Giáo trình Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ cây cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC.) từ bốn chủng Agrobacterium rhizogenes - Trà Đông Phương

Nội dung text: Giáo trình Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ cây cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC.) từ bốn chủng Agrobacterium rhizogenes - Trà Đông Phương

1. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ cây cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) A. DC.) từ bốn chủng Agrobacterium rhizogenes Trà Đông Phương Vũ Thị Bạch Phượng Quách Ngô Diễm Phương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 03 tháng 02 năm 2016, nhận đăng ngày 02 tháng 12 năm 2016) TÓM TẮT Cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) được sử dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai A. DC.), loài duy nhất trong chi Platycodon chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 có khả (Campanulaceae), được phân bố chủ yếu ở vùng năng cảm ứng tạo rễ tơ cát cánh. Hai gene rolB Đông Á. Rễ cát cánh là vị thuốc được sử dụng và rolC chịu trách nhiệm cảm ứng tạo rễ tơ khi rộng rãi trong y học cổ truyền để chữa ho, đau được kiểm tra đã sát nhập thành công vào bộ họng, suyễn, lao, tiểu đường và một số bệnh viêm gene rễ tơ cát cánh. Lá cát cánh là nguyên liệu nhiễm. Các nghiên cứu hiện đại đã chứng minh được cảm ứng tốt nhất với 100 % số mẫu có khả rễ cát cánh chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh năng tạo rễ tơ. Quy trình được tối ưu hóa thời học. Vì vậy, để nghiên cứu và thu nhận các hợp gian ngâm mẫu và thời gian đồng nuôi cấy với chất có giá trị từ rễ cát cánh, kĩ thuật cảm ứng kết quả tốt nhất tương ứng là 10 và 15 phút (10 tạo rễ tơ nhằm tạo nguồn nguyên liệu ban đầu ổn phút cho chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và 15 định, có khả năng tăng sinh nhanh (trong môi phút cho chủng A. rhizogenes C34) và 72 giờ. trường không có hormone) và sản xuất nhiều hợp Trong tương lai, kĩ thuật cảm ứng tạo rễ tơ cát chất thứ cấp đã được xây dựng trên loài thực vật cánh được mô tả trong nghiên cứu này là một kĩ này. Để thực hiện kĩ thuật trên, Agrobacterium thuật hữu ích, có thể được áp dụng cho nghiên rhizogenes – một công cụ chuyển gene tự nhiên cứu và thu nhận các hợp chất thứ cấp có giá trị có thể chuyển DNA vào bộ gene thực vật – đã từ nuôi cấy rễ tơ cát cánh. Từ khoá: Agrobacterium rhizogenes, gene rol, gene virG, Platycodon grandiflorum, rễ tơ MỞ ĐẦU Kĩ thuật nuôi cấy rễ tơ hiện đang là một kĩ khung đọc mở (ORF), 4 trong số 18 ORF đó thuật có khả năng cung cấp nguồn nguyên liệu rễ chứa gene rolA, rolB, rolC và rolD. Gene rolB là một cách chủ động cho việc thu nhận các hợp gene chịu trách nhiệm chính trong sự cảm ứng chất thứ cấp hữu ích được sử dụng trong dược tạo thành rễ tơ [6, 13]. Rễ tơ ổn định về mặt di phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm [6]. Rễ tơ được truyền hơn mô và tế bào thực vật in vitro khác, hình thành từ sự chuyển gene thông qua sự xâm phát triển nhanh hơn các cơ quan thực vật bình nhiễm của Agrobacterium rhizogenes – một vi thường mà không cần hormone ngoại sinh và khuẩn đất gram âm mang plasmide Ri. A. chúng có thể tổng hợp các chất chuyển hóa thứ rhizogenes có thể chuyển đoạn T-DNA từ cấp với lượng tương đương hoặc thậm chí lớn plasmide Ri vào bộ gene tế bào thực vật tại vùng hơn cây mẹ [24]. Điều này cho thấy rễ tơ của mô bị vi khuẩn này xâm nhiễm. T-DNA mang 18 Trang 64
2. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 nhiều loài thực vật là một nguồn nguyên liệu đầy Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh tỉnh Bình hứa hẹn chứa nhiều hợp chất có giá trị. Dương. Cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) Môi trường nuôi cấy A. DC.) là loài duy nhất trong chi Platycodon Môi trường Murashige và Skoog (MS) bổ (Campanulaceae). Từ hơn 2000 năm về trước, rễ sung 30 g/L sucrose và 8 g/L agar dùng để nuôi cát cánh là vị thuốc phổ biến được sử dụng trong cấy mô thực vật in vitro. Môi trường MS được nhiều bài thuốc cổ truyền ở châu Á để chữa ho, điều chỉnh về pH 5,8 trước khi thêm agar rồi hấp đau họng, suyễn, lao và một số bệnh viêm nhiễm khử trùng ở 121 oC trong 20 phút. [23]. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu Môi trường Nutrient Broth (NB) được sử trên cây cát cánh chủ yếu tập trung vào hoạt tính dụng để lưu trữ và tăng sinh các chủng vi khuẩn sinh học của nó như kháng u, kháng oxi hóa, A. rhizogenes. Môi trường NB được điều chỉnh kháng viêm, chống đái tháo đường, điều hòa về pH 7,0 trước khi bổ sung 17 g/L agar và hấp miễn dịch, [14, 23]. Rễ cát cánh chứa nhiều khử trùng ở 121 oC trong 20 phút. nhóm chất khác nhau bao gồm các triterpenoid, saponine, flavonoid, anthocyanine, phenolic, Phương pháp polysaccharide, mà trong đó, triterpenoid và Phương pháp khử trùng hạt tạo cây con in vitro saponine là các hợp chất có hoạt tính sinh học Hạt cát cánh sau khi lắc 20 phút trong nước quan trọng [9, 10, 18, 22]. Vì vậy, để nghiên cứu xà phòng được lần lượt khử trùng bề mặt với và thu nhận nhiều chất chuyển hóa khác nhau từ ethanol 70 % (v/v) trong 90 giây và javel 10 % rễ cát cánh, kĩ thuật cảm ứng tạo rễ tơ nhằm thu (v/v) trong 10 phút. Sau đó, hạt được rửa 5 lần nhận nguồn nguyên liệu ban đầu ổn định, có khả với nước cất đã hấp khử trùng. Hạt sau khi khử năng tăng sinh nhanh (trong môi trường không có trùng được gieo trên môi trường MS rắn. Hạt đã hormone) và sản xuất nhiều hợp chất thứ cấp đã gieo được cho nảy mầm và phát triển trong phòng được xây dựng trên loài thực vật này. nuôi cấy ở nhiệt độ 25 oC, ánh sáng trắng 16 giờ Trong báo cáo này, chúng tôi tập trung trong ngày, cường độ ánh sáng 2500 lux. nghiên cứu kĩ thuật tạo rễ tơ cát cánh (bằng cách Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn A. rhizogenes sử dụng các chủng vi khuẩn A. rhizogenes xâm Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn A. nhiễm vào lá, thân và rễ cây cát cánh). Kĩ thuật rhizogenes được cải tiến từ các phương pháp nuôi này sẽ hữu ích để nghiên cứu về rễ tơ và ứng cấy vi khuẩn A. rhizogenes của Mano (1986) dụng sản xuất các hợp chất thứ cấp có giá trị từ [11], Gai [5] và Shilpha (2015) [19]. Các chủng quá trình nuôi cấy rễ tơ cát cánh. vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834, C25, C31 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP và C34 được hoạt hóa trong 25 mL môi trường Vật liệu NB lỏng ở 25 oC, không có ánh sáng, lắc với tốc Vật liệu sinh học độ 130–150 vòng/phút trong 72 giờ. Dịch khuẩn A. rhizogenes thu được sau 72 giờ nuôi cấy với Hạt cát cánh thuần chủng được mua từ Trung OD600nm = 0,5–1,0 được sử dụng để xâm nhiễm tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà vào mô thực vật. Nội. Phương pháp cảm ứng tạo rễ tơ cát cánh Chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 Tách rời riêng lẽ từng cơ quan cây cát cánh được mua từ ngân hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT Nhật Bản. Các chủng A. in vitro (lá, thân và rễ), tạo vết thương ở mỗi cơ quan rồi nhúng vào dịch khuẩn A. rhizogenes rhizogenes C25, C31, C34 được cung cấp bởi Trang 65
3. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 ATCC 15834, C25, C31 và C34. Sau đó, các mẫu Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 μL bao mô được làm khô bằng giấy thấm vô trùng và gồm: 2 μL DNA; 0,5 μM primer; 0,2 mM mỗi đồng nuôi cấy trên môi trường MS rắn trong điều loại dATP, dCTP, dGTP và dTTP; dung dịch kiện không có ánh sáng. Sau thời gian đồng nuôi đệm phản ứng PCR 1X, 1U Taq polymerase và cấy, các mẫu mô được cấy chuyền sang môi nước cất vô trùng vừa đủ 25 μL. Trong phản ứng trường MS mới không chứa hormone, có bổ sung PCR ở mỗi primer, một chứng âm và chứng 250 mg/L cefotaxime. Rễ mọc ra từ vị trí vết dương với thành phần tương tự nhưng thể tích thương trên mẫu mô được giả định là rễ tơ sẽ DNA nạp vào phản ứng sẽ được thay thế tương được cấy chuyền sang môi trường MS mới. Tất ứng bằng nước hấp khử trùng và DNA tổng số cả các thao tác và nuôi cấy đều được thực hiện ở của A. rhizogenes để tránh những giải thích sai nhiệt độ 25 oC. lầm. Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ được tính theo Phản ứng PCR được thực hiện gồm các công thức: bước: biến tính bước đầu (95 oC/5 phút), 35 chu Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ (%) = kì lặp lại (94 oC/0,5 phút, 54 oC/0,5 phút, 72 oC/1 o 푠ố ẫ 푡ạ표 ễ 푡ơ phút) và bước kéo dài cuối cùng (72 C/5 phút). 100 % 푡ổ푛 푠ố ẫ â 푛푕푖ễ Sản phẩm thu được sau phản ứng PCR được phân tích trên gel agarose 1,5 % (w/v). Gel được Phương pháp PCR kiểm tra gene chuyển nhuộm với ethidium bromide và soi trên bàn đèn Rễ tơ cát cánh giả định được thu nhận và bảo UV để phát hiện sự hiện diện của DNA đích. quản trong ống eppendorf sạch ở –20 oC trước Phương pháp xử lí số liệu thống kê khi sử dụng để tách chiết DNA. DNA bộ gene Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu của rễ tơ cát cánh được tách chiết theo phương trên mỗi nghiệm thức từ 30–35 mẫu. Số liệu thu pháp CTAB của Doyle & Doyle (1987) [3] được từ kết quả của thí nghiệm được phân tích nhưng đã được thay đổi một số yếu tố để phù hợp thô, vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel với điều kiện của phòng thí nghiệm. Trình tự 2013 và được xử lí thống kê bằng phần mềm primer dùng cho phản ứng PCR ở các gene rolB, SPSS 16.0 (phân nhóm các giá trị bằng phương rolC và virG được thể hiện ở Bảng 1. pháp Duncan với độ tin cậy 95 %). Bảng 1. Trình tự primer cho phản ứng PCR gene rolB, rolC và virG Gene Tên primer Trình tự primer (5‘ – 3‘) rolB rolB F GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT rolB R GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC rolC rolC F CTC CTG ACA TCA AAC TCG TC rolC R TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA virG virG F TTA TCT GAG TGA AGT CGT CTC virG R CGT CGC CTG AGA TTA AGT GTC Trang 66
4. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN và C31 lại không có hiện tượng ra rễ tơ (Hình 2 Khử trùng hạt tạo cây cát cánh in vitro và 3). Hiệu quả tạo rễ tơ ở mô thực vật có sự phụ Hạt cát cánh đã được khử trùng và gieo trên thuộc vào loài thực vật và chủng A. rhizogenes môi trường MS có tỉ lệ nảy mầm trên 70 %. 25– xâm nhiễm. Chandran và Potty (2011) nhận thấy 40 ngày sau khử trùng, hạt cát cánh đã nảy mầm ở nhiều loài thực vật (Ipomoea batatas, và tăng trưởng thành cây con với chiều cao từ 1 Solenostemon rotundifolius, Vigna vexillata và đến 2 cm, có 2 đến 4 cặp lá (Hình 1A). Cây con Canavalia sp.), các chủng A. rhizogenes khác lúc này được cấy chuyền sang môi trường MS nhau cho hiệu quả xâm nhiễm khác nhau, trong mới giúp cây phát triển tốt hơn. Sau 75–120 ngày đó chủng ATCC 15834 có khả năng xâm nhiễm nuôi cấy, cây cát cánh đạt chiều cao từ 5–10 cm, hiệu quả nhất [2]. Chủng LB510 xâm nhiễm tốt có hơn 6 cặp lá, cây xanh tốt, lá dày, to rộng trên Talinum paniculatum nhưng lại không tốt (Hình 1B) được sử dụng để xâm nhiễm vi khuẩn với Artemisia annua và Artemisia cina trong khi tạo rễ tơ. chủng ATCC 15834 và YMB072001 lại có khả năng xâm nhiễm rất tốt trên hai loài thực vật này [4, 12]. Trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi, khả năng cảm ứng tạo rễ tơ trên các mẫu mô cát cánh in vitro tốt nhất ở hai chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 nhưng lại không hiệu quả ở hai chủng A. rhizogenes C25 và C31. Kết quả này chứng tỏ các chủng A. rhizogenes khác nhau có thể có sự khác biệt về khả năng cảm ứng tạo rễ tơ ở cây cát cánh mà nguyên nhân này có thể là do sự khác biệt trong plasmide của từng chủng vi khuẩn dẫn đến hiệu quả chuyển gene khác nhau Hình 1. Cây cát cánh in vitro mọc từ hạt được khử trùng sau 30 ngày (A) và 90 ngày (B) [1]. Hai chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 được chúng tôi lựa chọn cho các thí nghiệm Sàng lọc chủng A. rhizogenes thích hợp có khả tiếp theo. năng cảm ứng tạo rễ tơ Cây cát cánh được cắt ra thành từng cơ quan, tạo vết thương, ngâm trong dịch khuẩn A. rhizogenes 20 phút và đồng nuôi cấy trong 96 giờ. Sau 2–6 tuần xâm nhiễm với các chủng A. rhizogenes ATCC 15834, C25, C31 và C34, có 2 chủng (A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 với phần trăm số mẫu tạo rễ tơ tương ứng là 71,35 ± 6,64 % và 68,81 ± 7,84 %, không có sự khác biệt khi xử lí số liệu thống kê giữa 2 chủng này) trong số 4 chủng có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ trên các mẫu mô cát cánh. Ngược lại, mẫu đối chứng, Hình 2. Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ ở các chủng A. mẫu được cảm ứng với chủng A. rhizogenes C25 rhizogenes khác nhau. Kí hiệu a thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05 giữa các nhóm thí nghiệm Trang 67
5. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Hình 3. Sự tạo rễ tơ sau 3 tuần xâm nhiễm. A) mẫu đối chứng, B) A. rhizogenes ATCC 15834, C) A. rhizogenes C25, D) A. rhizogenes C31 và E) A. rhizogenes C34 Loại mô thích hợp tạo rễ tơ cát cánh % số mẫu tạo rễ tơ do chủng A. rhizogenes C34). Từng loại cơ quan (lá, thân, rễ) của cây cát Điều này cho thấy rằng sự chuyển gene của A. cánh được tạo vết thương, ngâm trong dịch khuẩn rhizogenes ATCC 15834 và C34 vào tế bào ở mô 20 phút và đồng nuôi cấy trên môi trường MS lá hiệu quả hơn so với ở thân và rễ. trong 96 giờ. Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ được ghi nhận sau 2–6 tuần kể từ khi mẫu mô bị xâm nhiễm bởi A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 (Hình 4). Kết quả cho thấy các cơ quan khác nhau khi bị xâm nhiễm bởi A. rhizogenes tạo rễ tơ với tỉ lệ khác nhau. Rễ được hình thành từ vị trí vết thương hoặc gần vết thương có một số đặc điểm chung như: mọc nhiều, mảnh, dài và có lông hút (Hình 5). Lá là cơ quan tạo rễ tơ cao nhất (100,00 ± 0,00 % số mẫu đều tạo rễ tơ với hai chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34), thân và rễ có khả năng cảm ứng tạo rễ tơ thấp Hình 4. Phần trăm số mẫu tạo rễ tơ ở các cơ quan khác hơn (tương ứng 36,69 ± 15,95 % và 55,56 ± 9,62 nhau khi xâm nhiễm với A. rhizogenes ATCC 15834 % số mẫu tạo rễ tơ do chủng A. rhizogenes và C34. Kí hiệu a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05 giữa các nhóm thí nghiệm ATCC 15834; 40,95 ± 10,14 % và 58,89 ± 8,39 Trang 68
6. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Hình 5. Sự tạo rễ tơ ở các cơ quan cây cát cánh sau 5 tuần xâm nhiễm. A, D, G tương ứng là lá, thân, rễ đối chứng. B, E, H tương ứng là lá, thân, rễ cát cánh được cảm ứng bởi A. rhizogenes ATCC 15834. C, F, I tương ứng là lá, thân, rễ được cảm ứng bởi A. rhizogenes C34 Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng 10, 15, 20 và 30 phút) và đồng nuôi cấy trên môi minh hiệu quả tạo rễ tơ bởi sự xâm nhiễm của A. trường MS trong 96 giờ. Ngâm mẫu đã được tạo rhizogenes có sự phụ thuộc vào loại mô, cơ quan vết thương vào dịch khuẩn giúp tạo điều kiện để hay vị trí của cơ thể thực vật mà A. rhizogenes mẫu tiếp xúc trực tiếp với vi khuẩn, đồng thời xâm nhiễm, trong đó lá (đặc biệt là vùng gân lá) kích thích tín hiệu giải phóng từ tế bào thực vật thông thường cho tỉ lệ xâm nhiễm cao hơn các bộ kích hoạt sự hoạt động của gene vir dẫn tới sự phận còn lại [2, 16, 17]. Kết quả cho thấy: ở cây bám của A. rhizogenes lên vị trí bị thương của cát cánh, lá là cơ quan thích hợp cho sự tạo rễ tơ mẫu [7]. thông qua sự xâm nhiễm của A. rhizogenes Phần trăm trung bình số mẫu tạo rễ tơ và thời ATCC 15834 và C34. Tỉ lệ tạo rễ tơ ở lá cao gian xuất hiện rễ tơ ở lá được ghi nhận ở Bảng 2 không những liên quan đến độ nhạy cảm của lá và Bảng 3. Dựa vào kết quả này, chúng tôi nhận với A. rhizogenes hơn so với các vùng mô khác thấy ở các mốc thời gian ngâm mẫu được khảo mà còn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của từng sát, A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 đều cho vùng mô (các vùng/bộ phận non thích hợp hơn tỉ lệ mẫu tạo rễ tơ trên 79 %. Thời gian xuất hiện cho sự xâm nhiễm) [17]. Từ thí nghiệm này, lá rễ tơ dao động từ 12 đến 20 ngày ở chủng A. cát cánh được sử dụng làm nguồn vật liệu cho rhizogenes ATCC 15834 và từ 13 đến 24 ngày ở các thí nghiệm tiếp theo. chủng A. rhizogenes C34. Thời gian hình thành rễ Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong tơ, thường trong phạm vi 1 tuần đến hơn 1 tháng, dịch khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 và C34 phụ thuộc vào loài thực vật và chủng vi khuẩn Lá cát cánh được tạo vết thương, ngâm trong xâm nhiễm [8, 15]. dịch khuẩn từng khoảng thời gian khác nhau (5, Trang 69
7. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Bảng 2. Phần trăm số mẫu lá cát cánh tạo rễ tơ và thời gian xuất hiện rễ tơ khi ngâm trong dịch khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 ở những khoảng thời gian khác nhau Thời gian ngâm 5 10 15 20 30 mẫu (phút) Phần trăm trung bình số mẫu lá tạo 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 79,24 ± 9,38b rễ tơ (%) Thời gian xuất hiện 20,00 ± 7,21a 12,67 ± 2,31b 12,33 ± 1,15b 14,67 ± 1,53a 17,67 ± 2,52a rễ tơ (ngày) Ghi chú: kí hiệu a, b thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05 giữa các nhóm thí nghiệm trong cùng một chỉ tiêu theo dõi Bảng 3. Phần trăm số mẫu lá cát cánh tạo rễ tơ và thời gian xuất hiện rễ tơ khi ngâm trong dịch khuẩn A. rhizogenes C34 ở những khoảng thời gian khác nhau Thời gian ngâm 5 10 15 20 30 mẫu (phút) Phần trăm trung bình số mẫu lá tạo 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 82,31 ± 6,83b rễ tơ (%) Thời gian xuất hiện 24,33 ± 5,03a 14,67 ± 2,51b 13,67 ± 1,53c 16,33 ± 2,08b 19,67 ± 1,15a, b rễ tơ (ngày) Ghi chú: kí hiệu a, b, c thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05 giữa các nhóm thí nghiệm trong cùng một chỉ tiêu theo dõi Chủng A. rhizogenes ATCC 15834 có khả đồng nuôi cấy trên môi trường MS rắn trong năng xâm nhiễm tốt nhất vào lá trong khoảng những khoảng thời gian khác nhau (24, 48, 72, 96 thời gian ngâm mẫu từ 10 đến 15 phút (100,00 ± và 120 giờ). Kết quả phần trăm số mẫu tạo rễ tơ 0,00 % số mẫu lá tạo rễ tơ, khi ngâm mẫu trong và thời gian xuất hiện rễ tơ được thể hiện ở Bảng dịch khuẩn 10 và 15 phút thì số ngày xuất hiện rễ 4 và Bảng 5. tương ứng là 12,67 ± 2,31 và 12,33 ± 1,15 ngày, Quá trình đồng nuôi cấy có ảnh hưởng đến số liệu không có sự khác biệt khi được xử lí phần trăm số mẫu tạo rễ tơ và thời gian xuất hiện thống kê). A. rhizogenes C34 có thời gian ngâm rễ tơ. Đồng nuôi cấy trong 24 giờ cho hiệu quả mẫu tốt nhất là 15 phút (100 ± 0,00 % số mẫu lá tạo rễ tơ rất thấp (5,16 ± 4,51 % và 5,90 ± 5,24 % tạo rễ tơ và số ngày xuất hiện rễ là 13,67 ± 1,53 tương ứng với sự xâm nhiễm của hai chủng A. ngày). Thời gian ngâm mẫu dài (từ 30 phút trở rhizogenes ATCC 15834 và C34, có trường hợp đi) đều cho hiệu quả chuyển gene thấp hơn ở cả 2 không có sự tạo rễ tơ khi lặp lại thí nghiệm) và chủng A. rhizogenes. Vậy, thời gian ngâm mẫu thời gian xuất hiện rễ tơ rất dài (khoảng 60 ngày). 10 phút và 15 phút tương ứng với chủng A. Đồng nuôi cấy trong 48 đến 96 giờ cho hiệu quả rhizogenes ATCC 15834 và C34 được lựa chọn tạo rễ tơ tăng dần và thời gian xuất hiện rễ tơ dao cho thí nghiệm tiếp theo. động trong khoảng từ 12,67 ± 2,31 đến 18,33 ± Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên 2,08 ngày ở hai chủng, nhưng đồng nuôi cấy quá trình cảm ứng tạo rễ tơ trong thời gian quá dài (120 giờ trở đi) dẫn đến Lá cát cánh được tạo vết thương, ngâm trong sự giảm hiệu quả tạo rễ tơ rõ rệt. dịch khuẩn 10 hoặc 15 phút (tương ứng với Các kết quả của chúng tôi chứng tỏ thời gian chủng A. rhizogenes ATCC 15834 hoặc C34) và đồng nuôi cấy quá ngắn (24 giờ) thì hiệu quả tạo Trang 70
8. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 rễ tơ rất thấp, ngược lại, thời gian đồng nuôi cấy đầu có dấu hiệu giảm kể từ 96 giờ trở đi do mẫu kéo dài (120 giờ trở đi) sẽ tác động ngược về hiệu mô cấy không đủ sức chịu đựng sự cạnh tranh quả tạo rễ tơ do sự giảm ái lực của vi khuẩn với của vi khuẩn vào lúc này [20]. Vậy, đồng nuôi tế bào thực vật hoặc bị ức chế cạnh tranh do sự cấy trong 72 giờ là tối ưu cho A. rhizogenes gia tăng mật độ tế bào vi khuẩn [21]. Sivanesan ATCC 15834 và C34 để cảm ứng tạo rễ tơ ở lá và Jeong (2009) nhận thấy hiệu quả tạo rễ tơ tăng cát cánh. dần khi đồng nuôi cấy từ 24 đến 72 giờ và bắt Bảng 4. Phần trăm số mẫu lá cát cánh tạo rễ tơ và thời gian xuất hiện rễ tơ khi đồng nuôi cấy với A. rhizogenes ATCC 15834 ở những khoảng thời gian khác nhau Thời gian đồng 24 48 72 96 120 nuôi cấy (giờ) Phần trăm trung bình số mẫu tạo rễ 5,16 ± 4,51d 72,78 ± 12,51b 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 46,67 ± 7,64c tơ (%) Thời gian xuất hiện 56,00 ± 3,61a 18,33 ± 2,08b 13,33 ± 1,53c,d 12,67 ± 2,31d 17,67 ± 2,08b,c rễ tơ (ngày) Ghi chú: kí hiệu a, b, c, d thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05 giữa các nhóm thí nghiệm trong cùng một chỉ tiêu theo dõi. Bảng 5. Phần trăm số mẫu lá cát cánh tạo rễ tơ và thời gian xuất hiện rễ tơ khi đồng nuôi cấy với A. rhizogenes C34 ở những khoảng thời gian khác nhau Thời gian đồng 24 48 72 96 120 nuôi cấy (giờ) Phần trăm trung bình số mẫu tạo rễ 5,90 ± 5,24d 74,24 ± 5,17b 100,00 ± 0,00a 100,00 ± 0,00a 33,33 ± 2,89c tơ (%) Thời gian xuất hiện 59,67 ± 5,13a 17,33 ± 1,53b 14,33 ± 0,58b 13,67 ± 1,53b 16,33 ± 1,53b rễ tơ (ngày) Ghi chú: kí hiệu a, b, c, d thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05 giữa các nhóm thí nghiệm trong cùng một chỉ tiêu theo dõi. Kiểm tra sự chuyển gene phẩm PCR của bộ gene rễ tơ cát cánh đều có sự Vùng T-DNA trong plasmide Ri của A. hiện diện của rolB và rolC (tương ứng khuếch đại rhizogenes ATCC 15834 và C34 chứa các gene đặc hiệu một vùng trình tự 423 bp và 626 bp) rol chịu trách nhiệm cho sự cảm ứng tạo rễ tơ nhưng không có sự hiện diện của gene virG trên mô thực vật bị xâm nhiễm. Để chứng minh (Hình 6). Do đó, kết quả chứng minh gene rolB các gene này đã chèn thành công vào bộ gene rễ và rolC từ plasmide Ri của A. rhizogenes ATCC tơ cát cánh, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR 15834 và C34 đã sát nhập thành công vào bộ với các cặp primer đặc hiệu để phát hiện ba gene gene rễ tơ cát cánh. rolB, rolC và virG. Kết quả cho thấy các sản Trang 71
9. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Hình 6. A. Kết quả PCR với cặp primer rolB (phải) và rolC (trái). Giếng 1 và 1‘: chứng âm; giếng 2 và 2‘: rễ cát cánh in vitro; giếng 3 và 3‘: rễ tơ cát cánh cảm ứng bởi A. rhizogenes ATCC 15834; giếng 4 và 4‘: rễ tơ cát cánh cảm ứng bởi A. rhizogenes C34; giếng 5 và 5‘: chứng dương A. rhizogenes ATCC 15834; giếng 6 và 6‘: chứng dương A. rhizogenes C34; giếng M: thang 100 bp. B. Kết quả PCR với cặp primer virG. Giếng 1 và 2: chứng dương tương ứng với chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34. Giếng 3 và 4: rễ tơ cát cánh tương ứng được cảm ứng bởi A. rhizogenes ATCC 15834 và C34. Giếng 5 và 6: chứng âm tương ứng với chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34. Giếng M: thang 100 bp plus KẾT LUẬN Từ những kết quả thí nghiệm của mình, C34 tương ứng là 10 và 15 phút. Thời gian đồng chúng tôi đã xây dựng một quy trình hoàn chỉnh nuôi cấy trong 72 giờ sẽ tối ưu để tạo rễ tơ ở hai tạo rễ tơ cát cánh thông qua sự xâm nhiễm của chủng này. Chúng tôi hi vọng quy trình cảm ứng hai chủng A. rhizogenes ATCC 15834 và C34. tạo rễ tơ cát cánh được mô tả ở trên sẽ hữu ích Hai gene rolB và rolC chịu trách nhiệm cảm ứng cho các nghiên cứu về rễ tơ cát cánh trong tương tạo rễ tơ khi được kiểm tra đã sát nhập thành lai cũng như trong nhiều ứng dụng khác, đặc biệt công vào bộ gene rễ tơ cát cánh. Lá cát cánh là cơ là các nghiên cứu liên quan đến sản xuất hợp chất quan tạo rễ tơ tốt nhất (100 % số mẫu có khả thứ cấp vì quy trình tạo rễ tơ cát cánh này giúp có năng tạo rễ tơ). Thời gian ngâm mẫu lá tốt nhất nguồn nguyên liệu ban đầu chủ động, ổn định về trong dịch khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 và mặt di truyền. Trang 72
10. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Induction of Platycodon grandiflorum hairy roots through the mediation of four Agrobacterium rhizogenes strains Tra Dong Phuong Vu Thi Bach Phuong Quach Ngo Diem Phuong University of Science, VNU–HCM ABSTRACT Balloon flower (Platycodon grandiflorum into genome of plant, was exploited. The results (Jacq.) A. DC.), the only species in Platycodon suggested two (A. rhizogenes ATCC 15834 and genus (Campanulaceae), is mainly distributed in C34) of four A. rhizogenes strains could induce East Asia. The rhizomes of P. grandiflorum, a hairy roots. RolB and rolC genes, which are traditional herbal medicine, have been widely responsible for the induction of hairy roots, were used for the treatment of cough, sore throat, inserted into the genome of hairy roots. Leaves asthma, tuberculosis and other diseases. had the highest infection frequency of hairy root Recently, pharmacological researches identified induction 100 %. The optimization of protocol, important biological activities compounds in the including time of immersion and co-culture, had rhizomes. Thus, to study and extract valuable the best results with 10 and 15 mins (10 mins for compounds, a hairy root induced technique was A. rhizogenes ATCC 15834 and 15 mins for A. achieved on P. grandiflorum for stable material rhizogenes C34) and 72 hours, respectively. In with fast growth rates (in hormone-free media) the future, this protocol, which was described in and metabolites production. To achieve this, the this paper, should be useful for studying and “natural genetic tool” Agrobacterium isolating valuable compounds from P. rhizogenes, which can transfer DNA segments grandiflorum hairy root cultures. Keywords: Agrobacterium rhizogenes, hairy root, Platycodon grandiflorum, rol genes, virG gene TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. M. Akramian, S.M.F. Tabatabaei, M. [3]. J.J. Doyle, J.L. Doyle, A rapid DNA Mirmasoumi, Virulence of different strains isolation procedure for small quantities of of Agrobacterium rhizogenes on genetic fresh leaf tissue, Phytochemical Bulllletin, transformation of four Hyoscyamus 19, 11–15 (1987). species, American – Eurasian Journal of [4]. T.M. Ermayanti, Transformasi Artemisia Agricultural and Environmental Sciences, 3, cina dan Artemisia annua dengan 5, 759–763 (2008). Agrobacterium rhizogenes, Journal of [2]. R.P. Chandran, V.P. Potty, Different Applied and Industrial Biotechnology in inducer molecules and strains of Tropical Region, 2, 1–5 (2009). Agrobacterium rhizogenes on enhancing [5]. Q.Y. Gai, J. Jiao, M. Luo, Z.F. Wei, Y.G. transformation frequency in host Zu, W. Ma, Y.J. Fu, Establishment of hairy plants, Biotechnology, 10, 2, 203–208 root cultures by Agrobacterium rhizogenes (2011). mediated transformation of Isatis tinctoria Trang 73
11. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 L. for the efficient production of flavonoids [13]. O. Nilsson, O. Olsson, Getting to the root: and evaluation of antioxidant the role of the Agrobacterium rhizogenes rol activities, PloS One, 10, 3, e0119022 genes in the formation of hairy roots, (2015). Physiologia Plantarum, 100, 3, 463–473 [6]. M.I. Georgiev, A.I. Pavlov, T. Bley, Hairy (1997). root type plant in vitro systems as sources of [14]. E. Nyakudya, J.H. Jeong, N.K. Lee, Y.S. bioactive substances, Applied Microbiology Jeong, Platycosides from the roots of and Biotechnology, 74, 6, 1175–1185 Platycodon grandiflorum and their health (2007). benefits, Preventive Nutrition and Food [7]. H.T.T. Minh, Q.N.D. Phương, B.V. Lệ, Science, 19, 2, 59–68 (2014). Nghiên cứu quy trình chuyển gene tạo rễ tơ [15]. A. Pal, S.S. Swain, A.K. Mukherjee, P.K. in vitro cây đậu phộng (Arachis hypogaea Chand, Agrobacterium pRi TL-DNA rolB L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes and TR-DNA opine genes transferred to the nhằm thu nhận resveratrol, Tạp chí Công Spiny Amaranth (Amaranthus spinosus L.), nghệ sinh học, 9, 4A, 665–672 (2011). A Nutraceutical Crop, Food Technology [8]. Z. Hu, M. Du, Hairy roots and its aplication and Biotechnology, 51, 1, 26–35 (2013). in plant genetic engineering, Journal of [16]. P.K. Pawar, V.L. Maheshwari, Integrative Plant Biology, 48, 2, 121–127 Agrobacterium rhizogenes mediated hairy (2006). root induction in two medicinally important [9]. H. Ishii, K. Tori, T. Tozyo, Y. Yoshimura, members of family Solanaceae, Indian Saponins from roots of Platycodon journal of Biotechnology, 3, 3, 414–417 grandiflorum. Part 1. Structure of (2004). prosapogenins, Journal of the Chemical [17]. K. Pirian, K. Piri, T. Ghiyasvand, Hairy Society, Perkin Transactions, 1, 1928–1933 roots induction from Portulaca oleracea (1981). using Agrobacterium rhizogenes to [10]. H. Ishii, K. Tori, T. Tozyo, Y. Yoshimura, noradrenaline‘s production, International Saponins from roots of Platycodon Research Journal of Applied and Basic grandiflorum. Part 2. Isolation and structure Sciences, 3, 642–649 (2012). of new triterpene glycosides, Journal of the [18]. Α.V. Rao, D.M. Gurfinkel, The bioactivity Chemical Society, Perkin Transactions, 1, of saponins: triterpenoid and steroidal 661–668 (1984). glycosides, Drug Metabolism and Drug [11]. Y. Mano, S. Nabeshima, C. Matsui, H. Interactions, 17, 1-4, 211–236 (2000). Ohkawa, Production of tropane alkaloids by [19]. J. Shilpha, L. Satish, M. Kavikkuil, M.J.V. hairy root cultures of Scopolia Largia, M. Ramesh, Methyl jasmonate japonica, Agricultural and Biological elicits the solasodine production and anti- Chemistry, 50, 11, 2715–2722 (1986). oxidant activity in hairy root cultures of [12]. Y.S.W. Manuhara, A. Yachya, A.N. Solanum trilobatum L., Industrial Crops Kristanti, Effect of aeration and inoculum and Products, 71, 54–64 (2015). density on biomass and saponine content of [20]. I. Sivanesan, B.R. Jeong, Induction and Talinum paniculatum Gaertn. hairy roots in establishment of adventitious and hairy root balloon-type bubble bioreactor, Journal of cultures of Plumbago zeylanica L., African Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Journal of Biotechnology, 8, 20, 5294–5300 2, 4, 47–52 (2012). (2009). Trang 74
12. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 [21]. J. Tao, L. Li, Genetic transformation of [23]. L. Zhang, Y. Wang, D. Yang, C. Zhang, N. Torenia fournieri L. mediated by Zhang, M. Li, Y. Liu, Platycodon Agrobacterium rhizogenes, South African grandiflorus – An ethnopharmacological, Journal of Botany, 72, 2, 211–216 (2006). phytochemical and pharmacological [22]. Y.Z. Yan, J.C. Xue, J.R. Wu, D.S. Yoo, review, Journal of Ethnopharma- S.Y. Lee, Y.K. Kim, M.R. Uddin, S.U. cology, 164, 147–161 (2015). Park, Variation of triterpenoid saponine [24]. L.G. Zhou, J.Y. Wu, Development and content in Platycodon grandiflorum (Jacq.) application of medicinal plant tissue ADC., Asian Journal of Chemistry, 24, 3, cultures for production of drugs and herbal 1268–1270 (2012). medicinals in China, Natural product Reports, 23, 5, 789–810 (2006). Trang 75