Giáo trình Nghiên cứu xác định hàm lượng Vitamin B1 và B6 trong một số loại nấm lớn ở vùng bắc trung bộ của Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Bùi Thị Trường Giang

Nội dung text: Giáo trình Nghiên cứu xác định hàm lượng Vitamin B1 và B6 trong một số loại nấm lớn ở vùng bắc trung bộ của Việt Nam bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) - Bùi Thị Trường Giang

1. Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 20, số 3/2015 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1 VÀ B6 TRONG MỘT SỐ LOẠI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ CỦA VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Đến tòa soạn 16 - 6 - 2015 Đinh Thị Trường Giang Đại học Vinh SUMMARY RESEARCH TO DETERMINE THE AMOUNT OF VITAMINS B1 AND B6 IN LARGE FUNGUS FROM NORTH CENTRAL REGION OF VIETNAM BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Measured parameters and optimum conditions to determine the content of vitamins B1 and B6 were researched including wavelength, flow rate and mobile phase. The linear range was from 0.5-5.0 ppm with B1 and was from 1.0- 5.0ppm with B6.The amount of vitamin B1 and B6 in large fungus has been determined by HPLC using the calibration curve. The detection limits for B1 and B6 obtained were 0.069ppm and 0.13ppm; the quantification limits for B1 and B6 were 0.232 ppm and 0.42 ppm, respectively. The relative standard deviations for the determination of three levels of concentration of the standard solution were less than 1%, whereas the relative standard deviations for the determination of sample were less than 2.5%.The recovery of vitamins B1 and B6 was 82.3% and 83.3%, respectively. 1. MỞ ĐẦU năng, xuất hiện tiêu chảy và ung thư, ức Nấm lớn được chia ra nhiều chi, họ, loài, chế kìm hãm sự phát triển khối u. Thành loại khác nhau trong đó có nhiều loại có thể phần hóa học và dược tính của mỗi loại sử dụng làm dược liệu như nấm linh chi, nấm lớn khác nhau là khác nhau và cũng nấm thượng hoàng, nấm lỗ, nấm đen Đặc phụ thuộc vào vị trí địa lý, khí hậu của nơi biệt, nấm linh chi là loại thuốc quý có tác nấm sinh trưởng. Ngoài những hợp chất có dụng bảo vệ gan, giải độc, tiêu đờm, lợi hoạt tính sinh học cao như các polisacarit, tiểu, bổ dạ dày; nấm thượng hoàng có thể tritecpenoit thì trong các loại nấm lớn nói ngăn ngừa các bệnh như rối loạn chức chung, còn có các thành phần có giá trị 324
2. dinh dưỡng khác như các vitamin, axit thuộc loại tinh khiết phân tích sử dụng cho amin, lipit[1]. Cho đến nay, nghiên cứu các HPLC. loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ chủ yếu Chất chuẩn B1 (thiamine hyđrochloride, là điều tra đa dạng sinh học, mà chưa hãng Sigma - Mỹ) có độ tinh khiết cao hơn nghiên cứu về mặt hóa học, hoạt tính sinh 99%; chất chuẩn B6 (pyridoxamin học và các thành phần dinh dưỡng. Trong đihyđrochlorua, hãng Sigma - Mỹ) có độ các công bố trước đây, chúng tôi đã tiến tinh khiết cao hơn 98%. hành phân tích, đánh giá hàm lượng các 2.3. Chuẩn bị mẫu nấm phân tích nguyên tố vi lượng, trong công trình này, Mẫu nấm lớn sau khi thu hái về, đem rửa chúng tôi tiến hành phân tích, đánh giá hàm sạch, phơi khô tự nhiên, sau đó bảo quản lượng các vitamin B1 (thiamin) và B6 trong túi nilon. Ký hiệu thứ tự MN 201- (pyridoxan và các dạng của nó) trong các MN 211, tên khoa học các mẫu nấm tương loại nấm lớn nhằm góp phần xác định, đánh ứng được ghi trong bảng 3.1. Dùng dao cắt giá thành phần dinh dưỡng của các loại phần mũ nấm thành từng miếng (không lấy nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ nói riêng và phần cuống nấm) cỡ 3-5cm. Lấy mỗi mẫu Việt Nam nói chung. khoảng 30g, nghiền mịn và trộn sao cho 2. THỰC NGHIỆM mẫu đồng nhất. Làm lạnh sơ bộ để tránh 2.1. Thiết bị và dụng cụ mẫu tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời Hệ thiết bị sắc ký Alliance, bơm 2690, gian dài và đưa đi phân tích ngay . detector huỳnh quang 2475 (Hãng Waters, 2.3.1 Xử lý mẫu nấm xác định vitamin B1 Mỹ), cột C18 (250 4,6 mm, 5 μm I.D); nồi Cân 2 gam mẫu thử cho vào bình nón 250 cách thủy 06 chỗ (hãng Memmer); thiết bị ml, thêm khoảng 100ml dung dịch HCl 1N lọc dung môi (hãng Gast - Mỹ); máy rung sao cho pH = 1. Thủy phân mẫu trong nồi siêu âm (hãng Elma - Đức); máy li tâm cách thủy 1h kể từ lúc nước sôi. Sau khi 5702R, tốc độ tối đa 3000 vòng/phút (hãng thủy phân xong, để nguội, chỉnh pH đến Eppendorf - Mỹ); máy nghiền mẫu Retsch khoảng 3,75 - 4,75 bằng dung dịch GM 200 (Đức), máy lắc vontex Velp (Ý). CH3COONa 2,5N. Chuyển toàn bộ dung Cân phân tích có độ chính xác đến 0,0001 dịch này vào bình định mức 250ml và định của Mettler Toledo (Đức), giấy lọc dung mức vừa đủ tới vạch bằng nước cất. Lọc môi 47mm; 0,45µm. Các dụng cụ như: bình qua giấy lọc. Hút 1 ml dung dịch lọc vào định mức 10ml, 100ml, 250ml; cốc có mỏ bình định mức 10ml, thêm vào mỗi bình 100ml, 250ml; giấy lọc whatman. định mức 3 ml dung dịch NaOH 15% trong 2.2. Hóa chất K3Fe (CN)6 1% đã pha ở trên. Lắc trên máy Các hóa chất: mêtanol, iso butanol, axit lắc 1 phút, thêm isobutanol đến vạch định glyocylic, axit axêtic, axit 1-heptansulfunic, mức và lắc 30 giây. Để yên trong bóng tối CH3COONa.3H2O, HCl đ, K3Fe(CN)6, 20 phút để tách lớp. Tách chiết dung dịch NaOH, Fe(SO4).7H2O, NaBH4, H3PO4 đều trong để bơm vào HPLC[2] 325
3. 2.3.2. Xử lý mẫu nấm xác định vitamin B6 hiệu năng cao (HPLC), detector huỳnh Chúng tôi đã tiến hành xử lý các mẫu nấm quang. Những điều kiện và thông số cần lớn xác định vitamin B6 theo 2 quy trình: thiết cho phép ghi đo HPLC tối ưu, khoảng Quy trình 1: Theo TCVN 9513: 2012 [3]. nồng độ tuyến tính và đường chuẩn xác Cân 5 g mẫu đồng nhất cho vào bình nón định hàm lượng B1 và B6 đã được nghiên 150ml, thêm 50ml HCl 0,1M (pH=1) làm cứu, xác lập và xây dựng . Đánh giá nóng trong thiết bị áp lực 30 phút ở 120oC, phương pháp đã được tiến hành thông qua sau đó làm nguội tới nhiệt độ phòng, tính toán giới hạn phát hiện (LOD), giới chuyển sang bình định mức 100ml và pha hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại của phép loãng bằng nước đến vạch, lọc và ly tâm ghi đo và hiệu suất thu hồi. 50ml dung dịch mẫu đã xử lý bằng axit, 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chuyển lớp nổi phía trên sang chai thủy tinh 3.1.Nghiên cứu các điều kiện phân tích đậy kín, được dung dịch chiết mẫu . tối ưu Quy trình 2: Với các ký hiệu 3 dạng tồn tại 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn bước sóng kích có thể chuyển hóa cho nhau của B6 là thích và phát xạ PN(Pyridoxine); PL(Pyridoxal); Thực hiện các phép đo sử dụng detector PM(Pyridoxamine). Nguyên tắc quá trình huỳnh quang, cần lựa chọn các bước sóng xử lý các mẫu nấm như sau: Bước 1: PM kích thích tối ưu để các chất phân tích phát thực hiện phản ứng với axit glyoxylic tạo ra bức xạ huỳnh quang tối ưu tương ứng. PL, Bước 2: PL bị khử quay trở lại PN Bằng cách thay đổi các bước sóng kích bằng NaBH4 trong dung dịch axit yếu. thích và phát xạ của phép đo vitamin B1, Cân 5 gam mẫu đã được đồng hóa cho vào B6 chúng tôi đã lựa chọn được bước sóng bình nón 50ml. Thêm 2ml dung dịch kích thích λkt = 365nm, bước sóng phát xạ natriaxetat 0,625M; 2,5ml axit glyoxylic huỳnh quang λpx = 435nm dối với B1và 1M và 0,8ml sắt (II) sulfate 10g/l. Lắc qua bước sóng kích thích λkt = 290nm, bước đêm trên máy lắc ngang (ít nhất 12h) ở sóng phát xạ huỳnh quang λpx = 395nm với 370C. Để nguội, chuyển vào bình định mức vitamin B6. 50ml và định mức đến vạch bằng nước cất, 3.1.2. Nghiên cứu lựa chọn pha động và tỷ lọc qua giấy lọc. Dịch lọc sau khi lọc, thêm lệ pha động tiếp 4,5ml dung dịch NaBH4 0,1M và 0,5 Các phép nghiên cứu được thực hiện với ml axit acetic tinh khiết. Lắc nhẹ 30 giây. dung dịch chuẩn vitamin B1, B6 đều có Sau khi sủi hết bọt, lọc qua màng lọc nồng độ 2ppm, cột sắc ký lựa chọn là cột 0,45µm, bơm vào HPLC [4]. C18. Bằng cách lựa chọn một số hệ dung 2.4. Phương pháp phân tích môi có độ phân cực tương đương với dung Hàm lượng vitamin B1 và B6 trong các môi mêtanol (mêtanol, mêtanol: KH2PO4, mẫu nấm lớn đã được chúng tôi nghiên cứu mêtanol: acetonitrin, mêtanol: H3PO4+ axit xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng 1- heptane sulfonic), thay đổi tỷ lệ pha 326
4. động và đo sắc ký. Lựa chọn pha động và Tiến hành pha dãy dung dịch chuẩn tỷ lệ pha động tối ưu khi tại đó thu nhận vitamin B1 có nồng độ 0,2-6,5 ppm từ dung được diện tích pic sắc lý lớn nhất và độ lặp dịch chuẩn gốc thiamin clorua hyđroclorua lại của các phép đo tốt nhất. Chúng tôi đã 100 ppm trong HCl 1N và dãy dung dịch lựa chọn pha động để xác định vitamin B1 chuẩn vitamin B6 có nồng độ 0,2-6,5ppm là mêtanol; vitamin B6 là hệ mêtanol: từ dung dịch chuẩn gốc B6 500 ppm H3PO4 0,01M trong axit 1- heptane sulfonic pyidoxamin đihiđroclorua trong nước cất, 0,05% (w/v) pH=2,5 theo tỷ lệ 26:74. tiến hành ghi đo sắc đồ các dung dịch 3.1.3. Nghiên cứu lựa chọn tốc độ dòng chuẩn vừa pha. Kết quả nghiên cứu thu Các phép nghiên cứu được thực hiện trên được cho thấy khoảng nồng độ tuyến tính dung dịch chuẩn vitamin B1, B6 nồng độ đạt được cho phép đo HPLC với vitamin 2ppm. Thay đổi tốc độ dòng từ 0,8- B1 là từ 0,5-5 ppm và vitamin B6 là từ 1,0- 1,3ml/phút đối với cả 2 phép phân tích B1, 5,0 ppm. Trong khoảng tuyến tính thu được B6. Tốc độ dòng tối ưu được lựa chọn đều chúng tôi tiến hành xây dựng đường chuẩn là 1,0ml/phút vì tại đó diện tích pic sắc ký thể hiện sự phụ thuộc diện tích pic sắc ký lớn nhất và độ lặp các phép đo tốt nhất. vào nồng độ của vitamin B1, B6 như ở hình 3.2. Nghiên cứu khoảng tuyến tính và 3.1; 3.2 xây dựng đường chuẩn xác định vitamin B1, B6 6000000 4000000 2000000 y = 977121x + 113434 R2 = 0.9997 0 0.0 2.0 4.0 6.0 Hình 3.1.Đường chuẩn xác định vitamin B1 Hình 3.2. Đường chuẩn xác định Vitamin B6 3.3. Xác định hàm lượng B1, B6 trong mục 3.1, theo phương pháp đường chuẩn các mẫu nấm lớn trình bày ở mục 3.2. Hàm lượng B1 và B6 là giá trị trung bình cộng của 3 lần thí Hàm lượng B1 và B6 trong các mẫu nấm nghiệm song song và được ghi lại ở bảng được xác định với các điều kiện như ghi ở 3.1 và hình 3.3 327
5. Bảng 3.1. Hàm lượng vitamin B1, B6 trong các mẫu nấm thực Hàm lượng TB của Hàm vitamin B6 (mg/kg) lượng TB Theo Theo Ký hiệu của STT Tên khoa học của nấm lớn quy trình quy mẫu vitamin xử lý trình xử B1 mẫu 1 lý mẫu (mg/kg) 2 1 MN201 Hexagonia apiaria (Nấm lỗ) 3,4954 KPH KPH 2 MN202 Ganodema applanatum (linh chi) 2,5355 KPH KPH 3 MN203 Ganoderma lucidum (linh chi) 3,3234 KPH KPH 4 MN204 Ganoderma philippii (linh chi) 2,9103 KPH KPH 5 MN205 Phellinusmelanodermus (thượng hoàng) 0,9194 KPH KPH 6 MN206 Ganoderma triangulatum (linh chi) 1,7056 KPH KPH 7 MN207 Nigrofomes melanporus (nấm đen) 1,4382 KPH KPH 8 MN209 Ganoderma fulvellum (linh chi) 2,8457 KPH KPH 9 MN210 Phellinus setulosus (thượng hoàng) 0,8144 KPH KPH 10 MN211 Ganoderma lobatum (linh chi) 1,2553 KPH KPH Hình 3.3. Sắc ký đồ của một số mẫu chuẩn và mẫu nấm lớn Kết quả phân tích thu được cho thầy trong mẫu nấm lớn đều nằm dưới ngưỡng phát khi hàm lượng B1 trong tất cả 10 mẫu nấm hiện của phương pháp. lớn đều lớn, dao động từ 0,8144 đến 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 3,4954 mg/kg thì hàm lượng B6 trong 10 3.4.1.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOD) 328
6. Căn cứ vào kết quả xây dựng đường chuẩn Tính toán LOD, LOQ của vitamin B6 theo xác định vitamin B1 có độ lệch chuẩn quy tắc 3σ như vitamin B1 được các giá trị Sy1=31468 và phương trình đường chuẩn LODB6= 0,13ppm, LOQB6= 0,42ppm. của vitamin B1 là Y = AX+B = 1,355.106x 3.4.2. Độ lặp lại của phép ghi đo trên các + 145612 dung dịch chuẩn B1,B6 Tính toán LOD, LOQ của vitamin B1 theo Phép đánh giá được tiến hành ở 3 giá trị quy tắc 3σ thu được: LODB1 = (3SY1)/A = nồng độ đầu, nằm giữa và cuối khoảng 0,069ppm; LOQB1 = (10SY1)/A = 0,232ppm tuyến tính, tiến hành đo lặp lại 5 lần tại mỗi Căn cứ vào kết quả xây dựng đường chuẩn giá trị nồng độ. Độ lặp lại thể hiện qua độ xác định vitamin B6 có độ lệch chuẩn Sy2= lệch chuẩn tương đối Stđ% Kết quả phân tích 41114 và phương trình đường chuẩn của và tính toán được thể hiện ở bảng 3.2. vitamin B6 là Y = AX+B = 977121x + 113434. Bảng 3.2.Kết quả tính toán độ lặp lại của phép ghi đo trên dung dịch chuẩn vitamin B1, B6 Vitamin B1 B6 Nồng độ chuẩn bị (ppm) 1,000 3,000 5,000 1,000 3,000 5,000 Nồng độ TB phát hiện 1,0066 3,0252 5,0142 1,0096 3,0088 5,0128 Std% 0,533 0,923 0,168 0,648 0,223 0,244 Dựa vào giá trị độ lệch chuẩn tương đối rất nhỏ, chứng tỏ các phép đo trên có độ lặp lại tốt. 3.4.3. Dộ lặp lại trên các mẫu nấm lớn định vitamin B1, B6, kết quả được thể hiện Lấy 3 mẫu nấm song song 202-1, 202-2, ở bảng 3.3. 202-3, tiến hành phân tích như mục 3.3, xác Bảng 3.3 Kết quả phân tích độ lặp lại trên các mẫu thử song song Mẫu 201-1 201-2 201-3 Trung bình Std % Vitamin B1(mg/kg) 2,567 2,548 2,491 2,535 2,2091 Vitamin B6 (mg/kg) KPH KPH KPH KPH Từ giá trị phân tích, tính toán thể hiện ở nấm có thêm chuẩn một lượng chính xác bảng 3.3 cho thấy phép phân tích HPLC B1 hay B6. Tiến hành phân tích bằng xác định vitamin B1, B6 có độ lặp lại cao vì HPLC 2 loại mẫu trên theo quy trình phân giá trị Std % bé. tích như mục 3.3. Kết quả phân tích và tính 3.4.4.Hiệu suất thu hồi toán cho thấy: Để đánh giá độ đúng của phương pháp Hàm lượng B1 trong mẫu thử là 2,5355 phân tích, chúng tôi tiến hành thực nghiệm mg/kg, thêm chuẩn là 2,5205mg/kg, hàm và tính toán hiệu suất thu hồi qua việc phân lượng phân tích được bằng HPLC là tích mẫu thử là mẫu nấm MN201 và mẫu 329
7. 4,6812mg/kg, hiệu suất thu hồi H = 92,59 thực nghiệm và tính toán độ lặp lại, giới % với Std = 0,691 %. hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu Hàm lượng B6 trong mẫu thử là suất thu hồi. Kết quả tính toán cho thấy độ 0,000mg/kg, thêm chuẩn là 2,8358mg/kg, lặp lại tốt (độ lệch chuẩn tương đối đều bé hàm lượng phân tích được bằng HPLC là hơn 0,25%), giới hạn phát hiện và giới hạn 2,3622mg/kg, hiệu suất thu hồi H = 83,3% định lượng thấp (ngưỡng ppm), hiệu suất với Std = 1,112 %. thu hồi cao (đều lớn hơn 80%). Từ kết quả tính toán hiệu suất thu hồi và TÀI LIỆU THAM KHẢO theo AOAC, với ngưỡng hàm lượng ppm, [1]. R. P. Z. Furlani, H. T. Godoy (2008) hiệu suất thu hồi từ 80-120%, nhận thấy "Analytical, Nutritional and Clinical rằng phép phân tích HPLC với vitamin B1, Methods Vitamins B1 and B2 contents in B6 có hiệu suất thu hồi thỏa mãn với độ cultivated mushrooms", Food lệch chuẩn tương đối thấp, nên phép phân Chemistry,106, 816-819. tích có độ đúng tốt. [2].AOAC 941.15: "Vitamin B1 4. KẾT LUẬN (Thiamine)". Đã nghiên cứu lựa chọn được các điều kiện [3].TCVN 9513 :2012 -"Thực phẩm-xác phân tích tối ưu cho phép ghi đo HPLC để định B6 bằng phương pháp sắc ký lỏng xác định vitamin B1, B6 như các bước sóng hiệu năng cao" kích thích và phát xạ, tốc độ dòng, pha [4].Hung Khiem Trang, (2013) "Development động, tỷ lệ pha động. Đã tiến hành nghiên of HPLC method for the determination of cứu khoảng tuyến tính và xây dựng đường water-soluble vitamins in pharmaceutical chuẩn xác định vitamin B1, B6. Đã tiến and fortified food products", A thesis, Tiger hành xử lý 10 mẫu nấm lớn và xác định prints, Clemson University, pp.1745. hàm lượng vitamin B1và B6 trong các mẫu nấm bằng phương pháp HPLC. Đã tiến hành đánh giá phương pháp phân tích qua 330