›
›

Giáo trình Sử dụng hóa sinh và đánh dấu phân tử

pdf 67 trang huongle 3320
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Sử dụng hóa sinh và đánh dấu phân tử", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_su_dung_hoa_sinh_va_danh_dau_phan_tu.pdf

Nội dung text: Giáo trình Sử dụng hóa sinh và đánh dấu phân tử

  1. Chöông 5.1 CAÙC COÂNG CUÏ: Söû duïng hoaù sinh vaø ñaùnh daáu phaân töû
  2. Giôùi thieäu ƒ Caùc yeáu toá moâi tröôøng coù theå laøm aûnh höôûng ñeán caùc ñaëc ñieåm veà hình thaùi ƒ Ñaùnh daáu phaân töû taäp trung vaøo vaät lieäu di truyeàn hoaëc caùc bieán dò ñöôïc kieåm tra bôûi caùc gen ƒ Ñaùnh daáu phaân töû ñöôc söû duïng cho ƒ Ño ñeám vaøi chæ soá cuûa ña daïng di truyeàn ƒ Baûn ñoà gen ƒ Choïn caùc vaät lieäu di truyeàn cho caùc chöông trình choïn gioáng
  3. Ñaùnh daáu phaân töû laø gì ? ƒ Ñaùnh daáu phaân töû ƒ Chuoãi DNA deã phaùt hieän vaø moät protein thöøa keá coù theå giaùm saùt ƒ Hieän töôïng ña hình trong protein ƒ Gioáng chöùa caùc protein ƒ Isozyme vaø allozyme ƒ Hieän töôïng ña hình trong DNA ƒ Nhaân ƒ Teá baøo chaát (Chloroplast DNA vaø Mitochondrial DNA)
  4. Söû duïng ñaùnh daáu phaân töû ñeå ño ñeám bieán dò di truyeàn ƒ Ñaùnh daáu döïa vaøo protein ƒ Cô sôû DNA ƒ Ñaùnh daáu döïa vaøo RFLP ƒ PCR ƒ RAPD ƒ Ghi vò trí caùc chuoãi ƒ AFLP ƒ Caùc kyõ thuaät ñieän di
  5. Ñaùnh daáu döïa treân protein ƒ Giôùi thieäu protein ƒ Gioáng chöùa caùc protein ƒ Isozyme vaø allozyme
  6. Caáu truùc cô baûn cuûa protein
  7. Gioáng chöùa caùc protein ƒ Taïi sao söû duïng protein chöùa trong haït gioáng ? ƒ Haït gioáng laø nguoàn chöùa protein phong phuù ƒ Protein coù saún veà soá löôïng ƒ Haït gioáng deã xaùc ñònh ñöôïc caùc giai ñoaïn phaùt trieån ƒ Phöông phaùp ƒ Trích protein (pH, acid) ƒ Taùch protein rieâng leõ theo phöông phaùp ñieän di (Polyacrynamide gel electrophoresis) ƒ Coù theå nhìn thaáy protein treân gel baèng caùch nhuoäm maøu (Coomassie blue, Imido black) ƒ Phaân tích caùc kieåu daõi
  8. Isozyme vaø allozyme ƒ Nhieàu hình daïng cuûa enzyme gioáng nhau ƒ Allozyme: Moät enzyme, moät gen locus ƒ Isozyme: Moät enzyme, nhieàu hôn moät gen locus ƒ Phöông phaùp ƒ Ngaâm caùc moâ trong moâi tröôøng ñeäm laïnh ƒ Taùch protein rieâng leõ theo pp ñieän di ƒ Ñònh vò enzyme baèng nhuoäm moâ hoaù hoïc ƒ Phaân tích caùc kieåu daõi
  9. Phaân tích caùc band ƒ Ñoàng hôïp töû hay dò hôïp töû ƒ Caáu truùc thöù tö cuûa enzyme ƒ Soá löôïng gen loci ƒ Soá nhieãm saéc theå ƒ Phaân tích di truyeàn ñoâi khi caàn thieát
  10. Ví duï
  11. ÑÑaaùnhùnh dadaáuáu treântreân côcô sôsôûû DNADNA
  12. DNA cô baûn
  13. Toång hôïp DNA
  14. Toå chöùc cuûa DNA
  15. Ñaùnh daáu döïa vaøo RFLP ƒ Ña hình caùc ñoaïn caét (Restriction Fragment Length Polymorphism – RFLP) goàm caùc böôùc: ƒ Taùch coâ laäp DNA ƒ Duøng caùc enzyme giôùi haïn ñeå caét thaønh caùc ñoaïn nhoû ƒ Taùch caùc ñoaïn caét cuûa DNA baèng gel ñieän di ƒ Chuyeån caùc DNA caét qua boä loïc ƒ Duøng caùc cöïc doø nhaûn phoùng xaï ñeå ñoïc DNA ƒ Phaân tích keát quaû
  16. Taùch caùc ñoaïn caét cuûa DNA baèng gel ñieän di
  17. Chuyeånå caùcù DNA caété qua boää loïcï
  18. Ví duï: RFLP cuûa Brassica
  19. Phaân tích keát quaû (single-Locus probes)
  20. Phaân tích keát quaû (Multi-Locus probes)
  21. Phaûn öùng chuoãi polymera Polymerase Chain Reaction (PCR) ƒ Kyõ thuaät trong sinh hoïc phaân töû maø moät ñoaïn DNA nhoû coù theå nhaân thaønh nhieàu baûn. ƒ Polymerase Chain Reaction (PCR) söû duïng moät enzyme ñöôïc bieát ñeán nhö laø polymerase ñeå nhanh choùng nhaân leân töø moät ñoaïn DNA nhoû maø mang caùc ñaëc ñieåm di truyeàn cuûa sinh vaät. ƒ Moãi chu kyø PCR goàm coù 3 pha: ƒ Pha 1: Laøm bieán tính cuûa DNA thoâng qua nhieät ñeå caùc sôïi taùch ra ƒ Pha 2: Nhieät ñoä cuûa hoãn hôïp ñöôïc haï thaáp ñeå cho caùc mieáng Primer gaén vaøo vôùi caùc DNA ñaõ taùch ra ƒ Pha 3: Söï truøng hôïp . Nhieät ñoä noùng leân ñeå polymerase enzyme sao cheùp nhanh DNA. ƒ Moãi chu kyø PCR nhaân ñoâi soá löôïng DNA, khoaûng 1 tæ baûn sao cuûa 1 ñoaïn DNA coù theå taïo neân trong vaøi giôø ƒ PCR ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh moät caù nhaân naøo ñoù töø moät ít moâ hoaëc maùu, ñeå chaån ñoaùn beänh di truyeàn vaø nghieân cöùu tieán hoaù
  22. PCR 94-960C 50-650C 720C Chu kyø laäp laïi töø 25 – 50 laàn
  23. Taùi toå hôïp DNA (Recombinant DNA) ƒ Enzyme giôùi haïn (restriction enzymes) coù trong vi khuaån coù nhieäm vuï nhö chieác keùo phaân töû ñeå caét caùc coät Phosphat cuûa phaân töû DNA ôû caùc chuoãi bazô cuï theå. ƒ Chuoãi DNA bò caét vôùi caùc enzyme giôùi haïn ñeå laïi 1 ñuoâi ñöôïc goïi laø ñieåm dính taän cuøng (sticky ends) do noù coù theå noái laïi vôùi caùc ñuoâi khaùc cuûa caùc maûnh vôõ cuûa DNA naøo ñoù. ƒ Caùc nhaø khoa hoïc lôïi duïng caùc enzyme giôùi haïn vaø ñieåm dính ñöôïc taïo ra bôûi enzyme ñeå thöïc hieän vieäc taùi toå hôïp kyõ thuaät DNA
  24. Polymerase Chain Reaction (PCR) VCD: DNA Structure and Replication
  25. Ñieän di gel (Gel electrophoresis) ƒ Kyõ thuaät PCR vaø taùi toå hôïp DNA taïo neân nhieàu ñoaõn DNA. Ñeå nghieân cöùu caáu truùc cuûa caùc ñoaïn naøy ngöôøi ta duøng phöông phaùp ñieän di gel ƒ Trong ñieän di gel, caùc restriction enzymes taùch caùc DNA nghieân cöùu thaønh nhöõng ñoaïn coù chieàu daøi khaùc nhau. Caùc dung dòch chöùa nhöïng ñoaïn naøy ñöôïc ñaët trong chaát gel daøy vaø cho doøng ñieän chaïy qua, moät ñaàu laø aâm moät ñaàu laø döông. Taát caû caùc ñoaïn haïn cheá baét ñaàu di chuyeån töø cöïc aâm sang cöïc döông. Nhöõng ñoaïn nhoû hôn di chuyeån nhanh hôn nhöõng ñoaïn lôùn hôn.Sau vaøi giôø ngaét doøng ñieän thì caùc ñoaïn DNA traõi suoát xuyeân qua chaát gel, caùc ñoaïn nhoû hôn thì gaàn phía cöïc döông. Söï phaân taùn caùc ñoaïn trình baøy 1 kieåu töông töï vôùi soïc maõ soá. Moãi soïc trong kieåu naøy chöùa caùc ñoaïn DNA cuûa 1 kích thöôùc naøo ñoù. Ngöôøi ta xaùc ñònh caùc ñoaïn giôùi haïn cuï theå baèng caùc vò trí cuûa noù treân gel. ƒ Moät chuoåi DNA boå sung coù theå ñöôïc duøng thaêm doø ñeå tìm kieám moät ñoaïn giôùi haïn trong gel maø coù chuoãi nucleotid coù lieân quan. ƒ Caùc nhaø khoa hoïc duøng caùc DNA thaáy ñöôïc trong maùu ñeå so saùnh DNA trong ñieän di gel ñeå so saùnh baèng chöùng cuûa toäi phaïm
  26. Öùng duïng ñaùnh daáu phaân töû trong laâm nghieäp
  27. Ñaùnh daáu phaân töû (Molecular markers) ƒ Ñaùnh daáu phaân töû laø caùc coâng cuï di truyeàn cho pheùp chuùng ta nghieân cöùu söï khaùc nhau giöõa caùc caù theå ôû nhieàu vò trí trong khoâng gian thoâng qua boä gen. Ñaùnh daáu ñöôïc söû duïng ñeå ghi ñaïi chæ caùc gen kieåm soaùt caùc tính traïng. Nhaän bieát vò trí cuûa caùc gen roài cho pheùp taùch vaø moâ taû theo quy luaät töï nhieân. Caùc daáu naøy cuõng cho caùc yù töôûng ñeå kieåm tra nghieân cöùu caùc moái quan heä trong giöõa caùc caù theå, caùc quaàn theå vaø phaân loaïi phaùt sinh loaøi. ƒ Ñaùnh daáu phaân töû thöôøng söû duïng trong laâm nghieäp laø: ƒ Ñieän di protein (Protein electrophoresis - Isozymes) ƒ Ña hình ñoä daøi caùc ñoaïn caét (restriction fragment length polymorphism – RFLP) ƒ Vi veä tinh (Simple sequence repeats - SSR or microsatellites), ƒ Ña hình DNA nhaân baûn ngaãu nhieân (Random amplified polymorphic DNA - RAPD), ƒ Ña hình chieàu daøi caùc ñoaïn DNA ñöôïc nhaân baûn (amplified fragment length polymorphism - AFLP) ƒ
  28. Theo Daniel Plat, 2004
  29. Moâ hình tính traïngï di truyeànà soáá löôïngï cuûaû 1 locus Caùc aûnh höôûng trung bình cuûa Caùc aûnh höôûng töông taùc giöõa caùc Allen A1 vaø A2 Allen A1 vaø A2 THEÂM VAØO ÖU THEÁ Theo Daniel Plat, 2004
  30. Moâ hình tính traïngï di truyeànà soáá löôïngï cuûaû 2 loci TöôngTöông taùc taùc trongtrong caùccaùc loci loci Theo Daniel Plat, 2004 Tính gen troäi
  31. PhaânPhaân ttííchch cacaùcùc locuslocus ttíínhnh tratraïngïng sosoáá llööôôïngïng (QTL(QTL Analysis)Analysis) Trong caùc loaøi caây, caùc baûn ñoà lieân keát raát thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh caùc vuøng nhieãm saéc theå moät caùch cuï theå maø kieåm tra tính traïng coù giaù trò kinh teá quan troïng nhö tình khaùng beänh, tæ troïng goã hay sinh tröôûng. Caùc tính traïng bieán ñoäng theo soá löôïng trong moãi loaøi caây vaø caùc vuøng ñöôïc xaùc ñònh ñöôïc goïi laø vò trí tính traïng soá löôïng (QTC).
  32. BaBaûnûn ññooàà lieânlieân kekeátát (Linkage Maps) ƒ Xaây döïng baûn ñoà gen laø moät coâng cuï maïnh vaø môùi trong nghieân cöùu di truyeàn khoâng nhöõng cho con ngöôøi nhöng cuõng cho caây noâng nghieäp, laâm nghieäp vaø ñoäng vaät. ƒ Baûn ñoà lieân keát gen cung caáp thoâng tin vò trí töông ñoái cuûa caùc gen caùc tính traïng theo caùc nhieãm saéc theå cuûa moät loaøi. Bôiû vì coù raát ít thoâng tin veà caùc gen cuï theå hay caùc tính traïng maø coù theå xaùc ñònh tröïc tieáp töø moät caây caù theå, chuùng ta söû duïng ñaùnh daáu phaân töû DNA nhö caùc baûng daãn ñöôøng cuøng vôùi baûn ñoà gen. ƒ Baûn ñoà ñöôïc phaùt trieån baèng caùch xeùt nghieäm moät soá DNA marker coù lieân quan maät thieát cuûa caùc caù theå. Moãi marker xaùc ñònh moät vò trí treân baûn ñoà goïi laø moät locus. ƒ Nhieàu baûn ñoà lieân keát cho moät loaøi caây kinh teá ñöôïc phaùt trieån ñeå xaùc ñònh vò trí tính traïng soá löôïng (QLT loci) vaø ñeå cung caáp cô baûn cho vieäc giuùp ñôû choïn löïa caùc marker. ƒ Vieäc ñaùnh daáu tính traïng coù tính thöông maïi caàn phaûi traûi qua vaøi naêm, choïn loïc ñaàu tieân laø duøng caùc ñaùnh daáu phaân töû ñeå cung caáp thay theá tính traïng haáp daãn hôn cho caây lai taïo.
  33. Caùc gen thích hôïp (Candidate Genes) ƒ Ngöôøi ta thöôøng bieät laäp moät soá gen maø aûnh höôûng ñeán caùc tính traïng naøo ñoù cuûa caây nhö söï ra hoa, phaùt trieån sôïi goã. Ngöôøi ta xaây döïng baûn ñoà caùc gen naøy vaø xaùc ñònh caùc gen thích hôïp maø cuøng vò trí vôùi QLT cho caùc tính traïng thöông maïi quan troïng. Leân baûn ñoà gen thích hôïp giuùp chuùng ta hieãu vai troø cuûa moät gen trong vieäc xaùc ñònh cuûa moät tính traïng vaø trong caûi thieän hieäu quûa cuûa vieäc lai taïo caùc tính traïng ƒ Vôùi Eucalyptus globulus ngöôøi ta ñaõ xaây döïng ñöôïc baûn ñoà cho 4 loaïi baïch ñaøn töông ñoàng cuûa gen thöïc vaät Arabidopsis , 4 gen naøy ñoùng vai troø trong vieäc toång hôïp vaùch teá baøo vaø 6 gen trong con ñöôøng toång hôïp sinh cuûa monolignol.
  34. CandidateCandidate GenesGenes Locus Full name 4CL 4-Coumarate:Coenzyme A ligase AGE1 Agamous homologue 1 AGE2 Agamous homologue 2 CCoAOMT Caffeoyl Coenzyme A O-methyltransferase CCR Cinnamoyl Coenzyme A reductase COMT Caffeate O-methyltransferase EAP1 Squamosa homologue ECA1 Cellulase homologue ECS1 Cellulose synthase homologue ELF1 Leafy homologue EXS1 Xylan synthase homologue 1 EXS2 Xylan synthase homologue 2 MsaS2 S-adenosyl-homocysteine hydrolase PAL Phenylalanine ammonia-lyase
  35. Primer sequences of 33 A. mangium microsatellite loci Name Primer sequences (5' - 3') Repeat motif(s) Dinucleotide microsatellites CCACCCGTTACCCATTTATG Am008 (TG)14 CCGTGATTGACTCTCAGCG TGAGTCGATCGCTTAGCTTG Am012 (TC)15(AC)7-(AC)10AG TCCCGTTATTATGCCAAAGTG GTACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2 Am014 CTGGTTGTTCGCTTATATGG (AT)3AC CACGGCTGTTATTTCCTTCG Am018 (AC)14 GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC GAGGTAATATTTTGAATTCCTTGAAC Am030 (AT)9(GT)15 GGTGTATACCTCTTTCCTGTGG TAGGCTAATGGTCATATTCCTAG Am041 (GT)36 AGAGATAGGGGTACACACTAAAAAAC CCCATTGCCGTTTCTTTG Am136 (CT)20 GCATTTCCCTTGGAACAGTC ACCCGGACGTATAGAAATAAATACA Am164 (TG)93 CGTGGAGGCAAGCAATATC TTGGATGTCAAGATTTTACGG Am173 (AC)18 CATTAGGCCACGTTTTGATAG GGACCAAACTTATGCAACACC Am326 (CA)20 GCATCAATGTACTAAACCATTTCC CCATTCGAGCATCCTAAGAG Am341 (CA)12(TA)2 CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA CCTCATGTCCTTGAATGTCAC Am352 (TTC)2TA(AC)14 GACTAACCCACAAGGAAGAGTTAC CGCAACTCCATCTGATTTACTG Am367 (A)7G(A)6GG(A)14,(CA)14 TTATGTTGGGTTAATACGCTAACTG CACAAGGAACTGAGCAATGG
  36. Microsatellites ƒ Microsatellites, hay Simple Sequence Repeats (SSRs), goàm nhieàu caëp laäp laïi töø 1 – 5 caëp motif ƒ Ña hình chieàu daøi trong chuoãi thöôøng xuaát hieän thoâng qua polymerase tröôït trong suoát quaù trình laäp laïi cuûa DNA, gia taêng hoaëc giaûm soá löôïng laëp motif baèng moät ñôn vò toång quaùt. ƒ Microsatellites coù chaát löôïng quan troïng maø chuùng taïo neân caùc phaân töû ñaùnh daáu mong muoán. ƒ Microsatellite markers thì bieán ñoäng cao hôn caùc marker khaùc. ƒ Taát caû caùc alleles trong moät caù theå coù theå thaáy ñöôïc maø khoâng phaûi tröôøng hôïp cho caùc marker troäi nhö trong RAPD. ƒ Microsatellites raát linh hoaït trong öùng duïng noù coù theå söû duïng ñeå phaùt hieän caùc khaùc bieät vaø bieán ñoåi di truyeàn trong caùc quaàn theå, xaùc ñònh söï lai taïo giöõa caùc loaøi, kieåu thuï phaán vaø phaùt taùn haït gioáng, cho pheùp phaân tích nguoàn goác cha vaø ñaùnh giaù lòch söû di truyeàn vöøa qua nhö quaàn theå coå chai. ƒ Ngöôøi ta duøng microsatellites ñaùnh daáu caùc caù theå vaø loaøi ñeå xaây döïng baûn ñoà gen cho phaân tích QTL vaø hoã trôï ñaùnh daáu choïn loïc.
  37. Theo Daniel Plat, 2004
  38. Details of dinucleotide microsatellite loci characterised from Eucalyptus nitens, E. globulus and E. sieberi Locus Repeat motif Primers (5' - 3') Size GAG CTG GAA ATG GAG CAG AC En6 (GA) 102 15 TCA ATT TTT GCC TCT CCC C ATC AAA TGG CTT TAG CTT TGT G En10 (GA) 135 10 CCC AGA GAC AAA CCG CTC GAA CGC CCA CCA CAA AAG AG En11 (GA) A 78 19 26 CTG AAT TCC TCC GAG CTC C CAG AAC CCA GCG GAG GA En12 (GA) 220 15 GGA AAC GCC AAT GTA GCT CT GCC AAA TTG ATG GTA GGC AT En13 (GA) 96 17 CCA GCA AAT TCA AAT TCA CA CCC AAG AAA TCA CCG AAA AC En14 (GA) 153 18 GCT GAC GGA GGA GGA GAT GT TCC TCG TGC TCA TAC TCA AA En15 (GA) 96 19 ATG GCT GGA AGT AAC CGA GA TTT CCT CTT CAC GCA CTC G En16 (CAGA) (GA) 140 3 35 CTC CCG GGC CCT GTA CGA CGT CAC AGT TAT GTG GG Eg24 (CT) 169 10 CCT GAG CTT TTG AAT ACG GG GGAAGAAATCAAACTGGACACC Es054 (CA) 104 13 TTTGCGACTACCATTTTCACC (TC) (AC) AATGCTGCTGTAGACGATGC Es076 19 4 157 AT(AC)15 AAGACAAATCAAGCAAGTCAGC (ACAT) (AC) ACAATGAAGGATGCAAGAAGC Es115 8 19 151 (AT)6 TATGGCTAACTTTTAGCTGGAACA GCTCATTGTACTGCACAGAGG Es140 (GT) (GA) 151 20 10 AAGGCACCAACAGTACCTGG ACCATCACGGCTTCGGAC Es157 (CT) 112 16 GGCATTATCGACCGAGGAAC GGGAGAGCTGATTGAGTAATTG Es211 (GA) 100 17 GCTGAGAATGGAAGCACATC TTTGCCATAGCGAAGTGTTG Es255 (GT) 98 12 GACCACTTACCAAACTCACCG AAATGAAGGGCCTCTTGAAAG Es266 (CT) 118 18 CGACGAGCCTACCTAATAAATTG
  39. Isozymes ƒ Ñieän di Isozyme laø moät kyõ thuaät trong phoøng thí nghieäm cho vieäc ñaùnh giaù bieán ñoäng protein trong thöïc vaø ñoäng vaät ƒ DNA khaùc nhau giöõa caùc caây caù theå, trong caùc gen maø maõ hoaù cho enzyme proteins daãn ñeán bieán ñoåi trong moät chuoãi amino acid vaø bieán ñoåi trong thay ñoåi nhieäm vuï cuûa phaân töû protein ƒ Moät ñieän tröôøng ñöôïc duøng ñeå taïo caùc protein di truù thoâng qua moät gel vaø naïp ñieän khaùc nhau nhö laø keát quaû thay ñoåi khaùc nhau. Vì vaäy bieán ñoåi gen ñöôïc thaáy caùc baêng nhö “chaäm” hay “nhanh” treân gel. ƒ Taàn soá baêng xuaát hieän ñöôïc duøùng ñeå moâ taû caây caù theå hoaëc quaàn theå thöïc vaät vaø coù theå duøng ñeå nghieân cöùu caùc moái quan heä trong phaân loaïi, ña daïng loaøi vaø caùc heä thoáng lai taïo hoaëc giaùm saùt caùc chöông trình caûi thieän gioáng caây ƒ Kyõ thuaät ñöôïc duøng nhö laø moät phöông phaùp ñôn giaûn, reõ cho vieäc ñaùnh giaù nhanh nhöng ñang ñöôïc thay theá nhöõng kyõ thuaät maïnh hôn ñeå ñeå ñaùnh giaù bieán ñoåi tröïc tieáp cuûa DNA.
  40. Theo Daniel Plat, 2004
  41. Theo Daniel Plat, 2004
  42. Theo Daniel Plat, 2004
  43. Theo Daniel Plat, 2004
  44. Theo Daniel Plat, 2004
  45. Theo Daniel Plat, 2004
  46. Theo Daniel Plat, 2004