Giáo trình Nghiên cứu hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và Klebsiella pneumoniae của cao chiết lá dâm bụt (Hibiscus rosa-Sinensis L.)

Nội dung text: Giáo trình Nghiên cứu hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và Klebsiella pneumoniae của cao chiết lá dâm bụt (Hibiscus rosa-Sinensis L.)

1. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Nghiên cứu hoạt tính kháng Staphylococcus aureus và Klebsiella pneumoniae của cao chiết lá dâm bụt (Hibiscus rosa-sinensis L.) Lương Thị Mỹ Ngân Nguyễn Thị Thùy Linh Nguyễn Ngọc Quý Phạm Thị Ngọc Huyền Trương Thị Huỳnh Hoa Trần Trung Hiếu Phạm Thành Hổ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 30 tháng 05 năm 2016, nhận đăng ngày 02 tháng 12 năm 2016) TĨM TẮT Cây dâm bụt Hibiscus rosa-sinensis đã được hexane và 25 cao tiểu phân đoạn EtOAc đã được sử dụng cho việc kháng viêm và kháng nhiễm thu nhận. Tất cả các cao tiểu phân đoạn khơng khuẩn trong dân gian từ rất lâu đời. Nghiên cứu cĩ hoặc cĩ hoạt tính rất yếu lên K. pneumoniae. này nhằm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của Các cao tiểu phân đoạn cĩ hoạt tính mạnh đối các cao chiết lá dâm bụt lên Staphylococcus với S. aureus đã được ghi nhận, như: H4, H14– aureus và Klebsiella pneumoniae, hai trong số H16, và E1, E7, E17–E19. Đặc biệt là E7 cĩ hoạt các tác nhân quan trọng hàng đầu gây nhiễm tính mạnh nhất lên S. aureus với nồng độ MIC và khuẩn bệnh viện. Kết quả nghiên cứu cho thấy MBC lần lượt là 0,1 và 0,2 mg/mL. Dữ liệu GC- cao phân đoạn EtOAc và cao phân đoạn hexane MS cho thấy thành phần chính của tiểu phân cĩ hoạt tính kháng như nhau lên S. aureus, đoạn E7 là neophytadiene, trans-phytol và nhưng kháng rất yếu lên K. pneumoniae. Bằng 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol. phương pháp sắc ký cột, 24 cao tiểu phân đoạn Từ khĩa: lá Dâm bụt, Hibiscus rosa-sinensis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, kháng khuẩn, cao chiết MỞ ĐẦU Sự kháng lại các loại thuốc kháng sinh của đường hơ hấp trên ở cả người và động vật [2]. nhiều dịng vi khuẩn gây bệnh hiện đang gây nên Klebsiella pneumoniae thường gây nhiễm trùng mối quan ngại sâu sắc cho việc chăm sĩc sức đường hơ hấp dưới như viêm phổi, viêm phế khỏe y tế cộng đồng trên tồn thế giới. Thực vật quản phổi thứ phát ở các bệnh nhân sau khi bị được xem như là một trong những nguồn thay thế cúm, sởi, ho gà hoặc ở các bệnh nhân đang hồi lý tưởng vì mức độ an tồn, khơng hoặc ít phản sức hơ hấp. S. aureus và K. pneumoniae là hai ứng phụ, và cĩ nhiều đích tác động khác nhau lên trong số các tác nhân quan trọng hàng đầu gây tế bào vi khuẩn nên ít cĩ nguy cơ gây ra sự kháng nhiễm khuẩn bệnh viện và ngày càng xuất hiện thuốc [1]. Staphylococcus aureus là vi khuẩn gây nhiều chủng kháng lại nhiều loại thuốc kháng bệnh thường gặp nhất cĩ khả năng gây ra nhiều sinh làm cho tình trạng nhiễm khuẩn ngày càng loại bệnh khác nhau, vì chúng thường trú ở da và trầm trọng hơn [2, 3]. Trong một nghiên cứu Trang 84
2. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 trước đây của chúng tơi, nhiều loại tinh dầu thực pneumoniae ATCC 700603 được cung cấp từ vật đã được chứng minh cĩ khả năng kháng lại K. Đơn vị Nghiên cứu Lâm Sàng Đại học Oxford tại pneumoniae, trong đĩ tinh dầu nụ hoa Đinh Việt Nam và được giữ giống tại Phịng thí hương và tinh dầu tiêu cĩ hoạt tính ức chế mạnh nghiệm Chuyển hĩa Sinh học, Bộ mơn Cơng lên sự tăng trưởng của này với giá trị MIC lần nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hĩa Sinh học, lượt là 1,5 và 2,5 mg/mL. Việc nghiên cứu tìm ra Khoa Sinh học – Cơng nghệ Sinh học, Trường các hợp chất tự nhiên cũng như các chế phẩm Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM. thực vật cĩ chứa các hoạt chất chống lại sự tăng Phương pháp trưởng của các chủng vi khuẩn này mang một ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng trong việc Phương pháp thu nhận cao tổng kiểm sốt các chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng Bột lá dâm bụt khơ (3,8 kg) được ngâm trong bệnh viện [4]. 12,5 lít ethanol tuyệt đối (EtOH). Sau 3 ngày, lọc Cây dâm bụt (cây bụp) (Hibiscus rosa- và thu dịch chiết. Phần bột lá cịn lại được tiếp sinensis L.) thuộc họ Bơng (Malvaceae) là cây tục ngâm trong EtOH (2 lần, 3 ngày/lần). Tất cả o tiểu mộc được trồng rộng rãi làm hàng rào ở các dịch chiết được cơ quay chân khơng ở 44 C nhiều nơi trong thành phố và các tỉnh thuộc khu để loại bỏ hết EtOH và thu cao tổng EtOH. vực phía nam [5]. Theo y học cổ truyền, dược Phương pháp tách các cao phân đoạn liệu này được gọi là xuyên can bì, cĩ vị ngọt, tính Cao tổng EtOH (100 g) được ngâm dầm bình, khơng độc, cĩ tác dụng thanh nhiệt, lợi tiểu, trong 4 lít hexane. Sau 2 giờ, thu phần hịa tan giải độc, tiêu sưng. Cả lá, vỏ thân, rễ và hoa dâm trong dung mơi. Phần cao cịn lại được tiếp tục bụt đều được sử dụng chữa bệnh. Hoa dâm bụt cĩ ngâm trong hexane (2 lần, 2 giờ/lần). Tất cả các thể chữa mụn nhọt, nhức đầu, chĩng mặt, khĩ phần hịa tan trong hexane được cơ quay chân ngủ, hồi hộp; lá cĩ thể chữa bệnh quai bị, kiết lỵ, khơng ở 44 oC để loại bỏ hết hexane và thu cao mẫn ngứa, tiêu độc; vỏ thân được sử dụng để phân đoạn hexane (Hình 2). Tương tự, phần cao chữa khí hư, chàm mặt, kiết lỵ; và rễ giúp điều cịn lại được tiếp tục ngâm trong 4 lít ethyl hịa kinh nguyệt [6, 7]. acetate (EtOAc), thực hiện 3 lần, 2 giờ/lần để thu Trong nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng các cao phân đoạn EtOAc. cao chiết từ lá cây dâm bụt, một đối tượng được Phương pháp tách các cao tiểu phân đoạn dân gian sử dụng trong chữa bệnh viêm nhiễm và Từ cao phân đoạn hexane và cao phân đoạn được trồng tương đối phổ biến ở thành phố Hồ EtOAC, sắc ký cột silica gel (đường kính cột: 5 Chí Minh để khảo sát hoạt tính kháng S. aureus cm, chiều dài cột: 55 cm) được sử dụng để thu và K. pneumoniae. Thành phần hĩa học của cao nhận các cao tiểu phân đoạn. Rf của các tiểu phân tiểu phân đoạn cĩ hoạt tính cũng được ghi nhận đoạn được xác định bằng sắc ký bản mỏng trong bài báo này. (Merck, Kieselgel 60 F254). Các tiểu phân đoạn cĩ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Rf giống nhau được gộp chung với nhau và được Vật liệu sử dụng để thử hoạt tính kháng khuẩn. Lá dâm bụt được thu hái tại quận Thủ Đức, Phương pháp Sắc ký khí ghép khối phổ (GC–MS) thành phố Hồ Chi Minh vào tháng 4/2015. Cao tiểu phân đoạn E7 (2 mg) cĩ hoạt tính kháng khuẩn, được hịa tan trong 1 mL ethyl Chủng bệnh phẩm vi khuẩn Staphylococcus aureus được cung cấp từ bệnh viện Đại học Y acetate. Sau đĩ, được phân tích bằng sắc ký khí (Trace GC-Ultra, Thermo Scientific) ghép khối Dược TP. HCM và chủng chuẩn Klebsiella Trang 85
3. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 phổ (Single quadrupole, Thermo Scientific) với vào từng đĩa giấy (đường kính 8 mm, dày 1 mm) cột DB-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) sao cho khối lượng cao chiết ở mỗi đĩa giấy là 10 (Agilent Technologies) và sử dụng helium làm mg/đĩa giấy. Các đĩa giấy này được đặt trong tủ khí mang ở áp suất 13.209 psi ở nhiệt độ buồng cấy vơ trùng với quạt thổi trong 15 phút nhằm tiêm 280 oC và thể tích mẫu tiêm là 1 µL. làm bay hơi ethanol để cho cao chiết được phân Chương trình nhiệt được thực hiện ở nhiệt độ đầu tán đều trên đĩa giấy. Sau đĩ, đặt từng đĩa giấy là 70 oC (trong 1 phút), sau đĩ tăng 15 oC/phút thử nghiệm trên đĩa mơi trường thạch LB đã được cho đến 300 oC và giữ trong 15 phút. Các hợp cấy trải 100 l dịch vi khuẩn ở nồng độ 108 chất chính trong cao tiểu phân đoạn E7 được xác CFU/mL (độ đục McFarland 0,5) mật độ vi định bằng cách so sánh khối phổ với ngân hàng khuẩn ban đầu được xác định lại bằng phương dữ liệu của NIST (National Institute of Standard pháp đếm khuẩn lạc. Các đĩa vi khuẩn thử and Technology (NIST), USA/Wiley, 2011). nghiệm sau đĩ được ủ ở 37 oC. Sau 24 giờ, Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng đường kính vịng kháng khuẩn xuất hiện xung khuẩn quanh đĩa giấy được ghi nhận (Hình 1A). Các đĩa giấy đối chứng âm chỉ chứa 50 l ethanol/đĩa Phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên mơi giấy. Các đĩa giấy đối chứng dương cĩ chứa 30 trường thạch (paper disc diffusion) được sử dụng g tetracycline/đĩa giấy. Thí nghiệm được thực để xác định đường kính vịng kháng khuẩn [8]. hiện 3 lần ở các thời điểm khác nhau. Các cao chiết được hịa tan trong ethanol ở nồng độ 200 mg/mL. Mỗi dịch cao chiết được thấm A) B) C) D) Hình 1. Phương pháp đĩa giấy khuếch tán trên mơi trường thạch và vịng kháng khuẩn (A). Nồng độ ức chế tối thiểu MIC của các chế phẩm thực vật được xác định bằng phương pháp pha lỗng trên đĩa 96 giếng với sự đổi màu của resazurin (B). Giá trị MIC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm khơng làm đổi màu xanh của resazurin. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC được xác định bằng phương pháp trải đĩa. Giá trị MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ ở các giếng thử nghiệm (B) cho thấy khơng cĩ khuẩn lạc vi khuẩn nào cĩ thể mọc trên đĩa mơi trường thạch LB (C), và đĩa đối chứng cĩ mọc khuẩn lạc vi khuẩn (D) Trang 86
4. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 Phương pháp pha lỗng các cao chiết thực sau 24 giờ quan sát sự sống sĩt của vi khuẩn. Giá vật (broth dilution) trên đĩa 96 giếng và chất chỉ trị MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thị màu resazurin được sử dụng để xác định nồng của các chế phẩm thực vật cĩ thể tiêu diệt tồn bộ độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory vi khuẩn trong giếng (Hình 1C), khơng cĩ khuẩn Concentration) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu lạc nào xuất hiện trên đĩa mơi trường thạch LB, MBC (Minimum Bactericidal Concentration) [9, đĩa mơi trường đối chứng cĩ khuẩn lạc vi khuẩn 10]. Chế phẩm thực vật (gồm cao tổng và các cao xuất hiện (Hình 1D). Mỗi thí nghiệm được thực phân đoạn) được pha lỗng dưới dạng stock trong hiện ít nhất 3 lần vào các thời điểm khác nhau để DMSO với nồng độ tương ứng là 200 mg/mL và xác định kết quả. 100 mg/mL. Để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN các dung dịch stock này được pha lỗng thành Tách chiết thu nhận cao tổng và cao tiểu phân các nồng độ khảo sát từ 0–10 mg/mL đối với cao đoạn tổng và 0–5 mg/mL đối với cao phân đoạn. Dịch vi khuẩn được nuơi cấy qua đêm và được pha Quy trình thu nhận cao tổng EtOH và các cao lỗng sao cho mật độ đạt 105–106 CFU/mL. Mỗi phân đoạn hexane và EtOAc được tĩm tắt ở Hình giếng gồm 50 l dịch vi khuẩn và 50 l chế phẩm 2. Hiệu suất chiết cao tổng EtOH là 11,9 % so thực vật ở các nồng độ pha lỗng khác nhau với trọng lượng khơ của lá dâm bụt. Tỉ lệ phần (Hình 1B). Các giếng đối chứng chứa dịch vi trăm cao phân đoạn hexane và cao phân đoạn khuẩn, mơi trường và DMSO. Mỗi nghiệm thức EtOAc trong cao tổng EtOH lần lượt là 53,0 % và được lặp lại 3 lần. Các đĩa thử nghiệm và đối 10,7 %. chứng sau đĩ được ủ ở 37 oC. Sau 24 giờ, 20 µL Cao phân đoạn hexane (20 g) hoặc EtOAc thuốc thử resazurin 0,01 % được cho vào mỗi (16 g) được tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột giếng. Quan sát sự thay đổi màu, ghi nhận giá trị silica gel, với pha động là hexane (100–0 %) và MIC. Các giếng cĩ sự đổi màu của dung dịch ethyl acetate (0–100 %), sau cùng là methanol resazurin từ màu xanh sang màu hồng cho thấy (MeOH) 100 %. Hàm lượng và tỉ lệ % của các cĩ sự tăng trưởng của vi khuẩn trong giếng. Nồng tiểu phân đoạn qua sắc ký cột được ghi ở Bảng 1 độ ức chế tối thiểu MIC được định nghĩa là nồng và Bảng 2. Kết quả cho thấy rằng, các cao tiểu độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm của phân đoạn H24 (7,7 g), E24 (4,5 g) và E25 (3,8 các chế phẩm thực vật cĩ thể ức chế sự tăng g) chiếm hàm lượng lớn và chứa các hợp chất cĩ trưởng của vi khuẩn (khơng làm đổi màu độ phân cực mạnh hơn cao tiểu phân đoạn khác, resazurin) (Hình 1B). Nồng độ diệt khuẩn tối vì H24, E24 và E25 thuộc hệ ly giải hexane:ethyl thiểu MBC đươc xác định bằng phương pháp trải acetate (H:EtOAc) là 0:100 hoặc MeOH 100 %. đĩa: 100 µL dịch thử nghiệm trên các giếng Các cao tiểu phân đoạn cịn lại chiếm hàm lượng khơng cĩ sự đổi màu của resazurin được trải lên thấp và chứa các hợp chất khơng phân cực hoặc các đĩa mơi trường thạch LB và được ủ ở 37 oC, cĩ độ phân cực nhỏ. Trang 87
5. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Hình 2. Quy trình thu nhận các cao chiết thực vật bằng phương pháp ngâm dầm trong dung mơi. Cao tổng EtOH, cao phân đoạn hexane, cao phân đoạn EtOAc, và cao EtOH cịn lại Hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết lá Qua kết quả ở Bảng 4, các cao chiết lá dâm bụt dâm bụt cĩ tính kháng mạnh đối với S. aureus hơn là đối với Hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết lên K. pneumoniae. Hoạt tính kháng S. aureus của các S. aureus và K. pneumoniae được xác định bằng cao phân đoạn hexane và EtOAc tương tự nhau với phương pháp đĩa giấy và phương pháp pha lỗng MIC là 2,5 mg/mL và MBC là 7,5 mg/mL, và mạnh trên đĩa 96 giếng. Kết quả cho thấy rằng đường hơn so với cao tổng ETOH. Vì vậy, cả hai cao phân kính vịng kháng khuẩn do cao tổng và các cao phân đoạn này được tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột để đoạn tạo ra thay đổi từ 9–15 mm đối với S. aureus, thu nhận các tiểu phân đoạn và kiểm tra hoạt tính 9–11 mm đối với K. pneumoniae (Bảng 3). kháng khuẩn. Bảng 1. Hàm lượng và tỉ lệ thu nhận các cao tiểu phân đoạn từ cao phân đoạn hexane Cao tiểu phân đoạn Pha động (H:EtOAc) Hàm lượng (g) Tỉ lệ (%) H1 95:5 0,03 0,14 H2 90:10 0,01 0,05 H3 85:15 5,10 25,5 H4* 85:15 0,22 1,08 H5 – H8 80:20 0,86 4,26 H9 – H13 70:30 2,19 10,93 H14* 70:30 0,47 2,34 H15* 70:30 0,26 1,29 H16* 70:30 0,40 2,00 H17 – H23 70:30 2,76 13,76 H24 0:100 và MeOH 100 % 7,70 38,50 Tổng 19,97 99,89 *phân đoạn cĩ hoạt tính kháng khuẩn Trang 88
6. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 Kết quả kháng khuẩn của các cao tiểu phân cao phân đoạn EtOAc (Bảng 2). đoạn bằng phương pháp pha lỗng trên đĩa 96 Hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh của các cao giếng với thuốc thử resazurin và bằng phương chiết lá và hoa dâm bụt cũng đã được nghiên cứu pháp trải đĩa được ghi nhận ở Bảng 5. Nghiên cứu bởi một số tác giả trên thế giới. Arullappan và cs cho thấy, trong số 24 tiểu phân đoạn được thu nhận (2009) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của từ cao phân đoạn hexane, các cao tiểu phân đoạn H4 các cao chiết MeOH, EtOAc và petroleum ether và H14–H16 cĩ hoạt tính kháng S. aureus, và chỉ cĩ từ thân, lá, và hoa dâm bụt bằng phương pháp đĩa H4 kháng K. pneumoniae. Trong đĩ, cao tiểu phân giấy khuếch tán trên mơi trường thạch. Các cao đoạn H4 cho giá trị MIC = 1,25 và MBC = 2,5 chiết này khơng cĩ khả năng kháng E. coli, P. mg/mL đối với S. aureus; MIC = 5 và MBC = 10 aeruginosa, và K. pneumoniae, nhưng cao chiết mg/mL đối với K. pneumoniae; và mạnh hơn so với petroleum ether cĩ khả năng kháng mạnh nhất đối các cao tiểu phân đoạn H14–H16. Trong số 25 tiểu với chủng vi khuẩn MRSA (methicillin-resistant S. phân đoạn được thu nhận từ cao phân đoạn EtOAc, aureus) [11]. Theo Uddin và cs (2010), cao chiết các tiểu phân đoạn E1, E7 và E17–E19 cĩ hoạt tính MeOH từ lá cĩ hoạt tính kháng S. aureus và kháng lại S. aureus, và chỉ cĩ E7 kháng lại K. khơng cĩ khả năng kháng K. pneumoniae [12]. pneumoniae. Trong đĩ, E7 cĩ hoạt tính kháng mạnh Nghiên cứu của Seyyedneja (2010) cho thấy rằng nhất đối với S. aureus (MIC = 0,1 và MBC = 0,2 cao chiết EtOH lá dâm bụt 20 mg/đĩa giấy ( 6 mg/mL) và với K. pneumoniae (MIC = 7,5 và MBC mm) cĩ thể kháng K. pneumoniae và tạo vịng = 10 mg/mL). Tiếp theo là E1 cho giá trị MIC = kháng khuẩn 8 mm, trong khi đĩ chỉ với 2,5 0,25 và MBC = 0,5 mg/mL đối với S. aureus, nhưng mg/đĩa giấy ( 6 mm) cĩ thể kháng S. aureus và cĩ hoạt tính kháng yếu đối với K. pneumoniae. Các tạo vịng kháng khuẩn 7 mm [13]. Điều này cho tiểu phân đoạn H4, E1 và E7 cĩ hoạt tính kháng thấy rằng, cao lá dâm bụt cĩ chứa các hoạt chất khuẩn mạnh hơn so với tất cả các tiểu phân đoạn kháng cả S . aureus và K. pneumoniae. Tuy cịn lại, nhưng chúng chiếm tỉ lệ rất nhỏ, H4 nhiên, hoạt chất kháng K. pneumoniae cĩ lẽ chiếm 1,08 % trong cao phân đoạn hexane (Bảng chiếm tỉ lệ rất thấp hoặc K. pneumoniae ít nhạy 1), và E1 chiếm 0,14 %, E7 chiếm 1,11 % trong với các hoạt chất này. Bảng 2. Hàm lượng và tỉ lệ thu nhận các cao tiểu phân đoạn từ cao phân đoạn EtOAc Cao tiểu phân đoạn Pha động (H: EtOAc) Hàm lượng (g) Tỉ lệ (%) E1* 95:5 và 90:10 0,39 0,14 E2 80:20 0,05 0,05 E3 – E6 70:30 0,81 28,50 E7* 70:30 0,11 1,11 E8 – E15 70:30 2,14 15,79 E16 70:30 và 60:40 0,36 2,0 E17* 60:40 và 50:50 0,34 5,00 E18* 50:50 và 40:60 0,17 1,05 E19* 40:60 0,17 2,23 E20 40:60 và 20:80 0,65 0,84 E21 20:80 và 100:0 0,27 2,25 E22 0: 100 0,85 0,55 E23 0: 100 và 100 % MeOH 0,24 1,84 E24 100 % MeOH 4,52 38,50 E25 100 % MeOH 3,84 24,0 Tổng 14,91 93,19 * phân đoạn cĩ hoạt tính kháng khuẩn Trang 89
7. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Bảng 3. Vịng kháng khuẩn của cao tổng EtOH và các cao phân đoạn lên S. aureus và K. pneumoniae Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Mẫu (10 mg/đĩa giấy) S. aureus K. pneumoniae Cao tổng EtOH 9,2 0,3 8,8 0,2 Cao phân đoạn hexane 15.4 0,8 10,8 0,4 Cao phân đoạn EtOAc 14,8 0,4 10,7 0,3 Cao EtOH cịn lại - - Tetracycline (0,03 mg/đĩa 29,7 1,45 - giấy) - khơng hoạt tính Thành phần của tiểu phân đoạn E7 được xác định bằng GC-MS Thành phần của tiểu phân đoạn E7 cĩ hoạt cứu của Pejin và cs (2014), trans-phytol cĩ khả tính kháng mạnh với S. aureus được phân tích năng kháng Staphylococcus aureus, Bacillus bằng GC-MS (Hình 3). Kết quả cho thấy thành cereus, Micrococcus flavus, Listeria phần chính của tiểu phân đoạn này là monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, neophytadiene (C30H38), (2E)-3,7,11,15- Salmonella typhimurium, Escherichia coli, và tetramethyl-2-hexadecen-1-ol (trans-phytol, Enterobacter cloacae với MIC 0,003–0,038 C20H40O) và 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen- mg/mL và MBC 0,013–0,052 mg/mL; kháng 1-ol (C20H40O, một dạng stereoisomer của trans- nấm Aspergillus spp., Penicillium spp. và phytol). Neophytadiene đã được chứng minh bởi Trichoderma spp. với MIC 0,008–0,016 mg/mL nhiều tác giả là chất cĩ hoạt tính kháng khuẩn và MFC (Minimum Fungicidal Concentration) mạnh, cĩ ở nhiều loại vi tảo như Dunaliella 0,090–0,520 mg/mL [21]. 3,7,11,15-tetramethyl- salina [14], Navicula delognei [15], và 2-hexadecen-1-ol cĩ thuộc tính kháng ung thư, Chaetoceros muelleri [16], và nhiều lồi thực vật kháng oxy hĩa và kháng khuẩn [22]. Hoạt tính như Bursera simaruba [17], Turnera ulmifolia kháng khuẩn của neophytadien, trans-phytol và [18], Urtica dioica [19], và Hugonia mystax [20]. 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol cĩ trong Trans-phytol, một hợp chất diterpene alcohol, E7 cĩ lẽ quyết định tính kháng khuẩn mạnh của được chứng minh là cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa, tiểu phân đoạn này lên S. aureus. kháng khuẩn và kháng nấm mạnh. Theo nghiên Bảng 4. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC và diệt khuẩn tối thiểu MBC của các cao chiết lên S. aureus và K. pneumoniae bằng phương pháp pha lỗng trên đĩa 96 giếng với thuốc thử resazurin và bằng phương pháp trải đĩa S. aureus K. pneumoniae Mẫu MIC (mg/mL) MBC MIC (mg/mL) MBC (mg/mL) (mg/mL) Cao tổng EtOH 5,0 >10,0 10 15,0 Cao phân đoạn hexane 2,5 7,5 10 15,0 Cao phân đoạn EtOAc 2,5 7,5 10 12,5 Cao EtOH cịn lại - - - - - khơng hoạt tính Trang 90
8. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 Bảng 5. Nồng độ ức chế tối thiểu MIC và diệt khuẩn tối thiểu MBC của các tiểu phân đoạn hexane (H) và EtOAc (E) lên S. aureus và K. pneumoniae bằng phương pháp pha lỗng trên đĩa 96 giếng với thuốc thử resazurin và bằng phương pháp trải đĩa S. aureus K. pneumoniae Mẫu* MIC (mg/mL) MBC (mg/mL) MIC (mg/mL) MBC (mg/mL) H4 1,25 2,5 5 10 H14 2,5 5 - >10 H15 2,5 5 - >10 H16 2,5 7,5 - >10 E1 0,25 0,5 > 7,5 >10 E7 0,1 0,2 7, 5 10 E17 4 5 > 7,5 >10 E18 2 3 > 7,5 >10 E19 0,5 3 > 7,5 >10 *Các tiểu phân đoạn cịn lại khơng cĩ hoạt tính hoặc cĩ hoạt tính rất thấp Hình 3. Thành phần của tiểu phân đoạn E7 được xác định bằng GC-MS KẾT LUẬN Lá dâm bụt Hisbicus rosa-sinensis cĩ chứa EtOAc, E7 cĩ hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. các hoạt chất cĩ tính kháng mạnh lên Các thành phần chính của E7 là neophytadiene, Staphylococcua aureus. Vi khuẩn Klebsiella trans-phytol và 3,7,11,15- tetramethyl-2- pneumoniae ít nhạy với các cao phân đoạn hexadecen-1-ol. hexane và EtOAc và các cao tiểu phân đoạn từ Lời cảm ơn : Nghiên cứu được tài trợ bởi cao tổng EtOH của lá dâm bụt. Trong số các tiểu Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh (ĐHQG- phân đoạn được tách chiết từ cao phân đoạn HCM) trong khuơn khổ Đề tài mã số C2015-18- 25. Trang 91
9. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Study on the antibacterial activities of Hibiscus rosa-sinensis leaf extracts against Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae Luong Thi My Ngan Nguyen Thi Thuy Linh Nguyen Ngoc Quy Pham Thi Ngoc Huyen Truong Thi Huynh Hoa Tran Trung Hieu Pham Thanh Ho University of Science,VNU-HCM ABSTRACT Hibiscus rosa-sinensis has been used in folk acetate, and yielded 24 hexane subfractions (H1– medicine to treat inflammation and bacterial H24) and 25 ethyl acetate subfractions (E1–E25). infections for a long time. This study aims to All subfractions had no or little activities to K. evaluate the antibacterial activity of H. rosa- pneumoniae. Subfractions as H4, H14–H16, and sinensis leaf extracts against Staphylococcus E1, E7, E17–E19 had strong activities against S. aureus and Klebsiella pneumoniae. Both are the aureus. Especially, E7 subfraction exhibited the major causes of hospital acquired infections. The strongest activity with MIC and MBC values of results showed that the hexane and ethyl acetate 0.1 and 0.2 mg/mL, respectively. GC-MS data fractions were similarly active to S. aureus but showed that the main constituents of the E7 very weak active to K. pneumoniae. Both of these subfraction were neophytadiene, trans-phytol and fractions were subjected to chromatograph using 3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-ol. silica gel column eluted with hexane and ethyl Key words: Hibiscus rosa- sinensis, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, antibacterial activity, extracts TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. I. Raskin, D.M. Ribnicky, S. khuẩn bệnh viện tại bệnh viện nhân dân Komarnytsky, N. Ilic, A. Poulev, N. Gia Định, Tạp chí Y Học TP. Hồ Chí Borisjuk, A. Brinker, D.A. Moreno, C. Minh, 13, 6, 295–300 (2009). Ripoll, N. Yakoby, J.M. O‘Neal, T. [3]. Đ.M. Phương, N.Q. Anh, Căn nguyên vi Cornwell, I. Pastor, B. Fridlender, Plants sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện and human health in the twenty-first thường gặp, theo Tạp chí Y học lâm sàng, century, Trends Biotechnol, 20, 12, 522– 531 (2002). vi-sinh-vat-gay-nhiem-trung-benh-vien- [2]. N.S.M. Tuyết, V.T.C. Hải, T.A. Dũng, thuong-gap-di1246 n5333 (2012). L.T.T. Nga, Khảo sát vi khuẩn gây nhiễm Trang 92
10. TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T5- 2016 [4]. T.T. Hiếu, N.T. Hằng, L.T.T. Loan, H. rosa sinensis, Trop Life Sci Res, 20, 2, Việt, L.T.M. Ngân, Hoạt tính của các loại 109–118 (2009). tinh dầu thực vật kháng phế trực khuẩn [12]. B. Uddin, T. Hossan, S. Paul, T. Ahmed, Klebsiella pneumoniae, Tồn văn kỷ yếu T. Nahar, S. Ahmed, Antibacterial activity Hội nghị Khoa học lần IX, Trường Đại of the ethanol extracts of Hibiscus rosa- học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP. sinensis leaves and flowers against clinical HCM, 158–167 (2014). isolates of bacteria, Bangladesh J Life Sci, [5]. P.H. Hộ, Cây cỏ Việt Nam, Quyển I, tập 22, 65–73 (2010). 2, Nxb. MeKong, 661 (1991). [13]. S.M. Seyyednejad, H. Koochak, E. [6]. P.X. Trung, Chữa bệnh bằng cây dâm bụt, Darabpour, H. Motamedi, A survey on Nơng Nghiệp Việt Nam (theo Nam dược Hibiscus rosa-sinensis, Alcea rosea L. and thần hiệu), Malva neglecta Wallr as antibacterial yhoccotruyen/baiviet/29_010.htm (2000). agents, APJTM, 3, 5, 351–355 (2010). [7]. L.T.M. Ngan, J.K. Moon, J.H. Kim, T. [14]. J.A. Mendiola, S. Santoyo, A. Cifuentes, Shibamoto, Y.J. Ahn, Growth-inhibiting G. Reglero, E. Ibáđez, F.J. Seđoráns, effects of Paeonia lactiflora root steam Antimicrobial activity of sub- and distillate constituents and structurally supercritical CO2 extracts of the green related compounds on human intestinal alga Dunaliella salina, J. Food Prot, 71, bacteria, World J. Microbiol Biotechnol, 10, 2138–2143 (2008). 28, 4, 1575–1583 (2012). [15]. J.A. Findlay, A.D. Patil, Antibacterial [8]. Y.J. Ahn, J.H. Kwon, S.H. Chae, J.H. constituents of the diatom Navicula Park, J.Y. Yoo, Growth-inhibitory delognei, J. Nat Prod, 47, 815–818 responses of human intestinal bacteria to (1984). extracts of oriental medicinal plants, [16]. J.A. Mendiola, C.F. Torres, P.J. Martín- Microb Ecol Health Dis, 7, 5, 257–261 Alvarez, S. Santoyo, A. Toré, B.O. (1994). Arredondo, F.J. Seđoráns, A. Cifuentes, E. [9]. L.T.M. Ngan, J.K. Moon, T. Shibamoto, Ibáđez, Use of supercritical CO2 to obtain Y.J. Ahn, Growth-inhibiting, bactericidal, extracts with antimicrobial activity from and urease inhibitory effects of Paeonia Chaetoceros muelleri microalga. A lactiflora root constituents and related correlation with their lipidic content, Eur compounds on antibiotic-susceptible and - Food Res Technol, 224, 505–510 (2007). resistant strains of Helicobacter pylori, J. [17]. M.E. Carretero, J.L. Lĩpez-Pérez, M.J. Agric Food Chem, 60, 9062–9073 (2012). Abad, P. Bermejo, S. Tillet, A. Israel, B. [10]. Y.W. Mak, L.O. Chuah, R. Ahmad, R. Noguera-P, Preliminary study of the anti- Bhat, Antioxidant and antibacterial inflammatory activity of hexane extract activities of Hibiscus (Hibiscus rosa- and fractions from Bursera simaruba sinensis L.) and Cassia (Senna (Linneo) Sarg. (Burseraceae) leaves, J bicapsularis L.) flower extracts, J. King Ethnopharmacol, 116, 1, 11–15 (2008). Saud Univ Sci, 25, 4, 275–282 (2013). [18]. K. Kalimuthu, R. Prabakaran, R. Preetha, [11]. S. Arullappan, Z. Zakaria, D.F. Basri, Phytochemical screening and GC-MS Preliminary screening of antibacterial studies on the ethanolic extract of Turnera activity using crude extracts of Hibiscus ulmifolia L., Int J Pharm Phytopharmacol Res, 4, 179–181(2014). Trang 93
11. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 [19]. T.M.B. Balkhi, F.A. Bhat, Bioactive [21]. B. Pejin, A. Savic, M. Sokovic, J. potential of leaf extracts from Urtica Glamoclija, A. Ciric, M. Nikolic, K. dioica L. against fish and human Radotic, M. Mojovic, Further in vitro pathogenic bacteria, Afri. J. Microbiol. evaluation of antiradical and antimicrobial Res., 6, 6893–6899 (2012). activities of phytol, Nat. Prod. Res., 28, 6, [20]. G. Rajeswari, M. Murugan, V.R. Mohan, 372–376 (2014). GC-MS analysis of bioactive components [22]. M.J.D. Mol, P.M Radhamany, GC-MS of Hugonia mystax L. (Linaceae), Res. J. profiling in the fruits of Tamilnadia Pharm. Biomed. Sci., 29, 818–824 (2012). uliginosa (Retz.) Tirveng and Sastre (Rubiaceae), WJPPS, 5, 1, 890–896 (2016). Trang 94