Giáo trình Phân tích vi sinh - Bài 4: Các quy trình kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phi truyền thống - Nguyễn Thành Luân

Nội dung text: Giáo trình Phân tích vi sinh - Bài 4: Các quy trình kiểm tra vi sinh vật truyền thống và phi truyền thống - Nguyễn Thành Luân

1. 4/01/2013 BÀI 4 CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHI TRUYỀN THỐNG Lớp phân tích vi sinh GV: ThS. Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật (Nhắc lại) Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp  Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi  Gián tiếp thông qua:  Phương pháp đo độ đục  Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định  Định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN). 1
2. 4/01/2013 Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu. • Nhƣợc điểm: - Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết - Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu - Khó đạt được độ chính xác cao - Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Phƣơng pháp đếm trực tiếp THIẾT BỊ GÌ?? • Buồng đếm hồng cầu • Buồng đếm Breed • Kính hiển vi huỳnh quang 2
3. 4/01/2013 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc •Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp •Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc •Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba đĩa. •Ƣu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu 3
4. 4/01/2013 Phƣơng pháp MPN (Most Probable Number)  Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu  Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp.  Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn. Phƣơng pháp đo độ đục • Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. • Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm. • Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng 4
5. 4/01/2013 CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA • Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV • Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa. • Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV: • Cách truyền thống • Sử dụng các bộ KIT • Sử dụng các thiết bị tự động 5
6. 4/01/2013 Thử nghiệm khả năng lên men • Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV • Nguyên tắc: VSV sử dụng CH tao acid giảm pH môi trường • Các loại carbohydrate • Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose • Dicarbonhydrate: sucrose, lactose • Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose • Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO • Các loại đường rượu: chứa chức -OH 6
7. 4/01/2013 Phenol Red Carbohydrate Broth Trypticase 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 0,018g Carbohydrate* 1 g Hấp ở 115oC trong 15 phút Thử nghiệm khả năng lên men • Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm • VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH thay đổi màu chất chỉ thị phenolred • Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng • Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ 7
8. 4/01/2013 Thử nghiệm Citrate • Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất. • Cở sở sinh hóa: • VSV sử dụng citrate, sinh ra CO2 làm kiềm hóa MT • VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa MT Thử nghiệm Citrate Môi trường Simmon citrate agar Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 13g 8
9. 4/01/2013 Thử nghiệm Citrate • Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính Thử nghiệm Urease • Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease • Cơ sở sinh hoá: (NH2)2CO + H2O 2 NH3 + CO2 tăng pH môi trường đỏ phenol (vàng – đỏ) • Môi trường sử dụng: • Urea Broth (Rustigian – Stuart) • Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) 9
10. 4/01/2013 Môi trƣờng Urea Broth Urea 20g Cao nấm mem 0,1g Na2HPO4 9,5g K2HPO4 9,1g Phenol red 0,01g Nước cất 1 lít Thử nghiệm Urease •Thực hiện • Chuẩn bị môi trường • Cấy VSV vào 5ml môi trường • ủ 37oC/24 giờ • Quan sát 10
11. 4/01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Mục đích: phát hiện khả năng sinh H2S • Cơ sở sinh hóa: desulfohydrase Acid amin chứa S H2S thiosulfate reductase Thiosulfate H2S  H2S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS) Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Để phân biệt các loài thuộc họ Enterobacteriaceae và giống Proteus • Môi trường sử dụng: • KIA, TSI (thạch nghiêng) • SIM, PIA (thạch sâu) • BSA (thạch đĩa) Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48h) 11
12. 4/01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Đọc kết quả: (+) Xuất hiện màu đen trong môi trường (-) Không xuất hiện màu đen trong môi trường ĐC (+) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Pancreatic digest of 20.0 g casein (casitone) Peptic digest of animal 6.1 g tissue (beef extract) Ferrous ammonium 0.2 g sulfate Sodium thiosulfate 0.2 g Agar 3.5 g (-) (+) (+) 12
13. 4/01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh Indol • Mục đích Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol  các VSV có hệ emzym tryptophanase 37oC / 24h Thuốc thử Kovac’s Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính Thử nghiệm khả năng sinh Indol • Là phản ứng giúp phân biệt • E. coli (+) với Klebsiella (-) • Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) • Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) • Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens 13
14. 4/01/2013 Thử nghiệm KIA/TSI • KIA: Kligler iron agar (trang 99) Pepton 20g Lactose 20g Glucose 1g NaCl 5g Feric ammonium citrate 0,5g Sodium thiosulphate 0,5g Agar 15g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2 Thử nghiệm KIA/TSI • TSI: Triple sugar iron agar (trang 106) Pepton 20g Lactose 10g Sucrose 10g Glucose 1g NaCl 5g Feric ammonium sulphate o,2g Sodium thiosulphate 0,2g Agar 13g Phenol red 0,025g Nước cất 1 lít pH 7,4±0,2 14
15. 4/01/2013 Thử nghiệm KIA/TSI • Mục đích: phát hiện khả năng • sử dụng các nguồn cacbonhydrate • sinh H2S • tạo hơi (gas) Ủ 37oC/24 giờ Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S Thử nghiệm KIA/TSI ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15
16. 4/01/2013 Thử nghiệm MR (Methyl red) • Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose. • Cơ sở sinh hóa: • Chất chỉ thị pH: methyl red dưới 4,4 5,0 – 5,8 trên 6,0 • MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid • MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính  Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC Thử nghiệm MR (Methyl red)  Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth) ủ 2 – 5 ngày 37oC Chủng VSV MR-VP broth Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC 16
17. 4/01/2013 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản phẩm trung tính (acetoin) trong quá trình lên men glucose • Cở sở sinh hóa: Acetoin được tạo ra trong điều kiện yếm khí hoàn toàn. 2 pyruvate acetoin + 2 CO2 17
18. 4/01/2013 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Môi trường sử dụng: MR-VP • Phương pháp tiến hành: • Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP • Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC • Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ • Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ. Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng (+) : Enterobacter cloacea (-) : E. coli • Đọc kết quả: (+): màu đỏ trên môi trường (-): mặt môi trường không đổi màu (-) (+) 18
19. 4/01/2013 Thử nghiệm Bile Esculin •Mục đích: xác định khả năng thủy giải glucoside esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. •Cơ sở sinh hoá: •Esculin là hợp chất nhân tạo •Esculetine được phóng thích phản ứng với Fe2+ tạo thành phức hợp màu đen Môi trường Bile Esculine Agar Beef extract 3g Pepton 5g Esculin 1g Mật bò (Oxgall) 40g Ferric citrate 0,5g Agar 15g Nước cất 1 lít 19
20. 4/01/2013 Esculetine Phân tử Esculine Glucose Sự phân giải Esculine thành Glucose và Esculetine Thử nghiệm Bile Esculin 20
21. 4/01/2013 Khuẩn lạc Enterococcus faecalis cho kết quả BEA (+) Thử nghiệm Malonate • Mục đích Phát hiện các VSV có khả năng sử dụng malonate như nguồn carbon duy nhất • Cơ sở sinh hoá Malonate là chất cạnh tranh với succinate Khi VSV phân hủy được malonate thì cũng phân huỷ được các nguồn đạm vô cơ khác  tạo thành sp kiềm  làm tăng pH môi trường 21
22. 4/01/2013 Thử nghiệm Malonate • Môi trường sử dụng: Malonate broth (bromothymol blue) • DươngpH 7,6 xanh da trời • Âm tính: MT không đổi màu và không sinh khối Đ (+) (-) C Thử nghiệm catalase •Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzym catalase. • Cơ sở sinh hoá: • Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý catalase • H2O2 H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide) 22
23. 4/01/2013 Thử nghiệm catalase • Thực hiện • VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn) • Đặt VSV lên lam kính sạch • Nhỏ H2O2 30% • Quan sát sau 1-2 giây • Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện • Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện Thử nghiệm catalase 23
24. 4/01/2013 Thử nghiệm catalase Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30% Thử nghiệm decarboxylase • Mục đích: xác định khả năng tạo enzyme decarboxylase xúc tác phân cắt nhóm carboxyl ở một số acid amin Cấu trúc của phân tử Amino acid 24
25. 4/01/2013 Ba thử nghiệm quan trọng • Lysine decarboxylase (LDC) • Ornithine decarboxylase (ODC) • Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH) Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng Thử nghiệm decarboxylase • Cơ sở sinh hoá • Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường đổi màu chất chỉ thị • Môi trường sử dụng: Decacboxylase Basal Medium chỉ thị bromocresol purple (5,2 – 6,8) pH 6,8 25
26. 4/01/2013 Thử nghiệm decarboxylase • Biểu hiện sinh hoá Dương tính: pH môi trường tăng Âm tính: pH giảm MT trước khi cấy Pứ dương tính Pứ âm tính THỬ NGHIỆM COAGULASE • Mục đích: Thử nghiệm khả năng làm đông tụ huyết tương bởi enzyme coagulase • Là bước cuối trong định danh các giống Staphylococcus • Chủng đối chứng (+): S. aureus (-): S. epidermidis • Thử nghiệm tiến hành với huyết tương và fibrinogen. 26
27. 4/01/2013 THỬ NGHIỆM COAGULASE Thử nghiệm bằng 2 cách Thử trên phiến kính Đọc kết quả Giọt nước + Sinh khối vsv + Huyết tương người Thử nghiệm trong ống nghiệm: 0,5ml huyết tương Ủ và đọc kết quả mỗi 0,5ml huyết dịch sinh khối 30 phút THỬ NGHIỆM COAGULASE Kết quả thử nghiệm Coagulase (+) khi xuất hiện khối đông tụ huyết tương (-) không xuất hiện khối đông tụ, dung dịch đồng nhất 27
28. 4/01/2013 Thử nghiệm Gelatinase • Mục đích: thử nghiệm khả năng phân giải gelatine bởi gelatinase. • Cơ sở sinh hóa: gelatinase Gelatine polypeptide + acid amin Gelatine trong môi trường dinh dưỡng môi trường đông đặc VSV phân hủy gelatine môi trường lỏng Thử nghiệm gelatinase •Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila âm: E. coli •Môi trường sử dụng Nutrient Gelatine •Dạng ống nghiệm thạch sâu •Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng. 28
29. 4/01/2013 Thử nghiệm gelatinase • Đọc kết quả (+) môi trường tan chảy (-) môi trường không tan chảy TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA •Mục đích: thử nghiệm khả năng chuyển hoá glucose theo các con đường khác nhau •Cơ sở sinh hóa: • Lên men: là quá trình kỵ khí, tạo môi trường acid cao • Ôxi hóa: là quá trình hiếu khí 29
30. 4/01/2013 TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA • Môi trường sử dụng: Oxidation/Fermentation media (Hugh & Leifson media) • Chỉ thị pH: bromocresol purple pH 6,8 TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA Trực khuẩn gram âm O (oxidation) Pseudomonas aeruginosa F (fermentation) Serratia marcescens Cầu khuẩn gram dương O (oxidation) Micrococcus luteus F (fermentation) Staphylococcus aureus 30
31. 4/01/2013 TN KHẢ NĂNG LÊN MEN – ÔXI HÓA • Đọc kết quả: A: đối chứng B: phản ứng Ôxi hóa C: phản ứng lên men Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) • Mục đích: Thử nghiệm khả năng khử nitrate • Cở sở sinh hóa: nitratase NO3 NO 2,,,, NH 3 N 2 NH 2 OH NO NO2 + sulphanilamine/N-napthylethylenediamine hydrochloride  chất màu hồng NO3 + bụi kẽm  màu hồng 31
32. 4/01/2013 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) • Phương pháp tiến hành: • Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứa nitrate • Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của nitrite • Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) 32
33. 4/01/2013 Thử nghiệm oxydase •Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase (hệ cytochrom C) •Cơ sở sinh hoá + Cytochrom C khử + H + O2 Cytochrom C ôxi hoá + H2O Cytochrom C ôxi hoá + TMPD khử TMPD ôxi hoá (màu xanh) Thử nghiệm oxydase • Thuốc thử • TMPD (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p- phenylenediamine • Bảo quản lạnh trong tối • Thời hạn bảo quản: 2 tuần •Đối chứng (+): Serratia marcescens (-) : Proteus rettgeri 33
34. 4/01/2013 Thử nghiệm oxydase •Thực hiện: • Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm • Nhỏ thuốc thử TMPD • Quan sát sau 30 giây Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh Phản ứng (-): sinh khối vẫn màu trắng Thử nghiệm oxydase 34
35. 4/01/2013 Thử nghiệm ONPG • Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme ß- galactosidase – enzyme cảm ứng. • Cơ sở sinh hóa: ONPG o-nitrophenol Không màu Màu vàng Thử nghiệm ONPG ủ qua đêm 37oC Lactose agar Màu vàng Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (-) 35
36. 4/01/2013 Thử nghiệm khả năng tan huyết •Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu • Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ •Cơ sở sinh hoá: • Các heamolysine là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật • Vi sinh vật khác nhau heamolysine khác nhau cường độ và biểu hiện tan hồng cầu khác nhau Thử nghiệm khả năng tan huyết •Phân loại: 3 kiểu tan huyết •Tan huyết hoàn toàn (ß): vòng tan huyết trong, rõ •Tan huyết không hoàn toàn (α):xung quanhvà dưới khuẩn lạc chuyển đục và có màu khác •Không tan huyết (ɣ): hoàn toàn không tan huyết 36
37. 4/01/2013 Thử nghiệm CAMP •Mục tiêu: thử nghiệm khả năng cộng hưởng tan huyết giữa các VSV •Cơ sở sinh hóa: • S. aureus tiết β-lysin gay tan hồng cầu • VSV tiết cAMP gây tan huyết • β-lysin + cAMP  gây tan huyết mạnh, hoàn toàn •Ý nghĩa: dùng phân biệt Streptococcus nhóm B (+) với Streptococcus nhóm khác (-) Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae (+) Streptococcus pyogenes (-) 37
38. 4/01/2013 Thử nghiệm tính di động • Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. • Cở sở: Vi sinh vật di động nhờ tiêm mao • Các tiến hành: Cấy đâm sâu vi sinh vật vào môi trường thạch mềm (0,5% agar). • Vi sinh vật di động sẽ làm môi trường đục, phát triển lan ra khỏi vết cấy. • Vi sinh vật không di động sẽ phát triển quanh đường cấy, môi trường không bị đục. Thử nghiệm tính di động (-) (+) (+) 38
39. 4/01/2013 Ứng dụng thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV • Mỗi loài vsv có những đặc tính sinh hóa khác nhau • Thực hiện kiểm tra các thử nghiệm sinh hóa có thể giúp xác định tên loài (định danh) vi sinh vật đó. • Bảng sinh hóa dùng định danh các loài vi sinh vật đường ruột 39
40. 4/01/2013 Hệ thống xác định vi sinh vật API-20E (bioMerieux, Inc) 40
41. 4/01/2013 Các phƣơng pháp truyền thống phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật • Tổng số vi khuẩn hiếu khí Là số vi sinh vật hiếu khí, tổng số đếm trên đĩa, tổng số vi sinh vật sống, số đếm đĩa chuẩn. Chỉ tiêu này được dùng để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm. Từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh và các điều kiện bảo quản sản phẩm và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm Tổng số vi khuẩn hiếu khí • Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử (O2). • Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. • Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng • Được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm. 41
42. 4/01/2013 Coliforms và Escherichia coli • Coliforms là những trực khuẩn Gram (-) không sinh bào tử hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ, hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt trong ruột người & động vật • Chúng bao gồm: Escherichia coli, Enterobacter spp, Citrobacter spp, Klebsiella spp. • Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi chung là IMViC Các Coliforms khác • Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường canh EC. • Coliforms phân (Feacal Coliforms hay E.coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indol khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5oC trong canh Trypton. Dùng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân. 42
43. 4/01/2013 Staphylococcus aureus Vi khuẩn Staphylococcus aureus hình cầu, Gram (+), có khả năng sinh nội độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Các tế bào thường liên kết thành các chùm nho, không tạo bào tử, không di động, có khả năng sinh coagulase. S. aureus hiếu khí hay kỵ khí tùy ý có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, saccarose. S. aureus còn được gọi là tụ cầu khuẩn gây bệnh, do đó cần xác định để biết mẫu sản phẩm thực phẩm phân tích có mang mối nguy hiểm cho người tiêu dùng hay không Staphylococcus. aureus được xác định trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập Clostridium • Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy phân đường và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. • Hầu hết nhóm Clostridium đều ưa nhiệt vừa tuy nhiên có một số loài ưa nhiệt và một số loài thuộc nhóm ưa lạnh. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C.botulinum và C.perfringens 43
44. 4/01/2013 Clostridium • Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa ferri ammonium citrate và disodium sulphate, ủ ở 37oC trong 1 – 2 ngày. • Nếu nghi ngờ có ưa nhiệt thì ủ thêm ở 50oC. Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường. Salmonella • Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và manitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indol, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amin từ triptophan, hầu hết đều sinh H2S. • Tăng sinh chọn lọc Salmonella trên các môi trường tăng sinh chọn lọc dùng để phát hiện Salmonella trong các mẫu thực phẩm như: RV (Rappaport Vassiliadis), Tetrathionate Mueler Kauffmann Broth (TT) 44
45. 4/01/2013 Salmonella • Phân lập: Tách và nhận dạng Salmonella khỏi quần thể các vi sinh vật khác trong mẫu, môi trường giúp nhận dạng Salmonella dựa trên vài đặc tính. - Khẳng định: nhằm xác nhận lại sự có mặt của các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. • Bước này dựa trên các việc sử dụng các phản ứng sinh hóa và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella như KIA/TSI, Indol, LDC, ODC, urease, lên men manitol, sorbitol, Tổng số nấm men, nấm mốc • Trong thực phẩm, sự hiện diện của nấm men, nấm mốc có thể làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố hay gây ngộ độc thực phẩm. • Mật độ nấm mốc, nấm men trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng số nấm mốc, nấm men bằng kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar (DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol agar (DRBC). 45
46. 4/01/2013 Các phƣơng pháp phi truyền thống • Các phương pháp truyền thống có một số nhược điểm như: tốn nhiều thời gian, chậm thu kết quả, mất nhiều công sức, tốn kém • Để khắc phục, nhiều phương pháp nhanh và tự động được phát triển và thưong mại hóa. • Các phương pháp này được gọi chung là các phương pháp không truyền thống và có đặc điểm chung là cho kết quả nhanh hơn phương pháp truyền thống. PHƢƠNG PHÁP PHI TRUYỀN THỐNG RA ĐỜI Phƣơng pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh • Adenosin triphosphate (ATP) được tìm thấy trong tất cả các tế bào sống nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu nhận biết vật chất sống đang tồn tại. • ATP có thể được phát hiện một cách nhanh chóng bởi lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng. 46
47. 4/01/2013 Phƣơng pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh • Kỹ thuật này có thể phát hiện được 1pg (10-12g) tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10-15 gATP/tế bào). • Độ nhạy này có được khi sử dụng các hóa chất thương mại đắt tiền, sự phân tích thường chỉ diễn ra vài phút • Vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạ Phƣơng pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm trải qua hai giai đoạn: E + LH2 + ATP ↔ E – LH2 AMP + PPi (1) E – LH2 AMP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν (2) Phản ứng có thể đƣợc viết lại nhƣ sau: E + LH2 + ATP + O2 ↔ Oxyluciferin + AMP + CO2 + hν + PPi (E: enzyme Luciferase; LH2: Luciferin) 47
48. 4/01/2013 Nguyên tắc phản ứng • Phản ứng phát sáng của đom đóm là có hiệu quả nhất, được biết đến như phản ứng phát sáng sinh học để xác định hàm lượng ATP. • Phản ứng này đòi hỏi D-Luciferin và ion Mg2+ để hoạt động. Chất dioxetanone thì được hình thành bởi sự tạo phức hợp của luciferase với oxi và phức hợp Mg – ATP. • Sau đó, ánh sáng vàng - xanh (bước sóng cao nhất là 562nm) được phát ra. • Tổng hàm lượng ATP này bao gồm hàm lượng ATP của eukaryote và của tế bào vi sinh vật. • Ánh sáng phát ra bởi phản ứng phát sáng được đo bằng các loại máy đo ánh sáng đo được cường độ ánh sáng thấp Nguyên tắc • Nguyên tắc chung của quy trình phát quang sinh học này như sau: Mẫu được thu bằng cách dùng que bông vô trùng quẹt một diện tích nhỏ nhất định trên bề mặt dụng cụ, thiết bị. Sau đó que bông được cho vào dung dịch trích ly ATP, xử lý với ATPase và cho phản ứng phát sáng. • Gần đây, nhiều hệ thống phát hiện được thiết kế, chế tạo chứa sẵn những hóa chất nằm trong dụng cụ quẹt mẫu bằng tay và sự phát sáng xảy ra ở phía đầu của dụng cụ quẹt mẫu, sau đó dụng cụ này được đặt trong máy đo lượng ánh sáng phát ra. • Để biết mật độ vi sinh vật, so sánh trị số ánh sáng đo được với một đường chuẩn tương quan giữa lượng ánh sáng phát ra và mật độ tế bào vi sinh vật đã biết trước 48
49. 4/01/2013 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme – linked ImmunoSorbent Assay) • ELISA được sử dụng phát hiện và định lượng vi sinh vật trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh. • Những tiến bộ kỹ thuật trong vài thập niên qua đã phát triển của nhiều kỹ thuật ELISA trong chuẩn đoán huyết thanh nhanh nhạy, chính xác các bệnh truyền nhiễm. • Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên) với một kháng thể đặc hiệu. • Có thể nhận biết thông qua sự ngưng tủa hay kết dính của kháng nguyên – kháng thể hoặc bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme). Phƣơng pháp lai phân tử • Hiện nay nhiều hệ thống đã được thiết lập dựa trên DNA để định lượng vi sinh vật và độc tố. • Tuy nhiên, chỉ có phương pháp lai phân tử (hay còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes) và phương pháp PCR là được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm 49
50. 4/01/2013 Phƣơng pháp lai phân tử • Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là phương pháp lai phân tử. • Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp các trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. • Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố: • Nồng độ DNA trong môi trường, • Nhiệt độ và thời gian phản ứng, • Kích thước các trình tự lai • Lực ion của môi trường. Phƣơng pháp PCR • Do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. • Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm • Bước 1: Biến tính DNA ở 94 – 95oC trong 30 – 60 giây. Mạch đôi DNA tách ra thành dạng mạch đơn. • Bước 2: Bước Lai: nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ này khoảng 40 – 70oC, từ 30 – 60 giây. • Bước 3: Tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút. 50
51. 4/01/2013 Quy trình chung cho việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh trong mẫu thực phẩm bằng PCR • Bước 1: Tăng sinh trên môi trường không hoặc ít chọn lọc trong thời gian từ 10 – 20 giờ. • Bước 2: Thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào trong dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích bằng 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt ở 100oC trong 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR. • Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR • Bước 4: Điện di trên gel agarose 1,5% xem kết quả trên đèn UV. Các phƣơng pháp khác • Ngoài ra còn có một số phương pháp thử nhanh khác như: - Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ - Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp - Kỹ thuật màng Petri (petrifilm) - Kỹ thuật Redigel - Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng. - Kỹ thuật đo vi lượng calorie - Kỹ thuật đo mức phóng xạ 51
52. 4/01/2013 Tài liệu tham khảo 1. Trần Linh Thước – Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm – NXB Giáo dục. 2. Nguyễn Đức Lượng – Vệ sinh an toàn thực phẩm – NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Câu hỏi 1. Vi sinh vật chỉ thị là gì? Ý nghĩa? Các chỉ tiêu vi sinh vật trong thực phẩm? 2. Kiểm tra vi sinh vật trong nguyên liệu thực phẩm và thực phẩm? 52
53. 4/01/2013 Câu hỏi 3. Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm? 4. Các phương pháp định lượng vi sinh vật? 5. Các thử nghiệm sinh hóa quan trọng? 6. Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp truyển thống? 7. Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật theo phương pháp không truyền thống? 53