Giáo trình Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sinh trưởng, phát triển và hàm lượng hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm

Nội dung text: Giáo trình Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sinh trưởng, phát triển và hàm lượng hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sinh trưởng, phát triển và hàm lượng hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm Phạm Thị Lan, Đỗ Hải Lan, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Bạc Thị Thu, Phạm Văn Nhã* Khoa Sinh - Hóa, Trường Đại học Tây Bắc, Phường Quyết Tâm - thành phố Sơn La, Việt Nam Tóm tắt Cordyceps militaris (L.) Link được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở châu Á nhờ có nhiều tá dụng dược lý quan trọng. Nuôi cấy nấm C.militaris được nghiên cứu rộng rãi nhằm tạo thể quả đạt số lượng và chất lượng để sử dụng trong y học và thực phẩm bổ dưỡng. Nhiệt độ và ánh sáng là hai trong nhiều yếu tố môi trường quan trọng cho quá trình sinh trưởng, phát triển hình thành thể quả và sinh tổng hợp hàm lượng cordycepin của nấm Cordyceps militaris. Nghiên cứu này được tiến hành nhằm đánh giá yếu tố nhiệt độ và ánh sáng đến khả năng hình thành thể quả và hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm. Kết quả cho thấy nhiệt độ tối ưu cho cho sự sinh trưởng, phát triển, hình thành thể quả và hàm lượng cordycepin của nấm C. militaris trên nhộng tằm là 25oC. Ngoài ra, loại ánh sáng từ đèn compact (công suất 20W, tương đương 350 lx) và thời gian chiếu sáng (12 giờ sáng: 12 giờ tối) cho hiệu suất hình thành thể quả (số lượng và kích cỡ) và hàm lượng cordycepin cao hơn so với ánh sáng từ nguồn đèn LED màu xanh dương, màu đỏ (750 bóng, mỗi bóng có công suất 0,05W, 716 lx). Hàm lượng cordycepin trong thể quả từ loại ánh sáng của đèn compact là 4.54 mg/g. Nhận ngày 02 tháng 10 năm 2016, Chỉnh sửa ngày 01 tháng 11 năm 2016, Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 12 năm 2016 Từ khóa: Cordyceps militaris, nhiệt độ, ánh sáng, thể quả, nhộng tằm. 1. Đặt vấn đề* militaris có thể sinh trưởng tạo thể quả. Một số loại giá thể nhân tạo thường được áp dụng trong Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris có nuôi cấy nấm C. militaris gồm: môi trường hình thức sống ký sinh trên cơ thể côn trùng và SDAY có bổ sung bột nhộng hoặc tằm, môi sâu bọ [1]. Cordyceps militaris là một trong trường gạo lứt có bổ sung thêm môi trường những loài hiện đang thu hút mối quan tâm của SDAY hoặc bột nhộng/tằm Giá thể tự nhiên nhiều nhà khoa học, vì khả năng nuôi cấy dễ chính là cơ thể tằm dâu hoặc nhộng [3]. Khả dàng hơn trong điều kiện in vitro so với nấm C. năng sinh trưởng và phát triển của nấm C. sinensis [2]. Giá thể nhân tạo và giá thể tự militaris và hàm lượng cordycepin trên giá thể nhiên là hai loại môi trường chính mà nấm C. nhộng tằm phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong đó có thể kể đến như: nhiệt độ nuôi cấy, loại, ___ * Tác giả liên hệ. ĐT: 84-1693514789 cường độ và thời gian chiếu sáng, độ ẩm và Email: phamvannhadhtb@gmail.com trạng thái sinh lý của nhộng, tằm. Để đảm bảo 63
2. 64 P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 sản phẩm tạo ra có hàm lượng hoạt chất cao, cần lắc ở tốc độ 150 rpm trong điều kiện nhiệt độ xác định được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng môi trường 25°C. Thời gian nuôi giống là và phát triển của nấm trên giá thể tự nhiên [3]. 4 - 5 ngày. Hiện nay, tại Việt Nam có rất ít các nghiên cứu 2.2. Nuôi cấy C. militaris trên giá thể tự nhiên về ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sự nhộng tằm sinh trưởng, phát triển và hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học được tổng hợp bởi Giá thể tự nhiên được sử dụng trong nghiên nấm C. militaris. Vì vậy, chúng tôi tiến hành cứu này là tằm/nhộng tằm sống. Giống “Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh Cordyceps militaris NBRC 100741 được tiêm sáng tới sự sinh trưởng, phát triển và hình thành vào phần đầu của nhộng trong điều kiện vô hoạt chất của nấm C. militaris nghiên cứu trên trùng. Thể tích giống tiêm cho một cơ thể nhộng tằm nhằm xác định điều kiện tối ưu cho nhộng sống là 0,1 ml. Các bước chuẩn bị và qui trình nuôi cấy C. militaris. nuôi cấy C. militaris được tiến hành như sau: - Chuẩn bị giá thể nhộng tằm: Tiến hành cắt kén tằm trong box cấy vô trùng thu lấy 2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu nhộng. - Lây nhiễm nấm C. militaris vào giá thể Chủng nấm sử dụng là chủng Cordyceps nhộng tằm: Tiêm 0,1 ml (2.105 CFU bào militaris NBRC 100741 được mua vào tháng tử/mL) giống nấm C. militaris vào phần đầu 4/2015, tại Trung Tâm Nguồn Sinh Học Quốc nhộng tằm. Sau khi tiêm, nhộng được trải rộng Gia (NBRC), Nhật Bản. Nhộng và tằm dâu ra trên một miếng giấy ẩm (vô trùng) và được được thu mua tại hộ gia đình có truyền thống đặt trong lọ thủy tinh trong suốt có nắp đậy. nuôi tằm dâu. Nhộng được thu mua cả kén để - Ủ tối tạo hệ sợi nấm C. militaris trên giá đảm bảo tránh nhiễm vi sinh vật thêm trong quá thể nhộng tằm: Nhộng tằm sau khi được lây trình vận chuyển và bảo quản. nhiễm thì được bảo quản trong bóng tối ở nhiệt 0 Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu độ 23 - 25 C, độ ẩm 80 - 90%. Khoảng 4 - 5 này gồm: tủ ấm lắc (Jeio Tech - SI300), buổng ngày sau khi tiêm giống nấm, hệ sợi nấm dần cấy vi sinh (Telstar), máy đo pH (Schott dần bao kín giá thể nhộng tằm. Instrument Lab 850), nồi hấp (Sturdy SA- 2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và 300VF), phòng nuôi cấy có trang bị điều hoà phát triển của nấm Cordyceps militaris nhiệt độ, que cấy, kim tiêm vô trùng (đường Tiến hành nuôi cấy tạo thể quả nấm C. kính kim Φ = 1,2 mm), bơm tiêm dùng một lần militaris vào các cá thể nhộng tằm, sau đó (dung tích 5 mL), dàn để mẫu có hệ thống chiếu chuyển các cá thể này sang các nhiệt độ khác sáng bằng đèn compact (công suất 1 bóng: nhau: 7°C; 15°C; 20°C; 25°C; 30°C, mỗi nhiệt o 20W) và dàn để mẫu được chiếu sáng bằng đèn độ được dao động trong khoảng ± 1 C, đồng LED (gồm có hai màu: xanh dương và đỏ. Tỉ lệ thời cần đảm bảo các điều kiện về độ ẩm, ánh giữa hai màu tương ứng lần lượt là: 1 xanh sáng. Mỗi dải nhiệt độ, bố trí 30 cá thể nhộng/tằm, lặp lại thí nghiệm 3 lần. Theo dõi dương: 2 đỏ). kết quả trong vòng 2 tháng. 2.1. Chuẩn bị giống Cordyceps militaris NBRC Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá: 100741 + Thời gian hình thành mầm thể quả sau khi ra sáng (ngày) 5 ml giống nghiên cứu được cấy vào 150 ml + Số lượng thể quả/con môi trường SDAY lỏng (40 g/L glucose, 10 g/L + Khối lượng thể quả/con (g) pepton, 10g/L cao nấm men pH = 7,0) trong + Kích thước thể quả (mm) box cấy vô trùng. Bình nuôi cấy sau đó được + Hình dạng thể quả chuyển sang máy lắc (Jeio Tech - SI300) và + Màu sắc thể quả
3. P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 65 2.4. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng, sau đó nghiền thành bột. Hòa 1 g bột khô vào phát triển và hình thành thể quả của nấm 20 mL nước cất và siêu âm 1h tại 50oC. Đem ly Cordyceps militaris tâm tại 4000 rpm trong vòng 15 phút tại 4oC. Lấy dịch nổi, lọc qua màng lọc 0.45 μm và Sau khi tiêm Cordyceps militaris NBRC được dùng để tiêm vào hệ thống HPLC. Nồng 100741 vào phần đầu của nhộng, nhộng được độ cordycepin được định lượng bằng sắc ký đặt trong điều kiện không được chiếu sáng, lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1260 nhiệt độ 25°C và độ ẩm 80 - 90%. Sau 14 ngày, infinity. Cột phân tích: Cột RP C18 Elipse plus nhộng được chuyển ra điều kiện chiếu sáng với C18 (4.6 x 250 mm, kích thước hạt 5 μm ). loại ánh sáng khác nhau. Thời gian chiếu sáng Nhiệt độ cột duy trì ở 25°C. Pha động gồm là 12 giờ sáng: 12 giờ tối. Có hai lô thí nghiệm nước cất và methanol (tiêu chuẩn HPLC) với tỷ với hai loại ánh sáng khác nhau: lệ 87:13 (v/v). Tốc độ dòng: 1ml/phút. Detector Lô 1 - được chiếu sáng bằng đèn compact UV-VIS, bước sóng 260 nm. Thể tích tiêm có công suất 20W, tương đương với 350 lx. 10 μL. Lô 2 - được chiếu sáng bằng đèn LED màu gồm 750 bóng nhỏ (gồm bóng cho ánh sáng 2.6. Phương pháp xử lý số liệu xanh dương và bóng cho ánh sáng đỏ với tỉ lệ 1:2) mỗi bóng có công suất 0,05W tương đương Mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần. với 716 lx. Số liệu được xử lí trên phần mềm Iristat 4.0. Mỗi lô thí nghiệm gồm 30 cá thể nhộng. Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± Sau 60 ngày nuôi cấy, chúng tôi xác định số SD. So sánh được sử dụng theo phương pháp t- student. lượng và kích thước thể quả phát triển trên giá thể nhộng. Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá: 3. Kết quả + Thời gian hình thành mầm thể quả sau khi ra sáng (ngày) 3.1. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin + Số lượng thể quả/con thể quả nấm Cordyceps militaris + Khối lượng thể quả/con (g) + Kích thước thể quả (mm) Khảo sát về tính thích hợp của hệ thống + Hình dạng thể quả HPLC tại phòng thí nghiệm + Màu sắc thể quả ● Độ chọn lọc - đặc hiệu Tiến hành phân tích mẫu chuẩn cordycepin 2.5. Định lượng cordycepin có nồng độ 10 µg/mL, mẫu trắng và mẫu thử. Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng Theo phương pháp được mô tả trước đây với thời gian lưu của cordycepin (14.60 phút) với một số thay đổi nhỏ cho phù hợp với điều không xuất hiện pic như ở mẫu chuẩn. Các pic kiện phòng thí nghiệm [3]. Mẫu chuẩn: của chất phân tích trong mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính cordycepin (C3394, Sigma, Singapore) được chọn lọc tốt và độ đặc hiệu cao. hòa tan trong nước cất và pha loãng thành các ● Độ tuyến tính nồng độ khác nhau bao gồm 5, 10, 12.5, 25, 50, Pha một dãy dung dịch chuẩn cordycepin có và 100 μg /mL để lập đường chuẩn. Mẫu nồng độ khoảng 5 - 100 µg/ml, và tiến hành sắc nghiên cứu (thể quả) được làm khô 1h tại 85oC, ký theo điều kiện đã lựa chọn (Bảng 1).
4. 66 P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 Bảng 1. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của cordycepin Nồng độ (µg/mL) 5 10 12,5 25 50 100 Diện tích pic (mAU*s) 134.2 270.8 334.2 667.5 1341.2 2637.4 Phương trình hồi quy: y = 26.368 + 7.6287 R2=0.9999 G Xác định độ đúng dựa vào phân tích mẫu kiểm soát ở các nồng độ khác nhau trong đường chuẩn: 5,0 µg/ml, 50,0 µg/ml, 100 µg/ml. Chuẩn bị 3 dãy mẫu kiểm soát. Xác định độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ ngoại suy từ đường chuẩn so với nồng độ thực tế (Bảng 2). Kết quả cho thấy: ở điều kiện trong ngày và khác ngày, độ đúng của phương pháp đều đạt > 98.6%. Độ lặp lại trong ngày và khác ngày của phương pháp được xác định với hệ số RSD nhỏ. ● Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định Hình 1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính lượng LOQ giữa nồng độ và diện tích pic của cordycepin. Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn phát hiện Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến và giới hạn định lượng của cordycepin. Tiến tính giữa diện tích pic và nồng độ cordycepin hành pha thử 4 - 5 nồng độ quanh điểm dự kiến. trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của ~ 1, đáp ứng yêu cầu của đường chuẩn trong cordycepin là 0,1 µg/ml; giới hạn định lượng phân tích định lượng. dưới của cordycepin là 0,4 µg/ml. ● Độ đúng Bảng 2. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng cordycepin Nồng độ TRONG NGÀY (n=3) KHÁC NGÀY (n=3) biểu kiến Nồng độ ngoại Độ đúng (%) RSD (%) Nồng độ ngoại Độ đúng RSD (%) (µg/ml) suy (µg/ml) suy (µg/ml) (%) 5 5.02 ± 0.03 102.0 2.94 4.98 ± 0.015 98.6 1.53 50 50.01± 0.13 100.02 0.32 49.89 ± 0.76 99.22 1.95 100 99.66 ± 0.62 99.66 0.62 99.32 ± 1.12 98.32 1.15 Iưk Hình 2. Sắc ký đồ HPLC của mẫu chuẩn cordycepin.
5. P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 67 Hình 3. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thử. 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, sang màu cam nhạt. Tuy nhiên, do nhiệt độ cao phát triển và hình thành thể quả của nấm không thích hợp cho hệ sợi nấm sinh trưởng và Cordyceps militaris trên nhộng tằm phát triển, hệ sợi nấm bị chết, không hình thành o Sau 2 tháng tiến hành thí nghiệm, kết quả mầm thể quả. Nhiệt độ môi phòng nuôi 20 C, o thể hiện trong bảng 3 và hình 4. 25 C thích hợp cho hệ sợi nấm sinh trưởng, Dựa vào kết quả ở bảng 3 và hình 4, kết hợp phát triển và hình thành thể quả, sau 2 - 3 ngày với theo dõi quá trình hình thành thể quả, nhận ra sáng, hệ sợi nấm chuyển màu, thời gian hình o o thấy: ở 7oC và 15oC nhiệt độ quá thấp, hệ sợi thành mầm thể quả ở 25 C nhanh hơn ở 20 C. nấm chuyển màu từ trắng sang vàng cam nhưng Kích thước, khối lượng trung bình thể quả của 0 không hình thành mầm thể quả. Ở 30oC, sau 2 - nấm C. militaris khi nuôi ở nhiệt độ 25 C cũng o 3 ngày ra sáng, hệ sợi nấm màu tráng chuyển lớn hơn khi nuôi ở 20 C. Bảng 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps militaris trên nhộng tằm Các chỉ tiêu theo dõi Nhiệt độ (oC) 7 15 20 25 30 Thời gian hình thành mầm thể - - 8 - 10 6 - 8 - quả sau khi ra sáng (ngày) Số lượng thể quả/con - - 4,63±0,25 4,75±0,10 - Khối lượng thể quả/con (g) - - 1,4±0,03 1,72±0,04 - Kích thước thể quả (mm) - - 26,48±0,04x2±0,02 27,56±0,03x2±0,02 - Hình dạng thể quả - - Hình trụ đôi khi Hình trụ đôi khi phân - phân nhánh nhánh Màu sắc thể quả - - Vàng sậm Vàng sậm -
6. 68 P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 0 70C 15 C 200C 250C 300C Hình 4. Thể quả nấm C. militaris trên nhộng tằm ở các dải nhiệt độ khác nhau. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin trong thể quả nấm Cordyceps militaris Phân tích hàm lượng cordycepin của thể quả mẫu nấm C. militaris nuôi cấy tạo thể quả ở 20oC và 25oC. Kết quả được trình bày ở bảng 4 cho thấy tại 25oC thì thể quả cho hàm lượng cordycepin cao hơn, và sự khác biệt có ý nghĩa o Hình 5. Hệ sợi của nấm C. militaris phát triển thống kê so với tại nhiệt độ 20 C trên giá thể nhộng trong điều kiện không được chiếu sáng. Bảng 4. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin o o Bảng 5. Ảnh hưởng của ánh sáng đèn compact và 20 C 25 C ánh sáng đèn led trắng lên sự hình thành thể quả của Hàm lượng 1,13 ± 0,17 4,79 ± 0,26 nấm C. militaris trên nhộng tằm Cordycepin mg/g mg/g* Các chỉ tiêu Ánh sáng đèn Ánh sáng đèn *: khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) theo dõi compact led trắng Thời gian 6 - 8 6 - 8 3.3. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng, hình thành phát triển và hình thành thể quả của nấm mầm thể quả Cordyceps militaris trên nhộng tằm Số lượng thể 4,70 ± 0,02 3,82 ± 0,27 quả/lọ Khối lượng 1,74 ± 0,18 1,35 ± 0,60 Sau khi nuôi cấy nhộng trong điều kiện thể quả/lọ không được chiếu sáng (4-5 ngày), hệ sợi của Kích thước (26,87 ± 0,23) (21,46 ± 0,54) nấm C. militaris đã phát triển tốt trên giá thể thể quả (dài x (2 ± 0,02) x (2 ± 0,03) này (hình 5). x rộng) Số lượng, kích thước trung bình và các chỉ Hình dạng Hình trụ, đôi Hình trụ, đôi thể quả khi phân nhánh khi phân tiêu theo dõi của thể quả của nấm C. militaris ở nhánh hai lô thí nghiệm được trình bày trên bảng 5 và Màu sắc thể Vàng sậm Vàng nhạt hình 6. quả
7. P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 69 f sinh trưởng của nấm C. militaris là ánh sáng từ đèn compact. 5. Bàn luận C. militaris từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở châu Á nhờ có các tác dụng sinh học đa dạng như chống ung thư, tăng cường và điều hòa hệ miễn dịch, chống oxy hóa, chống Đèn led trắng Đèn compact viêm, kháng khuẩn do sự có mặt của các hoạt chất như cordycepin. Thể quả của C.militaris trong tự nhiên rất đắt, vì đặc điểm vật chủ của nấm C. militaris rất đặc hiệu và hiếm gặp trong tự Hình 6. Thể quả nấm C. militaris trên nhộng tằm dâu khi nuôi trồng trong điều kiện ánh sáng đèn nhiên. Nấm C. militaris phát triển rất chậm trong compact và ánh sáng đèn led trắng. tự nhiên, sự tăng trưởng có giới hạn và kích thước nhỏ. Rất khó để thu được một số lượng để có thể Theo kết quả thu được trên bảng 5 và hình dùng làm thuốc hay thực phẩm chức năng. Nhộng 6, lô thí nghiệm gồm các bình được chiếu sáng tằm đã được sử dụng làm vật chủ cho nuôi cấy bằng đèn compact cho kết quả tốt hơn so với lô nấm C. militaris trong một số nghiên cứu [4]. còn lại được chiếu sáng bằng đèn led trắng cả Phương pháp tiêm cấy vào nhộng tằm cho thấy về hiệu suất, kích thước và khối lượng thể quả. hiệu quả cao hơn các phương pháp khác như phun Sự khác biệt về kích thước thể quả trong hai sấy hay nhúng [5]. Do đó, chúng tôi sử dụng điều kiện chiếu sáng khác nhau được trình bày phương pháp tiêm trong nghiên cứu của mình. trên hình 7. Nhộng tằm khi bị tiêm cấy giống C.militaris chết trong vòng 2 ~ 3 ngày, trở nên cứng trong khoảng 7 ngày sau tiêm, và sau đó sản sinh thể quả. Thể 4. Phân tích hàm lượng cordycepin của thể quả quả trong tự nhiên của C. militaris có màu cam, mẫu nấm C. militaris hình trụ và dao động 2,5-4,5 cm chiều dài [6]. Kết quả của chúng tôi cho thấy thể quả cũng có các Tiến hành phân tích hàm lượng cordycepin đặc điểm tương tự, cho thấy rằng nhộng tằm cũng của thể quả mẫu nấm C. militaris nuôi cấy tạo có khả năng sản sinh ra thể quả của nấm thể quả của lô 1 và lô 2. Kết quả được trình bày C.militaris tương tự trong tự nhiên. ở bảng 6. Kết quả cho thấy lô 1 thì thể quả cho Đã có một số nghiên cứu được tiến hành hàm lượng cordycepin cao hơn, và sự khác biệt nhằm tối ưu điều kiện nuôi cấy để cho nấm C. có ý nghĩa thống kê so với lô 2. militaris. Hung và cs. đã đánh giá yếu tố nhiệt độ đến hàm lượng cordycepin của nấm C. Bảng 6. Kết quả phân tích hàm lượng cordycepin militaris nuôi cấy trong các bình Erlenmeyer. Nhóm tác giả này cho thấy nhiệt độ 20oC - 25oC Lô 1 (Ánh sáng Lô 2 (Ánh đèn compact) sáng đèn là nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm C. LED) militaris và cho hàm lượng cordycepin cao nhất o Hàm lượng 4,54 ± 0,21 0,98 ± 0,13 trên sợi nấm và thể quả [7]. Nhiệt độ 30 C ức cordycepin mg/g* mg/g chế sự sinh trưởng của nấm, do đó ngăn cản quá trình sinh tổng hợp cordycepin. Kết quả của * khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) chúng tôi cũng tương tự của nhóm tác giả này, cho thấy nhiệt độ 25oC là nhiệt độ tối ưu cho Từ những kết quả thu được ở trên, chúng nuôi cấy nấm C. militaris. tôi xác định được loại ánh sáng thích hợp cho
8. 70 P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 j Lô 1 Lô 2 Hình 7. Kích thước thể quả của nấm C. militaris NBRC 100741 trên giá thể nhộng trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau. Lô1 - điều kiện chiếu sáng bằng đèn compact; Lô2 - điều kiện chiếu sáng bằng đèn LED (gồm tỉ lệ màu: xanh dương: đỏ là 1:2). Một số nghiên cứu khác đã được tiến hành hơn so với ánh sáng xanh dương (xanh blue) nhằm xác định ảnh hưởng của ánh sáng đến hoặc ánh sáng đỏ [9]. sinh trưởng của nấm C. militaris trên giá thể tự Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù nhiên và nhân tạo [8-11]. Kết quả của các hợp với kết quả của Dong và cs [9]. Đèn nghiên cứu này cho thấy rằng ánh sáng có ảnh compact tạo ra ánh sáng trắng có bước sóng kết hưởng lớn đến sinh trưởng và phát triển của hợp giữa bước sóng của tia tử ngoại (400 - 450 nấm C. militaris đồng thời cũng có ảnh hưởng nm) và ánh sáng nhìn thấy được (600 - 700 đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học có nm), do đó cho kết quả sinh trưởng, phát triển trong thể quả của nấm C. militaris. Theo Dong và hình thành thể quả của nấm C. militaris cao và cs, ánh sáng có màu hồng (gồm 1/3 ánh sáng hơn so với ánh sáng từ đèn LED phối hợp hai có bước sóng 450 - 460 nm và 2/3 ánh sáng có loại ánh sáng màu xanh dương và ánh sáng màu bước sóng 650 - 660 nm) cho thể quả có kích đỏ với tỉ lệ tương ứng là 1:2. thước lớn hơn và hàm lượng cordycepin nhiều
9. P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 71 6. Kết luận medicinal mushroom Cordyceps militaris. Process Biochemistry 40(5) (2005) 1667. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu và tạo thể quả o [4] Hong I-P, Kang P-D, Kim K-Y, Nam S-H, Lee trên nhộng tằm tốt nhất ở 24-26 C, ở nhiệt độ M-Y, Choi Y-S, et al. Fruit body formation on này cho kết quả hình thành thể quả tốt nhất và silkworm by Cordyceps militaris. hàm lượng cordycepin trong thể quả là cao nhất Mycobiology 38(2) (2010) 128. so với các dải nhiệt độ khác. Trong nuôi cấy C. [5] Chen R, Ichida M. Infection of the silkworm, militaris nếu sử dụng ánh sáng từ đèn compact Bombyx mori, with Cordyceps militaris. thì thu được kết quả sinh trưởng tốt hơn so với Journal of Insect Biotechnology and Sericology 71(1) (2002) 61. khi sử dụng ánh sáng từ đèn LED có pha trộn [6] Sung J. The insects-born fungus of Korea in giữa hai loại ánh sáng màu xanh dương và ánh color. (1996). sáng màu đỏ với tỉ lệ tương ứng là 1:2 do thu [7] Hung L, Keawsompong S, Hanh V, Sivichai được số lượng và kích thước thể quả cao hơn, S, Hywel-Jones N. Effect of temperature on cũng như hàm lượng cordycepin cao hơn. cordycepin production in Cordyceps militaris. Thai J Agric Sci 42(2) (2009) 219. Lời cảm ơn [8] Yi ZL, Huang WF, Ren Y, Onac E, Zhou GF, Đề tài được tài trợ bởi Chương trình Khoa Peng S, et al. LED lights increase bioactive học và Công nghệ phục vụ phát triển bền vững substance at low energy cost in culturing vùng Tây Bắc, ĐHQGHN, mã số đề tài: fruiting bodies of Cordyceps militaris. KHCN-TB.03C/13-18. Scientia Horticulturae 175((2014) 139. [9] Dong JZ, Lei C, Zheng XJ, Al XR, Wang Y, Wang Q. Light wavelengths regulate growth Tài liệu tham khảo and active components of Cordyceps militaris [1] Kobayashi Y. The genus Cordyceps and its fruit bodies. J Food Biochem 37((2013) 578. allies. Sci Rep Tokyo Bunrika Daigaku Sect B [10] Chen YS, Liu BL, Chang YN. Effects of 5((1941) 53. light and heavy metals on Cordyceps [2] Sung J-M, Choi Y-S, Lee H-K, Kim S-H, Kim militaris fruiting body growth in rice grain- Y-O, Sung G-H. Production of fruiting body based cultivation. Korean J Chem Eng 28(3) using cultures of entomopathogenic fungal (2011) 875. species. The Korean Journal of Mycology [11] Dong JZ, Liu MR, Lei C, Zheng XJ, Wang Y. 27(1) (1999) 15. Effects of selenium and light wavelengths on [3] Mao X-B, Eksriwong T, Chauvatcharin S, liquid culture of Cordyceps militaris Link. Zhong J-J. Optimization of carbon source and Applied biochemistry and biotechnology carbon/nitrogen ratio for cordycepin 166(8) (2012) 2030. production by submerged cultivation of Study the Effect of Temperature and Light on Growth, Fruiting Body and Cordycepin Production by Cordyceps Militaris NBRC 100741 on Silkworm Pham Thi Lan, Do Hai Lan, Nguyen Thi Hong Hanh, Bac Thi Thu, Pham Van Nha Faculty of Biochemistry, Tay Bac University, Quyet Tam District - Son La City, Vietnam Abstract: Cordyceps militaris (L.) Link is widely used as a folk medicine in Asia due its many pharmacological functions. Cultivation of C.militaris is extensively studied. Temperature and light are
10. 72 P.T. Lan và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72 an important factor for the growth, fruiting body and cordycepin production by Cordyceps militaris. In this study, the temperature and light conditions for the Cordyceps militaris NBRC 100741 strain on silkworm was evaluated on growth, fruiting body and the production of cordycepin. Our results showed that optimum temperature for growth, fruiting body and cordycepin production of C.militaris was 25oC. The light from compact fluorescent light (20W power, equivalent to 350 lx), 12 h light/dark cycle conditions is better for growth, fruiting body and cordycepin production than light-emitting diode (LED) blue and red light (750 lightbulbs, each bulb 0,05W power, equivalent to 716 lx) in terms of size and amount of fruiting bodies. The cordycepin content in the fruiting body under light from compact fluorescent light was 4.54 mg/g. Keywords: Cordyceps militaris, silkworm, temperature, light, fruit body.