Giáo trình Phát triển cây trồng chuyển gen - Chương 7 đến Chương 11

Nội dung text: Giáo trình Phát triển cây trồng chuyển gen - Chương 7 đến Chương 11

1. Chương 7 TẠO DÒNG LÚA INDICA CHUYỂN GEN 7.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen kháng rầy nâu vào cây lúa 7.2. Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào lúa và tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu 7.2.1. Nội dung nghiên cứu 7.2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 7.2.3. Kết quả thực hiện chuyển gen 7.3. Chuyển gen cryIA(b,c) kháng sâu vào cây lúa thông qua A. tumefaciens 7.3.1. Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân và kháng bệnh bạc lá thông qua A . tumefaciens và chọn lọc bằng Hyg 7.3.2. Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A. tumefaciens và chọn lọc bằng mannose 7.1. Căn cứ khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây lúa Lúa (Oryza sativar L.) là một loại cây trồng quan trọng. Hơn một nửa dân số trên thế giới sử dụng lúa như nguồn cung cấp lương thực chính. Ở Việt Nam, lúa được trồng rộng rãi và là nguồn lương thực quan trọng nhất. Tuy nhiên, năng suất lúa phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh như khí hậu, thời tiết, đặc điểm thổ nhưỡng và sâu bệnh. Hiện nay, sự phát triển của công nghệ sinh
2. 154 Lê Trần Bình học, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, kỹ thuật di truyền và kỹ thuật phân tử cho phép các nhà tạo giống nâng cao tính chống chịu của cây trồng một cách nhanh chóng. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens ngày càng được ứng dụng rộng rãi để chuyển một hay nhiều gen vào cây trồng. Tính ưu việt của hệ thống chuyển gen này là hiệu quả tạo cây chuyển gen bền vững cao, có thể chuyển một đoạn DNA có kích thước tương đối lớn, không cần đến thiết bị cũng như hệ thống nuôi cấy phức tạp. Ngoài ra, lượng bản sao gen chuyển ít tạo thuận lợi trong việc phân tích cũng như biểu hiện gen mới trong cây chuyển gen. Những năm gần đây bắt đầu có những kết quả nghiên cứu về khả năng chuyển gen thông qua A. tumefaciens ở cây lúa trong đó đã chuyển gen thành công cả ở lúa japonica và lúa indica, lúa indica có khả năng tái sinh và chuyển gen thấp hơn so với lúa japonica. Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là dùng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens để tạo cây lúa mang các gen kháng sâu bệnh đặc biệt gen kháng sâu đục thân. Vì đối với loại sâu hại này, biện pháp phòng trừ bằng dùng giống kháng không đem lại kết quả. Hơn 30 năm qua Viện Nghiên cứu Lúa quốc tế đã chọn lọc tính kháng sâu đục thân cho hơn 30.000 giống lúa nhưng chưa tìm ra giống kháng (IRRI, 1995). Do vậy, chuyển gen kháng sâu đục thân vào cây lúa bằng công nghệ gen là phương pháp nhiều hứa hẹn, việc tạo ra các giống lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân sẽ giúp giảm lượng thuốc trừ sâu, tiết kiệm chi phí và giảm ô nhiễm môi trường. Một số tác giả thông báo đã tạo được các dòng lúa japonica và indica chuyển gen Bt kháng được sâu đục thân màu hồng, sâu đục thân sọc, sâu đục thân màu vàng và sâu cuốn lá (Fujimote và CS, 1993; Duan và CS, 1996; Nayak và CS, 1997; Datta và CS, 1998). Wu và CS, 2002 báo cáo giống lúa japonica chuyển gen cryIA(b) tạo được tính kháng sâu đục thân ổn định ở thế hệ R6 và trong điều kiện thí nghiệm ngoài đồng. Tuy nhiên, chưa thấy có báo cáo về việc tạo dòng lúa biến đổi gen Bt trên nền giống có đặc tính nông học tốt. Hơn nữa, trong chuyển gen ở cây trồng, hệ thống chọn lọc cây biến đổi gen thông dụng nhất là sử dụng thuốc kháng sinh hoặc thuốc trừ cỏ. Các tế bào đã biến đổi gen có khả năng phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy có chứa chất kháng sinh (thường dùng nhất là
3. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 155 hygromycin) hoặc chất trừ cỏ (thường dùng nhất là PPT). Việc sử dụng các hệ thống chọn lọc này gây nhiều lo ngại về tính an toàn của cây trồng biến đổi gen đối với môi trường và sức khỏe con người. Nhằm khắc phục nhược điểm này, gần đây một phương pháp chọn lọc mới đã được ứng dụng, đó là hệ thống chọn lọc bằng mannose. Hệ thống chọn lọc này dựa trên việc sử dụng gen pmi - được phân lập từ Escherichia coli - làm gen chỉ thị để điều khiển tạo ra enzyme phosphomannose isomerase (Miles và Guest, 1984). Trong môi trường nuôi cấy có thêm mannose, tế bào đối chứng không mang gen pmi, enzyme hexokinase trong các tế bào làm biến đổi mannose thành mannose-6-phosphate là nguồn carbon mà tế bào cây không sử dụng nên không phát triển được. Ngược lại, các tế bào có mang gen pmi, enzyme phosphomannose isomerase được tạo ra làm chuyển hóa mannose-6-phosphate thành fructose-6-phosphate là nguồn carbon mà tế bào cây có thể sử dụng cho sự sinh trưởng phát triển. Vì vậy, chỉ có cây trồng có mang gen pmi mới có khả năng phát triển bình thường trong môi trường nuôi cấy có chứa mannose, trong khi các cây không có gen pmi không phát triển được. Hệ thống chọn lọc bằng mannose đã được áp dụng trong tạo cây biến đổi gen ở cây củ cải đường (Joersbo và CS, 1998), ngô, lúa mì (Wright và CS, 2001) và lúa indica (Hoa và Bong, 2003). Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạo cây biến nạp gen cryIA(b)và cryIA(c) kháng sâu bằng Agrobacterium và sử dụng hai hệ thống chọn lọc bằng mannose và chọn lọc bằng kháng sinh trên các giống lúa có đặc tính nông học và phẩm chất tốt. Mục đích so sánh hai hệ thống chọn lọc nhằm tìm ra phương pháp tối ưu cho công nghệ chuyển gen ở cây lúa và giải pháp khắc phục các mối lo ngại về tính an toàn của cây biến đổi gen hiện nay. Các kết quả nghiên cứu nhằm hai mục tiêu chính: 1. Tiêu chuẩn hóa phương pháp chuyển gen bằng A. tumefaciens và máy bắn gen trên các giống lúa nhóm indica trồng ở Việt Nam (KDML105, IR64) và tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu. 2. Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A. tumefaciens và hệ thống chọn lọc bằng kháng sinh và chọn lọc bằng mannose.
4. 156 Lê Trần Bình 7.2. Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào lúa và tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu 7.2.1. Nội dung nghiên cứu Tiêu chuẩn hóa phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium và súng bắn gen trên các giống lúa nhóm indica (IR64, KDML105) đang trồng phổ biến ở đồng bằng Sông Cửu Long và tiến hành chuyển gen hữu dụng GNA để tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu. 7.2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu a) Vật liệu thực vật: Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và máy bắn gen đã được thực hiện trên các giống lúa nhóm indica (IR64, KDML105) đang trồng phổ biến ở nước ta (ĐBSCL) và giống Taipei 309 thuộc nhóm japonica làm đối chứng. b) Các phương pháp chuyển gen: Gen được chuyển bằng 2 phương pháp sau: i) Phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium Tạo mô sẹo: Hạt gạo và phôi non (2 tuần sau trổ) của các giống KDML 105, IR 64 và Taipei 309 được dùng làm vật liệu nuôi cấy. Chuẩn bị vi khuẩn: Dòng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang plasmid pTOK233 nhận từ Công ty Thuốc lá Nhật Bản (Hei và ctv. 1994) được dùng để chuyển gen. Vi khuẩn A. tumefaciens, từ ống tồn trữ trong glycerol 50%, được nuôi cấy trên môi trường AB (Chilton và ctv. 1974). Từng khuẩn lạc một của vi khuẩn được chuyển nuôi trong môi trường YEP (An và CS. 1988) có hygromycin 50 mg/l và nuôi 28-30 giờ, ở 28oC. Dung dịch vi khuẩn này được li tâm trong 15 phút (2.800 vòng/phút). Vi khuẩn thu được pha loãng trong 10ml dung dịch PIM2 chứa 100 mM AS và ủ ở 29oC trong 14-16 giờ với tốc độ lắc 200 rpm (đạt mật số OD600: 1,6-1,9), bổ sung 200 mM AS trước khi chủng lên mô sẹo và phôi non. Khử trùng bề mặt: Các hạt gạo sau khi bóc vỏ và hạt lúa từ bông lúa 2 tuần sau trổ được khử trùng bằng dung dịch Sodium
5. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 157 hypochloride 2% trong 30 phút (2 lần), sau đó rửa lại nhiều lần với nước cất vô trùng. Nuôi cấy phôi non: Phôi non của hạt lúa được tách dưới kính soi nổi, đặt lên môi trường lây nhiễm vi khuẩn MSGAs với bề mặt của thuẫn hướng lên trên. Hạt gạo: Các hạt gạo sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo MSCI. Sau 3 tuần, các mô sẹo có khả năng sinh phôi được tách nhỏ khoảng 1-2 mm và chuyển sang môi trường tiền lây nhiễm MSCI và giữ ở 28oC khoảng 4-5 ngày rồi chuyển sang môi trường MSGAs. Mỗi phôi non và mô sẹo trên môi trường MSGAs được chủng với 10 µl dung dịch vi khuẩn A. tumefaciens, ủ 2 - 3 ngày trong tối ở 24-25oC. Sau 3 ngày, các phôi non và mô sẹo được chuyển sang môi trường MSRe có carbenicillin 250 mg/l và cefotaxim 100 mg/l để ức chế sự phát triển A. tumefaciens. Chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen: Sau 3 tuần, các mô sẹo phát triển từ phôi non hay từ mô sẹo được chủng với vi khuẩn được tách nhỏ thành 1-2 mm, cấy trên môi trường chọn lọc MSSe có carbenicillin 250 mg/l, cefotaxim 100 mg/l và Hygromycin 30 mg/l trong 3 tuần. Các mô sẹo kháng hygromycin được tiếp tục chọn lọc trên môi trường có hygromycin 50 mg/l. Các dòng kháng hygromycin được chuyển sang môi trường tăng sinh N6P trong 2 hoặc 3 tuần trước khi chuyển sang môi trường tái sinh MSRe. Các dòng kháng này được giữ trong phòng nuôi cây có cường độ ánh sáng 2.500 lux, độ ẩm 70%, nhiệt độ 28oC, 16 giờ chiếu sáng/ngày. Cây tái sinh được chuyển sang môi trường tạo rễ MSR. Cây con sau đó được chuyển trồng nhà kính cho các phân tích tiếp theo. ii) Chuyển gen bằng súng bắn gen Chuẩn bị mô sẹo: Hạt gạo của các giống lúa KDML105, IR 64, Taipei 309 được dùng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô và chuyển gen. Hạt gạo được khử trùng như bước trên. Hạt gạo được cấy trên môi trường tạo mô sẹo MSCI và nuôi trong tối ở 28oC. Theo dõi sự phát triển của mô sẹo trong 3 tuần. Các mô sẹo có dạng sinh phôi được chọn và tách nhỏ (3 mm) trên môi trường N6 trước khi bắn gen ít nhất 4 giờ.
6. 158 Lê Trần Bình Quy trình bắn gen: Dòng E.coli mang plasmid pWG1515-gusA- hpt mang gen hpt kháng hygromycin và gen gus, pUbi-cryIA(c), pUbi-GNA được dùng để chuyển vào các giống lúa. Dòng vi khuẩn chứa các plasmid được bảo quản, tồn trữ trong glycerol 50% (v/v) và nuôi cấy trên môi trường LB. Từng khuẩn lạc đơn của E.coli được nuôi trong môi trường TB chứa Ampicilline 100 mgl-1 và nuôi từ 15-18 giờ ở nhiệt độ 37oC. Dung dịch vi khuẩn này được dùng cho ly trích plasmid-DNA. DNA của plasmid được ly trích theo bộ Kit (Concert Rapid Plamid Purification Systems, hãng Life Technologies) theo phương pháp của Birnboim và Doly (1979). DNA được pha loãng trong TE ở nồng độ 1µg/µl. DNA của dòng pWG1515-gusA-hpt được bắn riêng lẻ hoặc cùng kết hợp với các gen hữu dụng khác. DNA này được dùng cho quy trình bắn gen. DNA được tẩm trên các hạt vi đạn bằng vàng (Au) có kích thước 1µ, các vi đạn mang DNA được bắn vào mô sẹo đã nuôi 4 giờ trên môi trường N6 nhờ máy bắn gen Biolistic PDS-1000 He với các khoảng cách và áp lực bắn khác nhau. Chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen: Sau khi bắn 20-24 giờ, các mô sẹo được chuyển sang môi trường phục hồi MSCI để nhân mô sẹo. Sau 2 tuần, các mô sẹo được tách nhỏ 1-2 mm và chuyển sang môi trường chọn lọc MSSe có hygromycin 30mg/l. Sau 3 tuần, các mô sẹo sống sót được tách nhỏ và chuyển sang môi trường chọn lọc lần thứ 2 có hygromycin 50 mg/l. Các dòng kháng hygromycin và phát triển qua 2 lần chọn lọc được chuyển qua môi trường N6P (nhân nhanh mô sẹo) và theo dõi sự phát triển của mô sẹo từ 2-3 tuần. Các mô sẹo phát triển tốt được chuyển sang môi trường tái sinh MSRe và nuôi ở 28oC trong tối 1 tuần trước khi được chuyển đến phòng sáng có ẩm độ 70%, nhiệt độ 28oC và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. Cây tái sinh được chuyển sang môi trường tạo rễ MSR. Sau khi rễ đã phát triển đầy đủ cây con chuyển vào chậu đất và trồng ở nhà kính. c) Các phương pháp đánh giá cây chuyển gen: Việc đánh giá cây chuyển gen được tiến hành theo hai mức độ chính là ở phòng thí nghiệm và trong nhà kính.
7. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 159 i) Trắc nghiệm sự biểu hiện gen gus Trắc nghiệm sự biểu hiện tạm thời gen gus trong tế bào được chuyển gen được thực hiện ở các mô sẹo vào ngày thứ 3 sau khi chủng hoặc bắn, trắc nghiệm sự biểu hiện ổn định ở các mô sẹo phát triển tốt qua chọn lọc trước khi tái sinh và ở cây tái sinh. Các vật liệu gồm mô sẹo được chủng A. tumefaciens hoặc bắn gen sau 3 ngày và đoạn phiến lá dài 5-10 mm của các cây tái sinh được chuyển vào lỗ của đĩa nhiều giếng có chứa dung dịch X-Gluc. Quan sát sự biểu hiện gen gus, sau 24 giờ ủ ở 37oC các mẫu có những điểm màu xanh. Diệp lục tố trong lá được tẩy bằng hỗn hợp aceton: methanol (1:3). ii) Thử nghiệm sinh học tính kháng đối với rầy nâu Vật liệu và dụng cụ: Dụng cụ nuôi rầy (lồng, khay, chậu nhỏ, thuốc trừ nấm v.v.); Dụng cụ chọn lọc rầy (lồng kính, khay nhỏ, pen, thước, thẻ nhỏ v v); Giống lúa Tài Nguyên mùa làm thức ăn cho rầy (30-45 ngày tuổi); Giống Ptb33 làm giống chuẩn kháng, giống TN1 làm chuẩn nhiễm; Các dòng lúa chuyển gen cần chọn lọc. Phương pháp: Chọn lọc theo phương pháp hộp mạ của IRRI, có chỉnh sửa cho phù hợp với điều kiện của nước ta. Giống được ngâm ủ nhú mầm, cấy trong khay bùn mịn thành hàng, 5 lần nhắc lại kể cả TN1 và Ptb33. Thả rầy đồng (cùng) tuổi 2 hoặc 3 khi cây mạ 2 hoặc 3 lá (2-4 ngày sau khi cấy) với mật số 4-6 con/tép. Đánh giá khi giống chuẩn nhiễm cháy rụi ở cấp 9 (7-10 ngày sau khi thả rầy), theo thang điểm cấp 9 của IRRI. 7.2.3. Kết quả thực hiện chuyển gen a) Tiêu chuẩn hóa quy trình chuyển gen thông qua A. tumefaciens: Sự biểu hiện tạm thời của phản ứng gus thể hiện plasmid đã chuyển vào tế bào chủng với A. tumefaciens. Qua 3 lần thử nghiệm, tỷ lệ mô sẹo có phản ứng gus khác nhau tùy giống, nhìn chung còn thấp, khoảng 6-12,5% trên các giống indica so với giống japonica đối chứng, 22-38% (bảng 7.1). Qua chọn lọc và tái sinh các dòng kháng phát triển, thu được 7 dòng Taipei 309; 5 dòng KDML105 và 4 dòng IR64.
8. 160 Lê Trần Bình Trắc nghiệm sự biểu hiện gus trên lá các dòng tái sinh cho thấy, số dòng cho phản ứng gus dương tính ít hơn số dòng tái sinh (bảng 7.2) có thể do các dòng thoát khỏi sự chọn lọc hoặc đoạn DNA được chuyển bị loại trừ khỏi tế bào trong quá trình phân chia, phân hóa. Hình 7.1: Sự sống sót và phát triển của các mô sẹo trên môi trường chọn lọc (Hyg 50 mg/l) sau 2 tuần nuôi cấy Hình 7.2: Cây chuyển gen KDML105 tái sinh và sự biểu hiện gen gus Bảng 7.1: Tỷ lệ có biểu hiện gus ở các giống lúa thí nghiệm Tỉ lệ mô sẹo biểu hiện gus tạm thời (%) STT Tên giống Lần 1 Lần 2 Lần 3 1 Taipei 309 24,0 22,7 38,2 2 KDML105 8,0 10,0 12,5 3 IR64 6,0 0 10,0
9. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 161 Bảng 7.2: Số dòng tái sinh từ các mô sẹo qua chọn lọc Số dòng tái Số dòng biểu hiện gus STT Tên giống sinh dương tính 1 Taipei 309 7 3 2 KDML105 5 2 3 IR64 4 3 b) Tiêu chuẩn hóa chuyển gen bằng súng bắn gen: Máy bắn gen Biorad được sử dụng. Các áp lực và khoảng cách bắn khác nhau được thử nghiệm để tìm ra các thông số bắn thích hợp. Kết quả cho thấy khi bắn ở khoảng cách A với áp lực 900, 1.100psi cho kết quả tốt hơn khi bắn ở các thông số khác. Khi bắn ở khoảng cách A với áp lực 1.350psi, tuy cho tỷ lệ phản ứng gus tạm thời cao, nhưng tỷ lệ mô sẹo phát triển qua chọn lọc thấp hơn ở áp lực 900 và 1.100psi, có thể do áp lực cao làm tổn thương các tế bào mô sẹo (bảng 7.3). Bảng 7.3: Ảnh hưởng thông số bắn trên hiệu quả chuyển gen ở giống Taipei 309 Khoảng Phản ứng gus tạm Tỷ lệ mô sẹo sống sau Áp lực (psi) cách thời (%) chọn lọc (%) 900 12 7,3 A 1100 14 9,7 (rack1-3) 1350 16 5,2 900 2 0 B 1100 4 0 (rack 2-4) 1350 2 0 Sau khi thử nghiệm các thông số bắn thích hợp, các giống lúa đang trồng phổ biến tại đồng bằng sông Cửu Long được thử nghiệm khả năng tương thích với hệ thống chuyển gen. Tỷ lệ mô sẹo có phản ứng gus tạm thời khác nhau tùy giống, nhưng còn rất thấp ở các giống indica so với giống japonica đối chứng (bảng 7.4).
10. 162 Lê Trần Bình Bảng 7.4: Tỷ lệ mô sẹo biểu hiện gus của các giống lúa Phản ứng GUS tạm thời Tỷ lệ mô sẹo sống STT Tên giống (%) sau chọn lọc (%) 1 Taipei 309 14,6 10,8 2 KDML105 9,5 7,7 3 IR64 12 8,5 Bảng 7.5: Số dòng tái sinh từ các giống được chuyển gen STT Tên giống Số cây tái sinh 1 Taipei 309 5 2 KDML105 3 3 IR64 2 Qua chọn lọc và tái sinh các mô sẹo sống sót, thu được 5 dòng Taipei 309; 3 dòng KDML105; 2 dòng IR64 (bảng 7.5). Các dòng tái sinh này được thử nghiệm sự biểu hiện gus (hình 7.3) và được chuyển sang trồng trên đất trong nhà lưới và phát triển bình thường (hình 7.4 - 7.5). c) Kết quả chuyển gen kháng sâu GNA vào lúa: Sau khi tiêu chuẩn hóa phương pháp chuyển gen, hai gen hữu dụng GNA (trên plasmit pUbi-GNA) được chuyển vào các giống lúa KDML105, IR64 và Taipei309 (japonica) bằng súng bắn gen. Gen GNA được biết tạo tính kháng rầy nâu, gen cryIA(c) tạo tính kháng sâu đục thân. Kết quả chuyển nạp gen GNA được tóm tắt ở bảng 7.6. Ở áp lực 1100A, giống KDML105 cho tỷ lệ mô sẹo sống qua chọn lọc lần 2 đạt 8,3% so với giống Taipei309 đạt 12,7%. Giống IR64 có tỷ lệ thấp hơn, 3,9%. Bảng 7.6: Kết quả chuyển gen plasmid pUbi-GNA Tỉ lệ mô sẹo sống Tỉ lệ mô sẹo sống sau sau chọn lọc lần Số dòng Tên giống chọn lọc lần 1 (%) 2 (%) tái sinh 900A 1100A 900A 1100A KDML105 16,8 22,6 6,7 8,3 9 IR64 13,2 14,4 6,4 3,9 6 Taipei 309 20,8 21,3 9,6 12,7 12
11. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 163 Hình 7.3: Kết quả thử nghiệm sự biểu hiện tạm thời gen gus Hình 7.4: Các dòng chuyển gen Hình 7.5: Sự sinh trưởng bình trồng trong nhà kính thường của cây chuyển gen Hình 7.6: Thử nghiệm tính kháng rầy nâu Hình 7.7: Hai dòng lúa của các dòng lúa chuyển gen GNA sống sót khi thử tính kháng rầy d) Thử nghiệm tính kháng rầy nâu của các dòng nhận gen GNA: Các dòng biến đổi gen GNA thế hệ T4 được thử nghiệm tính kháng
12. 164 Lê Trần Bình rầy nâu với giống chuẩn kháng Ptb33 mang gen kháng Bph2 và Bph3, giống chuẩn nhiễm TN1 không mang gen kháng. Kết quả được trình bày ở bảng 7.6 cho thấy trong các dòng lúa KDML105 chuyển gen GNA, một dòng T29 (14-1-2-5-2) có tính kháng cấp 3, so với giống chuẩn kháng cấp 1, chuẩn nhiễm cấp 9, giống bố mẹ gốc KDML105 cấp 9. Tỷ lệ dòng biến đổi gen cho phản ứng cấp 5 chiếm tỷ lệ 35,4% (17/48 dòng). Giống lúa có cấp kháng rầy nâu 3-5 trong thử nghiệm nhà lưới thường kháng rầy nâu trong điều kiện ngoài đồng. Các giống lúa đang trồng trong sản xuất hiện nay hầu như chưa có giống nào có tính kháng cấp 1. Bảng 7.7: Kết quả thử rầy đối với các dòng lúa KDML 105 chuyển gen GNA STT Ký hiệu Dòng Cấp hại Phản ứng 1 T1 12-1- 1-1-1 7 N 2 T2 12-1-1 -1-2 7 N 3 T3 12-1-1-2-1 5 HN 4 T4 12-1-1-2-2 5 HN 5 T5 12-1-1-3-1 7 N 6 T6 12-1-1-4 7 N 7 T7 12-1-2-1-1 9 RN 8 T8 12-1-2-1-2 Không thử Không thử 9 T9 12-1-3-1-1 7 N 10 T10 12-1-3-2-1 7 N 11 T11 13-1-1-2-1 7 N 12 T12 13-1-4-1-1 7 N 13 T13 13-1-5-1-1 7 N 14 T14 13-1-6-1-1 7 N 15 T15 13-1-4-2-1 7 N 16 T16 13-1-6-1-2 5 HN 17 T17 13-1-2 1-2 5 HN - 18 T18 13-1-2 1-1 7 N 19 T19 13-1-3-1-1 7 N 20 T20 13-1-3-1-2 5 HN 21 T21 14-1-1-1-1 7 N 22 T22 14-1-1-2-1 5 HN
13. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 165 23 T23 14-1-1-6-1 7 N 24 T24 14-1-1-7-1 7 N 25 T25 14-1-1-7-2 5 HN 26 T26 14-1-1-8-1 5 HN 27 T27 14-1-2-3-1 5 HN 28 T28 14-1-2-5-1 5 HN 29 T29 14-1-2-5-2 3 HK 30 T30 14-1-2-6-1 7 N 31 T31 14-1-2-6-1 5 HN 32 T32 14-1-2-6-2 5 HN 33 T33 14-1-3-2-1 7 N 34 T34 14-1-3-2-1 7 N 35 T35 14-1-4-1-1 7 N 36 T36 14-1-4-4-1 5 HN 37 T37 14-1-5-4-1 5 HN 38 T38 14-1-6-4-1 5 HN 39 T39 14-1-7-6-1 7 N 40 T40 14-1-7-6-1 5 HN 41 T41 14-1-7-6-1 Không thử Không thử 42 T42 14-1-7-6-1 7 N 43 T43 14-1-8-2-1 7 N 44 T44 14-1-8-2-2 5 HN 45 T45 14-1-8-3-1 7 N 46 T46 14-1-8-5-1 7 N 47 T47 14-1-8-5-2 7 N 48 T48 14-1-9-2-1 7 N 49 T49 16-1-1-1-1 7 N 50 T50 16-1-1-1-2 7 N 51 TN1 Chuẩn nhiễm rầy 9 RN 52 PTB3 Chuẩn kháng rầy 1 K 53 KDML105 Giống bố mẹ T8 và T41 không đủ hạt để thử rầy e) Kết luận về chuyển gen kháng rầy vào cây lúa: Từ các kết quả trên, cho thấy có thể áp dụng các hệ thống chuyển gen qua trung gian A. tumefaciens hay dùng súng bắn gen đã được tiêu chuẩn hóa
14. 166 Lê Trần Bình trong điều kiện phòng thí nghiệm của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long để chuyển các gen hữu dụng vào cây lúa. Các dòng tái sinh được chuyển gen với plasmid pUbi-GNA (mang gen kháng rầy nâu GNA) sinh trưởng bình thường trong nhà kính, biểu hiện sự kháng rầy nâu ở cấp 3-5. 7.3. Chuyển gen cryIA(b,c) kháng sâu và gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A. tumefaciens 7.3.1. Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân và kháng bệnh bạc lá thông qua A . tumefaciens và chọn lọc bằng Hyg a) Giống lúa: Mô sẹo 15- 25 ngày tuổi từ hạt của giống lúa C71 (do Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp), được dùng làm vật liệu để chuyển gen. Chủng/vector LBA4404/pC1300, LBA4404/pC1301 mang gen Xa21 kháng bệnh bạc lá và gen CryIA(b) kháng sâu đục thân. Vector EHA105/pC1300 mang gen CryIA(c) kháng sâu đục thân. Các vector này đều mang gen chọn lọc kháng hygromycin hpt. b) Phương pháp nghiên cứu i) Tạo mô sẹo: Hạt lúa C71 bóc vỏ, khử trùng bằng cồn 70o trong 1 phút, nước giaven 60% trong 25 phút, rửa kỹ bằng nước cất tiệt trùng 3 lần. Hạt đã khử trùng được thấm khô trên giấy thấm tiệt trùng và cấy lên môi trường tạo mô sẹo (MS*; 30 g/l saccharose; 10 g/l agar; 2,0 mg/l 2,4-D) nuôi trong tối, ở nhiệt độ 25±2oC. ii) Tạo dịch huyền phù A. tumefaciens, nhiễm mô sẹo và nuôi cộng sinh: Khuẩn được lấy từ glycerol nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 220v/p ở 28oC trong 12- 14 giờ. Cấy quệt trên môi trường LB thạch có bổ sung kanamycin 50 mg/l, nuôi ở 29oC trong 3 ngày. Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn lắc 220v/p, 28oC qua đêm trong 100 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin 50 mg/l. Lấy ra 4 ml cho vào môi trường LB lỏng mới, nuôi lắc tiếp 4 giờ trong cùng điều kiện. Ly tâm thu sinh khối tế bào rồi hòa tan vào môi trường MS lỏng có bổ sung AS để tăng hiệu quả chuyển gen (Hood E.E & CS, 1993; Ian Godwin & CS,1990).
15. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 167 Mô sẹo lúa 15-18 ngày tuổi, được ngâm trong dịch huyền phù vi 9 khuẩn có mật độ OD660=0.2-0.4 (1.0 OD660=3.10 tế bào) trong 15 phút. Sau khi thấm khô dịch môi trường trên giấy lọc khử trùng, mô sẹo được nuôi cộng sinh (môi trường tạo mô sẹo có bổ sung 50 µM AS) với vi khuẩn trong 3 ngày ở nhiệt độ 25±2oC, trong tối. iii) Chọn lọc mô sẹo, chuyển gen và tái sinh cây: Sau ba ngày, mô sẹo được ngâm và rửa vi khuẩn trong môi trường lỏng nuôi mô sẹo có bổ sung 300 mg/l cefotaxime. Sau khi thấm khô trên giấy thấm, mô sẹo được cấy lên môi trường chọn lọc có chứa 50 mg/l hygromycin và 250 mg/l cefotaxime trong 3-4 tuần. Những mô sẹo sống sót được cấy chuyển lên môi trường tái sinh, đặt dưới giàn đèn 2.000lux, chu kì sáng tối với tỉ lệ 8h sáng/16h tối, ở nhiệt độ 25±2oC. iv) Phân lập khuẩn bạc lá: Vi khuẩn Xathomonas oryzae được phân lập từ lá lúa bị bệnh bạc lá (do Bộ môn Bệnh hại lúa, Viện Bảo vệ thực vật cung cấp) theo sơ đồ 7.1. Sơ đồ 7.1: Phân lập vi khun Xathomonas oryzae từ lá lúa bị bệnh bạc lá Lá cây bị bệnh Rửa sạch lá Chọn vết bệnh, cắt vết lá bị bệnh thành những mảnh nhỏ (2 mm x 2mm) Khử trùng mảnh lá bệnh bằng HgCl2 0,1% trong 5 giây, ethanol 70% trong 1 phút, sau đó rửa 3 lần với nước cất khử trùng, thấm khô trên giấy thấm tiệt trùng Đặt các mảnh lá bệnh lên đĩa petri chứa môi trường phân lập khuẩn bạc lá*, ủ ở 300C trong 72 giờ Xác định đặc tính hình thái của khuẩn (bằng kính lúp và kính hiển vi) Thử độ độc của vi khuẩn trực tiếp trên lá lúa Nhân trên môi trường thạch Môi trường phân lập khuẩn Xanthomonas oryae là môi trường khoai tây bán tổng hợp, thành phần môi trường gồm có: Khoai tây: 300 g
16. 168 Lê Trần Bình Ca(NO3)2. 4H2O: 0,5 g Na2HPO4. 12 H2O: 2 g Pepton: 5 g Saccharose: 20 g Agar: 17-20 g Dẫn nước cất đến 1 lít, pH = 6,8 - 7 c) Kết quả và thảo luận i) Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây Tỷ lệ tạo mô sẹo ở giống lúa C71 khoảng 92% cao tương đương với tỷ lệ tạo mô sẹo của giống lúa Binatoa (indica) do Noorain và CS thực hiện. Sau 3-4 tuần chọn lọc trên môi trường có hygromycin, các mô sẹo đối chứng không nhiễm khuẩn và một số mô sẹo nhiễm khuẩn bắt đầu chuyển dần sang màu nâu đen (hình 7.9-7.10). Các mô sẹo đối chứng chuyển sang màu nâu đen rõ rệt so với các mô sẹo nhiễm khuẩn. Hầu hết các mô đối chứng đều chết sau 4 tuần chọn lọc (hình 7.10). Qua thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy mô sẹo từ 15-18 ngày tuổi dùng cho chuyển gen là tốt nhất. Kết quả thu được tỷ lệ mô sẹo sống sót sau khi chọn lọc trên môi trường có hygromycin cao hơn Noorain và cộng sự thực hiện khoảng 15%. Do khả năng tái sinh của lúa indica đã được Fauquet và CS chứng minh là thấp hơn so với lúa japonica nên để rút ngắn thời gian đồng thời tăng khả năng tái sinh của cây lúa chuyển gen, các mô sẹo sống sót sau khi chọn lọc 3-4 tuần được chuyển lên môi trường R thay vì chọn lọc từ 6-8 tuần ở lúa japonica. Các mô sống sót này cho cây tái sinh sau khoảng 50-60 ngày. Các cây được tách riêng từ cụm cây tái sinh và sau đó cấy chuyển lên môi trường R chọn lọc có hygromycin nồng độ 50 mg/l, chọn lọc từ 10-12 ngày, đối chứng là cây lúa C71 không chuyển gen và cây lúa C71 chuyển gen đã có kết quả PCR gen hpt dương tính. Tỷ lệ cây tái sinh và kết quả được trình bày ở bảng 7.8.
17. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 169 Hình 7.8: Tạo mô sẹo ở giống Hình 7.9: Mô sẹo trên môi trường lúa C71 (1) Hạt bắt đầu tạo mô chọn lọc (1) Mô sẹo mới đưa vào sẹo; (2) Mô sẹo 14 ngày tuổi chọn lọc; (2) Mô sẹo sau 3 tuần chọn lọc 1 2 Hình 7.10: Chọn lọc mô sẹo (1) Mô sẹo đã nhiễm khuẩn sau 3 tuần chọn lọc; (2) Mô sẹo không nhiễm khuẩn sau 3 tuần chọn lọc Hình 7.11: Cây tái sinh (1) Cây tái sinh sau 15 ngày; (2) Cây tái sinh sau 50 ngày, đã tạo rễ
18. 170 Lê Trần Bình Bảng 7.8: Kết quả chọn lọc và tái sinh cây Số cây sống Số mô sẹo Số mô sẹo sống Số mô Số sau thử trên xử lý TN sau chọn lọc / số sẹo tái cây môi trường nhiễm mô sẹo chọn lọc sinh con hygromycin/ khuẩn Tổng số cây Gen Cry IA (c) (gen kháng sâu đục thân) 1 750 300/ 750 (40%) 2 400 80/ 400 (20%) 56/631 3 1600 400/ 1600 (25%) 42 cụm 631 cây tái (8.9%) 4 500 200/500 (40%) sinh 5 250 100/ 250 (40%) Gen Cry IA (b) (gen kháng sâu đục thân) 1 1300 503/ 1300 (38%) 78 cụm 2 600 cây tái 1015 51/1015 (5%) 430/ 1300 (33%) sinh 3 700 Gen Xa21 (gen kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá) 1 500 127/ 500 (25%) 53 cụm 174/ 2032 2 500 114/ 500 (23%) cây tái 2032 (8,6%) sinh 3 500 145/ 500 (29%) Tỷ lệ cây sống sót thu được so với tổng số cây chọn lọc sau khi chọn lọc trên môi trường có hygromycin khoảng 5-8,9%. ii) Kết quả kiểm tra PCR sự có mặt của gen cryIA(c) và trồng thử nghiệm ngoài nhà lưới: Kết quả cho thấy DNA tổng số của các dòng cây chuyển gen sống trên môi trường hygromycin được tách theo phương pháp của Egnin và CS có chất lượng tốt đủ điều kiện để tiến hành phản ứng PCR và các kỹ thuật sinh học phân tử tiếp theo (hình 7.12). Các primer dùng để kiểm tra sự có mặt của gen cryIA(c) và cryIA(b) được thiết kế theo chương trình DNA Star. Phản ứng PCR được dùng để kiểm tra cây chuyển gen cryIA(c). Kết quả kiểm tra 45 dòng cây chuyển gen thu được 5 dòng cây dương tính thể hiện ở các cột 6, 7, 9, 10, 12 trên hình 7.12 đạt 6,6%. Tỷ lệ cây chuyển gen này cao hơn so với các kết quả chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào lúa indica đã đạt được trước đây. Các cây chuyển gen cryIA(c) có kết quả PCR dương tính được đem trồng ngoài nhà lưới sinh trưởng và phát triển bình thường, không có biểu hiện gì khác lạ. Chúng tôi đã thu hạt thế hệ T1 của các dòng cây dương tính
19. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 171 này. Một số hạt của các dòng cây T1 này đã được điểm tra bằng PCR và đã thu được một dòng cây T1/26 dương tính. Hình 7.12: Kết quả nhân đoạn gen cryIA(c) bằng kỹ thuật PCR (M) Marker 1 kb; (1) Plasmid pC1300/CryIA(c); (6, 7, 12) Dương tính; (2-5, 8-11, 13, 14) Âm tính iii) Kết quả lây nhiễm bệnh bạc lá: Các mảnh lá lúa bị bệnh bạc lá sau khi được khử trùng, đặt lên đĩa petri chứa môi trường phân lập sẽ được ủ trong tủ ấm ở 30oC. Sau 72 giờ, các đĩa petri có khuẩn mọc sẽ được lấy ra khỏi tủ ấm, đầu tiên quan sát bằng mắt thường, sau đó cấy trải để thu được khuẩn lạc, nhận dạng khuẩn lạc bằng kính lúp và kính hiển vi. Tiến hành thử độc tính của vi khuẩn phân lập được trực tiếp trên lá lúa. Kết quả là đã phân lập được khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa. Sau khi lây nhiễm bệnh bạc lá cho 41 dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 (kháng hygromycine) và cây C71 không chuyển gen (đối chứng). Đánh giá khả năng kháng bệnh của các dòng lúa sau 7 ngày và 14 ngày lây nhiễm bệnh. Thời gian thí nghiệm được bố trí vào cuối tháng 7 và đầu tháng 8, đây là thời điểm có nhiệt độ và thời gian chiếu sáng trong ngày rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của khuẩn Xanthomonas oryzae. Kết quả về phản ứng với bệnh bạc lá của 41 dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 và cây đối chứng không chuyển gen sau hai lần lây nhiễm bệnh được trình bày trong bảng 7.10. - Lây nhiễm bệnh bạc lá: Những dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 được xác định là kháng hygromycine và cây C71 không chuyển gen (đối chứng) sau 2 tuần nuôi trên môi trường MS 1/10 được đưa ra trồng trong các chậu ngoài nhà lưới (05 cây/1 chậu). Thành phần
20. 172 Lê Trần Bình các chất dinh dưỡng trong đất và chế độ chăm sóc ở tất cả các chậu là như nhau. Đất trồng cây được trộn theo tỉ lệ: đất: mùn : phân gà = 5 : 5 : 3 và NPK = 1,5-2%. Khi cây lúa có 5-6 lá (6 tuần tuổi), bắt đầu tiến hành lây nhiễm bệnh bạc lá cho cây chuyển gen và cây đối chứng. Phương pháp lây nhiễm bệnh bạc lá: cắt lá lúa bằng kéo nhúng dịch khuẩn, mật độ khuẩn khoảng 109 tế bào/ml, khoảng cách từ đầu lá tới vị trí cắt là 3-4 cm. Trong 3 ngày đầu các chậu lúa được đặt dưới mái che. Thí nghiệm được nhắc lại 2 lần. Bảng 7.9 : Thang điểm đánh giá tình trạng nhiễm bệnh đối với lúa Điểm % lá bị bệnh 1 (kháng cao) Dưới 1% lá bị bạc (bằng giống tiêu chuẩn chống bệnh) 3 (kháng khá) 1 – 5% 5 (nhiễm trung 5 – 25% bình) 7 (nhiễm nặng) 25 - 50% 9 (nhiễm rất nặng) Trên 50% lá bị bạc (bằng giống tiêu chuẩn nhiễm bệnh) Khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng lúa chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen sẽ được đánh giá sau 7 ngày và 14 ngày, kể từ ngày lây nhiễm bệnh. Mức độ nhiễm bệnh được đánh giá theo thang phân cấp tiêu chuẩn của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI). - Kết quả: Sau khi lây nhiễm bệnh bạc lá cho 41 dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 (kháng hygromycine) và cây C71 không chuyển gen (đối chứng). Đánh giá khả năng kháng bệnh của các dòng lúa sau 7 ngày và 14 ngày lây nhiễm bệnh. Thời gian thí nghiệm được bố trí vào cuối tháng 7 và đầu tháng 8, đây là thời điểm có nhiệt độ và thời gian chiếu sáng trong ngày rất thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của khuẩn Xanthomonas oryzae. Kết quả về phản ứng với bệnh bạc lá của 41 dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 và cây đối chứng không chuyển gen sau hai lần lây nhiễm bệnh được trình bày trong bảng 7.10.
21. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 173 Bảng 7.10: Tỷ lệ bệnh và tình trạng nhiễm bệnh của 41 dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo chuyển gen Xa21 sau 7 và 14 ngày lây nhiễm bệnh bạc lá với khuẩn Xan thomonas oryzae Kết quả lây nhiễm bệnh lần 1 Tên Sau 7 ngày Sau 14 ngày dòng % lá bệnh % so với ĐC Điểm % lá bệnh % so với ĐC Điểm ĐC 19,52 100,0 5 22,46 100,0 5 1 29,87 153,0 7 34,52 153,7 7 2 34,67 177,6 7 39,36 175,2 7 3 38,26 196,0 7 49,03 218,3 7 4 24,24 124,2 5 24,44 108,8 5 5 12,20 62,5 5 19,69 87,7 5 6 46,08 236,1 7 51,09 227,5 9 7 40,91 209,6 7 42,86 190,8 7 8 12,68 65,0 5 14,18 63,1 5 9 13,30 68,1 5 16,97 75,6 5 10 11,39 58,4 5 14,13 62,9 5 11 28,07 143,8 7 28,72 127,9 7 12 18,26 93,6 5 24,63 109,7 5 13 16,17 82,8 5 19,33 86,1 5 14 26,14 133,9 5 29,27 130,3 7 15 6,40 27,7 5 7,08 27,1 5 16 6,74 34,5 5 8,25 36,3 5 17 18,75 96,1 5 20,64 91,9 5 18 12,82 65,7 5 16,16 72,0 5 19 46,23 236,8 7 54,63 243,2 9 20 16,38 83,9 5 20,26 90.2 5 21 6,60 33,8 5 9,45 37,6 5 22 5,13 26,3 5 6,67 29,7 5 23 22,56 115,6 5 25,46 113,4 7 24 44,94 230,2 7 53,39 237,7 9
22. 174 Lê Trần Bình 25 20,73 106,2 5 27,37 121,9 7 26 42,63 218,4 7 58,94 262,4 9 27 30,56 156,6 7 50,88 226,5 9 28 50,70 259,7 9 64,79 288,5 9 29 19,33 99,0 5 25,2 112,2 7 30 19,79 101,4 5 24,88 110,8 5 31 18,19 93,2 5 23,27 103,6 5 32 36,84 188,7 7 41,17 183,3 7 33 18,60 95,3 5 24,07 107,2 5 34 21,25 108,9 5 29,38 130,8 7 35 24,05 123,2 5 27,38 121,9 7 36 6,50 33,3 5 11,61 51,7 5 37 31,00 158,8 7 43,75 194,8 7 38 25,33 129,8 7 30,24 134,6 7 39 23,53 120,5 5 25,00 111,3 5 40 19,80 101,4 5 24,44 108,8 5 41 6,67 34,2 5 9,73 43,3 5 Kết quả lây nhiễm bệnh lần 2 Sau 7 ngày Sau 14 ngày % lá bệnh % so với ĐC Điểm % lá bệnh % so với ĐC Điểm 21,68 100,0 5 24,40 100,0 5 38,64 178,2 7 44,65 183,0 7 32,56 150,1 7 38,51 157,8 7 36,70 169,3 7 49,18 201,5 7 25,42 117,3 7 28,48 116,7 7 18,32 84,5 5 22,13 90,7 5 43,26 199,5 7 48,70 199,5 7 47,10 217,3 7 55,66 228,1 9 8,91 41,1 5 13,60 55,7 5
23. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 175 7,58 35,0 5 11,40 46,7 5 12,50 57,7 5 14,81 60,7 5 21,48 99,1 5 25,50 104,5 7 22,16 102,2 5 25,89 106,1 7 15,42 71,1 5 17,39 71,3 5 24,60 113,5 5 27,63 113,2 7 7,15 33,0 5 9,84 40,3 5 6,59 30,4 5 8,73 35,8 5 21,06 97,1 5 22,35 91,6 5 8,99 41,5 5 10,60 43,4 5 42,31 195,2 7 48,02 196,8 7 22,54 104,0 5 25,5 104,5 7 8,37 38,6 5 15,02 61,6 5 7,63 35,2 5 13,68 56,1 5 24,80 114,4 5 27,36 112,1 7 39,49 182,2 7 41,57 170,4 7 26,57 122,6 7 28,13 115,2 7 41,34 190,7 7 49,35 202,2 7 37,42 172,6 7 43,93 178,0 7 49,35 227,6 7 53,49 219,2 9 22,54 104,0 5 26,67 109,3 7 24,96 115,1 5 27,56 113,0 7 24,72 114,0 5 27,17 111,4 7 46,81 215,9 7 50,83 208,3 9 21,49 99,1 5 26,05 106,7 7 25,97 119,8 7 31,85 130,5 7 22,18 102,3 5 26,34 107,9 7 13,59 58,1 5 18,18 74,5 5 32,48 149,8 7 37,17 152,3 7 29,76 137,3 7 35,82 146,8 7 24,18 111,5 5 28,57 117,1 7
24. 176 Lê Trần Bình 23,90 110,2 5 26,92 110,3 7 7,70 35,5 5 9,66 39,6 5 ĐC: Cây lúa C71 không chuyển gen Kết quả đánh giá tình trạng nhiễm bệnh theo thang phân cấp tiêu chuẩn của IRRI trình bày ở bảng 7.10 cho thấy: cây lúa C71 không chuyển gen đạt điểm 5 (5-25% lá bị bệnh, nhiễm trung bình) sau 7 ngày và 14 ngày ở cả hai lần lây nhiễm bệnh. Trong khi đó, tất cả 41 dòng cây tái sinh từ các mô sẹo của giống gốc C71 chuyển gen Xa21 đều đạt mức điểm thể hiện tình trạng nhiễm bệnh là bằng (5 điểm) hoặc cao hơn (từ 7-9 điểm) so với cây lúa C71 không chuyển gen ở cả hai lần lây nhiễm bệnh. Tuy nhiên, nếu đánh giá theo % lá bị bệnh thì các dòng 15, 16, 41 có tỷ lệ lá bị bệnh sau 7 ngày và 14 ngày ở cả hai lần lây nhiễm là nhỏ hơn 10%, trong khi đó đối chứng có tỷ lệ lá bị bệnh là 19,52% và 22,46% (tương ứng) ở lần lây nhiễm 1 và ở lần lây nhiễm 2 là 21,68% và 24,4% lá bị bệnh (tương ứng). Ngoài ra, các dòng 5, 8, 9, 10, 13, 17, 18, 21, 22 và 36 cũng có % lá bị bệnh thấp hơn so với cây đối chứng C71 không chuyển gen ở cả hai lần lây nhiễm bệnh, như dòng 8 có tỷ lệ lá bị bệnh là 12,68% và 14,18% sau 7 ngày và 14 ngày (tương ứng) ở lần lây nhiễm 1 và ở lần lây nhiễm 2 là 8,91% và 13,6% lá bị bệnh sau 7 ngày và 14 ngày lây nhiễm bệnh. Trong kết quả của thí nghiệm, chúng tôi cũng thấy có một số dòng cây chuyển gen có mức điểm thể hiện tình trạng nhiễm bệnh là cao hơn so với cây không chuyển gen (như các dòng 1, 2, 3, 6, 7, 19, 24, 26 đều đạt điểm 7 hoặc 9 ở cả 2 lần lây nhiễm bệnh). Điều này có thể là do một số cây tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp có sức sống kém vì phải trải qua thời gian sống trên môi trường có kháng sinh chọn lọc (hygromycine) và kháng sinh diệt khuẩn. Kết quả của thí nghiệm lây nhiễm bệnh bạc lá đã chỉ ra: trong số 41 dòng cây tái sinh từ các mô sẹo sau biến nạp gen Xa21, đã không có dòng cây nào có mức điểm thể hiện tình trạng nhiễm bệnh là thấp hơn so với cây đối chứng không chuyển gen (đạt từ 1 đến 3 điểm). Tuy nhiên, có 13/41 dòng (các dòng 5, 8, 9, 10, 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 36 và 41) là có % lá bị bệnh thấp hơn so với cây C71 không chuyển gen. Để khẳng định sự có mặt hay không của gen Xa21 trong 13 dòng cây này, cần phải tiến hành phân tích bằng PCR.
25. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 177 iv) Kết quả kiểm tra PCR sự có mặt của gen Xa21: Để xác định các dòng cây có mang đoạn gen Xa21 hay không, cần phải kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi U1 và I1 được sử dụng để nhân bản đặc hiệu đoạn DNA có kích thước 1,4kb trong trình tự của gen Xa21. Từ thí nghiệm đánh giá tính kháng bệnh bạc lá theo thang phân cấp tiêu chuẩn của IRRI, chúng tôi đã chọn được 13/41 dòng cây tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 được xem như có tính kháng bệnh khá so với đối chứng cây chuyển gen để phân tích PCR. Các mẫu DNA của 13 dòng cây đã được dùng làm khuôn để nhân đoạn gen Xa21 với cặp mồi U1 và I1 bằng kỹ thuật PCR. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của 13 dòng chọn lọc (hình 7.14) đã chỉ ra rằng, mẫu DNA plasmid có chứa gen Xa21 nên đã nhân bản được đoạn DNA với kích thước là 1,4 kb, kết quả này hoàn toàn đúng và phù hợp với lý thuyết. Trong khi đó sản phẩm PCR của tất cả 13 dòng chọn lọc đã không có đoạn DNA kích thước 1,4 kb được nhân bản mà chỉ có đoạn DNA với kích thước 1,3 kb được nhân bản (không phải gen chuyển). Điều đó chứng tỏ rằng không có một dòng cây nào trong số 13 dòng phân tích đã mang gen Xa21. M p 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1,7 kb 1,159 kb Hình 7.14: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra cây chuyển gen. (M) marker PstI; (p) plasmid mang gen Xa21 (1,4 kb); (1) cây C71 không chuyển gen; (2 13) cây C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 Sản phẩm PCR của cây C71 đối chứng không chuyển gen cũng có đoạn DNA kích thước 1,3 kb. Kết quả nghiên cứu của Liang và CS (1996) chỉ ra có đoạn DNA kích thước 1,3 kb được nhân bản ở dòng lúa TP309 không chuyển gen Xa21 (nhiễm bệnh bạc lá) và có
26. 178 Lê Trần Bình đoạn DNA kích thước 1,4 kb được nhân bản trong sản phẩm PCR của dòng 106-17 (IRBB21) chuyển gen Xa21. Những cây thế hệ T1 của dòng 106-17 chuyển gen được thử tính kháng bệnh với khuẩn Xanthomonas oryzae ở Philippin, thấy biểu hiện hai kiểu hình: kháng và không kháng (theo tỉ lệ 3:1). Khi tác giả kiểm tra các cây thế hệ T1 của dòng 106-17 bằng PCR thì nhận được kết quả: Những cây thế hệ T1 có kiểu hình kháng trong sản phẩm PCR có đoạn DNA kích thước 1,4 kb, còn những cây thế hệ T1 có kiểu hình bị nhiễm bệnh thì trong sản phẩm PCR chỉ có đoạn DNA kích thước 1,3 kb. Kết quả phân tích Southern blot cũng chỉ ra sự có mặt của gen Xa21 trong những dòng cây thế hệ T1 kháng bệnh bạc lá của dòng 106-17 chuyển gen. Khi kiểm tra cây lúa C71 được biến nạp gen Xa21 với cặp mồi U1 và I1, Hoàng Kim Oanh và CS (1998) cũng nhận được kết quả là có đoạn DNA kích thước 1,3 kb được nhân bản trong sản phẩm PCR của cây C71 không mang gen chuyển. Kết quả phân tích PCR của 13 dòng cây tái sinh từ các mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 bằng kỹ thuật PCR cũng phù hợp với kết quả thử hoạt tính kháng bệnh nhân tạo là không có dòng cây (tái sinh từ mô sẹo chuyển gen) nào có mức điểm thể hiện sự kháng bệnh bạc lá (1 điểm và 3 điểm). Điều đó một lần nữa chứng tỏ rằng chưa có dòng cây nào đã được chuyển gen Xa21. v) Kết quả thử sâu các dòng lúa chuyển gen thế hệ T3, T4: Hạt thế hệ T1, T2, T3, T4 của các dòng cây chuyển gen cryIA(c) có kết quả PCR dương tính được đánh giá bioasay (thử bằng sâu đục thân) thu được kết quả sau: Bảng 7.11: Kết quả kiểm tra các dòng lúa C71 chuyển gen ryIA© Thế hệ T1 Thế hệ T2 Thế hệ T3 Thế hệ T4 STT Tên Dòng PCR Biotest PCR Biotest PCR Biotest PCR Biotest 1 C66T1-3 R S - S + 2 C66T1-7 R S - S - S 3 C66T1-23 R S - S - 4 C67T1-4 R S - S - S 5 C67T1-11 R MR - MR + R 6 1.4/T1-3 R MR - MR - 7 1.4/T1-22 R S - S -
27. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 179 8 C66T2-27 + MR S - MR + 9 C66T2-18 + MR S - MR - 10 C66T2-25 + MR S - MR + S 11 C66T1-17 MR S - S + 12 C67T1-20 MR S - S - 13 1.4/T1-13 MR S - S - 14 C67T1-3 MR S - S - Hình 7.13: Vi khuẩn Xanthomonas oryzae mọc trên môi trường phân lập (A) (B) (C) Hình 7.15: Một số hình ảnh về sàng lọc và đánh giá cây lúa chuyển gen cryIA©. (A) Thử sâu bằng thân cây lúa nếp hoa vàng (đối chứng nhiễm); (B) Thử sâu bằng thân cây lúa C71 (đối chứng âm); (C) Thử sâu bằng thân cây lúa C71 chuyển gen CryIA(c) ở thế hệ T3 (đối chứng dương)
28. 180 Lê Trần Bình Ghi chú: R (resistance) Kháng; MR (medium resistance) Kháng trung bình; S (subceptible) Nhiễm. (+) phản ứng PCR dương tính; (-) phản ứng PCR âm tính Từ bảng trên cho thấy, quá trình sàng lọc và đánh giá ở các thế hệ liên tiếp thì thế hệ T3, biotest thu được 5 dòng cây kháng sâu: 1) C67T1-11; 2) 1.4/T1-3; 3) C66T2-25; 4) C66T2-18; 5) C66T2-27. Hình 7.16: Kết quả PCR các dòng lúa chuyển gen kháng sâu đục thân thế hệ T4. (M) marker 100bp; (1) đối chứng dương; (2) đối chứng âm; (3) C67T4-11; (4) C66T4-25; (5) C66T4-27; (6) C66T4- 17; (7) C66T4-3 Hình 7.17: Dòng C67T4-11 kháng sâu Hình 7.18: Đối chứng C71 đục thân không chuyển gen
29. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 181 Thế hệ T4 chúng tôi thu được 5 dòng cây phản ứng PCR dương tính: 1) C66T4-3; 2) C67T4-11; 3) C66T4-25; 4) C66T4-27; 5) C66T4-17 và trong đó có dòng C67T4-11 cho kết quả thử sâu là 100% kháng sâu đục thân sau 3 lần nhắc lại. Những cây có phản ứng PCR dương tính đang được tiến hành lai Southern và Western. 7.3.2. Tạo dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân qua trung gian A. tumefaciens và chọn lọc bằng mannose a) Vật liệu và phương pháp i) Thiết kế vector chứa gen kháng sâu cryIA(b) và cryIA(c) với gen chọn lọc là pmi: Để tạo ra các dòng lúa biến đổi gen kháng sâu bằng hệ thống chọn lọc mannose, chúng tôi đã thiết kế hai vectơ Vector pUBB-Man (hình 7.19): được thiết kế bằng cách dùng vector pCaCar (Hoa và ctv., 2003) nhưng gen crtI và psy trên vector này được lấy ra bằng enzyme giới hạn Hind III + BamHI và thay vào đó là ubiquitin promoter-cryIA(b). Để thực hiện mục tiêu này, ubiquitin-cryIA(b) từ vector pUBB (do Dr. Altosaar cung cấp) được tách ra bằng enzyme giới hạn HindIII+ SpeI và đoạn DNA gần 2,2 kb có mang ubiquitin promoter được chọn. Vector pUBB cũng được cắt với Spe I+ BamHI để chọn đoạn DNA khoảng 1,9 kb có mang gen cryIA(b). Hai đoạn DNA 2,2 kb và 1,9 kb được gắn đồng thời vào vị trí tương ứng Hind III và BamHI trên vector pCaCar. Vector pUBB- Man chuyển vào tế bào có khả năng tiếp nhận DNA ngoại nhập (competent cell) của A. tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema và CS, 1984). Vector pUBC-Man (hình 7.20): được thiết kế bằng cách dùng vectơ pCaCar (Hoa và CS, 2003) nhưng gen crtI và psy trên vectơ này được lấy ra bằng enzyme giới hạn Hind III + BamHI và thay vào đó là ubiquitin-cry1A(c) được cắt từ vector pUBC (do Dr. Altosaar cung cấp). Các công đoạn cắt, ghép được thực hiện như trên để tạo ra vector pUBC-Man và được chuyển vào A. tumefaciens chủng LBA 4404 (Hoekema và CS, 1984). ii) Giống lúa và phương pháp chuyển gen: Phôi non của giống lúa IR64 và phôi già từ hạt gạo KDML105, Một Bụi được tách và nuôi cấy trên môi trường tạo mô sẹo. Chọn các mô sẹo có khả năng sinh phôi để chủng với vi khuẩn A. tumefaciens chủng LBA 4404.
30. 182 Lê Trần Bình Phương pháp chuyển gen được thực hiện theo Hoa và Bong (2003). Chọn lọc được tiến hành cách nhau mỗi hai tuần trên môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có chứa 30 g/l sucrose và 25 g/l mannose (D(+)-mannose 99+%, Heros Organics, Geel, Belgium) ở vòng chọn lọc thứ nhất, 15 g/l sucrose và 25 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ hai và 5 g/l sucrose cộng với 35 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ ba. Các cây kháng mannose được kiểm tra lại bằng xét nghiệm chlorophenol red (CR) (Hoa và Bong, 2003) trước khi chuyển trồng ra đất. Short CaMV35S terminator XhoI CaMV35S PolyA SSU transit peptide Gt-1 PSY CaMV35S 35S EcoRI T-Boder (right) XhoI T-Boder (left) Ctrl nos PMI XhoI pCaCar Ubiquitin Gt1- PSY- 35S-Ctrl promoter CryIA(b) CaMV35S PolyA Kpnl XhoI CaMV35S promoter BamHI EcoRI T-Boder (right) T-Boder (left) PMI Xhol Ubiquitin pro CryIA(b) gene nos XhoI XhoI Hindlll pUBB-Man Hình 719: Sơ đồ vector pUBB-Man Short CaMV35S terminator XhoI CaMV35S PolyA SSU transit peptide Gt-1 PSY CaMV35S 35S EcoRI T-Boder (right) XhoI T-Boder (left) Ctrl nos PMI XhoI pCaCar Ubiquitin Gt1- PSY- 35S-Ctrl promoter CryIA(c) CaMV35S PolyA Kpnl XhoI CaMV35S promoter BamHI EcoRI T-Boder (right) T-Boder (left) PMI Xhol Ubiquitin pro CryIA(c) gene nos XhoI XhoI Hindlll pUBC-Man Hình 7.20: Sơ đồ vector pUBC-Man
31. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 183 iii) Tách DNA và phân tích Southern: DNA được trích từ lá theo phương pháp của McCouch và CS (1988). 10 micrograms DNA được cắt đoạn với EcoRI và BamHI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen cry1A(b) đối với dòng lúa chuyển gen bằng vectơ pUBB-Man và cắt đoạn với KpnI (một điểm cắt) để xác định số copy. Tương tự DNA của các dòng lúa chuyển gen bằng vector pUBC-Man được cắt đoạn với EcoRI và BamHI hoặc XhoI (hai điểm cắt) để xác định sự hiện diện của gen cry1A(c) và cắt với KpnI (1 điểm cắt) để xác định số copy. DNA cắt đoạn được chạy điện di qua 0,8% agarose gel trước khi chuyển bằng mao dẫn và cố định trên màng nylông (Hybond-N+, Amersham). Gen cry1A(b) và cry1A(c) được đánh dấu bằng DIG được dùng làm mẫu dò lai (probe). Lai, rửa, phát hiện và xác định gen được thực hiện theo phương pháp của Wiinn và cs. (1996). iv) Phân tích sự phân ly của các dòng lúa biến đổi gen Hạt tự thụ T1từ các cây lúa biến đổi gen T0 được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS + 20 g/l mannose. Các cây kháng phát triển trên môi trường sau 2 tuần được chuyển trồng trên đất trong nhà lưới. Mẫu lá được lấy để phân tích Southern. v) Thử nghiệm sinh học tính kháng sâu đục thân hai chấm Scirpophaga incertulas của các dòng lúa biến đổi gen Bt v.a) Vật liệu: Giống chuẩn kháng W1263, IR62 và chuẩn nhiễm IR29; Các dòng lúa chuyển gen Bt ở thế hệ T1 và T3; Vợt bắt bướm, bóng đèn điện, lồng nhựa lớn để nuôi bướm lấy trứng; Khay lớn. Lồng nhựa nhỏ dùng trong thử nghiệm; Hộp nhựa (= 6 cm) để ủ trứng nở, cọ nhỏ dùng bắt sâu non; Chậu sành (= 15 cm) trồng các dòng giống lúa cần thử nghiệm; Phân bón cho lúa thử nghiệm . v.b)Phương pháp trồng lúa và nuôi sâu: Các dòng lúa thử nghiệm được trồng trong chậu nhựa nhỏ đường kính 15 cm, 3 chậu/dòng, cấy ở tuổi mạ 15 ngày và thử nghiệm ở giai đoạn 30 ngày sau khi cấy (hình 7.21). Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lai trong 3 khay tôn kích thước 1,2 x 2,4 x 0,2 m. Bướm sâu đục thân được bắt vào buổi tối dưới bóng đèn điện bằng ống nghiệm. Bướm được nuôi cho đẻ trứng trong lồng nhựa
32. 184 Lê Trần Bình có đặt sẵn lúa 30 ngày tuổi. Bướm đẻ trứng sau 1-2 ngày và nở sau 5-7 ngày. Lá có ổ trứng được thu cho vào hộp nhựa có lót giấy thấm ủ 2 ngày trước khi trứng nở. Hình 7.21: Trồng các dòng lúa thử nghiệm Quy trình nuôi sâu được trình bày như sau: Hình 7.22: Bướm sâu Hình 7.23: Lồng Hình 7.24: Trứng đục thân hai chấm được nuôi bướm sâu sâu đục thân lấy từ nuôi trong nhà lưới đục thân bướm nuôi Hình 7.25: Trứng sâu đục thân lấy từ Hình 7.26: Sâu đục thân nở bướm nuôi (sau 7 ngày tạo ra sâu con) Hình 7.27: Thử nghiệm tính kháng trong Hình 7.28: Thử nghiệm đĩa petri tính kháng toàn cây
33. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 185 v.c)Phương pháp thử nghiệm đĩa petri: Cắt đoạn thân (7 cm) cho vào đĩa petri có lót giấy lọc ẩm (3 lần lập lại cho mỗi dòng) ; Thả 5 sâu mới nở vào mỗi đĩa, dán kín bằng parafilm để tránh sự thất thoát sâu (hình 7.27) ; Cho đĩa petri vào phòng có nhiệt độ 25oC; Tách thân lúa để quan sát số sâu sống, chết hoặc thất thoát sau 4 ngày lây nhiễm. v.d) Phương pháp thử nghiệm toàn cây: Cây được chọn 10 chồi, 3 lần lập lại cho mỗi dòng. Mỗi cây được chủng với 10 con sâu mới nở, 1 sâu/chồi và được cho vào lồng để tránh sâu thoát. v.d) Chỉ tiêu theo dõi gồm: Đếm số chồi héo do sâu đục vào các ngày: 5,10,15 và 20 sau khi thả sâu. Tính tỷ lệ héo đọt (hình 7.28); Tính tỷ lệ sâu sống trên mỗi dòng vào ngày thứ 25 sau chủng sâu bằng cách: Cắt sát gốc cây lúa thử nghiệm để chẻ tách đếm sâu sống hay nhộng trên mỗi dòng, giống; Cân trọng lượng sâu ngay sau khi đếm sâu sống của từng dòng với 3 lần nhắc lại (3 chậu); Cấp hại của sâu đục thân trên các dòng trắc nghiệm được đánh giá theo thang điểm (IRRI) dựa trên tỷ lệ chồi chết như sau: Bảng 7.12: Cấp hại của sâu đục thân Tỷ lệ chết đọt Cấp Phản ứng 0% 0 Rất kháng (RK) 1 - 10% 1 Kháng (K) 11 - 20% 3 Hơi kháng (HK) 21 - 30% 5 Hơi nhiễm (HN) 31 - 60% 7 Nhiễm (N) > 60% 9 Rất nhiễm (RN) b) Kết quả chuyển gen kháng sâu đục thân vào lúa i) Tạo các dòng lúa biến đổi gen cry1A(b) và cry1A(c): Các giống lúa được dùng để chuyển gen bằng phương pháp sử dụng Agrobacterium gồm IR64, KDML105 và Một Bụi, đây là các giống lúa thuộc nhóm indica, phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long. Vector mang gen kháng sâu cryIA(b) hoặc cryIA(c) và gen chỉ thị pmi cho phép áp dụng hệ thống chọn lọc mannose đã được thiết kế và chuyển gen vào các giống lúa trên. Hiệu quả biến đổi gen đối với vectơ pUBB-Man trên giống IR64 từ 1,00-2,40% và KDML105 từ 0,79-3,33%, Một Bụi 5,50-
34. 186 Lê Trần Bình 5,80% (bảng 7.8) đối với vector pUBC-Man trên giống IR 64 từ 1,80-4,78% và KDML105 từ 1,81-3,07% và Một Bụi 4,16-5,71% (bảng 7.13) thực hiện chuyển gen trên giống IR64 bằng Agrobacterium và chọn lọc bằng hygromycin, thu nhận hiệu quả biến đổi thấp hơn hiệu quả đạt được ở nghiên cứu này. Chuyển gen bằng A. tumefaciens và chọn lọc bằng đường mannose đối với các giống lúa indica cho hiệu quả chuyển gen cao. Trong nghiên cứu này của chúng tôi sử dụng 5 g/l sucrose cộng với 35 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ ba. Hoa và CS (2003) báo cáo đã dùng 5 g/l sucrose cộng với 50 g/l mannose ở lần chọn lọc thứ ba cho giống Taipei 309. Nồng độ mannose cần cho chọn lọc đối với giống indica thấp hơn japonica. Bảng 7.13: Hiệu quả biến đổi gen bằng A. tumefaciens LBA 4404 Số mô Cây biến đổi Số Hiệu sẹo tạo gen (kiểm cây quả Thí phôi Số mô chứng bằng Giống xanh biến đổi nghiệm được kháng CR+ và tái gen chủng Southern sinh (B/A)% (A) blot+) (B) IR64 1 125 15 6 3 2,40 2 140 10 5 2 1,42 3 100 6 3 1 1,00 KDML10 1 120 16 7 3 2,50 5 2 150 12 8 5 3,33 3 146 4 2 1 0,79 Một Bụi 1 109 10 7 6 5,50 2 120 10 8 7 5,83 Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy chọn lọc bằng mannose cho hiệu quả chuyển gen tương đối cao, các cây phát triển trên môi trường mannose được kiểm định có mang gen pmi qua xét nghiệm PCR và phân tích Southern. Kết quả đã thu được các dòng To mang gen cryIA(c) và cryIA(b) được kiểm định bằng phân tích Southern. Các dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đang được tạo ra bằng ứng dụng hệ thống chọn lọc mannose, sinh
35. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 187 trưởng phát triển bình thường. Nghiên cứu này cũng cho thấy lợi điểm của phương pháp biến đổi gen bằng Agrobacterium. Gen chuyển được gắn vào bộ gen cây lúa theo phương thức đơn giản ở một locus, không có sự tái sắp xếp, điều này liên quan đến tính ổn định trong sự biểu hiện của gen chuyển ở các dòng biến đổi gen. Để phân tích sự phân ly của các dòng biến đổi gen, hạt tự thụ của các cây biến đổi gen (thế hệ T1) được cấy trong môi trường 1/2 MS có 20 g/l mannose. Cây kháng được đánh giá sau 2 tuần nuôi cấy và được chuyển vào trồng nhà lưới để lấy mẫu phân tích Southern. Sự phân ly các dòng T1 trên môi trường chọn lọc có chứa mannose theo tỷ lệ 3 kháng: 1 nhiễm theo định luật Mendel trong trường hợp gen được chuyển gắn vào nhiễm sắc thể một cách đơn giản (bảng 7.15). Bảng 7.14: Hiệu quả biến đổi gen bằng A. tumefaciens LBA 4404 Cây biến đổi Số mô gen sẹo Số (kiểm tạo cây Hiệu quả Thí Số mô chứng Giống phôi xanh biến đổi gen nghiệm kháng bằng được tái (B/A)% CR+ và chủng sinh Souther (A) n blot+) (B) 1 230 60 25 11 4,78 IR64 2 110 10 5 2 1,80 3 100 9 4 2 2,00 1 110 15 7 2 1,81 KDML105 2 130 16 9 4 3,07 3 146 14 6 3 2,05 1 120 10 8 5 4,16 Một Bụi 2 140 16 12 8 5,71
36. 188 Lê Trần Bình E2-4 E2-3 E2-2 + - M + - E1-2 E1-3 E1-4 1,84kb H×nh A H×nh B Hình 7.29: Phân tích Southern blot các dòng To/ IR64 chuyển gen với plasmit . A. Phân tích Southern blot các dòng T0/ IR64 chuyển gen với plasmit pUBC-Man bằng Agrobacterium. DNA được cắt đoạn bằng BamH I cộng EcoR I. Màng được lai với đoạn gen cryIA(c) phương pháp đánh dấu DIG. Mũi tên chỉ chiều dài 1,84kb của gen cryIA(c). (-) : Đối chứng không biến đổi gen. (+): Plasmit DNA. B. Phân tích Southern blot các dòng lúa T0/IR64 chuyển gen bởi plasmit pUBB-Man bằng Agrobacterium. DNA được cắt bằng enzyme giới hạn BamH I và EcoR I. Màng được lai với đoạn gen cryIA(b) phương pháp đánh dấu DIG. Mũi tên chỉ chiều dài 1,84 kb của gen cry1A(b). (+): Plasmit DNA; (-) : Đối chứng không chuyển gen M - + E1-2 E1-3 E1-6 E2-3 E2-4 (kb) S D S D S D S D S D 3,1 Hình 7.30: Phân tích Southern của các dòng lúa Một bụi (T0) chuyển gen với pUBC-Man. S: cắt đơn bởi KpnI, D: cắt đôi bởi XhoI. -: đối chứng 1. +: Plasmid DNA
37. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 189 Hình 7.31: Cây chuyển gen thế hệ T2 giống IR64 trồng tại nhà lưới Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long Hình 7.32: Cây chuyển gen thế hệ T2 giống KDML105 trồng tại nhà lưới Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long Bảng 7.15: Đánh giá sự phân ly của các cây chuyển gen qua chọn lọc mannose Tổng Chọn lọc Tỷ lệ Gen Thế số hạt Mannose phân ly được Dòng (IR64) hệ chọn (Kháng: chuyển Kháng Nhiễm lọc Nhiễm) T1 E1-2/cry1A(b) 30 13 17 13:17 cry1A(b) E1-3/cry1A(b) 30 16 14 16:14 cry1A(c) E2-1/cry1A(c) 40 24 16 24:16 E2-2/cry1A(c) 40 23 17 23:17 E2-3/cry1A(c) 30 24 6 24:6 E2-4/cry1A(c) 31 20 11 20:11 E2-5/cry1A(c) 30 24 6 24:6 E2-6/cry1A(c) 30 12 18 12:18 E2-9/cry1A(c) 30 18 12 18:12 E2-11/cry1A(c) 30 20 10 20:10
38. 190 Lê Trần Bình E2-12/cry1A(c) 31 17 14 17:14 E2-13/cry1A(c) 29 18 11 18:11 E2-14/cry1A(c) 30 22 8 22:8 E2-15/cry1A(c) 30 22 8 22:8 E2-16/cry1A(c) 30 13 17 13:17 E2-17/cry1A(c) 29 20 9 20:9 E2-18/cry1A(c) 29 18 11 18:11 T2 E1-2-4/cry1A(b) 7 4 3 4:3 E1-3-7/cry1A(b) 10 7 3 7:3 cryIAb E1-3-9/cry1A(b) 41 30 11 30:11 E1-3-10/cry1A(b) 40 31 9 31:9 E2-1-1/cry1A(c) 27 37 0 37:0 E2-1-2/cry1A(c) 40 40 0 40:0 cry1A(c) E2-1-3/cry1A(c) 39 39 0 39:0 E2-1-4/cry1A(c) 36 36 0 36:0 E2-1-5/cry1A(c) 40 30 10 30:10 E2-2-1/cry1A(c) 20 16 4 16:4 E2-2-2/cry1A(c) 19 15 4 15:4 E2-2-3/cry1A(c) 20 20 0 20:0 E2-2-4/cry1A(c) 20 14 6 14:6 cry1A(c) E2-2-5/cry1A(c) 21 14 7 14:7 E2-2-6/cry1A(c) 20 15 5 15:5 E2-2-7/cry1A(c) 22 10 12 10:12 E2-2-8/cry1A(c) 20 12 8 12:8 E2-2-9/cry1A(c) 20 17 3 17:3 E2-3-1/cry1A(c) 40 30 10 30:10 E2-3-2/cry1A(c) 40 29 11 29:11 cry1A(c) E2-3-3/cry1A(c) 40 35 5 35:5 E2-3-4/cry1A(c) 40 30 10 40:10 E2-4-1/cry1A(c) 22 18 4 18:4 E2-4-2/cry1A(c) 20 16 5 16:5 E2-4-3/cry1A(c) 21 16 5 16:5 cry1A(c) E2-4-4/cry1A(c) 20 18 2 18:2 E2-4-5/cry1A(c) 20 18 2 18:2 E2-4-7/cry1A(c) 20 20 0 20:0 cry1A(c) E2-5-1/cry1A(c) 13 10 3 10:3 E2-5-2/cry1A(c) 20 8 12 8:12 E2-5-4/cry1A(c) 21 12 9 12:9 E2-5-5/cry1A(c) 20 14 6 14:6
39. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 191 E2-5-6/cry1A(c) 20 16 4 16:4 cry1A(c) E2-6-1/cry1A(c) 8 5 3 5:3 E2-9-1/cry1A(c) 40 30 10 30:10 E2-9-2/cry1A(c) 40 29 11 29:11 cry1A(c) E2-9-3/cry1A(c) 43 34 6 34:6 E2-9-5/cry1A(c) 37 37 0 37:0 E2-11-1/cry1A(c) 38 29 9 29:9 cry1A(c) E2-11-2/cry1A(c) 40 32 8 32:8 E2-11-4/cry1A(c) 40 27 13 27:13 E2-12-1/cry1A(c) 39 28 11 28:11 E2-12-3/cry1A(c) 39 36 3 36:3 E2-12-4/cry1A(c) 40 31 9 31:9 E2-12-5/cry1A(c) 40 28 12 28:12 cry1A(c) E2-12-7/cry1A(c) 40 26 14 26:14 E2-12-8/cry1A(c) 40 30 10 30:10 E2-12-9/cry1A(c) 40 26 14 26:14 E2-12- 39 25 14 25:14 10/cry1A(c) E2-13-1/cry1A(c) 40 32 8 32:8 E2-13-2/cry1A(c) 38 38 0 38:0 E2-13-3/cry1A(c) 40 23 17 23:17 E2-13-4/cry1A(c) 40 39 1 39:1 cry1A(c) E2-13-5/cry1A(c) 40 40 0 40:0 E2-13-7/cry1A(c) 36 36 0 36:0 E2-13-8/cry1A(c) 40 24 16 24:16 E2-13-9/cry1A(c) 40 38 2 38:2 E2-15-4/cry1A(c) 40 38 2 38:2 E2-15-5/cry1A(c) 40 40 0 40:0 cry1A(c) E2-15-6/cry1A(c) 40 39 1 39:1 E2-15-7/cry1A(c) 40 31 9 31:9 E2-15-8/cry1A(c) 39 37 02 37:2 E2-16-1/cry1A(c) 39 28 11 28:11 E2-16-2/cry1A(c) 40 26 14 26:14 E2-16-3/cry1A(c) 39 24 15 24:15 E2-16-5/cry1A(c) 38 28 10 28:10 cry1A(c) E2-16-6/cry1A(c) 40 26 14 26:14 E2-16-7/cry1A(c) 18 10 8 10:9 E2-16-8/cry1A(c) 41 27 14 27:14 E2-16-9/cry1A(c) 40 32 8 32:8
40. 192 Lê Trần Bình E2-18-1/cry1A(c) 40 37 3 37:3 E2-18-2/cry1A(c) 40 39 1 39:1 cry1A(c) E2-18-6/cry1A(c) 40 31 9 31:9 E2-18-7/cry1A(c) 41 32 9 32:9 E2-18-8/cry1A(c) 10 6 4 6:4 ii) Kết quả thử nghiệm tính kháng sâu đục thân của các dòng biến đổi gen Bt ii.a) Thử nghiệm tính kháng toàn cây các dòng biến đổi gen T1 (IR64): Tính kháng (thử nghiệm toàn cây) của 30 dòng biến đổi gen (thế hệ T1) được thử nghiệm trong nhà lưới. W1263 được dùng làm giống chuẩn kháng, IR29 làm giống chuẩn nhiễm. Bảng 7.16: Tỷ lệ chồi héo (%) ghi nhận trên 30 dòng giống lúa IR64 ở thế hệ T1 ở 5,10, 15, 20 ngày sau khi chủng sâu 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày sau sau TT Dòng sau chủng sau chủng chủng chủng sâu sâu sâu sâu 1 E2-1-1/cry1A(c) 0 5,54 ab 2,56 a 2,88 a 2 E2-1-2/cry1A(c) 9,44 ab 2,78 a 5,55 abc 7,50 abc 3 E2-1-3/cry1A(c) 0 9,44 a-d 3,33 ab 5,46 ab 4 E2-1-4/cry1A(c) 2,56 a 12,72 a-d 3,03 ab 10,31 abc 5 E2-1-5/cry1A(c) 5,55 a 3,33 a 3,03 ab 5,34 ab 6 E2-2-1/cry1A(c) 7,48 a 10,43 a-d 11,18 a-e 13,38 a- e 7 E2-2-2/cry1A(c) 6,36 a 6,66 abc 14,08 a-f 13,06 a- e 8 E2-2-3/cry1A(c) 3,83 a 9,33 a-d 6,36 a-d 6,82 ab 9 E2-2-4/cry1A(c) 6,86 a 10,00 a-d 8,09 a-e 6,94 ab 10 E2-2-5/cry1A(c) 8,46 a 11,42 a-d 17,26 a-f 16,38 a- f 11 E2-2-6/cry1A(c) 10,43 ab 12,22 a-d 22,77 c- f 22,08 b-h 12 E2-2-7/cry1A(c) 5,55 a 24,28 d 24,99 ef 19,72 a- g 13 E2-2-8/cry1A(c) 4,75 a 8,92 a-d 13,88 a- f 7,50 abc 14 E2-2-9/cry1A(c) 4,76 a 4,76 a 3,33 ab 4,99 ab 15 E2-3-1/cry1A(c) 0 8,33 a-d 11,66 a-e 13,03 a- d 16 E2-3-2/cry1A(c) 13,89 ab 12,96 a-d 9,69 a- e 4,62 ab 17 E2-3-3/cry1A(c) 6,11 a 11,38 a-d 13,96 a-f 12,79 a- d
41. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 193 18 E2-3-4/cry1A(c) 3,38 a 0 9,97 a- e 11,50 abc 19 E2-4-1/cry1A(c) 7,83 a 9,69 a-d 20,50 b- f 25,79 c-I 20 E2-4-2/cry1A(c) 8,14 a 10,18 a-d 18,75 a- f 35,77 ghi 21 E2-4-3/cry1A(c) 5,12 a 21,39 30,74 fg 30,95 e-i bcd 22 E2-4-4/cry1A(c) 8,21 a 13,89 a-d 21,49 c- f 33,39 f-i 23 E2-4-5/cry1A(c) 6,88 a 12,53 a-d 21,61 c- f 30,42 d-i 24 E2-4-7/cry1A(c) 12,75 ab 10,53 a-d 6,36 a- d 5,34 ab 25 E2-5-1/cry1A(c) 2,77 a 5,88 abc 12,28 a- e 12,39 abc 26 E2-5-2/cry1A(c) 2,77 a 3,83 a 6,86 a- d 9,82 abc 27 E2-5-4/cry1A(c) 0 3,33 a 17,18 a- f 14,99 a- e 28 E2-5-5/cry1A(c) 0 2,77 a 11,77 a- e 12,15 abc 29 E2-5-6/cry1A(c) 5,55 a 5,55 ab 2,56 a 1,66 a 30 E2-6-1/cry1A(c) 22,22 b 22,85 cd 44,24 g 42,78 i 31 IR29 (Chuẩn 22,42 b 47,98 e 61,57 h 61,12 j nhiễm) 32 CK W1263 9,87 ab 14,96 a-d 23,27 def 37,59 hi (Chuẩn kháng) CV % 93,7 67,5 58,4 55,5 Kết quả trình bày ở bảng 7.16 cho thấy tỷ lệ chồi héo ở 5, 10, 15, 20 ngày sau khi chủng sâu. Ở 20 ngày giống chuẩn kháng W1263 có số chồi héo là 37,59%, giống chuẩn nhiễm IR29 có tỷ lệ 61,12%, trong khi có 11/13 dòng dòng biến đổi gen T1 có tỷ lệ chồi héo thấp hơn 10%. Các dòng có tỷ lệ chồi héo thấp nhất gồm dòng số 29: E2-5-6/cry1Ac (1,66%), dòng số 1 E2-1-1/cry1Ac (2,88%), dòng số 16: E2-3-2/cry1Ac (4,62%). Bảng 7.17: Tỷ lệ sâu sống (%) và trọng lượng sâu sống 25 ngày sau chủng Trọng Số sâu thả Tỷ lệ sâu TT Dòng lượng sâu (con) sống (%) sống (gram) 1 E2-1-1/cry1A(c) 34 0 0 2 E2-1-2/cry1A(c) 28 0 0 3 E2-1-3/cry1A(c) 35 0 0
42. 194 Lê Trần Bình 4 E2-1-4/cry1A(c) 32 0 0 5 E2-1-5/cry1A(c) 31 0 0 6 E2-2-1/cry1A(c) 33 0 0 7 E2-2-2/cry1A(c) 35 2,85 0,01 8 E2-2-3/cry1A(c) 31 0 0 9 E2-2-4/cry1A(c) 30 0 0 10 E2-2-5/cry1A(c) 31 0 0 11 E2-2-6/cry1A(c) 32 0 0 12 E2-2-7/cry1A(c) 17 0 0 13 E2-2-8/cry1A(c) 23 8,69 0,02 14 E2-2-9/cry1A(c) 24 0 0 15 E2-3-1/cry1A(c) 26 7,69 0,04 16 E2-3-2/cry1A(c) 31 6,45 0,03 17 E2-3-3/cry1A(c) 33 0 0 18 E2-3-4/cry1A(c) 31 0 0 19 E2-4-1/cry1A(c) 29 10,34 0,06 20 E2-4-2/cry1A(c) 41 14,63 0,10 21 E2-4-3/cry1A(c) 31 9,67 0,04 22 E2-4-4/cry1A(c) 39 15,38 0,09 23 E2-4-5/cry1A(c) 35 0 0 24 E2-4-7/cry1A(c) 31 6,45 0,09 25 E2-5-1/cry1A(c) 35 8,57 0,04 26 E2-5-2/cry1A(c) 31 3,22 0,02 27 E2-5-4/cry1A(c) 34 5,88 0,02 28 E2-5-5/cry1A(c) 35 11,42 0,05 29 E2-5-6/cry1A(c) 36 0 0 30 E2-6-1/cry1A(c) 32 28,12 0,12 31 IR29 (Chuẩn nhiễm) 45 8,88 0,07 32 W1263 (Chuẩn 41 4,87 0,02 kháng) Bảng 7.17 ghi nhận tỷ lệ sâu còn sống và trọng lượng sâu sống trên các dòng thử nghiệm ở 25 ngày sau khi chủng sâu. Tỷ lệ sâu
43. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 195 sống sót và trọng lượng sâu sống trên giống chuẩn kháng W1263 lần lượt là 4,87 và 0,02 gram, trên giống chuẩn nhiễm IR29 lần lượt là 8,88 và 0,07 gram. Kết quả ghi nhận 16/30 dòng biến đổi gen T1 không có số sâu sống (tỷ lệ sống 0%) và cho thấy sự khác biệt về sâu sống sót giữa dòng biến đổi gen so với giống chuẩn nhiễm, chuẩn kháng. Bảng 7.18: Cấp hại (0-9) và phản ứng của các dòng lúa thử nghiệm đối với sâu đục thân TT Dòng Cấp hại trung bình Phản ứng 1 E2-1-1/cry1A(c) 1 K 2 E2-1-2/cry1A(c) 1 K 3 E2-1-3/cry1A(c) 1 K 4 E2-1-4/cry1A(c) 1 K 5 E2-1-5/cry1A(c) 1 K 6 E2-2-1/cry1A(c) 3 HK 7 E2-2-2/cry1A(c) 3 HK 8 E2-2-3/cry1A(c) 1 K 9 E2-2-4/cry1A(c) 1 K 10 E2-2-5/cry1A(c) 3 HK 11 E2-2-6/cry1A(c) 5 HN 12 E2-2-7/cry1A(c) 3 HK 13 E2-2-8/cry1A(c) 1 K 14 E2-2-9/cry1A(c) 1 K 15 E2-3-1/cry1A(c) 3 HK 16 E2-3-2/cry1A(c) 1 K 17 E2-3-3/cry1A(c) 3 HK 18 E2-3-4/cry1A(c) 3 HK 19 E2-4-1/cry1A(c) 5 HN 20 E2-4-2/cry1A(c) 7 N 21 E2-4-3/cry1A(c) 7 N 22 E2-4-4/cry1A(c) 7 N 23 E2-4-5/cry1A(c) 5 HN 24 E2-4-7/cry1A(c) 1 K
44. 196 Lê Trần Bình 25 E2-5-1/cry1A(c) 3 HK 26 E2-5-2/cry1A(c) 1 K 27 E2-5-4/cry1A(c) 3 HK 28 E2-5-5/cry1A(c) 3 HK 29 E2-5-6/cry1A(c) 1 K 30 E2-6-1/cry1A(c) 7 N 31 IR29 (chuẩn nhiễm) 7 RN 32 W1263 (chuẩn 5 N kháng) Đánh giá tính kháng của các dòng lúa thử nghiệm theo thang điểm 0- 9 dựa trên tỷ lệ số chồi chết vào 20 ngày sau khi chủng sâu được trình bày ở bảng 7.18. Kết quả ghi nhận giống chuẩn kháng W1263 có cấp 5 (hơi nhiễm), giống chuẩn nghiễm IR29 có cấp 7 (nhiễm). Trong 30 dòng biến đổi gen T1 sự phân bố tính kháng như sau: Cấp 0 (rất kháng): không có dòng nào. Cấp 1 (kháng): 13 dòng chiếm 43,3 % Cấp 3 (hơi kháng): 10 dòng chiếm 33,3 % Cấp 5 (hơi nhiễm): 3 dòng chiếm tỷ lệ 10,0 % Cấp 7 (nhiễm): 4 dòng chiếm tỷ lệ 13,3 % Kết quả này cho thấy, sự biểu hiện gen Bt (cry1A(c)) rất hiệu quả trong tạo ra tính kháng sâu đục thân ở lúa, số dòng biến đổi gen cho tính kháng cao (cấp 1) chiếm tỷ lệ đến 43,3%. ii.b) Thử nghiệm tính kháng sâu đục thân các dòng lúa biến đổi gen T2: Các dòng lúa biến đổi gen thế hệ T2 được thử nghiệm với phương pháp đĩa petri cùng với giống chuẩn kháng W1263 và chuẩn nhiễm IR29. Số liệu được ghi nhận cho số sâu sống, số sâu chết và tỷ lệ sâu chết. Hình 7.34 cho thấy sự khác biệt số sâu sống trên dòng biến đổi gen (100% chết) và giống chuẩn nhiễm, chuẩn kháng. Kết quả được trình bày ở bảng 7.19 cho thấy giống chuẩn kháng W1236 có tỷ lệ sâu chết 7/14 (50%), giống chuẩn nhiễm IR29 có 0/14 (0%). Trong 37 dòng lúa biến đổi gen, có đến 27 dòng có tỷ lệ sâu chết 100%, 7 dòng có tỷ lệ sâu chết trên 50%, 3 dòng có tỷ lệ sâu chết <50%. Các dòng cho tỷ lệ sâu chết 100% đều mang gen cry1A(c). Một dòng mang gen cry1A(b) cho tỷ lệ sâu chết thấp
45. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 197 (6,67%). Điều này cho thấy gen cry1A(c) hoạt động có hiệu quả tạo tính kháng sâu đục thân ở lúa. Hình 7.33: Sâu sống sót trên các dòng lúa thử nghiệm Hình 7.34: Các dòng lúa thử nghiệm được thử sâu 5 sâu mới nở/đoạn thân/3 lần lập lai và tách thân để quan sát sâu sau 5 ngày. Các dòng thể hiện độc tính Bt cao (Bt33:E2-16-8-7/cryIA(c), Bt 37: E2- 18-7-4/cryIA(c), Bt 30: E2-16-5-7/cryIA(c), Bt 22: E2-13-8-4/cryIA(c), Bt 28: E2-16-2-6/cryIA(c)) cho thấy sâu chết hoàn toàn sau 5 ngày lây nhiễm trong khi có 50% sâu chết ở giống chuẩn kháng (W1263) và không có sâu chết ở dòng chuẩn nhiễm (IR29)
46. 198 Lê Trần Bình Bảng 7.19: Số sâu sống, sâu chết và tỷ lệ sâu chết trên các dòng lúa thử nghiệm Số sâu đếm được 5 ngày Ký sau khi chủng Tỷ lệ TT Dòng hiệu con chết dòng Tổng số Số con Số con (%) con sống chết 1 E2-11-1-1/ CryIA(c) 7 14 0 14 100.00 2 E2-11-2-7/ CryIA(c) 8 13 0 13 100.00 3 E2-11-4-4/ CryIA(c) 9 12 0 12 100.00 4 E2-12-1-1/ CryIA(c) 10 14 0 14 100.00 5 E2-12-3-4/ CryIA(c) 11 15 0 15 100.00 6 E2-12-5-3/ CryIA(c) 12 9 0 9 100.00 7 E2-12-7-7/ CryIA(c) 13 15 0 15 100.00 8 E2-12-8-5/ CryIA(c) 14 10 0 10 100.00 9 E2-12-9-5/ CryIA(c) 15 12 0 12 100.00 10 E2-12-10-7/ CryIA(c) 16 12 0 12 100.00 11 E2-13-1-8/ CryIA(c) 17 11 0 11 100.00 12 E2-13-8-4/ CryIA(c) 22 13 0 13 100.00 13 E2-15-6-7/ CryIA(c) 24 14 0 14 100.00 14 E2-15-7-2/ CryIA(c) 25 15 0 15 100.00 15 E2-15-8-4/ CryIA(c) 26 15 0 15 100.00 16 E2-16-1-1/ CryIA(c) 27 14 0 14 100.00 17 E2-16-2-6/ CryIA(c) 28 13 0 13 100.00 18 E2-16-3-3/ CryIA(c) 29 14 0 14 100.00 19 E2-16-5-7/ CryIA(c) 30 14 0 14 100.00 20 E2-16-6-1/ CryIA(c) 31 12 0 12 100.00 21 E2-16-7-5/ CryIA(c) 32 14 0 14 100.00 22 E2-16-8-7/ CryIA(c) 33 13 0 13 100.00 23 E2-16-9-1/ CryIA(c) 34 14 0 14 100.00 24 E2-18-1-9/ CryIA(c) 35 14 0 14 100.00 25 E2-18-2-2/ CryIA(c) 36 11 0 11 100.00 26 E2-18-7-4/ CryIA(c) 37 14 0 14 100.00 27 E2-18-8-9/ CryIA(c) 38 14 0 14 100.00 28 E1-2-4-1/ CryIA(b) 1 10 1 9 90.00 29 E2-13-7-2/ CryIA(c) 21 12 1 11 91.67
47. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 199 30 E2-13-2-8/ CryIA(c) 18 12 3 9 75.00 31 E2-9-3-1/ CryIA(c) 5 11 3 8 72.72 32 E2-13-3-5/ CryIA(c) 19 11 3 8 72.72 33 E2-15-4-6/ CryIA(c) 23 13 5 8 61.53 34 E2-13-4-2/ CryIA(c) 20 13 6 7 53.84 35 W1263 (Chuẩn kháng) 14 7 7 50.00 36 E2-9-5-5/ CryIA(c) 6 12 7 5 41.67 37 E2-9-1-4/ CryIA(c) 3 12 9 3 25.00 38 E1-3-10-1/ CryIA(b) 2 15 14 1 6.67 39 IR 29 (Chuẩn nhiễm) 14 14 0 0.00 Qua thử nghiệm sinh học tính kháng sâu đục thân của các dòng biến đổi gen thế hệ T1 và T2, một số kết luận có thể rút ra như sau: 01. Gen kháng sâu đục thân cry1A(c) hoạt động hữu hiệu ở lúa, tạo tính kháng sâu cao, trong khi giống chuẩn kháng W1263 cho phản ứng nhiễm trong thử nghiệm sinh học. Tỷ lệ số dòng biến đổi gen thế hệ T1kháng cấp 1 chiếm tỷ lệ đến 43,3%. Tỷ lệ số dòng biến đổi gen thế hệ T2 cho 100% số sâu chết chiếm tỷ lệ đến 73% (27/37 dòng) 02. Số dòng biến đổi gen kháng tăng qua mỗi thế hệ và có thể sớm chọn được dòng kháng đồng hợp tử. Kết luận và đề nghị về chuyển gen vào lúa 01. Quy trình sử dụng phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian A. tumefaciens và dùng súng bắn gen (Biorad) đã thử nghiệm thành công trong điều kiện tại Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long và đã được áp dụng để chuyển nạp các gen hữu dụng (kháng sâu) vào các giống lúa thuộc nhóm indica đang trồng phổ biến trong sản xuất (IR64, Một Bụi, KDLM105, MTL250). Với phương pháp dùng máy bắn gen, khoảng cách A với áp lực 900 hoặc 1100 psi cho hiệu quả chuyển nạp gen cao hơn ở áp lực 1350 psi. Bằng cách sử dụng phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian A. tumefaciens và hệ thống chọn lọc bằng mannose (thay thế cho hệ thống chọn lọc bằng chất kháng sinh hoặc chất kháng thuốc trừ cỏ), gen kháng sâu cry1A(c) và cry1A(b) đã được chuyển nạp
48. 200 Lê Trần Bình vào các giống lúa IR64, KDML105 và Một Bụi. Hiệu quả biến đổi gen tùy theo vector và giống lúa indica đã đạt trong khoảng 0,79-5,80%; đây là kết quả rất khả quan đối với giống lúa nhóm indica. Nghiên cứu này đã xác định quy trình chọn lọc bằng mannose có hiệu quả với 30 g/l + 25 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ nhất, 15g/l sucrose + 25g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ hai và 5 g/l sucrose + 35 g/l mannose ở vòng chọn lọc thứ ba. 02. Các cây được chuyển nạp gen sống và phát triển trên môi trường chọn lọc có chứa mannose được kiểm định bằng phân tích Southern để khẳng định sự hiện diện của gen cry1A(c) hoặc cry1A(b). Nghiên cứu này cũng cho thấy lợi điểm của phương pháp biến đổi gen bằng Agrobacterium. Gen chuyển nạp được gắn vào bộ gen cây lúa theo phương thức đơn giản ở một locus, không có sự tái sắp xếp, điều này liên quan đến tính ổn định trong sự biểu hiện của gen chuyển nạp ở các dòng biến đổi gen. 03. Các dòng biến đổi gen được thử nghiệm sinh học tính kháng sâu đục thân. Đánh giá tính kháng của các dòng lúa thử nghiệm theo thang điểm 0-9 dựa trên tỷ lệ số chồi chết vào 20 ngày sau khi chủng sâu ghi nhận giống chuẩn kháng W1263 có cấp 5 (nhiễm nhẹ), giống chuẩn nhiễm IR29 có cấp 7 (nhiễm). Trong 30 dòng biến đổi gen T1, sự phân bố tính kháng như sau: - Cấp 1 (kháng): 13 dòng chiếm 43,3% - Cấp 3 (kháng trung bình): 10 dòng chiếm 33,3% - Cấp 5 (nhiễm nhẹ): 3 dòng chiếm tỷ lệ 10,0% - Cấp 7 (nhiễm): 4 dòng chiếm tỷ lệ 13,3% Các dòng lúa biến đổi gen thế hệ T2 được thử nghiệm với phương pháp đĩa petri. Kết quả cho thấy giống chuẩn kháng W1236 có tỷ lệ sâu chết 7/14 (50%), giống chuẩn nhiễm IR29 có 0/14 (0%). Trong 37 dòng lúa biến đổi gen, có đến 27 dòng có tỷ lệ sâu chết 100%.
49. Chương 7. Tạo dòng lúa indica chuyển gen 201 01. Qua thử nghiệm sinh học tính kháng sâu đục thân của các dòng biến đổi gen thế hệ T1, T2 sử dụng hệ thống chọn lọc bằng manose, và thế hệ T3, T4 sử dụng hệ thống chọn lọc bằng kháng sinh Hyg một số kết luận có thể rút ra như sau: Gen kháng sâu cry1A(c) hoạt động hữu hiệu ở lúa tạo tính kháng sâu đục thân cao, các dòng biến đổi gen kháng sâu đạt tỷ lệ cao và có tính kháng sâu đục thân hơn hẳn giống chuẩn kháng. Số dòng biến đổi gen kháng sâu đục thân tăng qua mỗi thế hệ và có thể và tạm thời kết luận đã chọn được 1 dòng kháng sâu đồng hợp tử thế hệ T4. (C67-T4-11). Hiệu quả chuyển gen khi sử dụng hệ thống chọn lọc bằng manose dao động từ 0,79 - 5,8% và tỉ lệ là 6,6% khi sử dụng hệ thống chọn lọc bằng kháng sinh Hyg. 02. Kết quả thử nghiệm sinh học tính kháng rầy nâu của các dòng lúa biến đổi gen GNA cho biểu hiện sự kháng rầy nâu ở cấp 3 - 5, trong khi giống bố mẹ nhiễm cấp 9. 03. Kết quả phân tích 41 dòng lúa C71 tái sinh từ mô sẹo sau biến nạp gen Xa21 (sống sót trên môi trường có hygromycine) bằng phương pháp PCR và thử tính kháng bệnh với khuẩn Xanthomonas oryzae cho thấy các dòng biến nạp không duy trì được một cách ổn định gen Xa21, rất có thể do kích thước của gen này quá lớn (trên 9 kb), cần tiếp tục tối ưu hóa kích thước gen và cách thức chuyển gen. 04. Đề nghị đưa phương pháp chuyển nạp gen qua trung gian Agrobacterium và sử dụng hệ thống chọn lọc mannose với quy trình xác định trong nghiên cứu này nên được ứng dụng để chuyển nạp các gen hữu dụng vào giống lúa nhóm indica. 05. Đề nghị tiếp tục chọn lọc các dòng lúa biến đổi gen kháng sâu đục thân các thế hệ tiếp theo với mục đích chọn được các dòng có tính ổn định di truyền.
50. Chương 8 CHUYỂN GEN Ở CÂY ĐU ĐỦ 8.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây đu đủ và bệnh đốm vòng 8.1.1.Cây đu đủ và bệnh đốm vòng 8.1.2.Gen kháng virus đốm vòng PSRV 8.2. So sánh gen CP của các chủng PSRV Việt Nam 8.3. Gen ACO oxidase và tính trạng chín chậm 8.4. Gen ACO oxidase từ quả đu đủ 8.5. Chuyển gen vào đu đủ 8.6. Thử tính kháng virus trong nhà kính 8.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây đu đủ và bệnh đốm vòng 8.1.1. Cây đu đủ và bệnh đốm vòng Đu đủ là cây ăn quả được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả chín để ăn và quả xanh được dùng làm rau, làm salad. Ngoài ra nhựa đu đủ còn là nguyên liệu tách chế phẩm enzym papain có giá trị thương mại sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và thuộc da. Ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ trên 2.500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200-300 tỉ đồng (Vũ Công Hậu, 1996).
51. 206 Lê Trần Bình Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng đu đủ (Papaya Ringspot Virus - PSRV) gây ra (hình 8.1). Virus này thuộc nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là RNA sợi đơn. Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợp dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả. Bệnh được truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nước ta (Vũ Công Hậu, 1996) cũng như Austrailia (Thomas và Dodman, 1993), Thái Lan (Srisomchai, 1975), Đài Loan (Wang et al., 1978), Malaysia (Ong, 1991) v.v. và đặc biệt là Hawaii (Linder et al., 1995) đều đã bị nhiễm bệnh. Hình 8.1: Biểu hiện bệnh đốm vòng hại lá cây đu đủ (hình trái) là mất diệp lục, biến dạng thùy lá so với lá không bị bệnh (hình phải) Hình 8.2: Cây đu đủ thịt quả vàng (bird papaya) mọc hoang ở Bogor, Indonesia
52. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 207 Rệp sáp, rệp mình mềm, bọ nhảy v.v. ngoài việc hút nhựa gây tác hại trực tiếp còn là vật truyền bệnh PRSV nhất thiết phải trị bằng những thuốc hiện có như Bi 58ND, Mipcin 20ND, Trebon 10ND, Applaud-BAM 50ND v.v Những cây đu đủ trồng lẻ tẻ, không chăm sóc có rất nhiều loại côn trùng và thực sự là những ổ dịch nếu không phá bỏ thì nghề trồng đu đủ rất khó phát triển. Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSV là chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh (Namba và Higa, 1977), sử dụng thuốc trừ sâu để diệt rệp truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh để ngăn sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo (Yeh, 1988 và 1994). Nhưng những phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này. Hiện nay, nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hóa protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật. Thành công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá (Powell-Abel et al., 1986). Sau đó là sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus (Cuozzo, 1988), alfalfa mosaic virus (Loesch-Fries et al., 1987) và potato leaf roll (Hemenway et al., 1998). Gần đây ở Hawaii đã tạo được dòng đu đủ 55-1 kháng lại PRSV (Fitch et al. 1990 và 1992). Dòng đu đủ được chuyển gen này đã trở thành giống thương mại sau khi lai với giống Kapoho (Nishina et al., 1998). Nhưng tính kháng của cây đu đủ chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của Hawai mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác (Tennant et al, 1994). Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen mã hóa protein vỏ (coat protein - CP) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hóa protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở Việt Nam với mục đích là tạo được một vector chuyển gen mang gen mã hóa cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụ cho việc chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có khả năng kháng lại PRSV ở Việt Nam.
53. 208 Lê Trần Bình PRSV thuộc loại potyvirus, nhóm gồm có khoảng 160 loại khác nhau. Nhóm potyvirus là lớn nhất và có ảnh hưởng quan trọng đến kinh tế do virus gây bệnh ở thực vật. Những virus của nhóm này có genome là sợi RNA đơn cuốn vòng với kích thước 780x12 nm. Nó chứa khoảng 10 kb liên kết với protein ở đầu 5' (VPg) và có đuôi polyA đầu 3' (Shukla et.al 1994). Sợi RNA genome này được bao bọc bằng vỏ protein (Capsid). Vỏ protein là sự lặp lại của những tiểu phần nhỏ là protein vỏ (coat protein). RNA genome của PRSV được dịch mã trong tế bào chủ tạo ra polyprotein. Polyprotein này thủy phân tạo ra 12 protein trong đó có protein vỏ. Trong suốt quá trình nhiễm trong tế bào chủ, virus sử dụng nguyên liệu của tế bào chủ để tạo ra những bản sao genome cũng như các protein của nó. Sau đó RNA và những tiểu phần protein vỏ tự lắp ráp với nhau tạo ra những virus hoàn chỉnh riêng biệt có khả năng nhiễm sang các tế bào khác trong cây hoặc sang các cây khác nhờ côn trùng. Genome của virus mã hóa khoảng 12 loại protein. Một vài loại thì chức năng của nó không hoàn toàn được xác định, một vài loại thì có nhiều chức năng khác nhau. Một số chức năng đã được xác định là vỏ protein, nhân, thân hình trụ, phần bổ trợ liên quan đến sự truyền nhờ côn trùng, helicase và nhiều protease, replicase, protein liên kết genome, ATPase. PRSV được truyền dễ dàng đến tế bào chủ thân thuộc nhờ nhiều loài rệp cây khác nhau với phương thức không liên tục. Virus được truyền không liên tục nhờ rệp cây là vì sự tồn tại trong vật truyền trung gian là rất ngắn, ngắn hơn cả thời gian tồn tại của virus trong dịch chiết lá cây. Trong quá trình truyền không liên tục, virus được truyền sang côn trùng sau khi sinh trưởng một thời gian ngắn trong cây bị nhiễm và có thể được truyền tới một hoặc vài cây ngay lập tức hay sau nhiều giờ. Có sự khác nhau trong vật truyền đặc hiệu của từng loại virus riêng biệt trong nhóm thậm chí giữa các dạng sinh học của cùng một loại virus. Điều này nói lên rằng cơ chế của sự tương tác virus - vector vượt ra ngoài tính chất sinh học chung của virus và vector truyền của nó . 8.1.2. Gen kháng virus đốm vòng PRSV Từ nhiều năm, người ta đã biết cây cỏ có thể trở nên kháng đối với các chủng virus gây bệnh nếu trước đó gây nhiễm chúng với cùng
54. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 209 loại hay với virus tương tự. Hiện tượng này gọi là “bảo vệ chéo”. Hình như protein vỏ của thể virus đóng vai trò quyết định đối với tính kháng chéo, bởi vì khi gen CP của nhiều loại virus RNA được thể hiện trong cây (cũng không nhất thiết phải có sự biểu hiện gen mã hoá protein vỏ ở mức độ cao) thì phản ứng bảo vệ chéo biểu hiện. Tính kháng virus còn có thể đạt được khi biến nạp thực vật với DNA có những đoạn mã hoá RNA vệ tinh. Cơ chế bảo vệ chéo còn chưa được giải thích đầy đủ nhưng có thể giả thiết rằng giữa thể virus gây nhiễm và tế bào chủ có sự hòa trộn sản phẩm biểu hiện của gen nên đã tạo ra tính kháng virus của cây. Bằng việc sử dụng các tiến bộ trong kỹ thuật di truyền, người ta đã chuyển gen CP của virus vào giống đu đủ, tạo cho cây có khả năng kháng bệnh virus. Đây là một thành tựu lớn của công nghệ sinh học trong việc chống lại bệnh PRSV. Các dòng đu đủ chuyển gen này sẽ góp phần có hiệu quả trong việc phòng trừ bệnh PRSV. Trên thế giới đã có nhiều phòng thí nghiệm làm về chuyển gen ở thực vật, nhưng chuyển gen CP để tạo cây kháng PRSV thì chỉ có một số phòng thí nghiệm nổi bật là: Trường Đại học Hawaii và Trường Đại học Cornell, Mỹ Hai nơi này đã đi tiên phong trong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng bệnh đốm vòng và đã mở ra một phương pháp mới cho việc tạo các giống cây trồng kháng bệnh virus. Nhóm các nhà khoa học gồm có: Dr. Dennis Gonsalves, Khoa bệnh học thực vật, Đại học Tổng hợp Cornell, tham gia trong việc tách phân lập gen CP từ virus PRSV; Dr. Jerry Slightom thiết kế cấu trúc gen CP dùng cho chuyển gen vào cây đu đủ. Dr. Maureen Fitch (USDA) thành công trong chuyển gen CP vào đu đủ và Dr. Richard Manshardt, Khoa trồng trọt, Đại học tổng hợp Hawaii, tham gia kiểm tra và khảo nghiệm các dòng cây chuyển gen. Nhóm nghiên cứu này đã đưa gen CP của dòng virus PRSV HA 5-1 vào vector pGA482 và chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" bằng súng bắn gen. Họ đã tạo ra hai dòng đu đủ mang tên 55-1 và 63-1 có mang gen CP trong genom và đã kiểm tra bằng lai Southern và ELISA. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng bệnh của thế hệ R1 từ dòng 55-1 cho thấy nó có tính kháng bệnh rất cao (chỉ có 5% của 128 cây được thử nhiễm bệnh) đối với các dòng virus tách từ Hawaii.
55. 210 Lê Trần Bình Nhưng không kháng được các dòng tách từ nơi khác (ví dụ dòng virus từ Thái Lan). Vì thịt quả của dòng 55-1 có mầu hồng không phù hợp với thị trường nên dòng 55-1 này đã được lai với giống Kapoho tạo ra dòng "Rainbow" có thịt quả mầu vàng mang đầy đủ các đặc tích của giống gốc. Hiện nay dòng "Rainbow" đã được đăng ký bản quyền và trở thành giống đu đủ chuyển gen thương mại đầu tiên có khả năng kháng lại PRSV. Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia Nhóm nghiên cứu gồm có: Dr.Burn, Dr. Kanokawan, Dr. Supart, Đại học Tổng hợp Kasetsart, Thái Lan; Dr. Srimake, Đại học Queensland, Austrailia. Để kiểm soát bệnh PRV thì từ năm 1987 Thailand đã tạo ra các giống có khả năng chịu bệnh cao theo phương pháp bảo vệ chéo nhưng hiệu quả không cao. Năm 1995, Thailand đã có chương trình phát triển cây đu đủ chuyển gen kháng bệnh PRSV được tài trợ của ACIAR kết hợp giữa trường đại học Kasetsart, Thái Lan và Queensland, Austrailia. Gen CP đã được tách từ các chủng virus của Thái Lan. Gen này được chuyển vào hai giống Khak-Dum và Khak-Nual bằng phương pháp bắn gen với nguyên liệu là phôi non qua giai đoạn mô sẹo. Hiện nay họ cũng đã thu được cây chuyển gen, đang thử nghiệm tính kháng PRSV. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia Nhóm nghiên cứu gồm Dr. Hassan tách phân lập gen CP từ các chủng virus của Malaysia; Dr. Tan Chong Seng thiết kế cấu trúc CP gen, đưa vào vector p2K7 dùng cho chuyển gen bằng súng bắn gen và vector pCAMBIA2300 dùng cho chuyển gen bằng Agrobacterium và Dr. Vilasini Pillai: chuyển gen CP vào giống đu đủ Ekotika. Hiện nay đã thu được cây chuyển gen To được khẳng định bằng lai Southern nhưng chưa được thử khả năng kháng bệnh. Ngoài ra dưới sự tài trợ và điều phối của ISAAA Tổ chức nhận biết và Dịch vụ Công nghệ sinh học Nông nghiệp 5 quốc gia Đông Nam Á gồm: Thái Lan, Indonesia, Phillippine, Malaysia và Việt Nam đang tham gia vào một đề án mạng lưới tạo cây đu đủ kháng PSRV bằng công nghệ gen. Điều đặc biệt là sau nhiều năm tìm kiếm các thành viên tham gia đề án của Indonesia đã không thể tìm thấy virus đốm vòng đu đủ trên cả hai nhóm giống là đu đủ ruột vàng (bird papaya, hình
56. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 211 8.1) mọc hoang và đủ đủ ruột đỏ. Vì thế, Indonesia chỉ tập trung tham gia nghiên cứu về tính chín chậm. 8.2. So sánh gen CP của các chủng PSRV Việt Nam Phân lập gen CP từ virus đốm vòng đu đủ dựa trên nguyên tắc phản ứng chuỗi polymerase sao chép ngược (RT-PCR) với RNA của virus làm khuôn và các cặp primer thiết kế đặc hiệu cho gen CP. 8.2.1. Kết quả phân tích trình tự gen CP Việt Nam Đoạn gen CP sau khi được nhân lên với hai cặp primer MB11- MB12 và NH2-NH5 được đưa vào vector pCR2.1. Vector tái tổ hợp này được tinh sạch và đọc trình tự. GTCTAGATGTCCAAAACTGAAGCTGTGGATGCTGGTCTGAATGAAAAGCTAAAAGAAAAG 60 GAAAAACAGAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGATAAACAAAAAGATAAAGATAATGATGGA GCTAGTGACGGAAATGATGTGTCAACTAGCACAAAAACTGGAGAGAGAGATAGAGATGTC 180 AACGCCGGAACTAGTGGAACTTTCACTGTTCCAAGGATAAAGTCTTTTACTGATAAGATG ATTTTACCAAGAATTAAGGGAAAGTCTGTCCTTAATTTAAATCATCTTCTTCAGTATAAT 300 CCGAAACAAATTGACATCTCAAACACTCGTGCCACTCAATCTCAATTTGAAAAGTGGTAT GAGGGAGTGAGGAATGATTATGGTCTTAGTGATAACGAAATGCAAGTGATGTTAAATGGT 420 TTGATGGTTTGGTGTATCGAAAATGGTACATCTCCAGACATATCTGGTGTTTGGGTAATG ATGGATGGGGAAACCCAGGTTGATTATCCTATCAAACCTTTAATTGAACATGCAACTCCT 540 TCATTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATATATCGCGAAGAGA AATGCAACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATTAAAAGGAATTTGACTGACATTAGC 660 CTCGCTCGATATGCTTTTGATTTCTATGAGGTGAACTCGAAAACACCTGATGGGGCTCGT GAAGCTCATATGCAGATGAAGGCTGCAGCGCTACGTAATACTAGTCGCAGAATGTTCGGA 780 ATGGACGGCAGTGTCAGTAACAAGGAAGAAAACACGGAGAGACACACAGTGGAAGATGTC AATAGAGACATGCACTCTCTCCTGGGTATGCGCAATTAAATACTCGCACTTGTGTGTTTG 900 GAGCTCC 907 Hình 8.3. Trình tự nucleotid của gen PRSV (gen CP) được nhân bằng cặp primer MB11-MB12 V.MSKTEAVDAGLNEKLKEKEKQKEKEKEKDKQKDKDNDGASDGNDVSTSTKTGERDRDV 60 NAGTSGTFTVPRIKSFTDKMILPRIKGKSVLNLNHLLQYNPKQIDISNTRATQSQFEKWY 120 EGVRNDYGLSDNEMQVMLNGLMVWCIENGTSPDISGVWVMMDGETQVDYPIKPLIEHATP 180 SFRQIMAHFSNAAEAYIAKRNATERYMPRYGIKRNLTDISLARYAFDFYEVNSKTPDGAR 240 EAHMQMKAAALRNTSRRMFGMDGSVSNKEENTERHTVEDVNRDMHSLLGMRN.ILALVCL 300 EL 302 Hình 8.4: Trình tự amino acid dịch mã từ gen PRSVN
57. 212 Lê Trần Bình 8.2.2. So sánh trình tự gen CP của các chủng PSRV Sử dụng chương trình Aligment của phần mềm DNAstar để so sánh trình tự gen CP nhân được và các trình tự này cũng được so sánh với các trình tự gen CP khác trong ngân hàng gen của trang Web: www.ncbi.nlm.nih.gov trên mạng internet. Bảng 8.1: Danh sách mẫu đu đủ bị nhiễm virus dùng để phân lập và so sánh tính đa dạng di truyền của gen CP độ dài trình tự Số đăng ký STT Tên vùng thu mẫu Ký hiệu (nucleotide) GenBank 1 Cần Thơ CT 1065 AJ875101 2 Điện Biên DB 1074 AJ875102 3 Hà Nội HN 1074 AJ875103 4 Kontum KT 1059 AJ875104 5 Lào Cai LC 1074 AJ875105 6 Lý Nhân (Hà Nam) LN 1074 AJ875106 7 Lạng Sơn 1 LS1 1074 AJ875107 8 Lạng Sơn 2 LS2 1074 AJ875108 9 TP. Hồ Chí Minh SG 1065 AJ875109 10 Thị xã Sơn La (Sơn La) SL 1074 AJ875110 11 Thiên Cầm (Hà Tĩnh) TC 1074 AJ875111 12 Thu Cúc (Sơn La) TCU 1074 AJ875112 13 Thạch Hà (Hà Tĩnh) TH 1074 AJ875113 14 Thuận Châu (Sơn La) THC 1074 AJ875114 15 Tuyên Quang1 TQ1 1074 AJ875115 16 Tuyên Quang2 TQ2 1074 AJ875116 Kết quả cho thấy các gen CP được phân lập từ các vùng khác nhau của Việt Nam có độ tương đồng từ 89,7-99,8% ở mức độ nucleotide và 91,5-99,7% ở mức độ amino axít. Điều quan trọng là các chủng virus của Việt Nam đứng riêng trên biểu đồ so sánh thành một nhóm độc lập gần với các chủng của Đài Loan và của
58. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 213 Nhật Bản. Điều đo càng khẳng định phương án tạo cây đu đủ kháng PSRV cho Việt Nam phải bắt đầu bằng việc phân lập gen của PSRV từ cây đu đủ bệnh của Việt Nam là cách tiếp cận cần thiết và đúng đắn. Nếu dùng nguồn gen CP của các quốc gia khác thì sẽ không thành công. Hình 8.5: So sánh mức độ tương đồng trình tự nucleotide của gen CP của 16 mẫu PSRV phân lập từ các địa phương ở Việt Nam và dẫn liệu khai thác từ Ngân hàng dữ liệu gen thề giới 8.2.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CP của PRSV Việt Nam Vector chuyên dụng dùng cho chuyển gen ở thực vật nói chung, và cụ thể ở cây đu đủ là pBI121. Sản phẩm PCR trong dòng TOPO được thay thế vào vị trí của gen GUS trong pBI121, tại đây gen CP chịu tác động điều khiển của promotor 35S và kết thúc bằng NOS. Ngoài ra gen CP còn được thiết kế vào vector pMON65309 có một đoạn CP và một đoạn antisense của CP ghép đối đầu vào nhau. Mục tiêu của thiết kế đa đoạn này là mở rộng phổ kháng PSRV đối với nhiều chủng khác nhau.
59. 214 Lê Trần Bình T-35S XbaI (8965) delta-CP-Vn Dra I (8803) Pst I (9186) HindIII (1) P-NOS BamH I (8664) EcoR I (13) Pst I (8531) EcoRV (9) Pst I/Bgl II (322) CP-Vn EcoR I (8477) Pst I (510) Dra I (8062) NPTII Dra I (7822) Nco I (7726) NOS 3' GmHSP17.9-leader LB EcoR V (7554) P-E35S pMON65309 ori-V Pst I (7030) Sma I (6979) 9198 bp RB Pst I (6492 Spc/Str Pst I (5553) rop ori-322 Hình 8.4: Cấu trúc vector pBI121 Hình 8.5: Cấu trúc vector pMON65309 mang đoạn gen CP của chủng PSRV mang đoạn gen CP và một đoạn thu từ Tuyên Quang antisense của CP lắp đấu đầu vào nhau Kết luận về phân lập gen CP đu đủ 01. 16 mẫu lá đu đủ bị nhiễm PRSV thu từ các địa phương khác nhau đã được tách RNA tổng số và sàng lọc PRSV. Gen PRSVN (gen CP) đã được nhân dòng thành công, xác định trình tự. 02. So sánh với trình tự các gen CP khác trong ngân hàng gen, mức độ giống nhau từ 86,7% đến 96,8 %. Các mẫu PSRV của Việt Nam tập trung thành một nhóm riêng trên biểu đồ hình cây, ở gần với PSRV của Đài Loan và của Nhật Bản. 03. Gen PRSVN này đã được đưa vào vector chuyển gen pBI121 và pMON65309 và được biến nạp vào chủng Agrobacterium LBA 4404 để cho chuyển gen cho cây đu đủ. 8.3. Gen ACO oxydase và tính trạng chín chậm Quả đu đủ chín dưới tác động của các tác nhân nội và ngoại sinh khác nhau, trong đó vai trò của ethylen có tính quyết định. Ethylene là một loại hormone thực vật có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển trong thực vật bậc cao. Ethylene ảnh hưởng tới quá trình rụng hoa, lá, quả, sự già hóa, sự nảy mầm và
60. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 215 sự đáp ứng tới quá trình tổn thương, lạnh, hạn hán, sự mất nước và nhiễm bệnh (Abeles, 1992; Tempe et al., 1992). Ethylene có ảnh hưởng đặc biệt tới quá trình chín trong quả chín dấm. Trong quá trình quả chín, thông thường con đường tổng hợp ethylene điều khiển cả quả chín dấm và quả không dấm (Yu et al., 1980). Khi quả chín dấm và quả không chín dấm bị tổn thương đều tạo ra ethylene. Điều đó cho thấy trong quả có hai hệ thống tổng hợp ethylene. Hệ thống I đáp ứng sự tổn thương và hệ thống II liên quan tới sự tự động xúc tác, đây là đặc tính có ở quả chín dấm nhưng không có ở quả không chín dấm (Kuai, Dilley, 1992). Cả hai hệ thống này đều có thể xảy ra theo con đường tổng hợp ethylene ở quả chín dấm. Trong quá trình chín của quả chín dấm, ethylene được đề cập đến nhiều, nó có vai trò kích thích ngang bằng với nhiều yếu tố khác tương tự (Grierson, Schuch, 1992). Trong cà chua sự tổng hợp ethylene nội sinh được nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau của quá trình chín, cùng với những thay đổi về mặt sinh lý, ethylene đã được coi như là “sự bật” trong quá trình chín (Grierson et al., 1992). Con đường sinh tổng hợp ethylene đầu tiên được nghiên cứu ở quả táo. Con đường này được xem như điều khiển tất cả các quá trình tổng hợp có liên quan tới sản phẩm ethylene trong thực vật (Adam, Yang, 1979; Boller et al., 1979; Dong et al., 1992). Quá trình sinh tổng hợp ethylene ở quả đu đủ bắt đầu từ methionine. Thông qua methionine- adenosyl- transferase metiomine biến đổi thành S- adenosyl methionine (SAM); SAM được chuyển hóa thành 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC); cuối cùng ACC được ôxy hóa thông qua ACC oxydase (ACO) thành ethylen. Tốc độ chín của quả phụ thuộc nhiều vào khả năng sinh tổng hợp ethylen, đặc biệt là hoạt độ của ACO: Gen ACO được hoạt hóa mạnh biểu hiện nhiều ACO thì có nhiều ethylen được sinh tổng hợp làm cho quả chín nhanh. Công ty Zeneca phát minh ra nguyên lý dùng phản gen của ACO (ACO-antisense) là một đoạn gen ACO có trình tự nucleotide đảo ngược để ức chế quá trình biểu hiện của gen ACO, giảm tốc độ tổng hợp ra ethylen để quả chín chậm lại. Mức độ chín chậm phụ thuộc vào mức độ ức chế biểu hiện ACO.
61. 216 Lê Trần Bình Tính trạng chín chậm có giá trị rất lớn trong thương mại cho phép vận chuyển với thời gian kéo dài hơn, khoảng cách vận chuyển xa hơn và nhất là khi đưa vào siêu thị thì thời gian trên giá bán hàng của hoa quả cũng được kéo dài hơn. 8.4. Phân lập gen ACO từ quả đu đủ 8.4.1. Nguyên liệu Quả đu đủ được thu thập từ 3 giai đoạn: quả xanh, ương, chín của các giống được trồng ở Việt Nam bao gồm: các giống địa phương của Việt Nam và các giống nhập ngoại: Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Mexico. Bộ kit RT-PCR của hãng Tratagen (Mỹ). E. coli chủng DH5α được mua từ hãng Life Technologies (Mỹ). 8.4.2. Phương pháp nghiên cứu a) Tách chiết RNA tổng số RNA tổng số được tách chiết ở 3 giai đoạn xanh, ương, chín theo phương pháp của Katharina Pawloski và cộng sự (Katharian et al., 1994). Sau khi tách chiết RNA được kiểm tra bằng phương pháp quang phổ và chạy điện di trên gel agarose. Chất lượng RNA được phân tích bằng kỹ thuật lai Northern: 10 µg RNA được điện di trên gel agarose 1,5% trong đệm 1 × MOPS. RNA tổng số được chuyển lên màng nylon bằng dung dịch 5 × SSPE, 1% SDS, 5 × Denhard. RNA được lai với gen ACC oxidase của đu đủ có đánh dấu phóng xạ P32. Màng được rửa trong 0,2 × SSPE, 1% SDS, ở 65oC, sau đó được hiện phim. b) Nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR: RNA thông tin được bắt cặp với một đoạn mồi có chứa poly d(T) để tổng hợp nên sợi đầu tiên của cDNA, có sử dụng M-MuLV, oligo d(T), dNTP của hãng Tratagen. Dùng sản phẩm này làm sợi khuôn để nhân đoạn gen ACC oxidase. Chương trình nhiệt là: 42oC-1 phút 30 giây; 99oC-5 phút; 5oC-5 phút. Cặp mồi suy diễn được thiết kế dựa trên so sánh trình tự các axit amin có ký hiệu là VFO1 và VFO2 trình tự sau:
62. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 217 VFO1: 5’- GTGAATTCGCNTGYGAG-AAYTGGGGHTT- 3’ VFO2: 5’- TCGTCTAGAGYTCYTTN-GCYTGRAAYTT - 3’ Các hóa chất PCR được mua của hãng Perkin Elmer (Mỹ). Chương trình tổng hợp PCR là: 94oC-2 phút; (94oC-1 phút; 52oC-1 phút; 72oC-2 phút) lặp lại 43 chu kỳ; 72oC-10 phút. c) Tạo dòng phân tử cDNA: Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pCR2.1-TOPO của hãng Invitrogen. Sau đó plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào chủng E. coli DH5α. Tách chiết DNA plasmid và các kỹ thuật DNA tái tổ hợp được tiến hành theo Sambrook và cộng sự (Sambrook et al., 1989). d) Phân tích trình tự gen: Trình tự DNA được xác định theo phương pháp của Sanger đọc trên máy đọc trình tự gen ABI 377 và số liệu được phân tích trong chương trình Winstar. 8.4.3. Kết quả phân lập gen ACO a) Tách chiết RNA tổng số và phân tích Northern: RNA tổng số tách chiết từ 3 giai đoạn của quả: xanh, ương và chín. Tế bào mô quả đu đủ được nghiền trong một dung dịch gồm (SDS ở nồng độ cao) một tác nhân gây biến tính mạnh protein Na2EDTA, một chất khử (2-mecaptoethanol), DEPC loại chất có tác dụng ức chế hoạt động của RNAse nội bào và tách chiết protein liên kết khỏi phân tử RNA. Các protein cùng scharide được loại khỏi mẫu bằng xử lý: Phenol : chloroform : isoamyl (25 : 24 : 1) và được ly tâm. Quá trình loại DNA được tiến hành với LiCl 2 M trong dung dịch. Nếu nồng độ LiCl trong dung dịch cao hơn 2 M thì DNA cũng sẽ bị kết tủa nhưng nếu thấp hơn 2 M thì lượng RNA sẽ thu được ít hơn. Sản phẩm RNA tổng số được kiểm tra tiếp trên điện di agarose 1,5%. Từ kết quả cho thấy ARN tổng số được tách chiết từ quả đu đủ ở các giai đoạn xanh, ương, chín đều có hai băng chính là 28S và 18S. Qua điện di, đo quang phổ trên máy đo 8542A DIODE ARRAY spetrophotometer thu được phổ hấp thụ có tỷ lệ A260/A280 từ 1,8 đến 2. Do vậy RNA tổng số đủ điều kiện về nồng độ, sự nguyên vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo như Northern và tạo ngân hàng gen.
63. 218 Lê Trần Bình 1 2 3 4 5 6 7 8 kb 1 2 3 4 5 28S 18S 0,95 0,85 0,56 ∼ 800 bp Hình 8.8: Phổ điện di tách chiết Hình 8.9: Phổ điện di sản phẩm RNA tổng số từ quả đu đủ. 1, 2, 3: RT-PCR của gen ACC oxidase. 1: Đu đủ giống LS ở giai đoạn xanh; Chuẩn DNA λ (EcoRI và BamHI). ương và chín. 4, 5, 6: Đu đủ giống 2, 3, 4 : Sản phẩm PCR của LS1 Thái Lan ở giai đoạn xanh, ương giai đoạn xanh, ương và chín. 5: và chín. 7, 8: Đu đủ giống Đài Sản phẩm PCR của ER giai đoạn Loan ở giai đoạn xanh và ương chín Để xác định giai đoạn nào của quá trình chín quả xuất hiện gen ACC oxidase, và kích thước của gen, chúng tôi đã tiến hành phân tích RNA tổng số bằng phương pháp Northern sử dụng đoạn dò ACC oxidase có gắn phóng xạ P32. Kết quả hiện phim cho thấy RNA thông tin của gen ACC oxidase từ các giống cây đu đủ trồng ở Việt Nam có kích thước vào khoảng 1,4 kb tại các giai đoạn xanh, ương, chín. b) Kết quả nhân gen ACO: RNA thông tin có đặc điểm chung là cấu trúc poly A, do vậy dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung mà tạo ra đoạn mồi d(T)16 để chuyển thành cDNA nhờ enzyme Taq polymerase. Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi VFO1 và VFO2. Sản phẩm PCR của giống đu đủ Lạng Sơn (LS) được tiến hành kiểm tra trên gel agarose1%. Kết quả nhận được trên phổ điện di (hình 8.9.) c) Kết quả chọn dòng gen ACO: Sản phẩm PCR được tiến hành gắn với vector pCR2.1-TOPO. Sản phẩm ghép nối được biến nạp vào trong tế bào khả biến E. coli chủng DH5α cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50 µg/ml), ủ qua đêm ở 37oC. Các sản phẩm plasmid được kiểm tra bằng cắt enzyme hạn chế EcoRI và PCR sử dụng mồi VFO1 và VFO2 đều cho ra các băng có kích thước phân tử khoảng 0,8 kb. Chúng tôi thu nhận plasmid mang đoạn gen ACC oxidase tiến hành đọc trình tự gen trên máy ABI 377 (hình 8.10).
64. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 219 TGTGAATTCGCGTGCGAGAACTGGGGATTCTTTGAGCTGGTGAATCATGGGATCCCAATT 60 C E F A C E N W G F F E L V N H G I P I 20 GAGCTGCTGGACACTGTCGAAAGATTGACAAAAGGGCACTACAGAAGATGCATGGAGCAG 120 E L L D T V E R L T K G H Y R R C M E Q 40 AGATTCAAGGAAATAATGGCGAGCAAGGGCTTAGATGGTATCCAAACAGAGGTCACTGAT 180 R F K E I M A S K G L D G I Q T E V T D 60 ATGGACTGGGAAAGCACCTTTTTCATACGCCATCTCCCTGAGCCTAACATAGCTGAGATT 240 M D W E S T F F I R H L P E P N I A E I 80 CCAGATCTCGACGATGAATACAGGAAAGTGATGAAAGAATTTGCTCTGAAACTGGAGAAA 300 P D L D D E Y R K V M K E F A L K L E K 100 ATAGCAGAGGAGCTTCTTGATTTGTTATGCGAGAATCTCGGGCTGGAAAAAGGGTATTTG 360 I A E E L L D L L C E N L G L E K G Y L 120 AAAAAAGCATTTTACGGGTCAAGAGGTCCAACTTTCGGCACCAAAGTCAGCAACTACCCT 420 K K A F Y G S R G P T F G T K V S N Y P 140 CCATGCCCTAAACCAAACTTGATCAAAGGGCTCCGGGCACACACCGACGCCGGCGGCATC 480 P C P K P N L I K G L R A H T D A G G I 160 ATCTTGCTCTTCCAGGACGACAAAGTCAGCGGCCTCCAACTCCTCAAAGACGGCAAATGG 540 I L L F Q D D K V S G L Q L L K D G K W 180 GTTGATGTTCCACCAATGCGCCACTCCATTGTCGTCAACCTCGGCGACCAACTCGAGGTG 600 V D V P P M R H S I V V N L G D Q L E V 200 ATTACCAACGGGAAATACAAGAGCGTGGAGCACAGAGTGGTGGCACAAACCGACGGGACG 660 I T N G K Y K S V E H R V V A Q T D G T 220 AGGATGTCAATAGCTTCTTTCTACAACCCCGGAAGCGACGCCGTGATTTATCCGGCGCCG 720 R M S I A S F Y N P G S D A V I Y P A P 240 ATATTGGTGGAGAAAGAAACAGAGGAGAAGGAAACAGCGTACCCGAAATTCGTGTTCGAG 780 I L V E K E T E E K E T A Y P K F V F E 260 GATTACATGAAGCTGTATGCTGGGTTGAAATTCCAGGCGAAGGAACTCTAGACGA 835 D Y M K L Y A G L K F Q A K E L - T 278 Hình 8.10: Trình tự gen đoạn gen ACO của giống đu đủ LS2 Đoạn gen nhân được có độ dài là 835 bp ở cả giai đoạn chín và ương. Chúng tôi tiến hành so sánh trình tự gen ACC oxidase của giống LS trong ngân hàng gen EMBL. Kết quả nhận được độ tương đồng so với các gen ACC oxidase của các cây khác là từ 75- 96,7%. Trình tự tương đồng của gen đối với gen ACC của giống đu đủ Đài Loan từ vị trí 143 đến vị trí 966 là 96,7%. Kết luận về phân lập gen ACO 01. RNA tổng số của quả đu đủ ở các giai đoạn xanh, ương, chín được tách chiết với chất lượng tốt với chiều dài đoạn gen RNA thông tin có kích thước phân tử vào khoảng 1,4 kb ở tất cả các giai đoạn xanh, ương, chín của quả. 02. Bằng kỹ thuật RT-PCR đã nhân được một đoạn gen ACO từ RNA tổng số của giống LS Việt Nam có kích thước là 835 bp. 03. Đã tách dòng phân tử trong vector pCR2.1-TOPO và đọc trình tự đoạn gen ACO này. Đoạn gen ACO giống LS Việt Nam có độ tương đồng so với các gen ACO của các
65. 220 Lê Trần Bình giống cây khác trên thế giới từ 75-96,7%. Đặc biệt độ tương đồng với giống cây đu đủ Đài Loan là 96,7%. 8.5. Chuyển gen vào cây đu đủ 8.5.1. Xây dựng hệ thống tái sinh cây từ phôi soma a) Căn cứ khoa học: Các nghiên cứu chuyển gen có thành công hay không phụ thuộc vào mức độ tối ưu của hệ thống tái sinh cây từ nuôi cấy mô. Mô sẹo đu đủ chuyển gen lần đầu tiên được Pang và Sanford (1988) công bố, sau khi nuôi cộng sinh mảnh lá đu đủ với Agrobacterium tumefaciens, nhưng đã không thành công khi tái sinh cây. Sau đó, đã có nhiều công bố khác nhau về các hệ thống tái sinh cây hữu hiệu. Trước đây, cũng đã có một vài nhóm công bố tái sinh cây đu đủ từ phát sinh cơ quan (Arora, Singh, 1978; Litz et al., 1983) hoặc tạo phôi soma (De Bruijne et al., 1974; Yie, Liaw, 1977; Mehdi, Hogan, 1979; Chen et al., 1987; Chen, 1988b; Yamamoto, Tabata, 1989). Sau đó, Litz và Conover (1980, 1981, 1982, 1983), Jordan et al., (1982), Moore và Litz (1984), Chen và Kuo (1988), Chen (1988a), Manshardt và Wenslaff (1989a, 1989b), Chen et al., (1991) đã công bố tạo phôi soma tỷ lệ cao ở các giống đu đủ khác nhau. Bằng cách biến đổi các phương pháp của Litz và Conover (1981, 1982, 1983); Manshardt và Wenslaff (1989a), Fitch et al., (1990) đã tạo được phôi soma từ đỉnh chồi và rễ từ phôi hữu tính nuôi cấy. Các phần trụ dưới lá mầm của cây con in vitro cũng đã trở thành phôi trên môi trường cảm ứng. Lê Quỳnh Liên và cộng sự (2003) đã nghiên cứu tái sinh cây đu đủ giống Mexicô theo phương pháp tạo đa chồi, kết quả đã tạo được trung bình 6-8 chồi đơn trên một cụm chồi. Phương pháp này có ưu điểm là rút ngắn thời gian tái sinh cây, tuy nhiên hiệu quả chuyển gen thông qua đa chồi thấp và tạo ra nhiều thể khảm. Một số cây trồng chuyển gen đã được tạo ra từ protoplast (Toriyama et al., 1988, Zhang, Wu 1988), từ mặt lá (Horsch et al., 1985, McCormick et al., 1986, Hinchee et al., 1988), từ phôi soma (McGranahan et al., 1988). Tiếp theo những nghiên cứu chuyển gen thành công này, nhiều quy trình nuôi cấy mô tái sinh hiệu quả đã được phát triển ở nhiều loại cây trồng khác nhau như: lúa, thuốc lá, đỗ tương v.v Sanford (1990) đã sử dụng súng bắn gen để chuyển gen vào phôi đu đủ, Fitch và cộng sự (1990), Fitch (1991) đã sử
66. Chương 8. Chuyển gen ở cây ₫u ₫ủ 221 dụng A. tumefaciens để chuyển gen vào phôi soma tạo cây chuyển gen. Cây đu đủ chuyển gen kháng PRSV đầu tiên đã được phát triển ở những năm đầu 1990 (Roberto et al., 2001). Dòng cây chuyển gen mang gen CP từ dòng đột biến HA5-1 (Yeh, Gonsalves, 1984), được đặt tên là 55-1 kháng virus đốm vòng được phân lập ở Hawaii (Fitch et al., 1992). Rainbow và SunUp là hai giống đu đủ chuyển gen kháng PRSV đã được thương mại hóa lần đầu tiên trên thế giới (Gonsalves, 1998). Trong nghiên cứu này, một hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh từ phôi soma nuôi lỏng giống đu đủ Mexico sẽ được giới thiệu, hệ thống này nhằm phục vụ cho các nghiên cứu chuyển gen, tạo cây đu đủ kháng bệnh. b) Vật liệu thực vật: Vật liệu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu là giống đu đủ Mexicô đang được trồng phổ biến tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, mẫu quả đu đủ được thu tại huyện Lý Nhân, tỉnh Hà Nam. c) Môi trường nuôi cấy: Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo, môi trường nuôi lỏng, môi trường chín phôi, môi trường phôi nẩy mầm, môi trường tạo rễ được sử dụng trong nghiên cứu. Bảng 8.2: Thành phần các loại môi trường nuôi cấy Môi trường Thành phần Môi trường cảm 1/2 MS* + 60 g/l sucrose + 8 g/l agar + 2-12 mg/l 2,4-D ứng tạo mô sẹo (D) + 400 mg/l glutamin + 50 mg/l myo-inositol Môi trường nuôi 1/2 MS + 60 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1-3 mg/l 2,4-D + lỏng (M2) 400 mg/l glutamin + 50 mg/l myo-inositol Môi trường chín 1/2 MS + 60 g/l sucrose + 8 g/l agar + 400 mg/l phôi (CP) glutamin + 50 mg/l myo-inositol Môi trường nẩy 1/2 MS + 20 g/l sucrose + 8 g/l agar + 50 mg/l myo- mầm phôi (G) inositol + 0,1 mg/l kinetin + 0,4 mg/l BA Môi trường tạo rễ MS + 20 g/l sucrose + 8 g/l agar + 1 g/l axit casamino + (R) 0,1 mg/l NAA. * Môi trường cơ bản của Murashinge và Skoog (1962) d) Phương pháp tiến hành: Chọn quả đu đủ (khoảng 80-90 ngày sau khi thụ phấn), rửa bề mặt quả đu đủ bằng nước máy, khử trùng bề mặt quả đu đủ bằng cách ngâm trong 10% thuốc tẩy (5,25% NaClO) trong 30 phút, sau đó rửa quả 3 lần bằng nước cất đã khử trùng. Rửa bề mặt quả 3 lần bằng cồn tuyệt đối. Bổ quả đu đủ bằng