein này liên kết lõi histone với ADN nối (ADN linker) nằm giữa nucleosome. Độ dài của các ADN linker không cố định như nhau. Histone H1 thiết lập nên cấu trúc có trật tự cao cho sợi nhiễm sắc. Các histone tham gia cấu trúc lõi đều có phần đầu NH2 nằm ở ngoài lõi, phân bố tự do theo các hướng khác nhau (Hình 3-GT). Chiều dài của đoạn phân bố tự do thay đổi từ 16 đến 44 acid amin (H3-44; H2B-32; H4-26 và H2A-16 acid amin). Các đoạn này giữ vai trò quan trọng đối với sự co đặc của sợi nhiễm sắc. Nghiên cứu động học quá trình thay đổi cấu hình của sợi nhiễm sắc cho thấy nó có thể tồn tại ở ba dạng: không co đặc (unfolded), co đặc ở mức độ trung bình (moderately folded) và co đậm đặc (extensively foded). Đoạn tự do của H3 và H4 cần thiết để sợi nhiễm sắc có mức độ co đặc vừa phải. Đặc biệt đoạn tự do của H3 không thể thay thế được. Độ dài và vị trí ra khỏi phần lõi của đoạn này cần thiết cho việc hình thành cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc. Như vậy cùng với histone H1, các đoạn tự do của bốn loại histone trong cấu trúc lõi đều cần thiết để duy trì cấu trúc không gian ba chiều cho nucleosome, duy trì trạng thái co đậm đặc của sợi nhiễm sắc cũng như tương tác giữa các sợi nhiễm sắc với nhau. Ngoài ra, chúng còn là các vị trí tương tác với các protein non-histone. Sau khi được tổng hợp, cả bốn loại histone đều chịu các biến đổi như ubiquitin hoá, phosphoryl hoá, glycosyl hoá và đặc biệt có ý nghĩa là quá trình methyl hoá và acetyl hoá. Hầu hết các biến đổi này xảy ra ở vùng N-terminal. Quá trình phosphoryl hoá và methyl hoá có thể tác động qua lại với nhau, ảnh hưởng đến sự co đặc của nhiễm sắc thể khi bước vào mitose. Riêng trường hợp ubiquitin hoá xảy ra ở phần đuôi C-terminal của histone, giúp cho cấu trúc nucleosome bị phá vỡ tạm thời trong quá trình tái bản hoặc tổng hợp ARN. Như vậy, các biến đổi hoá học của histone tác động đến cấu trúc không gian của nucleosome và hoạt động của gen, trước hết ở quá trình phiên mã. Các histone trong cấu trúc lõi bị acetyl hoá tại các acid amin lysine đặc hiệu phân bố ở phần N-terminal. Ngoại trừ histone H2A, các histone lõi khác thường có 4 đến 5 vị trí có gắn nhóm acetyl. Một nucleosome có thể có tới 26 vị trí mang nhóm acetyl. Acetyl hoá histone có một vai trò quan trọng, quyết định đến cấu trúc cúngợi nhiễm sắc. Nhờ đó sợi nhiễm sắc không co đặc, ADN được giải phóng ra khỏi nucleosome, sự tương tác giữa các nucleosome bị phá hủy, gây thay đổi liên kết giữa các domain N-terminal của histone với các protein non- histone, hoặc liên kết giữa các protein với ADN. Những biến đổi này góp phần hoạt hoá phản ứng tổng hợp ARN. Chỉ cần 46% trong tổng số 26 vị trí đặc biệt bị acetyl hoá cũng đủ phá vỡ trật tự cấu trúc của sợi nhiễm sắc và tăng cường quá trình sao chép ARN ở các gen. Thông thường acetyl hoá và khử acetyl ở histone liên quan đến hoạt hóa hay kìm hãm hoạt động của gen. Mỗi loại histone có thể được gắn nhóm acetyl ở những vị trí đặc hiệu bởi các enzym riêng biệt. Điều đó gây ra những tác động khác nhau đến biểu hiện của gen. Ngoài ra, quá trình acetyl hoá còn làm thay đổi cấu trúc của phức điều biến chromatin (remodeling chromatin complexes). Phức này có chức năng phá vỡ tạm thời cấu trúc lõi histone hay dịch chuyển nucleosome trên sợi nhiễm sắc. Chúng thường tương tác với vùng N-terminal của histone. Khi vùng này có mang nhóm acetyl, phức điều biến chromatin có thể làm cho các histone H2A-H2B bị di chuyển ra khỏi cấu trúc lõi nucleosome. Nhờ đó, các promoter được bộc lộ, cho phép quá trình tổng hợp ARNm được bắt đầu. Động học của phản ứng acetyl hoá và khử acetyl rất linh động, phức tạp, phụ thuộc vào hoạt tính của các enzym liên quan. Biến đổi thuận nghịch giữa hai dạng acetyl hoá và khử acetyl của histone phụ thuộc vào hai loại enzym histone acetyl transferase (HAT) và histone
  17. 17 deacetylase (HDAC) cùng với các protein đồng hoạt hóa (coactivator) với HAT hoặc đồng ức chế (corepressor) với HDAC. Rõ ràng, hai quá trình acetyl hoá và khử acetyl có tác dụng ngược nhau trong việc làm thay đổi cấu trúc sợi nhiễm sắc và hoạt động của các gen. Các enzym deacetylase HDAC làm giảm mức độ acetyl hoá histone, dẫn đến kìm hãm quá trình phiên mã. Ngược lại, enzym acetyl transferase HAT tăng cường acetyl hoá kích thích quá trình phiên mã. Mặt khác, cạnh tranh giữa hai phản ứng acetyl hoá và khử acetyl giúp sợi nhiễm sắc thay đổi cấu trúc linh hoạt, đáp ứng kịp thời với tăng cường hoặc kìm hãm hoạt động của gen. Ở động vật có xương sống, bốn loại histone H2A, H2B, H3 và H4 ít thay đổi giữa các loài. Tuy nhiên protein H1 gồm một số dạng được ký hiệu từ H1a đến H1e, H1t và H5. Vị trí phân bố của các loại histone H1 này chưa được xác định rõ ràng. Mặt khác trong các tế bào tinh trùng, histone được thay thế bởi protein protamine. Hơn nữa, histone có tính kiềm do cấu trúc bậc I của chúng có khoảng 20-30% arginine và lysine. Đây là các acid amin tích điện dương (+). Nhờ vậy thay đổi điện tích của histone liên quan chặt chẽ đến khả năng tương tác với ADN và độ bền vững của tương tác đó vì acid nucleic có điện tích âm quyết định bởi nhóm phosphate. 1.3.2. Methyl hoá ADN Bản thân ADN cũng chịu các biến đổi do gắn thêm các nhóm chức khác nhau. Ví dụ, hiện tượng methyl hoá cytosine hoặc adenine. Những thay đổi này có tính đặc thù cho từng vùng nhiễm sắc thể, tác động đến cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc và tham gia kiểm soát hoạt động của các gen. Những đặc thù riêng của từng vùng nhiễm sắc thể được di truyền cho thế hệ sau. Sai lệch trong cấu trúc không gian của sợi nhiễm sắc có thể làm xuất hiện tính trạng mới ngay khi trình tự nucleotide không sai hỏng. Do đó, phân tử ADN có chứa hai dạng thông tin: thông tin di truyền (genetic information) quyết định bởi trình tự nucleotide và thông tin ngoại sinh (epigenetic information) quyết định bởi tính phức tạp về cấu hình không gian của genome. Hiện tượng methyl hoá xảy ra với cả ADN prokaryot và eukaryot. Sự methyl hoá ADN ở prokaryot được xem như là một cơ chế bảo vệ hệ gen, trong khi ở eukaryot methyl hoá đóng vai trò quan trọng trong dạng thông tin thứ hai. Đó chính là một trong các cơ chế kiểm soát hiện tượng đánh dấu DNA (DNA imprinting), tức là tính trạng của gen được biểu hiện phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền từ bố hay mẹ. Cần lưu ý “DNA imprinting” hoàn toàn khác với di truyền theo giới tính. Hiên tượng đánh dấu ADN sẽ được xem xét chi tiết ở phần sau. Methyl hoá ADN có ý nghĩa đặc biệt đối với hoạt động của gen eukaryot, nhất là các gen trong quá trình hình thành phát triển cá thể. Phản ứng methyl hoá xảy ra ở những vị trí đặc hiệu. Khoảng 2-7% ADN ở tế bào động vật bị methyl hoá. Hầu hết nhóm methyl được tìm thấy ở cytosine (C) phân bố trong cặp nucleotide CpG. Tỷ lệ cytosine bị methyl hoá thay đổi rất khác nhau giữa các loài. Hầu như không phát hiện được methyl-cytosine ở nấm men S.cerevisiae. Khoảng 10% cytosine bị methyl hoá ở động vật có xương sống và 30% ở thực vật. Chỉ đến năm cuối cùng của thập kỷ 20 mới khẳng định được có hiện tượng methyl hoá ADN ở Drosophila. Tuy nhiên chỉ có khoảng 0,4% toàn bộ hệ gen ruồi giấm bị methyl hoá. Hơn nữa cytosine gắn gốc methyl nằm trong cấu trúc CpT và CpA chứ không phải trong trật tự CpG (như đối với động vật bậc cao). Đặc biệt ở thực vật bậc cao, hiện phản ứng methyl hoá có thể xảy ra với cytosine trong mọi cấu trúc CpG, CpNpG và CpNpN, trong đó N = A, T hoặc C.
  18. 18 Khi đưa các gen bị methyl hoá hoặc bị khử methyl vào genome tế bào nhận (thí nghiệm chuyển gen) thì chỉ những gen không có nhóm methyl mới hoạt động. Mặt khác, vùng ADN không có nhóm methyl thường trùng với vùng có các vị trí nhạy cảm ADNase. Thực nghiệm nhận thấy rất nhiều gen khi đang phiên mã tổng hợp ARN đều không có nhóm methyl ở vùng chứa promoter và exon thứ nhất (đầu 5'), mặc dù các exon tiếp sau và phía đầu 3' có chứa nhóm này. Rõ ràng methyl hoá có tác dụng ngăn cản gen hoạt động. Ngược lại, nếu khử nhóm này thì gen lại được hoạt hoá. Do đó để phân biệt với CpG bị methyl hoá, các cặp CpG không có gốc methyl, lặp đi lặp lại nhiều lần ở phía trước đầu 5' của gen khoảng 1-2 kb được gọi là cụm CpG (CpG island). Khoảng 56% các gen trong genome người được phân bố gần với cụm CpG. Những gen hoạt động trong mọi loại tế bào (housekeeping genes) đều có cụm CpG không bị methyl hoá. Tuy nhiên, đối với các gen đặc hiệu (chỉ hoạt động trong tổ chức chuyên biệt) thì phản ứng methyl hoá cụm CpG của chúng được kiểm soát chặt chẽ. Cụm này không bị methyl hoá trong tế bào cần đến sản phẩm của gen nhưng lại bị gắn gốc methyl trong những tế bào mà gen không biểu hiện. Như vậy để một gen hoạt động, ngoài việc xuất hiện các vị trí nhạy cảm với nuclease gần promoter, ADN ở vùng chứa gen cần bị khử nhóm methyl. Khi đưa ADN đã bị methyl hoá vào tế bào, nó tiếp tục bị methyl hóa không ngừng qua mỗi lần nhân đôi ADN. Ngược lại, nếu đưa ADN không có nhóm methyl vào tế bào, chúng không bị methyl hoá sau mỗi lần tái bản. Phản ứng gắn nhóm methyl vào cytosine được xúc tác bởi các enzym methyltransferase. Có thể phân biệt các enzym này thành 2 nhóm. Nhóm thứ nhất làm nhiệm vụ duy trì gốc methyl ở những vị trí cytosine trên sợi ADN vừa được tổng hợp trong quá trình tái bản ADN. Việc gắn gốc methyl mới này dựa vào nhóm mCpG trên sợi khuôn. Chúng được gọi chung là các enzym duy trì nhóm methyl (maintenance methyltransferase). Nhóm thứ hai gồm các enzym xúc tác phản ứng gắn gốc methyl vào vị trí cytosine trên phân tử ADN mà vị trí này trước đó không có nhóm methyl. Ví dụ, gắn nhóm methyl vào cụm CpG ở promoter khi cần kìm hãm hoạt động của gen. Ngoài ra, quá trình methyl hoá cytosine trong trật tự CpNpG hoặc CpNpN đòi hỏi protein và các phân tử ARN kích thước ngắn (20-25 nucleotide) để nhận biết những cytosine đó. Nhờ đó, cấu trúc sợi nhiễm sắc cũng như hoạt động của gen bị thay đổi. Enzym demethylase có thể đảm nhận phản ứng khử nhóm methyl. Tuy nhiên, enzym này chưa được tìm thấy trong tế bào động vật. Kết quả nghiên cứu gần đây (2002- 2005) cho thấy một số enzym tham gia sửa chữa ADN có liên quan đến việc loại bỏ cytosine mang nhóm methyl. Lúc đó, đoạn ADN chứa mC bị loại đi và thay thế bởi cytosine không mang nhóm methyl. 1.4 Các gen trong genome eukaryot Một trong những sai khác cơ bản trong cấu trúc gen giữa sinh vật prokaryot và eukaryot là hiện tượng gen bị gián đoạn (interupted gene). Hiện tượng này được khám phá lần đầu tiên năm 1977 và được tìm thấy phổ biến ở mọi sinh vật eukaryot. Kỳ lạ là hiện tượng này cũng được phát hiện ở một số thực khuẩn thể (bacteriophage). Khi so sánh trình tự nucleotide trên một gen với phân tử ARNm được phiên mã từ gen đó, các nhà khoa học phát hiện thấy gen có chứa những đoạn không mang mã di truyền. Những đoạn này không tìm thấy trong phân tử ARNm được sử dụng làm khuôn để tổng hợp protein. Chúng được gọi là các intron. Như vậy bên cạnh việc chứa những đoạn mang mã di truyền (gọi là exon), đa số các gen eukaryot còn chứa các intron. Mặc dù không chứa mã di truyền và bị cắt đi khỏi phân tử ARNm, đột biến xảy ra ở intron có thể ngăn cản phản ứng nối các exon với nhau, do đó tạo nên phân tử ARNm sai hỏng không sử dụng được để dịch mã tổng hợp protein.
  19. 19 Khi phân tử ARN được phiên mã từ một gen, nó phải trải qua quá trình loại bỏ các intron, nối các exon với nhau (phản ứng splicing). Phản ứng cắt nối này xảy ra với các loại ARNm, ARNr và ARNt. Để tạo ra phân tử ARN hoàn thiện, việc cắt intron, nối các exon tuân theo những qui luật nghiêm ngặt và chính xác để đảm bảo thứ tự của chúng. Điều thú vị là các exon của một phân tử ARNm được nối với nhau. Hiếm trường hợp nối các exon của các phân tử ARNm khác nhau. Do các intron không mang mã di truyền nên đột biến xảy ra trên chúng thường không được biểu hiện ở cấu trúc của chuỗi polypeptide. Tuy nhiên các đột biến có thể ảnh hưởng đến phản ứng splicing khi chúng xảy ra ở các vị trí cần thiết để cắt nối intron- exon. Điều đáng lưu ý với ADN của ty thể và lục lạp, intron của gen này có thể là exon của gen khác và sản phẩm protein của hai gen đó có chức năng hoàn toàn độc lập. Ngoài ra, một số gen được phiên mã tạo ra ARNm nhưng chúng không được dịch mã. Những phân tử ARNm này vẫn trải qua phản ứng cắt nối intron-exon để tạo ra các đoạn ARN ngắn. Chúng tiếp tục được phân huỷ thành các phân tử ARN kích thước nhỏ 22-25 nucleotides (miRNAs: micro RNAs). Các phân tử miRNAs tham gia vào nhiều quá trình kiểm soát hoạt động của một số gen trong genome, chủ yếu ở quá trình sau phiên mã. Trong cơ chế kiểm soát này, miRNAs làm nhiệm vụ nhận biết ARNm của một số gen khác để phân hủy các ARNm này. Đây là một cơ chế kiểm soát hoạt động của gen sau phiên mã được phát hiện vào những năm cuối thập kỷ 20. Ở sinh vật bậc cao, các gen mã cho protein hay các ARNt, ARNr hầu như đều bị gián đoạn. Độ dài trung bình của exon khoảng 200 bp trong khi của intron có thể lớn hơn 10 kb hoặc thậm chí đạt tới 50-60 kb. Ngoài ra, hiện tượng các gen nằm gối lên nhau (overlapping genes) rất hiếm xảy ra ở ADN nằm trong nhân tế bào eukaryot. Hiện tượng này hay gặp trong genome prokaryot và với gen phân bố trong các bào quan của tế bào eukaryot. Hơn nữa, một gen này có thể nằm trong một gen khác, tức là gen thứ hai được phân bố trong intron của gen thứ nhất. Ví dụ, điển hình cho trường hợp gen trong gen (genes-within-genes) ở genome của người là gen mã cho neutrofibromatosis loại I. Intron 27 của gen này có chứa 3 gen khác, mỗi gen đó đều có exon và intron riêng của mình (Hình 1.8). Hình 1.8: Cấu trúc gen trong gen ở intron 27 của gen mã cho neurofibromatosis. Intron 27 có chứa 3 gen nhỏ OGMP, EV12B và EV12A. Mỗi gen này đều có intron (I) và exon (phần sẫm màu). Có thể phân loại các gen tùy theo cấu trúc của gen hoặc theo chức năng của các sản phẩm do chúng mã hoá. Genome đơn bội ở các cơ thể đa bào có khoảng 1/4 đến 1/2 số gen mã cho protein là các gen đơn lẻ (single copy gene), không tồn tại bản sao thứ hai. Số gen còn lại thường tồn tại hai hoặc nhiều bản sao trong genome. Các bản sao của một gen không bắt buộc phải giống nhau hoàn toàn do trong quá trình tiến hoá chúng chịu những đột biến như thêm, mất, thay thế hoặc chuyển đoạn các nucleotide. Các gen hình thành từ một gen tổ tiên được xếp vào một họ gen (family genes). Các gen trong cùng một họ có thể tập trung thành một nhóm (trên một nhiễm sắc thể) hoặc phân tán trong genome (trên các nhiễm sắc thể khác nhau). Sản phẩm của các thành viên trong một họ có chức năng giống hệt nhau hoặc có liên quan đến nhau mặc dù các gen này thường hoạt động ở những thời điểm nhất định và trong các loại tế bào biệt hoá khác nhau. Ví dụ, việc tổng hợp các protein globin (được mã bởi các gen trong cùng một họ gen) xảy ra ở những giai đoạn nhất định trong quá trình phát triển phôi
  20. 20 thai và ở cơ thể trưởng thành. Ngoài ra còn có những trình tự nucleotide giống với một gen đã biết nhưng trình tự đó không được phiên mã hoặc không được dịch mã. Chúng được gọi là giả gen (pseudogen). Một số gen gồm nhiều bản sao giống hệt nhau lặp đi lặp lại liên tục trên một vùng nhiễm sắc thể (tandem repeat genes). Ví dụ, gen mã cho ARNr, ARNt, histone vv Như vậy, các gen eukaryot có thể phân thành các loại chính như sau: gen đơn lẻ, các gen thuộc một họ gen, gen lặp đi lặp lại liên tục và các pseudogen. 1.4.1. Các gen trong cùng một họ gen Cho đến nay, hầu hết các gen mã cho protein được nghiên cứu ở sinh vật eukaryot đều không phải là những gen đơn lẻ. Khoảng một nửa các gen đã biết trong genome động vật có xương sống đều có các bản sao giống hệt hoặc tương tự (số bản copy có thể từ 2 đến 20). Hiện tượng tồn tại nhiều bản sao giống hoặc tương tự của một gen có thể gây ra do sai lệch trong trao đổi chéo giữa hai nhiễm sắc thể tương đồng trong phân bào giảm nhiễm (meiosis). Điều đó làm cho một nhiễm sắc thể có số lượng bản copy tăng lên trong khi nhiễm sắc thể kia có số lượng giảm đi (Hình 1.9). Hình 1.9: Sai lệch trong trao đổi chéo giữa hai nhiễm sắc thể (mỗi nhiễm sắc thể có hai bản sao của một gen) khiến một nhiễm sắc thể chỉ mang một bản sao trong khi nhiễm sắc thể thứ hai mang ba bản sao. Sản phẩm của các thành viên trong một họ gen có chức năng giống nhau nhưng thường được sử dụng ở những thời điểm phát triển khác nhau hoặc trong các loại tế bào biệt hoá khác nhau. Trình tự acid amin của chúng chỉ tương tự mà không giống nhau hoàn toàn. Khi một thành viên trong họ gen bị bất hoạt, thành viên khác có thể được hoạt hoá thay thế mặc dù bình thường thành viên thứ hai không hoạt động cùng với gen ban đầu. Các gen globin là thí dụ điển hình về một họ gen (Hình 1.10). Ở mọi loài động vật, các gen này có cấu trúc tương tự do chúng có cùng nguồn gốc từ một gen tổ tiên. Tế bào trong cơ thể trưởng thành có globin tồn tại ở dạng tetramer gồm hai chuỗi polypeptide α và hai chuỗi β. Các gen mã cho các chuỗi này nằm trên hai nhiễm sắc thể khác nhau. Do đó hoạt động của chúng phải được phối hợp đồng thời sao cho số lượng hai loại polypeptide được tạo ra một cách tương đồng với nhau về mặt số lượng. Tế bào máu của phôi cũng chứa globin ở dạng tetramer nhưng gồm hai chuỗi tương tự α và tương tự β. Các gen mã cho chuỗi α và chuỗi tương tự α đều thuộc một họ gen trong khi các gen mã cho chuỗi β và chuỗi tương tự β thuộc họ gen khác. Ngoài ra, trong mỗi họ còn có các pseudogen (gen giả) và một số thành viên khác mà sản phẩm của chúng đôi khi vẫn được sử dụng.
  21. 21 Hình 1.10: Họ gen globin α và β ở người tập trung thành các nhóm trên hai nhiễm sắc thể. Chúng gồm các gen mã cho globin và các pseudogen (ψ). Các gen hoạt động theo trình tự từ trái sang phải phù hợp với quá trình phát triển từ phôi đến cơ thể trưởng thành. Họ gen globin α chiếm 28 kb trên nhiễm sắc thể 16, gồm các gen ξ, α1, α2 và θ. Sản phẩm của hai gen α1, α2 giống hệt nhau. Họ gen globin β chiếm 50 kb trên nhiễm sắc thể 11 gồm 5 gen hoạt động (ε, Gγ, Aγ, δ, β) và một pseudogen ψβ. Sản phẩm của hai gen γ chỉ khác nhau duy nhất ở một acid amin tại vị trí 136 (Glicine và Alanine). Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau tạo ra các dạng globin không giống nhau và được sử dụng ở những giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể (Bảng 1.1). Bảng 1.1: Các dạng globin thay đổi trong quá trình phát triển ở người Giai đoạn phát triển Hemoglobin Mô phôi (8 tuần) ξ2ε2, ξ2γ2, α1ε2 Thai nhi (3-9 tháng) α2 γ 2 Cơ thể trưởng thành (từ khi sinh) α2 δ2 (~ 2%), α2 β 2 (~97%), α2γ2 (~1%) Bên cạnh họ gen mã cho globin tập trung tại hai vùng trên nhiễm sắc thể 11 và 16, họ gen mã cho aldolase được xem là ví dụ điển hình về sự phân bố rải rác của một họ gen trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Họ gen này gồm 5 gen thành viên phân bố trên 5 nhiễm sắc thể 3, 9, 10, 16 và 17. Mặc dù phân tán trong khắp genome, các gen này có độ tương đồng rất cao về trình tự nucleotide cũng như trình tự acid amin tuơng ứng. 1.4.2. Gen lặp đi lặp lại liên tục Thông thường các thành viên trong một họ gen không giống nhau hoàn toàn. Sự sai khác giữa chúng đảm bảo tính hoạt động độc lập của từng gen và được duy trì qua chọn lọc. Tuy nhiên cũng có một vài trường hợp cá biệt, số lượng các thành viên trong họ rất lớn và chúng giống hệt nhau, thường tập hợp thành các nhóm phân bố trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Mỗi nhóm có thể bao gồm từ hai cho đến hàng trăm gen, gen nọ nối tiếp gen kia. Việc lặp đi lặp lại liên tiếp các bản sao của một gen trên một đoạn ADN (trên một vùng nhiễm sắc thể) có thể nhằm mục đích đáp ứng nhanh, đủ số lượng rất lớn sản phẩm của gen khi tế bào yêu cầu, ví dụ như cần đáp ứng kịp thời các phân tử ARNr cho giai đoạn sinh trưởng nhanh (phôi) hoặc các loại protein histone cho quá trình tái bản ADN. Gen mã cho ARNr: ARN ribosome chiếm 80-90% tổng số ARN có trong tế bào. Số gen mã cho chúng thay đổi từ 7 ở E.coli, 100-200 ở eukaryot bậc thấp đến vài trăm ở động vật bậc cao. Trong nhân tế bào eukaryot, hầu hết các gen mã cho ARNr tập trung thành từng nhóm chiếm một vùng trên nhiễm sắc thể (vùng ADNr). ARNr gồm các loại chính ARNr-5S, ARNr-5.8S, ARNr-18S và ARNr-28S (tương ứng với hai tiểu phần nhỏ và lớn của ribosome). Phân tử ARNr-5S được mã bởi gen riêng biệt và được tổng hợp bởi ARN polymerase III.
  22. 22 Genome của người có chứa khoảng 2000 gen mã cho ARNr 5S. Tất cả các gen này đều tập trung trên một vùng của nhiễm sắc thể số 1. Ba loại ARNr 5.8S, 18S và 28S được tổng hợp từ một gen bởi ARN polymerase I (Hình 1.11). Một phân tử tiền thân ARNr được phiên mã từ gen, sau đó bị cắt bởi các ribonuclease tạo thành các phân tử ARNr 18S, 5.8S và 28S. Đoạn nucleotide nằm giữa các phân tử ARN này sẽ bị phân hủy. Mỗi một nhóm gen mã cho ARNr gồm nhiều gen giống hệt nhau, khoảng cách giữa mỗi gen thay đổi tuỳ theo loài, thậm chí ngay trong cùng một loài. Genome ở người có khoảng 280 bản sao của gen mã cho ba loại ARNr, tập trung thành 5 vùng (mỗi vùng có từ 50 - 70 bản copy), phân bố trên 5 nhiễm sắc thể 13, 14, 15, 21 và 22. Ở động vật có vú, mỗi gen thường chiếm 13kb, nằm cách nhau khoảng 30 kb. Khoảng cách này có vai trò trong khởi động quá trình tổng hợp ARNr hoặc giúp cho ARN polymerase dễ dàng bám vào promoter. Hình 1.11: Một đơn vị phiên mã (một gen mã cho ARNr) mang thông tin di truyền cho các phân tử ARNr 18S, 5.8S và 28S Gen này được lặp đi lặp lại liên tục. Khoảng cách giữa các gen thay đổi tuỳ theo từng loài sinh vật. Gen mã cho protein histone: Protein histone tham gia liên kết với ADN để hình thành cấu trúc nucleosome. Có bốn loại histone khác nhau. Histone H2A, H2B, H3 và H4 tương tác với nhau tạo cấu trúc lõi. Lõi này được quấn quanh bởi đoạn ADN 146 bp tạo thành nucleosome. Histone H1 liên kết với ADN linker nằm giữa các nucleosome. Histone chiếm khoảng 0,5-1% tổng số protein của tế bào eukaryot. Việc tổng hợp protein này xảy ra trong suốt 1/3 chu kỳ tế bào (ở pha S). Tuy nhiên phân tử ARNm histone có thời gian bán sống ngắn (vài phút). Có lẽ vì lý do đó, có rất nhiều gen mã cho histone (50-500) phân bố thành các nhóm trên nhiễm sắc thể. Chúng nằm nối tiếp nhau, mỗi nhóm chiếm khoảng 5-6 kb (ở động vật có xương sống) (Hình 1.12). Cũng giống như nhóm gen mã cho ARNr, khoảng cách giữa các gen trong cùng một nhóm và giữa các nhóm thay đổi giữa các loài, thậm chí ngay trong từng cá thể. Có thể phân biệt các gen mã cho histone thành hai nhóm. Nhóm thứ nhất gồm các gen mã cho histone dùng trong quá trình tái bản ADN. Nhóm gen này không có intron và phân tử ARNm phiên mã từ chúng không có đuôi polyA. Đây là điều khác biệt với các ARNm eukaryot. Nhóm gen thứ hai gồm những gen mã cho histone tham gia vào quá trình biến đổi cấu trúc không gian của nhiễm sắc thể (liên quan đến thông tin di truyền ngoại sinh). Các gen thuộc nhóm này có chứa intron và phân tử ARNm tương ứng có gắn đuôi polyA.
  23. 23 Hình 1.12: Bản đồ phân bố các gen mã cho histone ở Cầu gai (A) và ở Ruồi giấm (B). Mỗi nhóm được lặp đi lặp lại trên một vùng nhiễm sắc thể. Chiều tổng hợp ARNm cho mỗi loại histone không giống nhau (chiều mũi tên) chứng tỏ ngay trong một nhóm, các gen hoạt động độc lập nhau. 1.4.3. Pseudogen (gen giả) Mọi thành viên trong một họ gen đều có thể hoạt động tùy thuộc trạng thái tế bào. Tuy nhiên có những thành viên mà không bao giờ phát hiện được sản phẩm của chúng mặc dù chúng giống hệt hoặc có trình tự nucleotide tương đồng rất cao với các thành viên khác. Những gen đó được gọi là các Pseudogen (tạm dịch là các gen giả, thường ký hiệu là ψ). Pseudogen không tạo được sản phẩm cuối cùng là protein, mặc dù chúng có thể được phiên mã tổng hợp ARNm. Cấu trúc pseudogen có thể chỉ gồm toàn exon hoặc gồm các exon và intron hoặc có trình tự nucleotide giống hệt hay tương tự các gen hoạt động khác nhưng không có promoter. Thực nghiệm cho thấy đột biến đã xảy ra ở các pseudogen khiến quá trình phiên mã không thể khởi động được, hoặc khiến quá trình tổng hợp ARNm dừng không đúng chỗ, hoặc ngăn cản phản ứng cắt nối intron-exon tạo phân tử ARNm. Thậm chí ngay khi phân tử ARNm được tạo ra, nó đã chứa các tín hiệu làm dừng quá trình tổng hợp protein sớm hơn cần thiết. Hầu hết các họ gen đều có các pseudogen, mặc dù với số lượng rất nhỏ. Các gen này có thể xuất hiện do sai lệch trong trao đổi chéo giữa các allen của hai nhiễm sắc thể tương đồng. Theo thời gian, các đột biến thêm, bớt, chuyển đoạn hoặc thay thế nucleotide ngày càng tích tụ trên các pseudogen. Ngoài ra không thể loại trừ khả năng enzym reverse transcriptase tổng hợp phân tử ADN trên khuôn mẫu các ARNm và các bản sao ADN này được ghép vào genome. Do đó, pseudogen thường không có promoter, không chứa intron, không có các đoạn nucleotide 5’ và 3’ nằm trước mã khởi đầu và nằm sau mã kết thúc phản ứng tổng hợp protein. Hai đoạn trước và sau này được gọi là đoạn không dịch mã (5’ and 3’untranslated regions). 1.5 Thành phần ADN lặp lại trong genome eukaryot 1.5.1. ADN vệ tinh (satelitte DNA) và ADN tiểu vệ tinh (minisatelitte DNA) Bên cạnh các họ gen và các gen lặp đi lặp lại liên tiếp, genome trong tế bào eukaryot còn chứa những vùng ADN gồm các oligonucleotide (thường từ 5, 10 đến 150, 300 bp) được lặp đi lặp lại rất nhiều lần. Điều đó tạo ra những đặc tính vật lí riêng biệt của loại ADN này. Dựa vào đó người ta có thể phân đoạn và tách chúng ra khỏi ADN genome. Chúng được gọi là các
  24. 24 ADN vệ tinh (DNA satellite). Tỷ lệ ADN vệ tinh thay đổi giữa các loài chiếm từ 10 đến 30% hệ gen. Trong hầu hết tế bào động vật có vú, ADN vệ tinh thường tập trung xung quanh tâm động (centromere) và vùng cuối hai đầu nhiễm sắc thể (telomere). Sự phân bố của chúng ở đó có vai trò nhất định trong quá trình phân chia tế bào và đảm bảo độ dài của telomere qua các lần tái bản ADN. Khi các nhiễm sắc thể phân ly về hai cực trong phân bào, các protein đặc hiệu bám dính vào những vị trí đặc biệt ở tâm động để kiểm tra, điều khiển sự di chuyển đó. ADN vệ tinh giữ vai trò của những vị trí đặc biệt này. Nói chung chúng không được phiên mã sang phân tử ARN. Ngoài ra, ADN vệ tinh ở tâm động được nhân bản cuối cùng trong quá trình tái bản nhiễm sắc thể. Rất có thể hiện tượng lặp đi lặp lại của một loại ADN tại tâm động nhằm ngăn cản sự xuất hiện tâm tái bản tại vị trí này. Ở côn trùng ADN vệ tinh thường bao gồm các đoạn nucleotide rất ngắn (khoảng 5-15 bp), còn ở động vật có vú thành phần này đa dạng hơn và thường phân bố thành từng nhóm trên nhiễm sắc thể. Ở người, có ít nhất hơn 10 loại ADN vệ tinh. Mỗi loại có thể chiếm tới 0,5-1% tổng số genome, tương đương khoảng 107 bp. Đối với từng cá thể riêng biệt, trong mỗi loại ADN vệ tinh, các đoạn oligonucleotide có thể lặp lại hoàn toàn chính xác như nhau hoặc có thể xảy ra sự thay thế, loại bỏ hay thêm vào một vài nucleotide. Tuy nhiên những biến đổi này phụ thuộc từng vùng trên nhiễm sắc thể. Chức năng của ADN vệ tinh phân bố rải rác trong genome chưa được sáng tỏ. Những năm cuối của thập kỷ 20, sinh học hiện đại đã chứng minh được các đoạn lặp lại phân bố gần hoặc nằm ngay trong gen có vai trò kiểm soát hoạt động của gen đó. Thông thường các đoạn ADN lặp lại không được phiên mã. Chúng bị bất hoạt do các cytosine và histone H3 bị methyl hoá ở lysine 9 nhưng histone H4 bị khử nhóm acetyl. Khi các oligonucleotide gồm khoảng 25-50 bp được lặp lại nhiều lần chiếm một đoạn ADN từ 1 đến 5 kb, thậm chí đến 20 kb thì chúng được gọi là ADN tiểu vệ tinh (minisatellite DNA) hoặc ADN lặp lại ngẫu nhiên đa hình VNTR (variable number tandem repeat). Tương tự như ADN vệ tinh, việc tồn tại của ADN tiểu vệ tinh có liên quan đến cấu trúc nhiễm sắc thể bởi vì loại ADN này thường bắt gặp ở telomere. Tuy nhiên, chức năng của ADN tiểu vệ tinh phân bố rải rác trong genome chưa được làm sáng tỏ. Ngoài ra khi số nucleotide rất ít (1-4 bp) được lặp lại nhiều lần thành từng đoạn khoảng 200 bp thì chúng được gọi là ADN vi vệ tinh (microsatellite DNA). ADN vi vệ tinh thường bao gồm 1 đến 4 nucleotide lặp lại khoảng 10 đến 20 lần. Số lượng loại ADN này rất lớn trong genome, vì vậy chúng được dùng làm chỉ thị phân tử trong việc xác định vị trí của gen trên bản đồ. Ví dụ, trong genome người, ADN vi vệ tinh CA (CACACA ) lặp đi lặp lại chiếm khoảng 0,5% (15Mb), trong khi sự lặp lại của một nucleotide A (AAA ) cũng chiếm đến 0,3%. Mặc dù chức năng của ADN vi vệ tinh chưa được biết nhưng chúng có một có một ý nghĩa rất quan trọng trong lập bản đồ toàn bộ genome. Trong mỗi một quần thể, các ADN vi vệ tinh tương tự như nhau, tuy nhiên số lần lặp lại cũng như những biến đổi trong mỗi loại phụ thuộc vào từng cá thể. Nói một cách khác, mỗi loại tiểu vệ tinh tồn tại trong mọi cá thể của quần thể, nhưng số lần lặp lại cũng như các biến đổi trong trình tự nucleotide lại đặc trưng cho từng cá thể. Tính chất này được áp dụng để phân biệt các cá thể khác nhau và phân tích quan hệ huyết thống (kỹ thuật DNA-fingerpring ). 1.5.2. Các đoạn ADN có khả năng di chuyển
  25. 25 Tần số trao đổi chéo giữa các ADN tiểu vệ tinh lớn hơn khoảng 10 lần so với trao đổi chéo xảy ra giữa các đoạn nhiễm sắc thể tương đồng trong phân bào giảm nhiễm. Đó là một trong những nguyên nhân tạo ra sự khác biệt giữa genome của các cá thể trong một loài. Ngoài ra sự đa dạng của genome còn do các đoạn ADN có khả năng di chuyển (thường được gọi là transposon). Khi di chuyển, các transposon gây ra việc sắp xếp, tổ chức lại genome của từng cá thể như tạo các đoạn ADN mới hoặc thay đổi chức năng hoạt động của các đoạn ADN ở vị trí chúng ghép vào và tách ra. Chúng có thể di chuyển tới vị trí bất kỳ và hoàn toàn không yêu cầu mối quan hệ nào giữa hai vị trí mới và cũ. Khi tách ra khỏi vị trí cũ, transposon có thể mang theo các đoạn ADN phụ cận, gây sự mất đoạn tại vị trí cũ. Ngược lại, khi ghép vào vị trí mới, chúng gây ra hiện tượng thêm đoạn hoặc chuyển đoạn ở vị trí mới. Do đó, transposon giống như các vector chuyên chở ADN từ nơi này sang nơi khác trong một genome hoặc từ genome này sang genome khác. Ngoài ra, trao đổi chéo giữa các transposon tương đồng ở hai vị trí khác nhau trên một hoặc trên hai nhiễm sắc thể cũng tạo ra những biến đổi tương tự. Những biến đổi đó dẫn đến sắp xếp lại genome, tạo tính đa dạng giữa chúng và tính đặc thù riêng của từng cá thể. Đặc biệt, sự thay đổi vị trí của các transposon còn có thể gây ảnh hưởng đến hoạt động của các gen phân bố xung quanh ngay khi chúng không làm thay đổi trật tự nucleotide ở những gen này. Do đó hoạt động của các gen liên quan đến sự di chuyển của transposons (thường là các gen nằm trong transposon) được kiểm soát rất chặt chẽ. Cơ chế kiểm soát chủ yếu thông qua biến đổi cấu trúc không gian vùng nhiễm sắc thể chứa transposon như methyl hoá ADN, methyl hoá histone H3, deacetyl histone H4 vv Cách thức di chuyển và ghép vào genome của các đoạn ADN đặc biệt này tuân theo hai cách liên quan đến dạng trung gian ADN hoặc ARN. Những đoạn ADN nào mà sự di chuyển của chúng gắn liền với dạng trung gian ARN được gọi là retroelement hoặc ADN retrotransposon. Việc di chuyển của retroelement xảy ra tương tự với cách thức xâm nhiễm của virus mà genome của chúng là phân tử ARN (những virus này được gọi là retrovirus). Một khi đã xâm nhiễm vào tế bào, ARN của retrovirus được sao chép bởi reverse transcriptase tạo ra ADN. Phân tử ADN này sẽ được ghép vào genome của tế bào chủ. Khi virus sinh sôi, phần ADN đó lại được dùng để phiên mã tạo ra các phân tử ARN mới cần thiết cho việc đóng gói tạo virus mới. Trong số các loại retroelement, cần lưu ý đến yếu tố ERVs (endogenous retrovirus) và các retrotransposons. Chúng đều là những đoạn ADN có khả năng di chuyển trong genome. Tuy nhiên ERVs có chung một đặc điểm là hai đầu được tận cùng bởi hai đoạn nucleotide lặp lại với kích thước lớn (long terminal repeat-LTRs). LTRs giữ vai trò quyết định trong quá trình di chuyển. Ngoài ra, retrotransposons bao gồm các yếu tố LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) hoặc SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) là những đoạn lặp lại dài hoặc ngắn phân bố rải rác trên các nhiễm sắc thể. Yếu tố LINEs không chứa LTRs nhưng có mang gen mã cho reverse transcriptase trong khi SINEs không có gen đó nhưng có khả năng "vay mượn" enzym này do các retroelements khác tổng hợp. Trong genome của người, yếu tố LINE-1 có tới 3500 bản sao dài nguyên vẹn 6,1 kb và hàng trăm nghìn bản sao có kích thước ngắn hơn. Bên cạnh đó trình tự Alu gồm hàng triệu bản sao là ví dụ điển hình của yếu tố SINEs. Mặc dù phân tử ARN được tổng hợp từ Alu nhưng sản phẩm protein không được tạo thành. Dù sao sự tồn tại của các ARN này cũng làm tăng cơ hội giúp Alu ghép vào genome. Các transposon ADN có khả năng thay đổi vị trí trong genome eukaryot không qua dạng trung gian ARN chiếm tỷ lệ ít hơn so với các retroelement. Ví dụ, ở genome người, chỉ có
  26. 26 khoảng 100 loại ADN transposon. Tuy nhiên, ADN transposon có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với sự đa dạng hoá genome. Một số transposon có mặt trong genome của các loại sinh vật khác nhau. Ví dụ, yếu tố mariner có chiều dài 1250 bp được tìm thấy ở ruồi giấm Drosophila cững như rất nhiều động vật khác, kể cả người. Phải chăng các transposon này có thiên chức tự nhiên trong tiến hoá là chuyên chở gen giữa các genome khác nhau? Các transposon có chung đặc điểm là hai đầu tận cùng của mỗi transposon có chứa hai đoạn oligonucleotide lặp lại ngược chiều (inverted repeats). Các transposon có thể chia làm hai loại dựa vào khả năng di chuyển độc lập hay phải phụ thuộc vào sự có mặt của transposon khác. *Loại thứ nhất gồm các đoạn ADN có khả năng di chuyển độc lập. Chúng chứa gen mã cho các protein điều khiển quá trình đó, ví dụ enzym nhận biết hai đầu transposon để cắt chúng ra khỏi vị trí cũ và ghép vào vị trí mới. Do đó, chúng tách ra khỏi vị trí cũ, ghép vào vị trí mới hoàn toàn độc lập. Nhờ khả năng này, chúng tạo ra các đột biến không bền vững. *Loại thứ hai gồm các transposon không có khả năng tự hoạt động, tức là chúng không có khả năng di chuyển do không chứa gen mã cho các enzym cần thiết. Việc di chuyển của transposon ở loại này phụ thuộc vào sự có mặt của transposon có khả năng hoạt động độc lập (transposon nhóm 1) cùng nhóm. Hai transposon có thể xếp vào cùng nhóm khi chúng có cấu trúc tương đồng với nhau, đặc biệt là các đoạn oligonucleotide phân bố ở hai đầu transposon. Đây là vị trí để enzym nhận biết và cắt nối transposon ở vị trí cũ và mới. Khi các transposon loại này di chuyển, chúng tạo ra những đột biến bền vững nếu như trong thế hệ nối tiếp chúng đã phân ly độc lập (phân ly theo định luật Mendel) với transposon có khả năng hoạt động độc lập cùng nhóm. Các transposon đơn giản nhất ở vi khuẩn được gọi là đoạn gắn IS (Insertion Sequences). Chúng có thể nằm trên chromosome hoặc trên các plasmid. Để diễn tả việc ghép của IS vào vị trí nào đó, ký hiệu hai lần dấu hai chấm được sử dụng (::). Ví dụ, λ :: IS1 mô tả transposon IS1 gắn vào genome của bacteriophage λ. Transposons vi khuẩn không giữ một chức năng nào trong tế bào. Trình tự nucleotide ở một đầu IS thường lặp lại nhưng ngược chiều so với đầu kia. Hai trình tự ở hai đầu một IS được gọi là trình tự lặp lại ngược chiều (inverted repeat). Ví dụ, cấu trúc của một IS có trình tự như sau: GGTAT-Xn-ATACC (trong đó n là số nucleotide nằm giữa hai đầu lặp lại ngược chiều). Do đó khi sợi đúp IS tách thành hai sợi đơn thì mỗi sợi này có khả năng hình thành liên kết bổ sung tại hai đầu của IS tạo cấu trúc dạng vòng (stem-loop) (Hình 1.13). Hình 1.13: Cấu trúc dạng vòng được tạo ra do liên kết tạo cặp bổ sung giữa hai trình tự lặp lại ngược chiều của một IS trên một sợi đơn ADN. Ngoài các IS, ở vi khuẩn còn có các đoạn ADN có khả năng di chuyển với kích thước dài hơn, gọi là transposon Tn. Các Tn thường phân bố trên plasmid (phân tử ADN dạng vòng, kích thước thường không lớn) và có khả năng ghép xen vào bất kỳ vị trí nào trong genome. Chúng thường mang thông tin di truyền mã cho các protein chống chịu kháng sinh.
  27. 27 Giữa IS và Tn có mối quan hệ về trình tự các nucleotide. Các Tn thường được giới hạn ở hai đầu bởi một loại IS nào đó. Hình 1.14: Cấu trúc của transposon Tn-9. Hình 1.14 mô tả cấu trúc của transposon Tn-9. Transposon này mang hai gen; một mã cho tính chống chịu chloramphenicol (Rch) và gen kia mã cho protein cần thiết cho sự di chuyển. Hai đầu của Tn-9 được giới hạn bởi IS-1 mà trình tự nucleotide của IS này sắp xếp theo cùng một chiều. Một số transposon chứa gen mã cho các enzym transposase làm nhiệm vụ nhận biết chuỗi nucleotide lặp lại ngược chiều (inverted repeat) để cắt transposon. ADN của vị trí mới bị cắt sao cho mỗi sợi đơn lệch nhau vài nucleotide (cắt thành đầu so le). Transposon nối vào các đầu cắt, tạo ra hai khoảng trống (gaps). Khoảng trống được sửa chữa theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Do đó các nucleotide của đầu so le ở vị trí mới được sao chép thành hai bản, mỗi bản ở một đầu và trình tự sắp xếp các nucleotide giống nhau. Vì vậy chúng được gọi là lặp lại cùng chiều (direct repeat) (Hình 1.15). Chiều dài của chúng thường khoảng 7-9 bp. Dựa vào sự có mặt của các đoạn cùng chiều và ngược chiều có thể xác định được vị trí transposon ghép vào hoặc chuyển đi. Hình 1.15 : Một transposon có hai đầu tận cùng gồm 7 nucleotide (1234567) lặp lại ngược chiều, gắn vào vị trí có 5 nucleotide (ATGCA) trong genome. Sau khi ghép nối, đoạn ngắn ATGCA được lặp lại nhưng sắp xếp theo cùng một chiều. Quá trình di chuyển của một transposon từ vị trí cũ (donor) sang vị trí mới (recipient) xảy ra theo hai cơ chế khác nhau: Cơ chế sao y bản chính (transposon có mặt ở cả hai vị trí) và cơ chế tách ra khỏi vị trí cũ di chuyển đến vị trí mới. Trong cơ chế thứ nhất, trình tự nucleotide
  28. 28 của transposon được sao chép từ vị trí cho và được ghép vào vị trí nhận. Như vậy mỗi lần di chuyển thì số lượng bản sao được tăng lên. Quá trình này liên quan đến hai loại enzym: transposase (tác động vào hai đầu bản gốc transposon) và resolvase (tác động lên bản sao). Trong cơ chế thứ hai, một transposon có thể tách ra khỏi vị trí cũ và ghép vào vị trí mới. Như vậy số lượng transposon không thay đổi. Kiểu di chuyển này chỉ đòi hỏi enzym transposase. Khi transposon chuyển đi, vị trí cũ bị gãy. Nó được nối lại nhờ cơ chế sửa chữa ADN trong tế bào. Ở sinh vật eukaryot, các transposon còn được gọi là yếu tố kiểm soát (controlling elements). Chúng được nghiên cứu từ những năm 1940. Tuy nhiên cơ chế hoạt động của chúng ở mức độ phân tử chỉ mới được sáng tỏ trong những năm gần đây. Các nghiên cứu điển hình được tiến hành với transposon ở ngô và ở ruồi giấm Drosophila. Transposons di chuyển, sắp xếp và khởi động các gen ở những thời điểm đặc trưng cho quá trình sinh trưởng phát triển của cá thể. Hai loại transposon Ac và Ds được nghiên cứu khá kỹ ở ngô. Chúng cùng thuộc vào một nhóm transposon, đều có hai trình tự lặp lại ngược chiều giống nhau. Di chuyển của các transposon Ds phụ thuộc vào sự có mặt của Ac. Trình tự nucleotide của Ac gồm 4563 bp, được giới hạn hai đầu bởi 11 bp lặp lại ngược chiều, tiếp đến 8 bp lặp lại cùng chiều của genome. Mọi Ds đều có đoạn lặp lại ngược chiều giống nhau mặc dù chiều dài của chúng thay đổi (Hình 1.16).
  29. 29 Hình 1.16: Cấu trúc của transposon Ac/Ds. Các Ds có chiều dài khác nhau (do Ac bị đột biến mất đoạn) hoặc có thể chứa đoạn ADN hoàn toàn không tương đồng với Ac, hoặc có thể nằm xen vào nhau. Tuy nhiên tất cả các transposon này đều được giới hạn bởi 11 bp lặp lại ngược chiều. Các transposon ở ngô thường ghép vào gần các gen, làm rối loạn hoạt động của chúng dẫn đến việc xuất hiện tính trạng mới nhưng không gây đột biến chết. Sự di chuyển của transposon ghép vào vị trí allen của một gen bất kỳ trên nhiễm sắc thể xảy ra ở tế bào soma sẽ tác động đến biểu hiện của allen đó trong quá trình phát triển của cây. Trải qua phân bào nguyên nhiễm (mitose), con cháu của tế bào chứa allen đột biến đó sẽ có biểu hiện tính trạng mới (thường quan sát được ở hình dạng, màu sắc của hạt ngô). Thay đổi này xảy ra trong quá trình phát triển soma được gọi là "variegation" hay còn gọi là hiện tượng mosaic (xuất hiện các đốm). Ở ruồi giấm Drosophila melanogaster, yếu tố P có khả năng di chuyển được phát hiện khi tiến hành lai giữa con đực dòng P với con cái dòng M. Hầu hết con lai bị bất dục, nhiễm sắc thể bị đứt gãy, bị đột biến. Hiện tượng rối loạn di truyền này chỉ xảy ra theo một chiều, tức là phép lai giữa con cái dòng P với con đực dòng M vẫn tạo ra các con lai bình thường. Hiện tượng này gây ra do genome của các cá thể thuộc dòng P có chứa yếu tố di chuyển P. Yếu tố dài nhất gồm có 2907 bp có chứa gen mã cho transposase. Điều đáng chú ý là mặc dù có chiều dài khác nhau, các yếu tố P đều có mang các trình tự nhận biết bởi transposase. Quan sát quần thể ruồi giấm trong thiên nhiên cho thấy số lượng P thay đổi từ vài bản sao đến 50 copy/genome. Hơn nữa, những loài ruồi giấm phát hiện trước năm 1950 đều không có P trong genome. Phải chăng P chỉ mới xuất hiện trong genome ruồi trong những năm cuối thế kỷ 20. Liệu sự có mặt của chúng có phải do virus xâm nhiễm ruồi giấm gây nên? Hiện tượng tương tự cũng được quan sát thấy ở vi khuẩn bị nhiễm thực khuẩn thể mang IS. Yếu tố IS xuất hiện trong genome vi khuẩn thông qua quá trình tiếp hợp (transduction). Cơ chế kiểm soát sự di chuyển của P phụ thuộc vào yếu tố tồn tại trong tế bào chất của trứng (di truyền theo mẹ). Khi yếu tố này có mặt thì chúng kìm hãm sự di chuyển của P. Vì vậy, tế bào trứng của con cái dòng P thụ tinh với con đực dòng M vẫn cho con lai bình thường do yếu tố trong tế bào trứng ngăn cản P chuyển chỗ. Tuy nhiên, tế bào trứng dòng M thụ tinh với con đực dòng P cho phép P di chuyển gây ra những rối loạn bất thường trong cấu trúc genome. Điều đó khiến con lai bị bất dục hoặc xuất hiện các tính trạng lạ. 1.6 Tương tác của T-ADN với genome thực vật
  30. 30 Sự di chuyển ADN từ genome vi khuẩn sang genome thực vật được nghiên cứu khá kỹ đối với tương tác giữa Argobacterium tumefaciens hoặc A.rhizogenes với hầu hết các cây hai lá mầm. Hiện tượng di chuyển ADN này gây những biến đổi về mặt di truyền, biểu hiện ở việc xuất hiện các nốt sần trên thân cây hoặc mọc rất nhiều lông rễ tại nơi bị nhiễm vi khuẩn. Bệnh xuất hiện nốt sần hoặc mọc nhiều rễ trên thân chỉ xảy ra khi có mặt Argobacteria. Tuy nhiên sau đó bệnh được duy trì không phụ thuộc sự tồn tại của vi khuẩn. Đó là do một số gen vi khuẩn đã được chuyển vào genome cây chủ và hoạt động gây bệnh. Các gen vi khuẩn có khả năng di chuyển và hoạt động trong tế bào thực vật nằm trên plasmid Ti (Tumor inducing) của A.tumefaciens gây bệnh nốt sần hoặc trên plasmid Ri (Root-hairs inducing) của A.rhizogenes gây bệnh mọc lông rễ. Cũng giống như các khối u động vật, các tế bào thực vật có ADN vi khuẩn ghép vào genome bị chuyển sang trạng thái mới, ở đó sự phát triển và biệt hoá của chúng hoàn toàn khác với các tế bào bình thường. Đó là do hoạt động của các gen vi khuẩn (prokaryot) trong genome của thực vật (eukaryot). Bình thường những gen này có mặt trong genome vi khuẩn nhưng chúng chỉ được bật mở sau khi ghép vào genome thực vật. Quá trình này có tính chất đặc hiệu, tức là một loại vi khuẩn chỉ có khả năng gây nốt sần trên một số loại cây chủ này mà không tương tác được với các loại cây khác. Việc tạo nốt sần hay thực chất quá trình chuyển gen từ vi khuẩn sang genome thực vật dẫn đến biến đổi trạng thái sinh lý của tế bào thực vật đòi hỏi các điều kiện sau: a/ Phải có hoạt động của các gen trên 3 vùng chvA, chvB, pscA nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn để khởi động việc bám dính vi khuẩn vào thân cây. b/ Plasmid Ti phải mang vùng vir - ADN (nằm ngoài đoạn T-ADN). Vùng này mang các gen cần thiết cho việc tách và vận chuyển T-ADN từ vi khuẩn sang tế bào thực vật. Vi khuẩn xâm nhiễm vào tế bào cây chủ tại vị trí tổn thương trên thân cây. Cây có vết thương do sự hư hỏng ngẫu nhiên của màng tế bào thực vật hoặc do vi khuẩn tiết ra hỗn hợp những chất được mã bởi các gen vir. Hoạt động của các gen này được hoạt hoá bởi hợp chất phenolic của cây (ví dụ như acetosyringone, catechol, các dẫn xuất của chalcone ). Ngoài ra, sự có mặt các monosaccharides như glucose, arabinose trong môi trường cũng khiến cho nhóm gen vir của vi khuẩn nhạy cảm hơn với các hợp chất phenolic do cây tiết ra. Sản phẩm của những gen trên vùng vir còn liên quan chủ yếu đến việc cắt T-ADN ra khỏi plasmid và vận chuyển nó vào tế bào chủ. Bằng các thí nghiệm bổ sung chức năng (complementation test), thực nghiệm đã phát hiện ít nhất có 21 polypeptide sản phẩm của các gen vir cũng như xác định được chức năng của hầu hết các protein này trong quá trình vận chuyển T-ADN. Protein VirA đóng vai trò quan trọng trong việc qui định tính đặc hiệu giữa các loại cây chủ với Agrobacteria. Trong thực tế, Agrobacteria không có khả năng xâm nhập vào cây một lá mầm. Có thể protein VirA không nhận biết được các tín hiệu do cây một lá mầm tiết ra. Protein VirC1 nhận biết và tương tác với các nucleotide nằm ở đầu bên phải của T-ADN. Mặc dù hai đầu T-ADN có trật tự tương đối giống nhau (chỉ sai khác nhau 2 nucleotide trong tổng số 25 nucleotide cần thiết cho sự vận chuyển T-ADN) nhưng các nucleotide đầu bên phải giữ vai trò quyết định cắt T- ADN ra khỏi plasmid. Đột biến ở đầu này khiến T-ADN không được cắt ra khỏi plasmid trong khi đột biến đầu bên trái hoàn toàn không ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển T-ADN từ tế bào vi khuẩn vào trong nhân tế bào cây chủ. Điều đó cho thấy việc cắt T-ADN được bắt đầu ở phía bên phải và tiến dần sang bên trái. Điều đặc biệt lưu ý là chỉ có một sợi đơn T- ADN được cắt ra và vận chuyển sang tế bào thực vật. Sợi đơn đó được gọi là sợi T. Đầu 5' của sợi T tương ứng với đầu bên phải của đoạn T-ADN. Các protein VirD1 và VirD2 liên quan đến phản ứng cắt sợi T ra khỏi plasmid. Tiếp theo đó, protein VirE2 tương tác với sợi T dọc theo chiều dài của sợi. Protein VirD2 giữ vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển.
  31. 31 Cấu trúc VirD2 gồm nhiều vùng có hoạt tính khác nhau, liên quan đến các chức năng như cắt, vận chuyển sợi T. Bên cạnh việc tham gia phản ứng cắt sợi T tại đầu bên phải của T-ADN, protein VirD2 còn liên kết với đầu 5' của sợi này tạo thành phức. Nhờ đó T-ADN được vận chuyển dưới dạng phức ra khỏi tế bào vi khuẩn và xâm nhập vào nhân tế bào cây chủ. Bằng các thí nghiệm trên cây chuyển gen, người ta đã phát hiện được protein VirD2 có mặt trong nhân tế bào thực vật. Vận chuyển sợi T ra khỏi tế bào vi khuẩn và ghép vào genome tế bào cây chủ là một quá trình phức tạp, đòi hỏi sự tham gia nhiều protein. Trong số đó, operon virB nằm trên vùng vir giữ một vai trò đặc biệt. Operon này dài 9,5 kb mã cho 11 proteins, đa số là các protein tiết hoặc phân bố trên màng tế bào. Chúng bao gồm ATPase (VirB11) và các protein kỵ nước tạo nên kênh dẫn trên màng. Các nhà nghiên cứu cho rằng một trong các protein được mã bởi operon này phân bố phía ngoài màng làm nhiệm vụ tương tác với protein của tế bào thực vật, tạo kênh dẫn đưa T-ADN vào nhân tế bào cây chủ. c/ Các gen trên vùng T-ADN được ghép vào genome tế bào thực vật gây biến đổi trạng thái các tế bào này. T-ADN là một đoạn ADN có chiều dài khoảng 23 kb (tuỳ thuộc vào từng loại A.tumefaciens) nằm trên plasmid Ti. Hai đầu của đoạn ADN này có chứa 25 bp lặp đi lặp lại giống nhau hoàn toàn chỉ sai khác nhau ở hai nucleotide (imperfect repeat sequence). Các nucleotide đầu bên phải giữ vai trò quan trọng trong việc cắt T-ADN. Các nucleotide đầu bên trái đóng vai trò trong việc ghép T-ADN vào genome cây chủ. T-ADN gồm hai nhóm gen. Nhóm thứ nhất gồm các oncogen mà cơ chế hoạt động của chúng khác biệt giữa A.tumefaciens và A.rhizogenes. Điều đó dẫn đến sự hình thành các nốt sần hoặc bệnh lông rễ. Trong trường hợp xuất hiện nốt sần, T-ADN mang ba oncogen mã cho các enzym tham gia vào phản ứng tổng hợp các hocmon sinh trưởng auxin và cytokinin. Chỉ khi T-ADN được ghép vào genome thực vật, các oncogen nằm trên T-ADN mới hoạt động một cách tự động. Do đó tế bào cây chủ nào có T-ADN ghép vào hệ gen lập tức phát triển không bình thường do rối loạn hocmon sinh trưởng mà T-ADN mã cho. Nốt sần xuất hiện tại vị trí cây bị nhiễm A. tumefaciens là tập hợp của các tế bào bình thường và tế bào bị biến đổi hệ gen. Trong trường hợp với bệnh mọc nhiều lông rễ, R-ADN của A.rhizogenes có chứa các oncogen mà sản phẩm của chúng làm thay đổi ngưỡng nhạy cảm của tế bào thực vật đối với nồng độ hocmon có mặt trong môi trường. Từ đó gây rối loạn sự phát triển của các tế bào có R-ADN ghép vào khiến cho rất nhiều rễ xuất hiện tại vị trí nhiễm. Nhóm gen thứ hai có mặt trên đoạn T-ADN gồm các gen mã cho các enzym tham gia tổng hợp những phức chất dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Các phức chất này được gọi chung là opines. Vi khuẩn sử dụng opines như nguồn cacbon và nitơ. Đặc biệt, khi T-ADN mang gen mã cho một loại opine nào đó thì ngay trên plasmid Ti, nằm ở ngoài đoạn T-ADN, có các gen tham gia quá trình chuyển hoá loại opine này, giúp cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Điều đáng lưu ý là opine được tổng hợp lại trở thành tín hiệu kích thích hoạt động của operon chứa các gen đồng hoá opine đó nằm trên plasmid Ti. Vì opine là protein được mã bởi các gen vi khuẩn, sự có mặt của chúng trong tế bào thực vật được xem là chỉ thị để phát hiện sự chuyển ghép thành công của T-ADN vào genome thực vật. T-ADN được vận chuyển vào trong nhân tế bào chủ và được ghép vào genome. Có thể xuất hiện nhiều bản sao của T-ADN trong một genome. Dạng vòng của T-ADN đôi khi được tìm thấy trong tế bào cây chủ. Đây là dạng trung gian hay chỉ là sự liên kết ngẫu nhiên giữa hai đầu trái và phải của T-ADN đang là vấn đề cần làm sáng tỏ. Khi đã ghép vào genome vật
  32. 32 chủ, các gen trên đoạn T- ADN mới được hoạt động. Như vậy điều đáng chú ý là các gen trên T-ADN (prokaryot) chỉ hoạt động dưới sự kiểm soát của các yếu tố phiên mã trong genome eukaryot. Nói chung, một gen được điều khiển bởi một promoter. Argobacterium có khả năng đưa các gen lạ vào genome thực vật. Vì vậy, chúng được sử dụng như các vector chuyên chở gen một khi các gen gây nốt sần trên T-ADN bị thay thế bởi gen nghiên cứu. Ngoài ra, promoter của các gen trên T-ADN đều là những promoter hoạt động mạnh trong tế bào nhận. Vì vậy chúng được sử dụng làm promoter báo cáo hoặc promoter điều khiển gen lạ trong kỹ thuật chuyển gen. Kỹ thuật này được ứng dụng rất rộng rãi trong nông nghiệp. Ví dụ, đưa các gen chống chịu sâu bệnh, gen chịu được môi trường trồng trọt khắc nghiệt vào các cây trồng quí hiếm hoặc cho năng suất cao. 1.7 ADN trong ty thể và lục lạp Đối với tế bào eukaryot, ADN không chỉ phân bố trong nhân mà còn có mặt ở ty thể và lục lạp. Hầu hết phân tử ADN trong các bào quan này ở dạng mạch vòng. Tuy nhiên cũng có một số trường hợp ADN trong bào quan có thể tồn tại ở cả hai dạng mạch vòng và mạch thẳng. Ví dụ, phân tử ADN trong ty thể của Paramecium, Chlamydomonas và một số loài nấm men luôn luôn là sợi ADN mạch thẳng. Mỗi tế bào thường chứa nhiều ty thể hoặc lục lạp. Hơn nữa, mỗi bào quan có thể có nhiều phân tử ADN. Do đó, số lượng ADN ty thể (ADNmt) hoặc ADN lục lạp (ADNcp) có thể đạt đến hàng nghìn bản sao trong một tế bào. Ví dụ mỗi tế bào nguời có tới 8000 phân tử ADNmt, trong đó một ty thể có khoảng 10 phân tử. Tế bào trứng của động vật có vú có chứa tới 108 bản sao của ADNmt. Vi tảo Chlamydomonas chứa khoảng 1000 phân tử ADN lục lạp trong một tế bào. Ngoài ra, kích thước phân tử ADN ở bào quan không tỷ lệ với tính phức tạp của cá thể. Phân tử ADNmt có thể thay đổi rất rộng từ 16-17 kb ở động vật có xương sống đến 2500 kb ở một số thực vật có hoa. Do kích thước nhỏ hơn nhiều so với genome trong nhân nên ADN ở các bào quan chứa số lượng gen ít hơn và các gen phân bố sát nhau hơn (khoảng cách giữa hai gen rất nhỏ, thậm chí chỉ vài nucleotide). Phân tử ADNmt hay ADNcp chứa những gen mã cho protein thực hiện chức năng chuyên hoá đặc thù của ty thể hay lục lạp như các protein tham gia chuỗi hô hấp. Ngoài ra, ADN trong ty thể và lục lạp còn chứa gen mã cho ARNr, ARNt và protein ribosome dùng riêng cho bào quan. 1.7.1. ADN ty thể Trình tự nucleotide của phân tử ADNmt ở một số sinh vật đã được xác định. Kết quả này giúp chúng ta hiểu rõ hơn cấu trúc và trật tự sắp xếp các gen trên phân tử ADN của bào quan. Ở động vật có xương sống, ADN ty thể có kích thước nhỏ gồm các gen không có intron và hầu như không có khoảng trống giữa các gen. Ví dụ, ADNmt của người gồm 16.659 bp tương ứng với 37 gen, trong đó 22 gen mã cho các phân tử ARNt, 13 gen mã cho các polypeptide liên quan đến phản ứng oxy hoá khử. Ở nấm men, ADNmt có kích thước lớn hơn so với động vật (78.000 bp) do một số gen có intron và khoảng cách giữa các gen khá lớn. ADNmt nấm men có ít nhất 33 gen, trong số này có 2 gen mã cho ARNr, 23 gen mã cho ARNt, 1 gen mã cho protein ribosome và 7 gen mã cho polypeptide tham gia phản ứng oxy hoá khử. Đặc biệt, ADNmt của thực vật có kích thước lớn nhất và cấu trúc phức tạp đa dạng nhất. Trình tự ADNmt của Marchantia polymorpha, thực vật nguyên thuỷ không có hệ mao dẫn, đã được xác định hoàn toàn. Đây là phân tử mạch vòng có kích thuớc 186 kb tương ứng với 94 khung đọc mở (ORFs).
  33. 33 Trong số 94 ORFs này, thực nghiệm mới xác định được một số gen mà số lượng intron của một gen lên đến 32. Đối với thực vật có hệ mạch, ADNmt còn lớn hơn nhiều. Ví dụ, ở ngô hay dưa hấu, ADNmt tương ứng với 570 kb và 300 kb. Ở các loài thực vật bậc cao, các gen có thể phân bố ở vị trí khác nhau trên phân tử ADNmt mặc dù sản phẩm của gen có cùng một chức năng trong tế bào. 1.7.2. ADN lục lạp Thực vật có ba loại lục lạp khác nhau tuỳ thuộc vào hợp chất mà chúng có như tinh bột, các sắc tố hoặc các chất béo. Cả ba loại này đều có chứa phân tử ADN (ADNcp) với kích thước thay đổi từ 85 đến 292 kb ở tảo và 120 đến 160 kb ở thực vật bậc cao. Đặc biệt ở một số thực vật như tảo xanh Acetabularia, ADNcp lớn đến 2000 kb. Phân tử ADNcp của một số thực vật đã được xác định trình tự nucleotide. Lục lạp thuốc lá Nicotiana tobacum có ADNcp gồm 155.844 bp tương ứng với khoảng 150 gen. Số lượng phân tử ADNcp trong mỗi tế bào phụ thuộc vào số lục lạp trong một tế bào và số ADNcp trong mỗi lục lạp. Ví dụ, tế bào tảo đơn bào Chlamydomonas reinhardtii chỉ có một lục lạp chứa khoảng 100 phân tử ADNcp. Số gen phân bố trên ADNcp bao gồm gen mã cho ARNr, ARNt, protein ribosome và một số polypeptide tham gia phản ứng quang hợp, hấp thụ năng lượng ánh sáng mặt trời. 1.8 Genomics 1.8.1 So sánh genome Dựa vào trình tự nucleotide của một số genome điển hình, các nhà sinh học có thể phân tích cấu trúc, hoạt động và chức năng của các gen, làm sáng tỏ được vai trò của ADN lặp lại, ADN nằm giữa các gen, ADN không chứa mã di truyền (các vùng 5’ và 3’ không được dịch mã) và các đoạn intron của từng gen vv Điều đặc biệt có ý nghĩa là khi so sánh các genome với nhau, chúng ta có được những hiểu biết tổng quan về hoạt động của genome ở các sinh vật khác nhau, mối quan hệ giữa chúng, sự đa dạng sinh học và mức độ tiến hoá. Ví dụ, toàn bộ trình tự nucleotide của genome Arabidopsis được xác định cuối năm 2000 nhằm mục đích phát hiện, phân lập các gen quan trọng của các cây nông nghiệp dựa vào sự tương đồng của chúng với các gen của Arabidopsis. Đây là thực vật đầu tiên có genome được xác định toàn bộ trình tự do kích thước genome tương đối nhỏ (130-140 Mbp, nhỏ hơn khoảng 200 lần so với các thực vật khác). Bộ nhiễm sắc thể đơn bội của Arabidopsis gồm 5 nhiễm sắc thể. Ngoài ra, Arabidopsis có vòng đời ngắn, dễ trồng và có thể mọc quanh năm. Hình dáng cây nhỏ chiếm rất ít diện tích nên hoàn toàn thích hợp với điều kiện nuôi trồng trong phòng thí nghiệm. Trình tự nucleotide của genome ở các sinh vật mô hình được đưa vào các loại ngân hàng ADN khác nhau tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu. Ba ngân hàng dữ liệu chính hiện nay lưu trữ hầu hết các thông tin về ADN là EMBL (thuộc Viện Tin học châu Âu- European Informatics Institude), GenBank (thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học của Mỹ-US National Centre for Biotechnology) và DDBS (thuộc Ngân hàng dữ liệu ADN của Nhật-DNA Database of Japan). Bên cạnh trình tự toàn bộ hệ gen, các loại ADN khác như cDNA, ADN đích-ESTs (Expressed Sequence Tags) vv cùng được lưu giữ phục vụ cho việc so sánh, phân tích và xác định chức năng của genome, của gen và sản phẩm (protein hoặc ARN) tương ứng.
  34. 34 So sánh genome giữa các loài sinh vật với nhau cho phép rút ra ba đặc điểm nổi bật: Thứ nhất là số lượng nhiễm sắc thể rất khác nhau ngay giữa những loài rất gần nhau. Thứ hai là các gen thường phân bố không theo qui luật. Một gen hoặc một họ gồm nhiều gen mã cho sản phẩm cùng chức năng có thể phân bố trên các nhiễm sắc thể khác nhau, nằm thành nhóm hoặc rải rác trong genome. Ví dụ, sự phân bố của gen mã cho ARNr được trình bày trên hình 1.17. Thứ ba là kích thước genome thay đổi không hoàn toàn tỷ lệ với tính phức tạp của loài. Nhìn chung, kích thước genome thường phản ánh tính phức tạp của loài. Tuy nhiên, điều đó không đồng nghĩa giữa việc tăng số lượng các gen với mức độ tiến hoá. Chỉ khi so sánh trình tự toàn bộ genome của một số sinh vật cũng như hoạt động của một số gen quan trọng trong sinh trưởng phát triển mà các nhà sinh học mới nhận thấy tính phức tạp liên quan chủ yếu đến việc tăng số lượng các đoạn ADN lặp lại. Ví dụ, genome của một số loài lưỡng cư hoặc thực vật có kích thước khoảng 1011 bp, trong đó thành phần ADN lặp lại chiếm hơn 60-70%. Genome của người nhỏ hơn, chỉ khoảng 3x109 bp. Chắc chắn rằng chỉ riêng kích thước genome không thể quyết định tính phức tạp hay mức độ tiến hoá của các loài. Hình 1.17: Phân bố của ADNr tương ứng với ARNr 45S và ARNr 5S trong các loài Triticeae Bên cạnh so sánh tổng thể toàn bộ genome giữa các loài, việc phân tích chi tiết đối với một gen nhất định còn liên quan đến vị trí các intron, các exon, các đoạn ADN điều khiển hoạt động của gen. Đây là những yếu tố quan trọng để so sánh tìm ra mối quan hệ giữa các loài. Ngoài ra, tổng số gen nói chung, số lượng các gen có nhiều bản sao trong genome, tỷ lệ các loại ADN lặp lại và thành phần của chúng cũng như sự di chuyển của các gen từ ADN riêng biệt trong các bào quan (ty thể, lục lạp) sang genome trong nhân đều chịu ảnh hưởng của thời gian, tức là đều phản ánh quá trình tiến hoá của các loài. Mặt khác, để có được sự so sánh chính xác hơn, toàn diện hơn, cần xét đến cấu trúc sợi nhiễm sắc, cấu hình không gian ba chiều của nhiễm sắc thể cũng như của toàn bộ genome phân bố trong nhân. 1.8.2 Genome người Dự án xác định trình tự genome người (hệ gen trong nhân) được đề cập đến từ những năm 1984-1988. Dự án được bắt đầu vào đầu thập kỷ 90 với sự tham gia của hơn 20 nhóm nghiên cứu từ các nước Mỹ, Nhật, Đức, Anh, Pháp và Trung quốc do tổ chức quốc tế Genome Người (Human Genome Organization-HUGO) và công ty tư nhân Celera Inc. cùng tiến hành độc lập với nhau. Dự án được triển khai với ba buớc cơ bản: thứ nhất là lập bản đồ của tất cả các gen (khoảng 70.000 đến 100.000 gen), tiếp đến là xác định bản đồ vật lý của 24 nhiễm sắc thể ở mức độ chi tiết nhất (mà các kỹ thuật hiện đại có thể đáp ứng được) và cuối cùng là đọc trình tự nucleotide của toàn bộ genome. Genome người được xem gồm có hai phần phân bố trong nhân và trong ty thể. Phân tử ADN ty thể có dạng vòng với kích thước 16.569 bp. Kích thước này quá nhỏ, có thể coi là
  35. 35 không đáng kể so với genome trong nhân. Tuy nhiên, do ty thể không có cơ chế sửa chữa ADN nên các đột biến (thêm, mất hoặc đảo đoạn) thường được tích lũy trong phân tử ADN của bào quan này. Mặt khác, mỗi tế bào có khoảng 800 ty thể, mỗi ty thể có hơn 10 phân tử ADN. Các phân tử này không giống nhau do chứa các đột biến tạo nên tính đa dạng rất cao của ADN ty thể giữa các tế bào ngay trong một cơ thể. Cuối năm 2000, hơn 96% trình tự nucleotide của genome người đã được công bố. Genome người có kích thước khoảng 3,2 x106 kb, tức là 3,2 Gb (Gigabase-đơn vị lớn nhất dùng đo chiều dài trên bản đồ vật lý). Trong đó khoảng 2,95 Gb là vùng chất nhiễm sắc (euchromatin). Chỉ có 1,1 đến 1,4% chứa gen mã cho khoảng 30.000-40.000 protein, trong đó chỉ mới xác định được 1/3, còn lại là các protein dự đoán (predicted protein). Genome người có tới 1,4 triệu chỉ thị SNPs. Thành phần ADN lặp lại (SINEs, LINEs, LTRs và transposon) chiếm gần một nửa genome (~43%). Tuy nhiên hầu hết các transposon và LTRs đều ở trạng thái không hoạt động. 1.8.3 Nghiên cứu Genomics ở thực vật Số lượng các gen và những thông tin về genome của rất nhiều loài sinh vật nói chung cũng như của thực vật nói riêng lưu trữ trong ngân hàng gen tăng nhanh không ngừng. Những số liệu này rất hữu ích trong định hướng nghiên cứu nhằm lựa chọn được phương pháp thích hợp. Chúng ta cùng nhau tìm hiểu xem các nhà sinh học đã sử lý những thông tin về genome, đặc biệt là của cây mô hình Arabidopsis như thế nào trong hương nghiên cứu genomics đối với thực vật. Trình tự nucleotide của genome Arabidopsis đã được xác định hoàn toàn vào cuối năm 2000. Loài thực vật này rất gần với các cây họ cải (cải bắp, súp lơ, xu hào, củ cải vv ). Đây là những loại rau xanh rất phổ biến trong đời sống con người. Một trong nhiều lý do khiến cho genome Arabidopsis được chọn để xác định toàn bộ trình tự là do genome có kích thước tương đối nhỏ (130 Mb) và chứa ít ADN lặp lại. Bên cạnh đó, dự án đọc trình tự genome cây lúa đã được thực thi. Genome của lúa lớn gấp 3,5 lần so với Arabidopsis nhưng cũng chỉ bằng 20% genome của ngô và 3% của lúa mỳ. Điều may mắn là cấu trúc genome của các cây lương thực (lúa, lúa mỳ, lúa miến, kê, ngô ) khá giống nhau. Sự khác nhau về kích thước genome chủ yếu do thành phần ADN lặp lại. Không phải genome càng lớn thì số lượng gen khác nhau càng nhiều. Do đó, trật tự các gen, chức năng của chúng cũng như cấu trúc genome của Arabidopsis và lúa rất cần thiết để phân lập và điều khiển các gen quan trọng ở các cây có quan hệ gần gũi với chúng. Những kết quả này đặc biệt cần thiết cho chọn lọc, tạo mới nguồn giống cây nông nghiệp có tính trạng mong muốn. Cùng với genome của Arabidopsis và lúa, hơn 127.000 các trình tự biểu hiện hay còn gọi là ADN đích- ESTs có nguồn gốc từ thực vật được lưu trữ trong ngân hàng dữ liệu cho phép so sánh các gen giữa các loài thực vật với nhau. Kết quả cho thấy hầu hết các gen đã biết ở thực vật bậc cao đều có mức độ tương đồng rất lớn. Do đó, từ trình tự nucleotide có thể suy đoán được chức năng của gen và ngược lại. Khi biết một gen bất kỳ ở một loài có thể phân lập được gen có chức năng tương tự ở loài khác. Ví dụ, các nhà sinh học đã tiến hành so sánh mức độ giống nhau của 64 protein được chọn ngẫu nhiên từ lúa và Arabidopsis. Chức năng của các protein này cũng như trình tự nucleotide của gen mã cho chúng đã biết. Để tránh hiện tượng so sánh các thành viên trong cùng một họ gen, các gen được chọn đều là những gen chỉ có một bản sao trong genome. Kết quả cho thấy số gen có độ tương đồng 70-80% chiếm tỷ lệ cao nhất. Điều này có nghĩa, mặc dù lúa và Arabidopsis không có quan hệ gần gũi với nhau