Giáo trình Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipid từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa

Nội dung text: Giáo trình Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipid từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipid từ quá trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa Lê Quỳnh Loan Ngô Đức Duy Hoàng Quốc Khánh Nguyễn Hoàng Dũng Viện sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Nguyễn Hoàng Dũng Nguyễn Lương Hiếu Hòa Viện Kỹ thuật Công nghệ cao, Đại học Nguyễn Tất Thành Nguyễn Thị Bạch Huệ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 15 tháng 10 năm 2015, nhận đăng ngày 02 tháng 12 năm 2016) TÓM TẮT Chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh lên men chủng C. bombicola sử dụng nguồn học đang ngày càng được quan tâm bởi những nguyên liệu dầu dừa. Kết quả cho thấy ở quy mô ứng dụng rộng rãi của chúng trong nhiều lĩnh phòng thí nghiệm, sau 7 ngày nuôi cấy, sản vực và những đặc tính ưu việt so với các chất có lượng sophorolipid thu nhận là 14,6 g/L với sức nguồn gốc hóa học như khả năng phân hủy sinh căng bề mặt là 40 mN/m. Sophorolipid thu nhận học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với môi có khả năng kháng lại một số vi khuẩn như E. trường. Sophorolipid là một dạng chất hoạt động coli, B. subtilis, P. aeruginosa và tạo nhũ với các bề mặt thuộc nhóm glycolipid được sản xuất từ loại dầu. Thông qua thí nghiệm DPPH, quá trình lên men bởi chủng nấm men không gây sophorolipid cho thấy có khả năng bắt gốc tự do bệnh như Candida bombicola và đang nhận được theo nồng độ tăng dần. Các kết quả trên cho thấy nhiều sự quan tâm. Trong nghiên cứu này, chúng sophorolipid có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận và khảo sát vực hóa mỹ phẩm. một số hoạt tính của sophorolipid từ quá trình Từ khóa: sophorolipid, Candida bombicola, kháng khuẩn, DPPH, dầu dừa MỞ ĐẦU Sophorolipid (SL), chất hoạt động bề mặt và C. bororiensis, trong đó chủng C. bombicola thuộc nhóm glycolipid, là những phân tử lưỡng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất [7, 8]. cực gồm một nhóm disaccharide sophorose liên Nguồn carbon ưa nước sử dụng phổ biến là kết với gốc hydroxyl của carbon kề cuối mạch glucose, nguồn carbon kị nước có thể là dầu, acid trong chuỗi acid béo C16 - C18 [12]. Các SL béo hoặc alkane [13]. Hai dạng cấu trúc chính được tổng hợp từ hai nguồn cơ chất bao gồm của SL là dạng acid tự do và dạng vòng lactone nguồn carbon ưa nước và kị nước thông qua quá [20]. Sự khác biệt trong cấu trúc dẫn đến sự khác trình lên men bởi các chủng nấm men không gây biệt về đặc tính lý hóa của SL, các SL mang tính bệnh như C. bombicola, C. magnolia, C. apicola acid cho thấy khả năng tạo bọt và tính tan tốt Trang 15
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 trong khi các SL có vòng lactone cho thấy hoạt khảo sát một số hoạt tính sinh học của tính kháng khuẩn và giảm sức căng bề mặt tốt sophorolipid thu nhận. [12]. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các SL có khả năng ứng dụng rộng rãi trong Vật liệu các lĩnh vực như: thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm, dệt may, sản xuất chất tẩy rửa [1]. Bên Chủng gốc nấm men C. bombicola ATCC cạnh đó những nghiên cứu gần đây còn cho thấy 22214 được cung cấp ở dạng đông khô bởi giáo SL có khả năng kháng khuẩn trong việc trị mụn, sư Kim Eun-Ki, Đại học Inha, Hàn Quốc. Chủng trị gàu, mùi hôi cơ thể và nhiều tác động hữu hiệu được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường YM trong việc bảo vệ da và tóc [20]. Chúng kích Broth (glucose 1 %, yeast extract 0,6 %, peptone thích sự biến dưỡng của các tế bào fibroblast 0,5 %); 1′,4″-sophorolactone 6′,6″-diacetate; 2,2- trong lớp biểu mô và kích thích quá trình tổng diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) được cung hợp collagen, nhân tố làm cho da săn chắc, chống cấp bởi công ty hóa chất Sigma (St. Louis, Mỹ). lại sự suy giảm miễn dịch do virus gây ra, ức chế Các dung môi hữu cơ như hexane, methanol, quá trình phát triển của tế bào ung thư bạch cầu, ethyl aceate được cung cấp bởi công ty hóa chất tiêu diệt nhiều dòng tế bào khác nhau như dòng tế Xilong (Trung Quốc). Nguồn dầu được công cấp bào ung thư gan [20]. Khả năng tạo nhũ của bởi công ty Thành Vinh (Huyện Châu Thành, sophorolipid cũng được ứng dụng trong các Tỉnh Bến Tre). ngành hóa dầu. Chúng có thể được sử dụng trong Hoạt hóa chủng C. bombicola trước khi lên việc thu hồi các sản phẩm dầu thứ cấp, loại bỏ men thành phần hydrocarbon trong dầu thô [6, 16]. Nấm men C. bombicola dạng đông khô được So với các chất hoạt động bề mặt được tổng hoạt hóa trong môi trường YM, sau 48 h dịch hợp qua con đường hóa học từ dầu mỏ, SL cho giống cấp 1 được cấy chuyền thành dịch giống thấy những đặc tính ưu việt hơn như khả năng cấp 2; dịch giống cấp 2 được sử dụng cho các thí phân hủy sinh học cao, độc tính thấp, thân thiện nghiệm khảo sát và lên men. Điều kiện hoạt hóa môi trường, có thể sản xuất từ nguồn nguyên liệu chủng C. bombicola: nhiệt độ 30 oC, tốc độ lắc tái sử dụng [13, 16]. Việc sản xuất các chất hoạt 180 vòng/phút, thời gian 48 h. động bề mặt sinh học như SL không chỉ góp phần Khảo sát một số đặc điểm sinh trưởng của hạn chế khai thác quá mức nguồn nguyên liệu nấm men dầu mỏ mà còn góp phần giảm thiểu vấn đề ô Chủng nấm men C. bombicola từ dịch giống nhiễm môi trường hiện nay. Do đó SL đang ngày cấp 2 được nuôi cấy trong môi trường YM, khảo càng thu hút sự sự quan tâm của các nhà nghiên sát khả năng sinh trưởng của nấm men ở các cứu trong và ngoài nước. Tuy nhiên, ở Việt Nam nhiệt độ và pH khác nhau, sau 48 h nuôi cấy sử những công trình liên quan đến sản xuất SL vẫn dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để tính mật độ chưa được nghiên cứu thấu đáo. Đa số tập trung tế bào và ghi nhận kết quả. vào việc phân lập các chủng vi khuẩn tạo chất bề mặt từ môi trường mặn nhằm xử lý ô nhiễm dầu Lên men sản xuất sophorolipid [18]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi bước đầu Thí nghiệm khảo sát lên men sophorolipid khảo sát thu nhận sophorolipid ở quy mô phòng được thực hiện trong các bình erlen 250 ml. thí nghiệm từ quá trình lên men chủng Thành phần môi trường lên men bao gồm: dầu C.bombicola sử dụng nguyên liệu dầu dừa và dừa 10 % (v/v); glucose 10 % (w/v); yeast extract 0,5 %; KH2PO4 0,1 %; MgSO4.7H2O 0,05 %, Trang 16
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 CaCl2.2H2O 0,01 %; NaCl 0,01 %; peptone 0,07 Sau khi giải ly, bản sắc ký được phun acid %; chủng C. bombicola 5 %. Điều kiện lên men: sulphuric 90 % và sấy khô ở 100 oC nhằm quan khối lượng lên men 100 mL, nhiệt độ lên men 30 sát và xác định các vết trên bản mỏng. o C, pH = 6, tốc độ lắc 180 vòng/phút, chủng Xác định một số hoạt tính của sophorolipid giống bổ sung vào môi trường lên men 5 % (v/v). Xác định khả năng làm giảm sức căng bề mặt Thu nhận sophorolipid thô Khả năng làm giảm sức căng bề mặt được Dịch sau nuôi cấy được ly tâm với tốc độ xác định bằng phương pháp vòng Du Nouy 6.000 vòng trong 5 phút, thu dịch nổi. Dịch sau ly (phương pháp này được hỗ trợ tiến hành bởi tâm được chiết với hexane (1: 1 v/v, 3 lần) nhằm phòng thí nghiệm các hợp chất có hoạt tính sinh loại các nguồn dầu thừa. Sau đó dịch tiếp tục học, Đại học Inha, Hàn Quốc). được chiết với ethyl acetate (1: 1 v/v, 3 lần) để Xác định hoạt tính kháng khuẩn và nồng độ ức thu nhận sophorolipid. Sản phẩm thu được cô chế vi khuẩn tối thiểu quay chân không ở 40 oC và cân xác định khối Hoạt tính kháng khuẩn được xác định theo lượng sophorolipid thô (Hình 1). phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonela typhi được cấy trên môi trường thạch LB đã được đục lỗ, hút mẫu sophorolipid cho vào các lỗ và ủ ở 37 oC trong 1 - 2 ngày rồi quan sát vòng kháng khuẩn. Nồng độ ức chế tối thiểu thực hiện theo phương pháp MIC thực hiện trên đĩa 96 giếng, dịch sophorolipid thô được pha loãng thành các nồng độ khác nhau, nồng độ ức chế tối thiểu được xác định là nồng độ có thể ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn. Xác định hoạt tính bắt gốc tự do Hoạt tính bắt gốc tự do được xác định bằng phương pháp DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl). Mẫu sophorolipid thô được hòa trong ethanol thành nhiều nồng độ, hút 100 µL Hình 1. Quy trình thu nhận sophorolipid thô từ quá mẫu nạp vào các giếng trên đĩa 96 giếng, thêm trình lên men của chủng C. bombicola 100 µL dung dịch DPPH 300 µM và trộn đều. Mẫu được ủ ở 37 oC trong 30 phút sau đó tiến Định tính sophorolipid thu nhận bằng sắc ký lớp mỏng TLC hành đo OD ở bước sóng 517 nm. Phần trăm bắt gốc tự do được tính theo công thức: % chống Mẫu sophorolipid thô được chấm lên bản sắc oxy hóa = (1- OD mẫu/ OD đối chứng)x100. ký, pha động được sử dụng là Xác định khả năng nhũ hóa chloroform:methanol:H2O (80:10:2 v/v/v) khoảng 30 phút. 1′,4″-sophorolactone 6′,6″- Khả năng tạo nhũ của sophorolipid được diacetate (Sigma) được sử dụng làm chất chuẩn. khảo sát lần lượt với các dung môi như hexane Trang 17
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 hoặc benzene và các nguồn dầu như DO, dầu đậu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN nành, dầu cải. Dịch sophorolipid pha loãng bằng Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh nước cất ở các nồng độ 5, 10, 20 µg/mL, bổ sung trưởng của nấm men C. bombicola vào dịch SL một lượng cùng thể tích nguồn cơ Đường cong sinh trưởng của nấm men C. chất khảo sát tạo nhũ, votex trong 2 phút, để yên bombicola 24 h và quan sát. Chỉ số nhũ hóa sau 24 h được Nấm men C. bombicola được nuôi trong môi tính theo công thức: E24 = (chiều cao lớp nhũ tạo o thành/tổng chiều cao dung dịch)x100. trường YM ở 30 C, tốc độ lắc 180 vòng/phút. Sau đó sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc trên Xác định thành phần acid béo của SL môi trường YM và tính mật độ tế bào theo các Sản phẩm SL thô thu nhận được gửi phân mốc thời gian 12 h. Kết quả xây dựng đường tích thành phần acid béo bằng kỹ thuật sắc ký khí cong sinh trưởng của C. bombicola được thể hiện (GC) tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm ở Hình 2. TP.HCM. 8.0 7,87 7,84 7,81 7,73 7.8 7,67 7,60 7.6 7,40 7.4 7,09 7.2 7.06,77 6,69 6.8 6.6 6.4 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 Mậtđộ tếbào (LogCFU/ml) Thời gian (h) Hình 2. Biểu đồ đường cong sinh trưởng của nấm men C. bombicola Kết quả ở Hình 2 cho thấy trong 24 h đầu, được lựa chọn để khảo sát ảnh hưởng của các yếu nấm men C. bombicola bước vào pha tăng tố khác lên sự sinh trưởng của nấm men. trưởng, bắt đầu gia tăng về số lượng tế bào. Từ Ảnh hưởng của nhiệt độ 24 - 48 h, tốc độ sinh trưởng của nấm men tiếp Chủng nấm men C. bombicola nuôi giữ trong tục tăng nhanh theo cấp số nhân và số lượng tế môi trường YM, tốc độ lắc 180 vòng/phút, pH = bào đạt cực đại ở 48 h. Từ 48 - 168 h, bắt đầu có 6 ở các nhiệt độ 20; 25; 30; 37 và 45 oC. Sau 48 h sự suy giảm về số lượng tế bào nấm men. Sau dịch nuôi cấy được trải trên môi trường PDA, ủ 168 h số lượng tế bào nấm men giảm mạnh, lúc 30 oC trong 48 h và đếm số khuẩn lạc mọc trên này chất dinh dưỡng đã cạn kiệt làm cho số lượng đĩa. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tế bào giảm dần theo thời gian. Như vậy 48 h (Hình 3) cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự tăng trưởng của nấm men là 30 oC. Trang 18
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 8.5 7,86e 7,95d 8 7,58c 7,39b 7.5 7 6,76a CFU/ml) 6.5 Mật độbào tếMật (Log 6 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (o C) Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của nấm men Các chữ cái thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử Duncan Ảnh hưởng của pH chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả này Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh cũng tương đổng với kết quả của Spencer và cs trưởng của nấm men lần lượt ở các giá trị pH từ 3 (1970) [19], Inoue và Kimura (1988) [11] về ảnh đến 9. Kết quả trình bày ở Hình 4 cho thấy giá trị hưởng của nhiệt độ và pH đến sự sinh trưởng của pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm men là nấm men C. bombicola. pH = 6. Như vậy giá trị pH = 6 và 30 oC được lựa 8.0 7,83i 7,89j 7,70h 7,67h 7,60g 7,44e 7,50f 7,49ef 7.5 7,26d 7,23d 7,18c 7.0 6,89b 6,75a 6.5 6.0 Mật độbào tếMật CFU/ml) (Log 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH Hình 4. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng của nấm men Các chữ cái thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê theo phép thử Duncan Lên men thu nhận sophorolipid từ nguồn cơ chất glucose và dầu dừa Các yếu tố ảnh hưởng đến sản lượng 10 % glucose là các điều kiện tối ưu cho quá sophorolipid từ quá trình lên men chủng C. trình lên men thu nhận sophorolipid (kết quả bombicola cũng được tiến hành khảo sát. Kết quả không trình bày). Các yếu tố này được áp dụng cho thấy pH = 6, nhiệt độ 30 oC, 10 % dầu dừa, cho quá trình lên men thu nhận sophorolipid. Trang 19
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Sophorolipid được thu nhận từ quá trình lên phân cắt của các emzyme. Hiện nay, các nghiên men chủng C. bombicola với nguồn cơ chất là cứu về sản xuất các sophorolipid đang được tiến glucose và dầu dừa. Môi trường lên men được bổ hành tập trung. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên sung 5 % (v/v) chủng giống và lên men ở 30 cC, cứu đều tập trung vào việc sử dụng các acid béo pH = 6, tốc độ lắc 180 vòng/phút, thời gian lên mạch trung bình (C16 - C18) cho quá trình lên men được khảo sát từ 1 - 10 ngày. Sophorolipid men [2, 12]. Các nghiên cứu về việc sử dụng được thu nhận tại các ngày lên men khảo sát bằng nguồn carbon mạch ngắn (C12 - C14) cũng như cách thu dịch lên men, ly tâm loại sinh khối tế mạch dài cho quá trình lên men sản xuất bào sau đó chiết với hệ dung môi hexane và ethyl sophorolipid (C22) vẫn chưa được tiến hành acetate, cuối cùng cô quay chân không loại bỏ nhiều. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dung môi, thu nhận sophorolipid thô. Lượng nguồn dầu dừa như nguồn cung cấp carbon mạch sophorolipid thô sau khi cô quay đem cân xác ngắn cho quá trình lên men. Dầu dừa là một định khối lượng, kết quả được trình bày ở Hình 5 nguyên liệu khá phổ biến ở Việt Nam. Việc sử và 6. Kết quả Hình 5 cho thấy sản lượng SL bắt dụng nguồn dầu này góp phần làm giảm giá đầu tăng mạnh từ ngày lên men thứ 3 và cho sản thành sản xuất cũng như đa dạng hóa các sản lượng cao nhất ở ngày lên men thứ 7, đến ngày phẩm từ dầu dừa. Kết quả lên men ở quy mô thứ 10 lượng SL lại giảm. Điều này cũng tương phòng thí nghiệm cho thấy khi tiến hành lên men đồng với nghiên cứu của Cavalero và Cooper thu nhận sophorolipid, sản lượng cao nhất đạt (2003) [2] về SL được sản xuất bởi nấm men C. được là 14,6 g/L. Kết quả này phù hợp với các bombicola ATCC 22214. Kết quả nghiên cứu cho kết quả trước đây khi tiến hành lên men từ các biết tế bào nấm men C. bombicola bắt đầu sản nguồn dầu khác nhau thì sản lượng sophorolipid xuất SL khi tế bào bước vào pha cân bằng, SL là thu được từ 10 - 25 g/L tùy loại dầu [3-6]. Để hợp chất ngoại bào được tiết ra từ quá trình sinh nâng cao hiệu suất quá trình lên men, quá trình tổng hợp của nấm men sẽ được tích lũy trong môi lên men thu nhận sophorolipid từ dầu dừa đang trường và đạt sản lượng cao ở cuối pha cân bằng, được tiến hành thử nghiệm ở quy mô bioreactor. đến pha suy vong sản lượng SL giảm có thể do sự 2 1.6 1,46 1,32 1,19 1.2 1,03 0.8 0.4 0,14 0,05 0 Sản lượng SLs lượng SLs Sản (g/100ml) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày 10 ngày Thời gian lên men (ngày) Hình 5. Biểu đồ sản lượng sophorolipid thô thu được ở các thời gian lên men khác nhau Trang 20
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Hình 6. Sophorolipid thô sau 3, 5, 7 và 10 ngày lên men Định tính sophorolipid bằng kỹ thuật TLC cho thấy trong hỗn hợp SL thu nhận chiếm chủ Sophorolipid thu nhận được tiến hành phân yếu là các acid béo có chiều dài mạch carbon C12 (24,7 %), C14 (10,09 %) và C16 (8,86 %). tích sắc ký lớp mỏng TLC silica gel 60 F254 với hệ dung môi chloroform:methanol:nước (tỷ lệ Các nghiên cứu trước về SL chủ yếu tập trung 80:10:2 v/v) và acid sulfuric được sử dụng để vào các nguồn carbon mạch dài như sử dụng dầu phát hiện sắc ký đồ, định tính sản phẩm thu được. đậu nành, dầu hạt cải làm nguồn carbon chính. Kết quả Hình 7 cho thấy, trong sản phẩm SL thô Trong nghiên cứu này sử dụng dầu dừa là nguồn có sự hiện diện của 1′,4″-sophorolactone 6′,6″- carbon kị nước được biết đến là một trong những diacetate. Ngoài ra, các vạch sắc ký xuất hiện ở nguồn giàu acid béo mạch carbon trung bình như những vị trí khác cũng cho thấy có sự hiện diện acid lauric C12:0 (48,7 %) và acid myristic C14:0 của các dạng cấu trúc khác trong hỗn hợp SL thu (17,7 %) (Gordon and Rahman, 1991) [9]. Kết nhận. quả nghiên cứu này cũng cho thấy sự tương đồng về xu hướng tạo thành các acid béo mạch carbon trung bình C12 - C16 trong hỗn hợp SL thu nhận. SL giàu acid béo mạch carbon trung bình có một số ưu điểm như sức căng bề mặt tốt hơn, khả năng giữ ẩm và kháng virus tốt hơn [9]. Xác định khả năng làm giảm sức căng bề mặt của SL Mẫu SL thu được có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nước từ 72 mN/m xuống còn 40 mN/m. So với các chất hoạt động bề mặt khác như sodium lauryl sulfate và Pluronic F-28 khả năng làm giảm sức căng bề mặt tương ứng là 47,3 mN/m và 42,8 mN/m (Develter và cs, 2010) Hình 7. Sắc ký đồ định tính SL (2) và (3) SL thu được; [6]. Kết quả này cho thấy SL có tiềm năng ứng (C) chất chuẩn (1′,4″-sophorolactone 6′,6″-diacetate) dụng trong việc sản xuất chất tẩy rửa. Xác định thành phần acid béo của SL Xác định khả năng nhũ hóa Kết quả phân tích thành phần acid béo trong Kết quả khảo sát khả năng tạo nhũ của SL, hỗn hợp SL thô thu nhận bằng kỹ thuật sắc ký khí Bảng 1 và Hình 8, cho thấy SL có khả năng nhũ Trang 21
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 hóa hầu hết các loại dung môi khảo sát với chỉ số luận khả năng kháng khuẩn của SL đối với vi nhũ hóa từ 59,23 - 69,64 %. Kết quả này cũng khuẩn Gram (+) mạnh hơn Gram (-). cho thấy sự tương đồng với kết quả của Daverey và Pakshirajan (2009) [3] rằng SL thu nhận từ Bảng 2. Khả năng kháng khuẩn của SL quá trình lên men chủng C. bombicola ATCC Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng 22214 với cơ chất glucose và dầu cải cho khả khuẩn (mm) năng tạo nhũ ổn định với dầu DO, benzene và Staphylococcus aureus 21,3 ± 0,58 Bacillus subtilis 15,5 ± 0,5 hexadecane. Escherichia coli 13,7 ± 0,58 Pseudomonas aeruginosa 11,3 ± 0,58 Bảng 1. Khả năng tạo nhũ của SL với các cơ chất khác nhau Cơ chất khảo sát Chỉ số nhũ hóa (E24) S. aureus B. subtilis (%) Hexane 62,50 ± 0,89 Dầu DO (0,05 % S) 59,23 ± 0,51 Dầu hạt cải dầu 65,18 ± 0,89 Dầu đậu nành 69,64 ± 0,9 E. coli P. aeruginosa Hình 9. Khả năng kháng khuẩn của SL Để xác định nồng độ ức chế tối thiểu, thử Hình 8. Khả năng nhu hóa của SL (1) dầu nghiệm MIC được thực hiện. Kết quả xác định cải; (2) dầu DO; (3) dầu đậu nành;(4) hexane; (5) nước nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của hỗn hợp SL thô thu nhận đối với các chủng vi khuẩn được Khả năng kháng khuẩn của SL trình bày ở Bảng 3. Kết quả cho thấy, SL có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Gram (+) tốt hơn Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của so với các chủng vi khuẩn Gram (-), trong đó SL (Bảng 2 và Hình 9) cho thấy SL có khả năng hoạt tính ức chế có hiệu quả nhất là đối với S. kháng cả 4 loại vi khuẩn kiểm tra với đường kính aureus (3,5 mg/mL) và yếu hơn với P. vòng kháng khuẩn từ 11 - 21 mm sau 24 h. Trong aeruginosa (5 mg/mL). So sánh với các nghiên đó SL cho thấy khả năng kháng mạnh với S. cứu trước thì nồng độ ức chế tối thiểu của SL thu aureus và B. subtilis. Như vậy bước đầu có thể nhận trong nghiên cứu này vẫn còn khá cao. Kim kết luận SL thu nhận cho khả năng kháng vi và cs (2005) [13] đã báo cáo rằng IC50 của SL khuẩn Gram (+) mạnh hơn vi khuẩn Gram (-). thu nhận từ quá trình lên men chủng C. Kết quả này cũng tương đồng với nghiên cứu của bombicola với cơ chất là glucose và dầu bắp sẫm Jose và cs (1999) [12], Kim và cs (2005) [13] kết màu đối với B. subtilis là 4 mg/L, P. acne là 0,5 Trang 22
9. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 mg/L và E. coli là 10 mg/L. Mặc dù SL thu nhận thể hiện hoạt tính kháng khuẩn còn thấp nhưng vẫn cho thấy được tiềm năng ứng dụng SL trong sản xuất dung dịch làm sạch trái cây. Bảng 3. Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của SL Chủng vi khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (mg/mL) Staphylococcus aureus 3,5 Hình 9. Khả năng bắt gốc tự do của SL Bacillus subtilis 4,5 Escherichia coli 4,5 KẾT LUẬN Pseudomonas aeruginosa 5,0 Bước đầu nghiên cứu thu nhận sophorolipid từ quá trình lên men chủng C. bombicola sử dụng nguồn nguyên liệu dầu dừa và glucose ở quy mô Khả năng kháng oxy hóa của SL phòng thí nghiệm, chúng tôi đã thu nhận được Khả năng bắt gốc tự do của SL được thể hiện sản lượng SL cao nhất là 14,6 g/L sau 7 ngày lên ở Hình 10. SL thu nhận có khả năng bắt gốc tự do men ở 30 oC, pH = 6, tốc độ lắc 180 vòng/phút. tăng dần theo nồng độ từ 19,7 % ở nồng độ 0,625 SL thu nhận có một số hoạt tính như: khả năng mg/mL đến 90,5 % ở nồng độ 10 mg/mL. Nồng tạo nhũ với các loại dung môi, làm giảm sức căng độ SL thô ức chế các gốc tự do DPPH ở 50 % bề mặt từ 72 mN/m xuống 40 mN/m, hoạt tính (IC ) cũng được xác định là 1,4063 mg/mL. Khả 50 chống oxy hóa với IC50 = 1,4063 mg/mL và có năng bắt gốc tự do hay kháng oxy hóa cũng như khả năng kháng một số vi khuẩn E. coli, S. kháng khuẩn của SL thô thu được cho thấy tiềm aureus, P. Aeruginosa và B. subtilis. Kết quả này năng ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, mỹ cho thấy sophorolipid có tiềm năng ứng dụng phẩm. trong lĩnh vực mỹ phẩm và dược phẩm. Lời cảm ơn: Nghiên cứu được tài trợ bởi Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Trang 23
10. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Production and characterization of sophorolipids produced by Candida bombicola from coconut oil Le Quynh Loan Ngo Duc Duy Hoang Quoc Khanh Nguyen Hoang Dung Institute of Tropical Biology, Vietnam Academy of Science and Technology Nguyen Hoang Dung Nguyen Luong Hieu Hoa NTT Hi-Tech Institute, Nguyen Tat Thanh University Nguyen Thi Bach Hue University of Science, VNU-HCM ABSTRACT The biosurfactants from microbial origin through fermentation by C. bombicola from increasingly gained interests because of their coconut oil. The results showed that the yield of application in many field and excellent properties sophorolipid obtained after 7 days of culture was compared to surfactants from chemical origin, 14.6 g/L, the surface tension was 40 mN/m. The such as the higher biodegradability, lower obtained sophorolipid showed ability to be toxicity and environmentally friendly. resistant to some bacteria such as E. coli, B. Sophorolipids, biosurfactants of glycolipid subtilis, P. aeruginosa, and S. aureus. Through groups are produced through the fermentation by DPPH experiment, sophorolipids showed the nonpathogenic yeasts such as Candida scavenging acitivity with IC50 = 1.4063 mg/mL. bombicola. In this study, we investigated the These results showed that sophorolipids could be production, surveyed properties of sophorolipids applied in cosmetics. Keywords: sophorolipid, Candida bombicola, antibacterial, DPPH, coconut oil TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. I.M. Banat, R.S. Makkar, S.S. Cameotra, sophorolipids from the yeast Candida Potential commercial applications of bombicola using a low-cost fermentative microbial surfactants, Appl Microbiol medium, Appl Biochem Biotechnol, 158, Biotechnol, 53, 495–508 (2000). 663–674 (2009). [2]. D.A. Cavalero, D.G. Cooper, The effect of [4]. J.D. Desai, I.M. Banat, Microbial medium composition on the structure and production of surfactants and their physical state of sophorolipids produced commercial potential, Microbiol. Mol. by Candida bombicola ATCC 22214, Biol. Rev, 61, 47–64 (1997). Journal of Biotechnology, 103, 31–41 [5]. D. Develter, S. Fleurackers, I.V. Bogaert, (2003). Method for the production of medium- [3]. A. Daverey, K. Pakshirajan, Production, chain sophorolipids, US 8530206 B2 characterization, and properties of (2013). Trang 24
11. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 [6]. D.W.G. Develter, L.M.L. Lauryssen, Appl Microbiol Biotechnol, 54, 625–633 Properties and industrial applications of (2000). sophorolipids, Eur. J. Lipid Sci. Technol., [15]. R.M. Mann, J.R. Bidwell, The acute 112, 628–638 (2010). toxicity of agricultural surfactants to the [7]. U. Gobbert, S. Lang, F. Wagner, tadpoles of four Australian and, two exotic Sophorose lipid formation by resting cells frogs, Environ. Pollut., 114, 195–205 of Torulopsis bombicola, Biotechnol. Lett, (2001). 6, 225–230 (1984). [16]. H. Marius, M.M. Markus, H.K. [8]. P.A.J. Gorin, J.F.T. Spencer, A.P. Johannes, B.L. Roberta, C. Jonas, S. Tulloch, Hydroxy fatty acid glycosides of Christoph, H. Rudolf, Rhamnolipids as sophorose from Torulopsis magnolia, biosurfactants from renewable resources: Can. J. Chem., 39, 846–855 (1961). Concepts for next-generation rhamnolipid [9]. M.H. Gordon, I.A. Rahman, Effect of production, Process Biochemistry, 47, processing on the composition and 1207–1219 (2012). oxidative stability of coconut oil, JAOCS [17]. V.K. Morya, J.H. Park, T.J. Kim, S. Jeon, 68, 574–576 (1991). E.K. Kim, Production and characterization [10]. R.K. Hommel, L. Weber, A. Weiss, U. of low molecular weight sophorolipid Himmelreich, O. Rilke, H.P. Kleber, under fed-batch culture, Bioresource Production of sophorose lipid by Candida Technology, 143, 282–288 (2013). (Torulopsis) apicola grown on glucose, J. [18]. N.Q. Việt, N.B. Hữu, Đ.T.C. Hà, Khả Biotechnol., 33, 147–155 (1994). năng tạo chất hoạt động bề mặt của chủng [11]. Inoue and Kimura, Novel microorganism. vi khuẩn KC31, Tạp chí Công nghệ Sinh US Patent 4782025 (1988). học, 2, 501–510 (2004). [12]. A.C. Jose, G.O. Felix, Sophorolipid [19]. J.F.T. Spencer, P.A.J. Gorin, A.P. production by Candida bombicola: Tulloch, Torulopsis bombicola sp. n. Medium composition and culture method, Antonie Van Leeuwenhoek, 36, 129–133 J. Biosci Bioeng., 88, 4888–494 (1999). (1970). [13]. H.S. Kim, Y.B. Kim, B.S. Lee, E.K. Kim, [20]. I.N. Van Bogaert, K. Saerens, C. De- Sophorolipid production by Candida Muynck, D. Develter, W. Soetaert, E.J. bombicola ATCC 22214 from a corn-oil Vandamme, Microbial production and processing byproduct, J. Microbiol application of sophorolipids, Appl. Biotechnol., 15, 55–58 (2005). Microbiol. Biotechnol., 76, 23–34 (2007). [14]. R.M. Maier, G. Soberón-Chávez, [21]. S. Vishal, B. Daniel, R. Peter, Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: Sophorolipids Having Enhanced biosynthesis and potential applications, antibacterial activity, antimicrob, Agents Chemother., 51, 397–400 (2007). Trang 25