GIáo trình Thành phần triterpen khung ursan phân lập từ rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) trồng ở Việt Nam

Nội dung text: GIáo trình Thành phần triterpen khung ursan phân lập từ rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) trồng ở Việt Nam

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 58-62 Thành phần triterpen khung ursan phân lập từ rễ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) trồng ở Việt Nam Nguyễn Hữu Tùng1,*, Vũ Đức Lợi1, Bùi Thanh Tùng1, Lê Quốc Hùng1,3, Hà Bá Tiến2, Trịnh Nam Trung2, Dương Thị Ly Hương1, Bùi Thị Xuân1, Nguyễn Thanh Hải1 1Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy, Hà Nội, Việt Nam 2Học viện Quân y, 160 Phùng Hưng, Hà Đông, Hà Nội, Việt Nam 3Viện Kiểm nghiệm Nghiên cứu Dược và Trang thiết bị y tế Quân đội-Bộ Quốc phòng, 1B Trần Thánh Tông, Hai Bà Trưng, Hà Nội, Việt Nam Tóm tắt Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) được trồngở Tây Bắc là một trong những cây thuốc quan trọng và có giá trị sử dụng cao. Trong chương trình nghiên cứu và phát triển dược liệu Tây Bắc, trên cơ sở sử dụng các phương pháp sắc kí đã phân lập được hai hợp chất triterpene năm vòng khung ursan từ rễ cây đan sâm thu hái ở Lào Cai. Câu trúc hóa học của hai hợp chất này được xác định là acid ursolic (1) và acid 2β-Hydroxypomolic (2) dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và cộng hưởng từ hạt nhân kết hợp so sánh với dữ liệu phổ được công bố trong tài liệu tham khảo. Đây là công bố đầu tiên về thành phần triterpen của cây đan sâm trồng ở Việt Nam. Nhận ngày 16 tháng 8 năm 2015, Chỉnh sửa ngày 10 tháng 9 năm 2015, Chấp nhận đăng ngày 05 tháng 12 năm 2016 Từ khóa: Đan sâm, Salvia miltiorrhiza, ursolic, 2β-Hydroxypomolic. 1. Đặt vấn đề* các mô thận khỏi thương tổn do bệnh đái đường gây ra, chống bệnh viêm và tổn thương tụy cấp Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge), còn tính, tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, và ức chế sự được gọi là huyết sâm, xích sâm là một loài phát triển của các tế bào ung thư ở người và thực vật sống lâu năm thuộc họ hoa môi HIV [4, 5]. (Lamiaceae) [1-3]. Đây là loài bản địa của Các nghiên cứu về thành phần hóa học chỉ Trung Quốc và được nhập nội vào nước ta [3]. ra rằng rễ cây đan sâm có chứa nhiều diterpene Trong y học cổ truyền, rễ đan sâm được sử khung abiatan hay còn gọi là các tanshinon như dụng để phòng và điều trị một số chứng bệnh là tanshinon IIA, cryptotanshinon, tanshinon I, liên quan tới tim mạch và đột quỵ như suy tim, có màu đỏ tạo nên mầu đặc trưng của đan tim hồi hộp, đau tức ngực, thấp khớp, viêm sâm và các acid phenolic hữu cơ phân cực như khới, thần kinh suy nhược, nhức đầu mất ngủ salvianolic acid A-E cùng một số thành phần và được dùng làm thuốc bổ. Các nghiên cứu khác bao gồm sterol, acid béo và polysaccharid khoa học hiện đại đã chứng minh đan sâm có [6, 7]. Cây Đan sâm ngày càng được trồng tác dụng ức chế sự phát triển của xơ gan, bảo vệ nhiều đặc biệt là các tỉnh Tây Bắc bao gồm Lào Cai, Hà Giang. Tuy nhiên, ở nước ta cho đến ___ * nay có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học Tác giả liên hệ. ĐT.: 84- 978745494 và tác dụng sinh học của dược liệu đan sâm di Email: tungnh.smp@vnu.edu.vn 58
2. N.H. Tùng và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 58-62 59 thực. Năm 2013, nhóm nghiên cứu Viện Dược đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, liệu lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa Damstadt, Đức). Phát hiện chất bằng đèn tử học rễ cây đan sâm di thực công bố phân lập và ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc xác định 3 thành phần tanshinon chính là dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % hơ tanshinon I, IIA và cryptotanshinon [8]. Năm nóng để phát hiện vết chất. 2014, nhóm nghiên cứu Ngô Quốc Luật và 2.3. Thiết bị, dụng cụ cộng sự nghiên cứu về thực vật học và khảo sát thành phần chất chính tanshinon IIA của đan Điểm nóng chảy được đo trên máy Stuart sâm thu hái ở các địa điểm khác nhau của Việt SMP3 (Sanyo, Nhật Bản). Phổ khối ion hóa Nam [9]. phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy Trong chương trình nghiên cứu và phát AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap triển dược liệu Tây Bắc, bước đầu nghiên cứu (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). Phổ cộng thành phần hoạt chất của đan sâm, chúng tôi đã hưởng từ hạt nhân một và hai chiều được đo phân lập được và xác định thêm hai thành phần trên máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản) và sử tanshinon là trijuganon B và dihydrotanshinon I dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn từ phân đoạn hữu cơ ít phân cực giàu tanshinon là tetramethylsilan (TMS). [10]. Tiếp tục nghiên cứu các phân đoạn phân 2.4. Chiết tách và phân lập chất cực hơn, chúng tôi đã phân lập được hai hợp chất triterpen khung ursan là acid ursolic (1) và Mẫu rễ đan sâm (1000 g) sau khi rửa sạch, acid 2β-hydroxypomolic (2). Theo đó, bài báo phơi khô, thái nhỏ được chiết kỹ bằng dung môi này trình bày về phân lập và xác định cấu trúc ethanol 80% 3 lần (mỗi lần 3 L) sử dụng thiết bị hóa học của hai hợp chất triterpen mới được chiết siêu âm ở 40 oC trong 5 giờ. Các dịch phân lập từ đan sâm trồng ở Lào Cai, Việt Nam. chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu cho 245 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 100 g cao chiết hòa tan trong nước cất (700 mL) và chiết 2.1. Đối tượng nghiên cứu phân bố bằng hexane và etyl axetat (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 700 mL). Các phân đoạn Mẫu cây đan sâm được thu hái vào tháng 10 hexane, etyl axetat được cất loại dung môi dưới năm 2014 tại huyện huyện Bắc Hà, tỉnh Lào áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng Cai, sau một năm trồng. Mẫu thực vật đã được hexane (5,2 g) và etyl axetat (33,8 g). Viện Dược liệu giám định tên khoa học là: Tiến hành phân đoạn dịch chiết etyl axetat Salvia miltiorrhiza Bunge., mẫu được lưu giữ (33,0 g) trên cột sắc ký silica gel (Φ85 mm × 90 tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. mm) với hệ dung môi có độ phân cực tăng dần 2.2. Dung môi, hóa chất bao gồm hexane-EtOAc (5:1→1:1, v/v, mỗi Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân phân đoạn 600 mL) và tiếp sau là CHCl3- lập như methanol (MeOH), n-hexan, ethyl MeOH (10:1→1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500 acetat (EtOAc), và dicloromethan (DCM) đều mL) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là F1~F7. đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất Từ phân đoạn F5 (8,3 g), chạy sắc ký cột lại trước khi dùng. Dung môi phân tích gồm silica gel (Φ45 mm × 350 mm) với hệ pha động CHCl3-MeOH (15:1, v/v, 2,5 L) thu được 6 MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O dùng để phân tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích.Pha phân đoạn nhỏ hơn là F5.1~F5.6. Tiếp theo, tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha tinh chế phân đoạn nhỏ F5.2 (815 mg) bằng sắc thường (0,040 - 0,063 mm, Nicalai Tesque Inc., ký cột pha đảo YMC C-18 sử dụng hệ dung môi Nhật Bản), YMC ODS-A (50μm, YMC Co. rửa giải MeOH-H2O (4:1, v/v, 2,0 L) thu được Ltd., Nhật Bản). Bản mỏng tráng sẵn trên đế hợp chất số 2 (48 mg). Phân đoạn F.5.2.4 được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel dùng hệ pha nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha
3. 60 N.H. Tùng và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 58-62 động là CHCl3-Etyl acetat (35:1, v/v) thu được (C-10), 24,6 (C-11), 126,0 (C-12), 138,7 (C-13), hợp chất 1 (53 mg). 42,1 (C-14), 28,4 (C-15), 24,6 (C-16), 48,3 (C-17), Hai hợp chất phân lập được (1 và 2) được 53,3 (C-18), 39,4 (C-19), 39,0 (C-20), 31,0 (C-21), xác định cấu trúc hóa học trên cơ sở các 37,3 (C-22), 28,4 (C-23), 15,6 (C-24), 15,8 (C-25), phương pháp hóa lý bao gồm phương pháp 17,1 (C-26), 23,7 (C-27), 181,1 (C-28), cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear 17,3 (C-29), 21,4 (C-30). Magnetic Resonance) và phổ khối MS (Mass Chất số 2 (acid 2β-Hydroxypomolic): Chất Spectroscopy). Cấu trúc hóa học của hai hợp bột màu trắng;[α]25 = 38o (c 0.6, CH OH); ESI- chất được minh họa trong hình 1. D 3 MS: m/z 489 [M + H]+; 1H NMR (400 MHz, 3. Kết quả và bàn luận CD3OD): δ 5,20 (1H, br s, H-12), 3,86 (1H, ddd, J = 11,2, 9,6, 4,0 Hz, H-2α), 3,23 (1H, d, 3.1. Tính chất vật lý và số liệu phổ của các chất J = 9,6 Hz, H-3α), 1,68 (3H, s), 1,45 (3H, s), phân lập được 1,28 (3H, s), 1,25 (3H, s), 0,98 (3H, s), 0,92 Chất số 1 (acid Ursolic): Chất bột màu (3H, s) (6 tín hiệu metyl bậc 3), 1.16 (3H, d, 13 o 25 o J = 4.0 Hz, H-30); C NMR (100 Hz, CD3OD): trắng; Mp 291 C;[α]D =64 (c 0,8, CH3OH); + δ 42,7 (C-1), 67,1 (C-2), 80,1 (C-3), 39,0 (C-4), ESI-MS: m/z 457 [M + H] ; 1H NMR (400 49,3 (C-5), 19,3 (C-6), 34,0 (C-7), 41,2 (C-8), MHz, CDCl3): δ 5,26 (1H, br s, H-12), 3,35 48,2 (C-9), 39,4 (C-10), 24,7 (C-11), 129,3 (1H, m, H-3), 1,27 (3H, s), 1,15 (3H, s), 1,08 (C-12), 140,0 (C-13), 43,1 (C-14), 29,2 (C-15), (3H, s), 0,98 (3H, s), 0,91 (3H, s), 0,78 (3H, 26,6 (C-16), 48,5 (C-17), 55,0 (C-18), 73,6 s) (các tín hiệu CH3), 0.88 (3H, d, J = 5,2 Hz, (C-19), 42,5 (C-20), 27,1 (C-21), 39,5 (C-22), 29-CH3), 0.76 (3H, d, J = 6,0 Hz, 30-CH3); 29,6 (C-23), 22,4 (C-24), 16,6 (C-25), 17,5 (C-26), 13C NMR (100 Hz, CDCl3): δ 39,0 (C-1), 24,9 (C-27), 182,3 (C-28), 27,3 (C-29), 16,9 27,1 (C-2), 79,1 (C-3), 39,1 (C-4), 55,8 (C-5), (C-30). 18,8 (C-6), 33,2 (C-7), 39,7 (C-8), 48,0 (C-9), 39,5 r Hình 1. Cấu trúc phân tử của acid ursolic (1) và acid 2β-hydroxypomolic (2). 3.2. Biện luận xác định công thức hóa học của triterpen khung ursane [11]. Phổ 13C NMR xuất các chất hiện tín hiệu cộng hưởng của một nhóm axit cacboxylic (COOH) tại δ 181,1 (C-28), hai olefin Hợp chất 1 thu được là chất bột màu trắng cacbon của nối đôi C-12/C-13 tại δ 126,0 (C-12) và được xác định cấu trúc dựa trên các hằng số và 138,7 (C-13) và một oxymethine cacbon tại δ vật lý, số liệu phổ khối và phổ cộng hưởng từ 79,1 (C-3). Kết hợp so sánh với số liệu phổ 13C hạt nhân 1H và 13C NMR trong phần 3.1. Phổ NMR, điểm chảy và độ quay cực của hợp chất 1 NMR của chất 1 mang đặc trưng của một với hợp chất ursolic acid thấy hoàn toàn phù hợp
4. N.H. Tùng và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 58-62 61 [12], cho phép xác định hợp chất 1 chính là Tài liệu tham khảo ursolic acid, một thành phần hóa học đã được công bố từ đan sâm nhưng lần đầu tiên phân lập [1] Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt được từ dược liệu này trồng ở nước ta. Nam, NXB Y học, 2001. Hợp chất 2 thu được ở dạng bột màu trắng. [2] Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Trên phổ ESI-MS của 2 xuất hiện peak ion tại NXB Y học, 2012. 489 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử là [3] Viện Dược liệu, Cây thuốc và động vật làm C H O .Phổ 1H NMR của 5 mang đặc điểm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ 30 48 5 thuật, 2004. đặc trưng của hợp chất triterpene khung ursane [4] Xu YY et al., Recent advance on research and với các tín hiệu của 6 nhóm methyl bậc 3 tại δ application of Salvia miltiorrhiza. Asian 1,68 (3H, s), 1,45 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,25 Journal of Pharmacodynamics and (3H, s), 0,98 (3H, s), 0,92 (3H, s) và một nhóm Pharmacokinetics 7 (2) (2007) 99. metyl bậc 2 đặc trưng δ 1,16 (3H, d, J = 4,0 Hz, [5] Wang BQ, Salvia miltiorrhiza: Chemical and H-30). Trên phổ cũng xác nhận sự có mặt của pharmacological review of a medicinal plant. một proton olefin tại δ 5,20 (1H, br s, H-12) và Journal of Medicinal Plants Research 4 (25) (2010) 2813. 2 proton oxymetin tại δ 3,86 (1H, ddd, J = 11,2, [6] Zhou L, Zuo Z, Chow MS, Dansen: An 9,6, 4,0 Hz, H-2α) và 3,23 (1H, d, J = 9,6 Hz, overview of its chemistry, pharmacology, H-3α). Phổ 13C-NMR của 2 xuất hiện 30 tín pharmacokinetics, and clinical use. The hiệu cacbon của khung triterpene C30, trong đó Journal of Clinical Pharmacology 45 (12) có một cacboxylic cacbon ở trường thấp δ 182,3 (2005) 1345. (28-COOH),2 olefin cacbon tại δ 129,3 (C-12), [7] Wang X, Morris-Natschke SL, Lee KH, New developments in the chemistry and biology of the 140,0 (C-13) đặc trưng của nối đôi C-12/C-13 bioactive constituents of Tanshen. Medicinal cùng với 2 oxymetin cacbon tại δ 67,1 (C-2) và Research Reviews 27 (1) (2007) 133. 80,1 (C-3) [11]. Từ những dữ kiện phổ trên kết [8] Phương Thiện Thương, Nguyễn Thị Kim An, hợp với so sánh số liệu phổ 1H và 13C NMR của Nguyễn Minh Khởi, Fumiaki Ito, Các 2β-hydroxypomolic acid được công bố trong tài tanshinon phân lập từ rễ cây đan sâm (Salvia liệu thấy hoàn toàn phù hợp [13]. Như vậy hợp miltiorrhiza Bunge) di thực và trồng ở Việt Nam, Tạp chí Dược học 53 (1) (2013) 44. chất 2 được xác định là 2β-hydroxypomolic [9] Ngô Quốc Luật, Trần Danh Việt, Đào Văn acid, đây là lần đầu tiên được phân lập được từ Núi, Nghiên cứu di thực cây đan sâm (Salvia đan sâm cũng như các loài thuộc chi Salvia. miltiorrhiza Bunge) tại Việt Nam, Tạp chí Dược học 54 (4) (2014) 687. [10] Nguyễn Hữu Tùng, Nguyễn Thanh Hải, Vũ Đức 4. Kết luận Lợi, Bùi Thanh Tùng, Nguyễn Tiến Vững, Bùi Hồng Cường, Một số hợp chất phân lập từ rễ cây Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng ở huyện các phương pháp phân tích phổ hiện đại, chúng Bắc Hà, tỉnh Lào Cai, Tạp chí Dược học 56 (4) tôi đã phân lập xác định cấu trúc phân tử của 2 (2016) 43. hợp chất triterpen năm vòng khung ursan là [11] Mahato S, Kundu A, 13C NMR spectra of acid ursolic (1) và acid 2β-hydroxypomolic (2). pentacyclic triterpenoids-a compilation and Đây là công bố đầu tiên về thành phần triterpen some salient features, Phytochemistry 37, (1994) 1517. có trong cây đan sâm trồng ở Việt Nam và hợp [12] Đinh Gia Thiện, Trần Văn Chiến, Nguyễn Thị chất 2 (acid 2β-hydroxypomolic) lần đầu tiên Hoàng Anh, Trần Văn Sung, Nghiên cứu phân lập được từ đan sâm cũng như chi Salvia. thành phần hóa học lá cây sơn trà Poilane (Eriobotrya poilanei J.E.Vid), họ hoa hồng Lời cảm ơn (Rosaceae), Tạp chí Hóa học 49 (2011) 223. [13] Cheng D., Cao X., Pomolic acid derivatives Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển from the root of Sanguisorba officinalis, khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) Phytochemistry 31 (4) (1992) 1317. trong đề tài mã số 106-YS.05-2015.05.
5. 62 N.H. Tùng và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 58-62 Triterpenen Ursan Frame Isolated from the Roots of Salvia Miltiorrhiza Bunge Growing in Vietnam Nguyen Huu Tung1, Vu Duc Loi1, Bui Thanh Tung1, Le Quoc Hung1,3, Ha Ba Tien2, Trinh Nam Trung2, Duong Thi Ly Huong2, Bui Thi Xuan1, Nguyen Thanh Hai1 1VNU School of Medicine and Pharmacy, 144 Xuan Thuy, Cau Giay, Hanoi, Vietnam 2Vietnam Militery Medical University, 160 Phung Hung, Ha Dong, Hanoi, Vietnam 3Military Institute of Drug Quality, Pharmaceutical Research and Medical Equipments, 1B Tran Thanh Tong, Hai Ba Trung, Hanoi, Vietnam Abstract: Danshen (Salvia miltiorrhiza Bunge) cultivated in the Northern West region of Vietnam is one of the most important and highly valuable medicinal plants. In our study course on medicinal materials of the Northern West region, using chromatography methods resulted in the isolation of two ursane-type pentacyclic triterpenes from the roots of danshen collected in Lao Cai. Their structures were identified as ursolic acid (1) và 2β-Hydroxypomolic acid (2) on the basis of spectroscopic data including mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectra together with comparison with those reported in the literature. This is the first report of triterpene components from danshen cultivated in Vietnam. Keywords: Salvia miltiorrhiza, ursolic acid, 2β-Hydroxypomolic acid.