Giáo trình Thực tập vi sinh vật chuyên ngành

Nội dung text: Giáo trình Thực tập vi sinh vật chuyên ngành

1. B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TR ƯNG ðI H C NƠNG NGHI P HÀ N I NGUY N XUÂN THÀNH (Ch biên) V Ũ TH HỒN NGUY N TH BÌNH - ðINH H NG DUYÊN Ch biên & hi u đính PGS.TS NGUY ỄN XUÂN THÀNH TH C T P VI SINH V T Chuyªn ngµnh Hà N i - 2007 Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 1
2. MC L C Ni dung Trang Bài s 1: Trang thi t b c n thi t trong nghiên c u vi sinh v t 1 Bài s 2: Ph ươ ng pháp c đnh tiêu b n và nhu m t bào vi sinh v t 12 Bài s 3: Chu n b d ng c và mơi tr ưng nuơi c y vi sinh v t 16 Bài s 4: Nuơi c y vi sinh v t 26 Bài s 5: Ph ươ ng pháp l y m u đ phân tích vi sinh v t 31 Bài s 6: Ph ươ ng pháp phân tích vi sinh v t 33 Bài s 7: ðánh giá đc tính sinh h c c a vi sinh v t 37 Bài s 8: Phân l p tuy n ch n Azotobacter t đt 40 Bài s 9: Ph ươ ng pháp l y m u và phân lp tuy n ch n vi khu n 42 Rhizobium Bài s 10: Ph ươ ng pháp xác đnh nhanh trao đi ch t vi sinh v t 46 Bài s 11: Vi sinh v t trong mơi tr ưng 50 Bài s 12: Ph ươ ng pháp xác đnh n m men, n m m c, t o và 53 nguyên sinh đng v t Bài s 13: Quá trình chuy n hố nit ơ d ưi tác d ng c a vi sinh v t 60 Bài s 14: Chuy n hố l ưu hu ỳnh d ưi tác d ng c a vi sinh v t 63 Bài s 15: Vi sinh v t phân gi i lân (phospho) 65 Bài s 16: Enzym trong quá trình trao đi nit ơ, phospho, l ưu hu ỳnh 67 Bài s 17: Xác đnh sinh kh i vi sinh v t đt 75 Bài s 18: Sinh tr ưng c a vi sinh v t 83 Bài s 19: Th ăm quan ki n t p v vi sinh v t 86 Ph l c 88 Tài li u tham kh o 91 Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 2
3. Bài s 1 TRANG THI T B C N THI T TRONG NGHIÊN C U VI SINH V T Mc đích yêu c u: + N m đưc nh ng máy mĩc, trang thi t b c n thi t trong nghiên c u v vi sinh v t. + Bi t s d ng thành th o m t s máy mĩc thơng d ng c a phịng nghiên c u. + Hi u đưc t m quan tr ng c a cơng tác tiêu đc, kh trùng. + S d ng thành th o kính hi n vi + Phân bi t các d ng hình thái c a vi sinh v t Ni dung : + Gi i thi u nh ng trang thi t b c n thi t trong phịng nghiên c u vi sinh v t. + Gi i thi u các d ng c và nguyên li u c n thi t đ nghiên c u vi sinh vt: d ng c l c, kh trùng, d ng c quang h c, d ng c đo lưng, mơi tr ưng nuơi c y. + Thao tác v n hành và s d ng các trang thi t b trong phịng nghiên c u vi sinh v t + C u t o và s d ng, b o qu n kính hi n vi + Quan sát hình thái vi sinh v t I. MÁY MĨC 1. T nuơi c y vi sinh v t (Incubator) T nuơi c y hay cịn g i là t đ nh ơn là thi t b quan tr ng dùng trong cơng tác nghiên c u vi sinh v t, vì nhi t đ trong t cĩ th thay đ i t 0 0 – 90 0 C tu ỳ theo ý mu n c a ng ưi nghiên c u và nhi t đ trong t sau khi đã đưc xác đ nh thì luơn luơn tr ng thái n đ nh trong su t th i gian nuơi c y. 1.1. C u t o Cu t o v t nuơi c y cĩ 2 l p: l p trong là kim lo i d n nhi t đ gi nhi t đ bên trong c a t , l p ngồi là kim lo i dày h ơn và đưc b c phía trong b i mt ch t cách nhi t (amiant). Gi a l p trong và l p ngồi là kho ng tr ng đ gi cho nhi t đ trong t ít b bi n đ i. Trong t cĩ b ph n c m nhi t đ báo nhi t đ lên xu ng cho r ơ-le ho t đng và qu t giĩ đưc l p ph n gi a thân đ điu hồ nhi t đ bên trong. Ph n ngồi t nuơi cĩ h th ng b ng đin t đ điu ch nh nhi t đ theo yêu c u c a nghiên c u. Phía trên t đưc l p van an tồn, n u nhi t đ trong t vưt quá dao đ ng biên đ, van an tồn s t ng t. 1.2. Cách s d ng ðĩng m ch đin, b m nút m cơng t c t (cĩ th gi vài giây đn khi xu t hi n đèn báo trên b ng đin t ). Sau đĩ b m nút đ t nhi t đ và th i gian (set up) theo yêu c u nuơi c y, điu ch nh nhi t đ và th i gian b ng n nút t ươ ng Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 1
4. ng m ũi tên lên ho c xu ng. Nhi t đ trong t m t ăng d n và đt t i nhi t đ đã xác đnh. Nhi t đ s đưc duy trì trong su t th i gian nuơi c y đã đnh s n. Trên bng đin t luơn xu t hi n ch s báo nhi t đ th c t trong t . Khi đ th i gian nuơi c y, t s phát ra ti ng báo hi u và r ơ le t ng t đ t đ ng t t ch đ làm vi c. Nu mu n nuơi c y liên t c lâu dài cĩ th khơng c n đ t ch đ th i gian, ch đ t nhi t đ . Khi nào mu n k t thúc thì b m nút t t cơng t c ngu n. 1.3. Khi s d ng máy c n chú ý nh ng đim sau đây + Hi u ch nh thi t b tr ưc khi s d ng. + Ph i n i t v i dây đ t và ki m tra đin th c a máy v i đin th n ơi đt máy xem cĩ gi ng nhau khơng, tr ưng h p khơng gi ng nhau ph i dùng bi n th . + Khi s d ng t m l n đ u, ph i ki m tra b ph n điu ch nh nhi t đ xem cĩ chính xác khơng, nhi t đ trong t cĩ đ u khơng. + C a t luơn luơn ph i đĩng kín, tr khi l y ho c cho nguyên li u vào nuơi c y nh ưng c ũng khơng đưc m c a t r ng và lâu. + Luơn luơn ph i đ m b o cho t m đưc khơ ráo, s ch s , ph i cho t ho t đ ng th ưng xuyên nh t là nh ng hơm tr i m. Khi làm đ các ch t d ch nuơi c y ho c làm b n trong t , ph i lau chùi và sát trùng ngay. + Nên đt trong t 1 c c n ưc vơ trùng trong quá trình nuơi c y đ giúp cho qu t giĩ ho t đ ng t t. + Khi khơng dùng, t t cơng t c đin và rút phích c m đin ra. 2. T s y khơ (Drying oven) 2.1. Tác d ng Dùng t s y khơ đ kh trùng các d ng c th y tinh, đ s nh ư ng nghi m, xi lanh, h p l ng, c c, ph u, c i ch y s , các đ kim khí nh ư dao, kéo, panh và các d ng c khác khơng cĩ n ưc khác nh ư bơng, b ăng, v i Tr v t li u làm t cao su và mơi tr ưng nuơi c y khơng đưc kh trùng b ng t s y khơ. Nguyên lý c u t o c a t s y khơ c ũng g n gi ng nh ư t m, ch khác là cĩ th ti t trùng nhi t đ 175 - 200 o C. 2.2. Cách s d ng t s y khơ Các d ng c ph i r a s ch, đ khơ, bao gĩi c n th n tr ưc khi cho vào t , sau khi s p x p các th vào trong t r i đĩng kín c a và đĩng các l thơng khí. B t cơng tc đin, đ t ch đ làm vi c cho t ( điu ch nh nhi t đ và th i gian gi ng nh ư v i t đ nh ơn). Thơng th ưng d ng c nuơi c y và phân tích vi sinh v t đưc kh trùng 160-180 oC trong 2 gi . V i các d ng c , nh ư: pipét, xi lanh, khơng đưc s y quá 60 oC vì nhi t đ cao làm giãn n thu tinh d n đ n m t đ chính xác c a d ng c. L ưu ý khi s y khơng nên đt d ng c sát thành t vì đ y nhi t đ th ưng cao Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 2
5. hơn nhi u d làm cháy gi y gĩi ho c nút bơng, c ũng khơng nên x p d ng c quá khít nhau đ khơng khí cĩ th l ưu thơng đưc và làm nĩng đu các v t c n kh trùng. Sau khi ng t m ch đin, ch nhi t đ h d n xu ng b ng nhi t đ phịng thì mi đuc m c a t đ l y d ng c s y ra. D ng c l y ra ph i đ trên giá g , trên gi y ho c v i, khơng đưc đ trên g ch men, trên sàn g ch ho c sàn xi măng vì d ng c đang nĩng g p l nh s d v và làm nh h ưng đ n tính vơ trùng ca d ng c . 3. N i h p h ơi n ưc cao áp (Autoclave) 3.1. Nguyên lý Ni h p h ơi n ưc cao áp (hình 1) làm b ng kim lo i ch u đưc nhi t đ cao (ít nh t là 135 o C) cĩ th dùng đin, dùng c i ho c dùng than đun cho n ưc sơi, hơi n ưc s nén d n l i trong n i và n u ti p t c đ cho n ưc sơi thì áp l c trong n i s t ăng d n, áp l c càng t ăng thì nhi t đ c a h ơi n ưc trong n i càng cao, nh ư v y gi a nhi t đ t 0 c a h ơi n ưc và áp l c P c a nĩ cĩ liên quan v i nhau, nh ưng khơng ph i theo m t t l đưng th ng (xem đ th ). Khi áp l c k ch s 0 cĩ ngh ĩa là: áp l c P trong n i h p = áp l c P khơng khí. Cho nên khi áp l c k ch 1kg/cm 2 thì chính là ch hi u s gi a áp l c bên trong v i áp l c khơng khí t n t i trong n i. 1kg/cm 2 = P (trong n i) - P (khơng khí trong n i) Do đĩ áp l c P trong n i khơng phù h p v i P áp l c k hay nĩi m t cách khác, nhi t đ trong n i khơng t ươ ng ng v i nhi t đ c a áp l c k . Vì v y mu n cho nhi t đ trong n i phù h p v i áp l c k thì ph i lo i b h t khơng khí trong n i ra (1kg/cm 2 = 1atm = 1 phoud). Bng 1. So sánh m i liên quan gi a áp su t ghi trên áp k c a n i h p bi u th b ng atmosphere và nhi t đ trong n i đã lo i h t khơng khí Áp Nhi t Áp Nhi t Áp Nhi t Áp Nhi t su t đ ( oC) su t đ ( oC) su t đ ( oC) su t đ ( oC) (atm) (atm) (atm) (atm) 0,0 100,0 0,5 112,5 1,0 121,0 1,5 127,0 0,1 102,5 0,6 114,5 1,1 129,9 1,6 128,0 0,2 105,0 0,7 116, 1,2 124,0 1,7 129,0 0,3 107,5 0,8 117,0 1,3 125,0 1,8 130,0 0,4 110,0 0,9 119,0 1,4 126,0 1,9 131,0 2,0 132,0 Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 3
6. Hình 1. S ơ đ n i h p áp l c ð lo i b h t khơng khí trong n i ra cĩ 2 cách: a) ðĩng khĩa thốt h ơi đ t ăng áp l c trong n i lên đn kho ng 0,3 atm ri xì cho thốt h t h ơi ra, sau đĩ khĩa l i và cho t ăng áp l c. b) M khĩa thốt h ơi và đun cho đn khi h ơi n ưc b t đ u thốt ra thành mt lu ng h ơi tr ng khá m nh, khá đ u thì đĩng l i và cho t ăng áp l c. 3.2. Cách s d ng n i h p cao áp - ð n ưc vào n i h p v i l ưng v a đ (xem v ch ngang ghi trên ng th y tinh ho c bình ch a l p bên ngồi n i h p). Chú ý n ưc ph i ng p dây may so trong n i n u là n i h p xách tay. - Các d ng c đem h p ph i đưc bao gĩi k , đ i v i các bình và ng mơi tr ưng cĩ nút bơng ph i b c b ng gi y d u ho c gi y nhơm đ tránh h ơi n ưc đng làm ưt nút. - Khi s p x p d ng c vào n i h p khơng nên đ sát nhau quá, đ v t n ng xu ng d ưi v t nh lên trên. - ðy n p, khĩa ch t các c theo t ng đơi đ i x ng nhau đ kh i vênh, kh i h , khi tháo khĩa c ũng ph i làm nh ư v y. ðĩng van điu áp và van x h ơi. - M m ch đin ho c đ t nhiên li u đ cung c p nhi t cho n i, n nút m cơng t c n i (nút on), đ t ch đ làm vi c (nhi t đ và th i gian h p) cho n i Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 4
7. bng cách điu ch nh m ũi tên lên xu ng. Ch đ làm vi c luơn th hi n trên bng ghi đin t . Sau khi h p đ theo nhi t đ và th i gian đ nh s n, r ơ le s t ng t, n i phát ra ti ng kêu báo hi u quá trình h p đã k t thúc. Vi n i h p xách tay ph i luơn luơn cĩ m t đ theo dõi kim ch áp l c trên đng h áp l c k trong khi h p, lo i h t khơng khí trong n i theo 2 ph ươ ng pháp đã nêu trên. Khi đt t i m c c n thi t thì điu ch nh ngu n nhi t đ duy trì áp l c khơng đ i trong m t kho ng th i gian c n thi t. Nhi t đ và th i gian h p kh trùng ph thu c vào v t đem kh trùng và mc đích nghiên c u. Ng ưi ta th ưng h p nhi t đ 121 oC trong kho ng 20 phút thì nha bào c a m t s lo i vi khu n c ũng s b tiêu di t. - Khi đt t i th i gian c n thi t thì ng t đin ( n nút off) ho c rút h t nhiên li u ra và đi cho áp l c h d n xu ng 0 o C, nhi t đ trong n i gi m h n ri m i đưc m n p l y d ng c đã kh trùng ra. Chú ý tránh h áp l c đ t ng t b ng cách m van xì h ơi ra quá m nh s làm r n n t ho c v d ng c . Cũng khơng nên đ n i h p ngu i l nh m i l y d ng c ra, vì lúc này n p n i s mút ch t vào mi ng đ m cao su r t khĩ m . - Các d ng c l y ra khơng đưc đ n n g ch men, n n đá, n n xi m ăng (vì dng c đang nĩng g p l nh s v , n t) và đm bào tính vơ trùng cho d ng c . 4. T l nh (Freezer) T l nh là m t thi t b quan tr ng dùng đ gi và b o qu n gi ng vi khu n, virus và b o qu n các lo i huy t thanh, các lo i vacxin, các mơi tr ưng dùng đ nuơi c y T l nh 0 o- 4 o C dùng đ gi gi ng vi khu n. T l nh -15 o C đn -30 o C dùng đ gi gi ng virus. 5. Máy ly tâm (Centrifugal machine) 5.1. Cơng d ng - T p trung đáy ng các ph n t c n nghiên c u ch a trong m t b nh ph m hay ch t mang. - T p trung vi khu n nuơi c y trong mơi tr ưng l ng đ tách riêng vi khu n. - Làm trong m t ch t l ng ch a nhi u ph n t đ c v n đ c. - Tách h ng c u riêng v i huy t t ươ ng . 5.2. Cách s d ng Máy ly tâm thơng th ưng cĩ m t tr c quay trịn, v phía trên c a tr c cĩ mt hình sao đ nh n các ng ch a ch t l ng c n ly tâm. Các ng này đưc mĩc vào sao b ng m t cái quai. Khi quay các ng s giãn ra th ng gĩc v i tr c quay đng và các h t l ng xu ng theo đưng tr c c a ng và d n v phía đáy. V i ki u máy này, t c đ t i đa là 4500 - 6000 vịng trong m t phút. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 5
8. Các máy ly tâm g n đây cĩ b ph n th ăng b ng t đ ng, cĩ máy đ th i gian t đ ng, cĩ đ ng h ch t c đ v.v , khi ly tâm ch c n v n các nút theo ý mu n. 6. Nh ng thi t b c n thi t khác - Máy hút chân khơng (vacuum gauge) - Máy đm khu n l c (colony counting) - Máy đo pH (pH meter) hay thang đo pH (pH paper set) - Máy c t n ưc (Deionizers) - Máy đánh m u (Mixers) - Máy đm t bào (cell counting) - Máy l c (shaker) - Phịng ho c bu ng vơ trùng (clean bench, laminars) II. CÁC D NG C VÀ THI T B PHỊNG THÍ NGHI M 1. Thi t b quang h c - Kính hi n vi quang h c (Microscopy) - Kính hi n vi ch p nh - ðèn soi kính hi n vi - T quang n n đen - Th ưc đo v t kính và th ưc đo th kính - Kính lúp hai m t đeo trán - Máy projector - Máy Over head - Máy nh - ðèn t ngo i (UV lamp) 2. Thi t b đo l ưng - Cân k thu t (technical balance) - Cân ti u ly cĩ l ng kính - Cân ti u ly xách tay - Cân bàn - Cân phân tích đin - Nhi t k treo t ưng và các lo i nhi t k đo nhi t đ khác - ðng h đin t đ m phút, giây 3. Các lo i d ng c khác - Các lo i d ng c th y tinh: Phi n kính, h p l ng, ng nghi m, l , bình, ph u, c c ng đong, xi lanh, pipet, que g t, đèn c n Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 6
9. - Các lo i d ng c kim lo i: Dao m các loi, kéo th ng, kéo cong, panh, que c y, đèn xì, h p tiêu đc, c ưa x ươ ng - Các lo i d ng c đ men, s : Khay men, c i chày s , xoong n i đ pha ch mơi tr ưng. - Các lo i d ng c cao su, v i, bơng, b ăng: G ăng tay đ m và đ r a dng c , ng, bơng th m nưc, bơng khơng th m n ưc, v i g c, v i l c, v i màn. - Các lo i hĩa ch t đ ch mơi tr ưng, r a d ng c th y tinh và sát trùng tiêu đc. - Các lo i thu c nhu m và thu c th ph n ng sinh hĩa. - Các lo i gi ng vi khu n và virus, các lo i kháng huy t thanh đ ch n đốn, các lo i khu n t đ ch n đốn. III. KÍNH HI N VI Kính hi n vi là m t d ng c quang h c r t c n thi t đ nghiên c u hình thái vi sinh v t và nghiên c u nh ng v t h t s c nh mà m t th ưng khơng th nhìn th y đưc, cĩ nhi u lo i kính hi n vi khác nhau. * C u t o kính hi n vi quang h c Kính hi n vi quang h c g m cĩ 2 b ph n: 1. B ph n c ơ h c 1.1 Chân kính hay đ kính Dùng đ đ kính hi n vi tr ng thái cân b ng, c u t o t kim khí đ c bi t. 1.2 Thân kính Ni li n v i chân kính, đưc t o t lo i kim khí đc bi t. Thân kính đ g n tồn b các b ph n c a kính hi n vi. 1.3 ng kính Là m t ng kim khí r ng hình tr l p trên tr kính, đ u trên c a ng kính l p th kính, phía d ưi c a ng kính là bàn xoay dùng đ l p các v t kính. Tác d ng ca ng kính là khi v t nh đưc phĩng đ i l n th nh t b i v t kính, thì đư a v t nh qua ng kính t i th kính đ phĩng v t nh l n th 2. Nh ư v y v t nh ta quan sát th y chính là nh o. 1.4 Khay kính hay đĩa kính Cĩ th hình vuơng hay hình trịn là n ơi đt tiêu b n đ quan sát, gi a cĩ l th u quang đ đưa ánh sáng t b t quang kính lên tiêu b n. Trên khay kính cĩ b ph n k p tiêu b n cho v ng và b ph n g i là xa đ di chuy n tiêu b n theo hai chi u khác nhau, t trái sang ph i, t tr ưc ra sau và ng ưc l i đ tìm v t nh. Ngồi ra, khay kính cịn cĩ th di chuy n theo các chi u b ng cách v n hai c hai bên khay kính. 1.5 c điu ch nh Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 7
10. Gm cĩ c điu ch nh l n ( c s ơ c p) và c điu ch nh nh ( c vi c p). c s ơ c p dùng đ điu ch nh tiêu đim, c vi c p dùng đ điu ch nh cho nh v t rõ nét. 2. B ph n quang h c: 2.1. G ươ ng ph n chi u ðt phía d ưi khay kính g m cĩ hai m t, m t m t ph ng và m t m t lõm, dùng đ l y ánh sáng. 2.2. T quang kính ðưc l p vào phía d ưi khay kính b i m t c c đ nh, dùng đ t p trung ánh sáng vào tiêu b n. 2.3. B ph n ch n sáng Cĩ hình gi ng nh ư con ng ươ i đt phía d ưi t quang kính cĩ th m r ng hay h p dùng đ điu hịa ánh sáng vào tiêu b n. 2.4. V t kính Là m t h th ng quang h c r t quan tr ng và ph c t p, g m m t s th u kính, nĩ tr c ti p phĩng đ i nh th t c a v t xem, kh n ăng phĩng đ i c a v t kính ph thu c vào tiêu c t c là ph thu c vào bán kính cong c a th u kính; th u kính càng cong, tiêu c càng ng n thì kh n ăng phĩng đ i càng l n. V t kính khi dùng đưc l p vào bàn xoay phía d ưi ng kính. Cĩ hai lo i v t kính: + Vt kính khơ: là v t kính cĩ đ phĩng đ i th p x8; x20; x40; dùng đ xem t ươ i, xem vi khu n di đ ng, xem khu n l c, hay xem ký sinh trùng ho c xem các tiêu b n t ch c + Vt kính d u: là v t kính cĩ đ phĩng đ i cao x 90; x100; x 120 , nĩ cĩ m t vịng khác màu đ u v t kính đ phân bi t v i v t kính khơ. Vt kính khơ và v t kính d u khác nhau ch t mà ánh sáng ph i đi qua tiêu b n (phi n kính) và v t kính. v t kính khơ ch t đi qua là khơng khí mà ch s khúc x (chi t xu t) c a khơng khí là n = 1 r t khác v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52; do đĩ các tia sáng khi ra kh i tiêu b n s b ph n x và ph n ngồi c a chùm ánh sáng khơng l t đưc vào v t kính. v t kính cĩ đ phĩng đ i ln ng ưi ta dùng d u b ch h ươ ng (huile de cèdre) cĩ ch s khúc x n =1,51 x p x v i ch s khúc x c a th y tinh n = 1,52 đt vào gi a tiêu b n và v t kính. Lúc này th y tinh và d u b ch h ươ ng là m t mơi tr ưng g n nh ư đng nh t, nên ánh sáng khi đi qua th y tinh s khơng b khúc x mà chi u th ng vào v t kính. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 8
11. Tiêu đim Tia sáng T quang kính 2.5. Th kính Gm cĩ hai th u kính l p vào hai đu c a m t cái ng nh l p trên đu ng kính, m t th u kính h ưng v m t ng ưi xem và m t th u kính h ưng v v t quan sát, kính trên là kính phĩng đi nh th t do v t kính thu đưc, kính d ưi là kính th tr ưng làm sáng t th tr ưng do đĩ mà ta nhìn th y rõ nh đưc phĩng đ i. Th kính cĩ đ phĩng đ i càng cao thì kho ng cách gi a hai th u kính càng ng n (tiêu c c a th kính càng ng n) và ng ưc l i. ð phĩng đ i c a th kính th ưng cĩ 4 s : x5 ; x7 ; x10 ; x15. Mu n bi t đ phĩng đ i c a v t quan sát ( đ phĩng đ i c a kính hi n vi), ng ưi ta nhân đ phĩng đ i c a v t kính v i đ phĩng đ i c a th kính. Ví d dùng v t kính d u x90 và th kính x15 thì đ phĩng đ i c a v t quan sát hay đ phĩng đi c a kính hi n vi s là: 90 x 15 = 1350 (l n) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 9
12. 8 9 7 6 10 5 11 13 3 4 2 12 14 1 Hình 2: C u t o kính hi n vi 1. ð kính 8. Th kính 2. ðèn chi u 9. ng kính 3. B t quang kính 10. Thân kính 4. Vịng b o hi m 11. c s ơ c p 5. Khay kính 12. c vi c p 6. V t kính 13. Cơng t c 7. Bàn xoay 14. B ph n điu ch nh khay kính 3. Cách s d ng kính hi n vi 3.1. Ki m tra kính hi n vi ðt kính vào v trí làm vi c, c m đin ho c quay g ươ ng ph n chi u v phía ánh sáng, đt kính trên bàn cho ngay ng n t ư th cĩ l i nh t cho ng ưi quan sát. Khi quan sát tiêu b n c n s d ng c 2 m t, m t trái dùng quan sát, m t ph i dùng đ ghi chép ho c v , khơng nên nheo m t m t l i đ xem, vì nh ư th r t d mi m t và đau đu. C n luy n t p đ cĩ th xem kính đưc b ng c hai m t. 3.1. Quan sát tiêu b n t ươ i v i v t kính khơ Khơng dùng t quang kính và b ph n ch n sáng, nh t là đi v i v t kính cĩ đ phĩng đ i th p ( 38), khi ngu n sáng h p thì dùng gươ ng ph ng v i v t Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 10
13. kính cĩ đ phĩng đ i th p, dùng g ươ ng lõm v i v t kính cĩ đ phĩng đ i cao (340), khi ngu n sáng r ng thì dùng g ươ ng nào c ũng đưc. H th p t t cùng t quang kính và ít m b ph n ch n sáng. 3.2. Quan sát tiêu b n nhu m v i v t kính d u Luơn luơn s d ng t quang kính, nâng cao t quang cho sát vào tiêu b n. Khi s d ng t quang kính c n chú ý m y đim: ðt phi n kính lên khay kính và c đ nh, dùng v t kính cĩ đ phĩng đ i th p đ cĩ nh trong th tr ưng tr ưc. H th p v t kính cho sát g n tiêu b n (khi h v t kính m t nhìn ngồi đ tránh đè m nh làm v tiêu b n). Theo dõi trong ng kính, r i t t v n c s ơ c p lên, đn khi trơng th y nh (th ưng cĩ hình ch p) thì ng ng v n c s ơ c p và b t đ u s d ng c vi c p, v n h t s c ch m đn khi th y nh rõ nét thì thơi (cĩ th v n t i ho c v n lui). Sau khi đã điu ch nh tiêu đim v i v t kính đ phĩng đ i th p thì quay v t kính đĩ ra, nh m t gi t d u b ch h ươ ng vào đim đ nh soi trên tiêu b n, khơng đ gi t d u lan r ng ra, xoay đu v t kính du vào, và v n v t kính d u sát xu ng tiêu b n ng m vào gi t d u, chú ý m t nhìn ngồi đ đ ng v n sát quá s đè v phi n kính, đ n khi th y ch p nh, t c là nh đã trơng th y nh ưng ch ưa th y rõ, lúc này điu ch nh c vi c p cho đ n khi nh v t rõ nét trong th tr ưng. 4. Cách b o qu n kính hi n vi + Khi l y kính t trong h p kính hi n vi ra, dùng tay ph i n m ch c, kéo kính ra theo h ưng n m ngang, khơng đ đ ng vào thành h p, sau đĩ dùng tay trái đ chân kính đ mang đi (bao gi c ũng ph i dùng 2 tay khi di chuy n). N u mang đi xa ph i c đ nh ch c ch n đ tránh b l c. + Khơng đưc s tay vào đu v t kính và th kính, n u b n cĩ th dùng vi m m ho c gi y lau kính đ lau. V t kính d u dùng xong l y v i m m m n hay gi y dai m n lau s ch d u b ch h ươ ng đ u v t kính, sau đĩ t m xylon lau cho h t d u (xylon cĩ tác d ng làm tan d u b ch h ươ ng). Cu i cùng lau l i m t ln n a b ng v i m m, m n hay gi y m m. + Khi dùng xong ph i xoay các b ph n c a kính v đúng v trí quy đ nh, khơng đưc đ v t kính n m trong tr c kính nh ư lúc quan sát mà ph i đ t đúng l mù ho c xoay v t kính ra hai bên và v n cho áp sát xu ng đĩ a kính, t quang h th p xu ng, g ươ ng ph n chi u xoay d c thân kính. Tồn b kính đ u coi nh ư tr ng thái ngh . Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 11
14. * Câu h i ơn t p bài s 1: 1. Trang thi t b , máy mĩc chuyên d ng cho nghiên c u VSV? 2. Nguyên lý v n hành và cách s d ng n i h p hơi n ưc cao áp (Autoclave)? 3. C u t o và cách s d ng kính hi n vi? 4. C u t o và cách s d ng máy đ m khu n l c? 5 Trình bày ph ươ ng pháp và cách tính kích th ưc t bào VSV? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 12
15. Bài s 2 PH ƯƠ NG PHÁP C ð NH TIÊU B N VÀ NHU M T BÀO VI SINH Mc đích yêu c u: + H ưng d n h c viên làm tiêu b n vi sinh v t t các m u v t. + N m v ng ph ươ ng pháp nhu m đơn, nhu m giemxa và ph ươ ng pháp nhu m Gram. + Nh n d ng hình thái vi sinh v t và phân bi t vi khu n Gram d ươ ng, Gram âm Ni dung: + Ph ươ ng pháp làm tiêu b n vi sinh v t + Pha ch thu c nhu m và các ph ươ ng pháp nhu m: nhu m đơn, Gram, Giem xa, Wright. + Quan sát m t s tiêu b n hình thái vi sinh v t: c u khu n, trc khu n, cu tr c khu n I. PH ƯƠ NG PHÁP LÀM TIÊU B N VÀ NHU M T BÀO VI SINH V T 1. M c đích c a c đnh tiêu b n và nhu m t bào VSV T bào vi sinh v t g n nh ư là khơng m u, do đĩ quan sát b ng ph ươ ng pháp xem tr c ti p r t khĩ, vì v y c n ph i làm tiêu bn r i đem nhu m m u. Nhu m vi sinh v t cĩ 4 m c đích: - ð nghiên c u hình thái, c u t o đ c bi t c a vi sinh v t nh ư giáp mơ, nha bào, - ð phân lo i vi sinh v t c ăn c vào tính ch t b t m u Gram, tính ch t kháng c n, kháng toan. - ð d phân bi t và quan sát đưc các vi c u t o trong t bào VSV. - ð b o t n tiêu b n trong m t th i gian dài, đ ch p nh. 2. Ph ươ ng pháp làm tiêu b n vi sinh v t đ nhu m 2.1. Chu n b phi n kính - Ch n phi n kính trong, s ch, khơng m , khơng cĩ d u m , đã đưc ngâm trong c n, khi dùng lau khơ b ng v i m m và h ơ qua trên ng n l a đèn cn. - Khoanh di n ph t vi sinh v t b ng cách dùng bút chì m khoanh m t vịng m t d ưi phi n kính. 2.2. Ph t m u v t - N u l y m u v t là vi sinh v t t ng canh trùng d ch th thì sau khi đã kh trùng que c y và đ ngu i, l y m t gi t mơi tr ưng nh lên phi n kính ch đã khoanh trịn b ng bút chì m , r i dàn m ng ra trong di n đã khoanh. Cn chú ý thao tác khi l y vi sinh v t đ ph t kính: Tay ph i c m que c y, nung đ que c y b ch kim và đư a tồn b ph n kim khí c a que c y qua ng n Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 13
16. la đèn c n 2 - 3 l n, làm tr ưc khi l y vi sinh v t và sau khi đã ph t kính xong; tay trái c m ng mơi tr ưng đ vào lịng bàn tay và c m nghiêng ng b ng 5 ngĩn tay. Dùng ngĩn tay út c a bàn tay ph i m nút bơng, sau khi đã quay nút bơng m t vịng trong mi ng ng cho tr ơn (k p nút bơng vào gi a ngĩn tay út và bàn tay, hay gi a ngĩn tay út và ngĩn tay đeo nh n) h ơ ng mơi tr ưng trên ng n l a đèn c n, và đu ng nghi m luơn luơn đ sát ng n l a đèn đèn c n, cho que c y vào sâu trong ng mơi tr ưng l y ra m t gi t mơi tr ưng, rút que cy ra, h ơ mi ng ng nghi m và đĩng nút bơng l i, cho ng nghi m vào giá, sau đĩ c m phi n kính đã chu n b s n, mu n c m phi n kính cho v ng thì ngĩn tay cái gi m t c nh dài c a phi n kính, ba ngĩn ti p gi c nh đ i di n, ngĩn út đ m t d ưi phi n kính, gi cho phi n kính khơng di chuy n trong khi ph t. - N u là vi sinh v t t canh trùng đc (mơi tr ưng th ch): thì dùng que c y bch kim l y m t ít vi sinh v t m t khu n l c, (khơng nên l y nhi u vi sinh v t vì ph t dày quá s khĩ xem và khĩ phân bi t hình thái c a vi sinh v t). ð t que cy lên phi n kính đã cĩ s n m t gi t n ưc c t hay n ưc sinh lý ho c n ưc th t vơ trùng đ làm huy n d ch vi sinh v t, tr n đ u vi sinh v t trong gi t nưc r i dàn m ng ra. - N u dùng máu đ ph t kính thì cĩ th l y máu t ĩnh m ch rìa tai ( đi vi đ ng v t s ng) ho c máu tim ( đ i v i đ ng v t m khám). ð t gi t máu lên phi n kính, r i dùng đu m t phi n kính khác, cĩ c nh nh n và th ng ho c c nh ca m t lá kính đt nghiêng m t gĩc 30 - 45 o v i phi n kính đ gi t máu lan kh p c nh r i đ y nh và đu t i đ u kia c a tiêu b n, máu theo phi n kính ch khơng ph i b phi n kính đ y đi, tiêu b n t t n u máu đưc dàn đu trên phi n kính thành m t l p m ng. - N u dùng ph t ng lách, gan, th n, h ch, ph i thì c t m t mi ng nh , th m b t n ưc b ng bơng hay gi y th m, r i ch m nh trên phi n kính đ 3 - 4 ch , khơng đè m nh trên phi n kính, ch th m nh nhàng, ho c cĩ th kéo l ưt nh mi ng ph t ng trên phi n kính thành v t dài c ũng đưc. - N u dùng đm m , t y x ươ ng ph t kính thì l y que c y l y đ m ch cĩ nhi u m nh t, r i dàn m ng ra trên phi n kính, n u m khơ thì tr ưc khi dàn, nh mt gi t n ưc sinh lý vơ trùng trên phi n kính, là t ươ ng t v i t y x ươ ng. 2.3. S y khơ tiêu b n : Cĩ 2 cách - ð t khơ nhi t đ phịng thí nghi m. - H ơ cao trên ng n l a đèn c n, khơng đ sát tiêu b n vào ng n l a, nĩng quá thân vi sinh v t s co qu p l i, protit trong nguyên sinh ch t đơng nhanh, nh h ưng đ n hình thái t bào. 2.4. C đ nh tiêu b n + C đ nh tiêu b n cĩ 3 m c đích: - Gi t ch t vi sinh v t đ vi c s d ng khơng gây nguy hi m. - Làm cho vi sinh v t g n ch t vào phi n kính, khi r a n ưc khơng b trơi đi. - Làm cho vi sinh v t b t m u t t h ơn. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 14
17. Cĩ th c đ nh b ng nh ng ph ươ ng pháp sau đây: + C đ nh b ng nhi t đ : H ơ phi n kính trên ng n đèn c n b ng cách đưa đi, đư a l i kho ng cách 10-15 cm đ 3 - 4 l n, n u h ơ nĩng quá s làm bi n d ng hình thái vi khu n. + C đ nh b ng ch t hĩa h c: - Nh vài gi t c n nguyên ch t hay c n 96 o 5 - 10 phút - Nh vài gi t c n mêtylic 2 - 3 phút - Ngâm tiêu b n vào axêton 5 phút + C đ nh b ng h ơi foocmalin 3 - 5 phút II. Ph ươ ng pháp nhu m tiêu b n 2.1. Thu c nhu m đơn và các ph ươ ng pháp nhu m đơn 2.1.1. Dung d ch fucxin (fuchsine) trong axit phênic + Chu n b thu c nhu m Fucxin ki m 1 g Cn nguyên ch t hay 96 o 10 ml Axit phênic k t tinh 5 g Nưc c t 100 ml Nghi n fucxin vi 5ml c n trong c i s ch, qu y đ u, đ t t 2/3 l ưng nưc vào, qu y đ u, xong cho thêm axit phênic, tr n đ u cho vào l kín đ 24 gi , đem l c qua gi y, tráng c c b ng 1/3 n ưc c t và 1/2 c n cịn l i, dung d ch này là dung d ch fucsin đ c, khi dùng nhu m đơ n ho c nhu m Gram thì đem pha lỗng dung d ch này g p 10 l n v i dung d ch axit phênic 5%. Dung d ch fucxin 10 ml Dung d ch axit phênic 5% 90 ml + Ph ươ ng pháp nhu m đơn a) Nh thu c nhu m lên tiêu b n đã c đ nh đ 1 - 2 phút, cĩ khi đn 10 phút tùy theo lo i thu c nhu m. b) R a n ưc, đ vịi n ưc t t ch y xu ng m t đ u phi n kính c m h ơi nghiêng đn khi n ưc trong là đưc. c) Th m khơ b ng gi y th m hay b ng h ơi nĩng. d) Quan sát trên kính hi n vi 2.1.2. Dung d ch xanh mêtylen trong axit phênic + Chu n b thu c nhu m Xanh mêtylen 1 g Axit phênic k t tinh 1 g Cn nguyên ch t 100 o 10 ml Nưc c t 10 ml Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 15
18. Cách pha gi ng nh ư fucxin trên. + Ph ươ ng pháp nhu m c ũng gi ng nhu m fucsin . 2.2. Ph ươ ng pháp nhu m Gram( nhu m kép) 2 2.1. Chu n b thu c nhu m a) Dung d ch tím gentian trong axit phênic Tím gentian 1 g Cn 96 o 10 g Axit phênic kt tinh 5 g Nưc c t 100 ml b) Dung d ch fucxin trong axit phênic Fucxin ki m 1 g Cn 96 o 10 g Axit phênic k t tinh 5 g Nưc c t 10 g Cách pha 2 dung d ch này gi ng nh ư dung d ch fucxin nĩi trên c) Pha dung d ch lugol Iơt đua kali (KI) 1 g It tinh th (I) 0,5 g Nưc c t 150 ml Nghi n iơt đuakali v i m t ít n ưc c t, sau đĩ cho i t đã tán nh vào l c cho tan h t, cu i cùng cho đ n ưc c t, l c đ u, đ 24 gi r i đem l c. ð ng vào chai m u. Khơng nên pha nhi u vì d b bi n ch t. d) Pha dung d ch t y m u c n axêtơn. Cn nguyên ch t 5 ph n Axêtơn 1 ph n Nu khơng cĩ axêtơn thì dùng cn nguyên ch t ho c 90 o c ũng đưc. 2.2.2. Ph ươ ng pháp nhu m Gram 1) Nh dung d ch tím gentian lên tiêu b n 1 - 2 phút. 2) R a n ưc nhanh, v y khơ n ưc. 3) Nh dung d ch lugol đ 1 phút (tiêu b n cĩ m u nâu đen). 4) R a n ưc nhanh, v y khơ n ưc. 5) Nh c n axêtơn t đ u phi n kính, nghiêng phi n kính cho c n ch y qua ch ph t vi sinh v t. 6) R a n ưc nhanh. 7) Nh dung d ch fucxin lỗng đ 1 phút. 8) R a n ưc Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 16
19. 9) Th m khơ - h ơ khơ - xem kính. Vi khu n Gram dươ ng b t màu tím, vi khu n Gram âm b t màu h ng. * Cn chú ý : B ưc t y m u b ng c n axêtơn r t quan tr ng. N u t y khơng k thì d nh m l n vi khu n Gram âm v i vi khu n Gram d ươ ng và ng ưc l i, n u t y lâu quá thì vi khu n Gram d ươ ng m t m u tím cho nên khi nhu m màu đ fucxin thì c ũng b t m u đ . Quan sát trên kính hi n vi nh n th y: h ng c u nhu m m u nâu h ng, nhân b ch c u nhu m màu tím. * Câu h i ơn t p: Bài s 2 1. Trình bày 3 ph ươ ng pháp c ơ b n trong nghiên c u v VSV? 2. Th nào là Gram? ình bày s sai khác gi a nhu m đơn và nhu n kép? 3. Các b ưc ti n hành ch t o tiêu b n? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 17
20. Bài s 3 CHU N B D NG C VÀ MƠI TR ƯNG NUƠI C Y VI SINH V T Mc đích, yêu c u: + Bi t đưc và chu n b d ng c nuơi c y VSV + N m v ng cách pha ch mơi tr ưng nuơi c y VSV + Hi u đưc ph ươ ng pháp kh trùng các lo i d ng c và mơi tr ưng nuơi cy VSV Ni dung ki n t p: + Chu n b và r a d ng c c n thi t đ pha ch mơi tr ưng nuơi c y VSV + H c cách b c gĩi các d ng c thơng d ng và nút bơng cho ng nghi m, pipet, + Cách pha ch mơi tr ưng th ch nghiêng và đĩa th ch I. CHU N B D NG C 1. Các d ng c th ưng đưc s d ng trong nghiên c u vi sinh v t - ðĩa petri (h p l ng) - ng nghi m, bình tam giác, bình c u, chai thu tinh - Pipét, xi lanh, que g t, que c y - Lam kính, lamen 2. Yêu c u Các d ng c ph i s ch v m t hố h c và vi sinh v t h c (các d ng c ph i đưc vơ trùng). 3. Cách x lý d ng c tr ưc khi r a - ði v i d ng c thu tinh m i ch ưa s d ng, c n ngâm n ưc lã ho c dung d ch H 2SO 4 lỗng 24 gi . R a l i b ng xà phịng và n ưc nhi u l n cho t i khi dung d ch r a cĩ pH trung tính. - Các d ng c đã qua s d ng, nh t là các VSV gây b nh tr ưc khi r a nh t thi t ph i đưc kh trùng b ng h ơi n ưc áp l c đ gi t ch t các t bào, đm bo an tồn cho ng ưi r a, khơng cho m m b nh c ũ nhi m vào mơi tr ưng m i. - ði v i các VSV khơng gây b nh cho ng ưi và đng th c v t, ch c n tháo nút bơng, x p vào n i ho c ch u nhơm chuyên d ng, đ n ưc xà phịng, dìm d ng c ng p kín n ưc, đun sơi 15-30 phút. Gom các c n b n vào túi nilon, bu c kín r i m i đ b. - D ch nuơi VSV tr ưc khi đ b c n thêm vài gi t formalin, l c m nh đ gi t ch t t bào. - S d ng dung d ch sunfo-cromic đ ngâm t y các v t b n trên d ng c thu tinh. 4. Cách r a d ng c Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 18
21. Ch n ch i r a thích h p v i t ng lo i ng ho c bình, phía đu nên đm dây chun đ ph n lõi s t khơng ch c th ng đáy ng nghi m ho c đáy bình. Dùng mi ng nhám th m n ưc r a ho c bơng th m c n lau s ch các ký hi u ghi trên thu tinh. Dùng ch i ho c mi ng r a đã th m dung d ch n ưc r a c k ĩ phía trong ng ho c bình hay đĩa petri t i khi s ch h t các v t b n. Dùng kh ăn m m c k ĩ phía ngồi. X n ưc làm s ch ch t t y r a. Tráng l i b ng n ưc c t. D ng ng ưc dng c vào giá đng cho rĩc h t n ưc. Làm khơ nhi t đ phịng ho c ph ơi nng ho c s y khơ 80-105 oC. ðĩa Petri nên r a và x p theo b đ d l p l i v i nhau. Các phi n kính và lá kính dùng xong nên ngâm riêng vào dung d ch t y ra ho c sát trùng. Dùng kh ăn m m c r a, tráng n ưc c t, th m khơ, hong l i tr ưc khi c t. Các lá kính r t d v , c n th n tr ng h ơn và nên r a d ưi vịi n ưc ch y nh . Vi các pipet dùng đ hút d ch VSV: sau khi s d ng c n ngâm ngay vào ng n ưc sát trùng, kh u b nút bơng, ngâm ti p vào dung d ch t y r a 1 ngày ri chuy n sang bình r a pipet t đ ng qua đêm. Tráng n ưc c t, hong khơ. Nu ra tr c ti p d ưi vịi n ưc, c n điu ch nh sao cho dịng n ưc ch y qua bên trong pipet. Vi các pipet dùng cho các ph n ng hố h c, khơng c n ngâm n ưc sát trùng, đt pipet d ưi vịi n ưc ch y đ x b t hố ch t bám dính bên trong, ngâm vào ng n ưc xà phịng m t ngày, r a s ch r i tráng n ưc c t. Pipet ch nên hong khơ nhi t đ phịng. N u s y nhi t đ cao, thu tinh giãn n làm sai l nh th tích. * Pha dung dich r a a) Dung d ch sunfo-cromic: Bicromat kali: 50 g H2SO 4 đc: 500 ml b) Dung d ch ki m trong alcol: NaOH viên: 120 g Nưc c t: 120 ml Alcol 95 o: 1000 ml 5. Chu n b d ng c đ kh trùng Dng c tr ưc khi kh trùng ph i đưc r a s ch, làm khơ và gĩi gi y đ bo đ m tính vơ trùng sau khi s y. Mi pipet đưc gĩi trong d i gi y dài cĩ chi u r ng 4 - 5cm. ðu pipet đưc dùng đ hút b ng mi ng đưc đút nút b ng m t ít bơng, nút bơng c n v a ph i, n u ch t quá s khĩ hút d ch và khĩ l y ra khi r a. Pipét đưc gĩi b t đ u t phía đ u nh gi t, qu n gi y d n d n vào theo ki u xốy trơn c cho đ n khi ht phía đ u cĩ nút bơng. Ph i qu n gi y cho sát khít vào pipet. Sau khi qu n Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 19
22. gi y, ta ph i gi cho kh i b n và kh i rách b ng cách bu c thành t ng bĩ cùng kích c ho c cho vào ng đ ng pipet làm b ng kim lo i hay b ng bìa c ng. Các que g t c ũng đưc gĩi riêng t ng cái và sau đĩ c ũng bĩ l i nh ư pipét. Các đĩa Petri đưc gĩi thành t ng ch ng, m i ch ng kho ng 4-5 b . Các chai l , ng nghi m và ng Burri dùng đ nuơi c y vi sinh v t nh t thi t ph i đưc đ y nút (nút nh a ho c kim lo i hay cao su nhân t o ch u nhi t ho c b ng nút bơng). N u làm nút bơng ph i dùng bơng khơng th m n ưc (bơng m). Nút bơng c n làm đúng ki u cách đ thu n ti n khi thao tác thí nghi m, cĩ th làm nút bơng tr n ho c nút bơng cĩ b c v i màn. L y bơng theo l p, tuỳ vào kích c mi ng bình, chai l và ng nghi m đ ly l ưng bơng phù h p. Cĩ 2 cách làm nút bơng thơng d ng: + Nh i bơng vào gi a, dàn đu ra xung quanh thành hình trịn, l y đ u m t ngĩn tay đt vào gi a, các ngĩn c a bàn tay kia gi đ u phía ngồi r i đy sát lên ngĩn tay đt gi a t o thành nút bơng. + ðt mi ng bơng v a l y (theo hình ch nh t) trên m t bàn s ch, cu n trịn l i theo chi u dài đn h t, r i g p làm đơi t o thành nút bơng. Xoay đu nút v a t o ra vào mi ng ng ho c bình, sâu kho ng 2-3 cm, điu ch nh sao cho khơng t o thành rãnh trên nút bơng đ ng ăn ch n s t p nhi m t khơng khí, vu t đ u ph n cịn l i bên ngồi r i b n ch t l i nh ư hình ng n l a. Nút bơng đt yêu c u c n v a ph i, khơng ch t quá, c ũng khơng l ng quá, d dàng l y ra khi th c hi n các thao tác nuơi c y VSV. Vi các bình mơi tr ưng th ch cĩ th bao gi y b c thay cho nút bơng. 6. Kh trùng các d ng c thu tinh Ph ươ ng pháp c ơ b n đ kh trùng các d ng c th y tinh là ph ươ ng pháp kh trùng b ng s c nĩng khơ (b ng nhi t). Cơng vic này đưc th c hi n trong t s y (Drying oven) nhi t đ 160 - 180 0C trong vịng 2 gi . Khi đĩ cĩ th tiêu di t c t bào dinh d ưng l n các bào t c a VSV. Các d ng c đã kh trùng đưc b o qu n trong túi polyethylen c t gi ch kín, tránh b i b m. Ch bĩc gi y ngay tr ưc khi s d ng. Sau khi kh trùng, các que g t, que c y ch nên s d ng trong vịng 24 gi , h p petri trong vịng 3 ngày, ng nghi m, bình nĩn kho ng 7-10 ngày n u b o qu n t t. N u đ lâu, dng c ph i đưc kh trùng l i tr ưc khi s d ng. Mt s d ng c nh ư que g t, que c y, ng nghi m, pipet cĩ th kh trùng bng h ơi n ưc áp l c cao (s d ng n i h p cao áp), thơng th ưng 121 oC/30’. Kh trùng xong nên s d ng ngay. II. CHU N B CÁC MƠI TR ƯNG ð NUƠI C Y VI SINH V T Cũng nh ư các sinh v t khác, đ sinh tr ưng và phát tri n các t bào vi sinh vt c n các ch t dinh d ưng thích h p. Khi nuơi c y nhân t o, ng ưi ta làm các lo i “th c ăn” cung c p cho t ng nhĩm vi sinh v t khác nhau. D ng “th c ăn” Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 20
23. này đưc g i là mơi tr ưng nuơi c y. Tu ỳ t ng gi ng VSV khác nhau mà cĩ mơi tr ưng nuơi c y chuyên tính khác nhau. 1. Các yêu c u v mơi tr ưng nuơi c y - ðy đ các ch t dinh d ưng phù h p v i t ng ki u trao đ i ch t c a tng nhĩm vi sinh v t, khơng ch a các y u t đ c h i, mơi tr ưng nuơi c y ph i đưc đ m b o cho s sinh tr ưng bình th ưng c a vi sinh v t. - Vơ trùng tuy t đơí đ khi nuơi c y ch phát tri n m t lo i VSV mong mu n. 2. Cách g i tên mơi tr ưng Mơi tr ưng th ưng đưc g i theo tên ng ưi ch t o cơng th c (ví d mơi tr ưng Hansen, MacConkey ) ho c theo ngu n dinh d ưng chính cĩ trong mơi tr ưng (mơi tr ưng tinh b t-th ch, malt-th ch, glucoza-pepton, ) 3. Phân lo i mơi tr ưng Mơi tr ưng đưc phân lo i theo thành ph n hố h c, ch đ dinh d ưng và cơng d ng 3.1. Phân lo i theo thành ph n hĩa h c 3.1.1. Mơi tr ưng cĩ thành ph n xác đ nh (mơi tr ưng t ng h p) - defined medium Mơi tr ưng đưc ch t o t các ch t cĩ thành ph n đưc xác đ nh rõ ràng. Ví d mơi tr ưng A cĩ ch a 5g glucoza, 1g (NH 4)2SO 4, 2g K 2HPO 4, 1 lít n ưc. Nu nh ư b sung 1 l ưng nh t đ nh axit amin c th nào đĩ (Lyzin) vào thì mơi tr ưng A v n đưc g i là mơi tr ưng cĩ thành ph n xác đ nh. Mơi tr ưng cĩ thành ph n xác đ nh đưc s d ng đ nghiên c u các nhu cu dinh d ưng ho c các con đưng sinh hố đ c bi t c a vi sinh v t Tuy nhiên, khái ni m mơi tr ưng xác đ nh c ũng ch cĩ tính ch t t ươ ng đi bi vì các hố ch t s d ng đ pha ch mơi tr ưng ngồi thành ph n chính đưc xác đnh, cịn cĩ các nguyên t vi l ưng t p nhi m khơng đưc xác đ nh. Ngu n n ưc pha ch mơi tr ưng c ũng c n đưc chú tr ng. V i lo i mơi tr ưng này nh t thi t ph i s d ng n ưc c t tinh khi t đ pha ch . 3.1.2. Mơi tr ưng thành ph n khơng xác đ nh (mơi tr ưng t nhiên ho c bán t ng h p)- Undefined medium, complex medium Mơi tr ưng cĩ ch a các hp ch t cĩ thành ph n khơng xác đ nh rõ ràng nh ư các ch t chi t t mơ đ ng th c v t hay t bào n m men. Ngồi các ch t chi t t nhiên, mơi tr ưng cịn cĩ c các hố ch t cĩ thành ph n xác đ nh. Ví d nh ư mơi tr ưng A trên đưc b sung thêm pepton. 3.2. Phân lo i theo ch đ dinh d ưng 3.2.1. Mơi tr ưng t i thi u (Minimal medium) Lo i mơi tr ưng cung c p nhu c u t i thi u c a VSV, khơng d ư th a. Ví d n u m t lo i VSV nào đĩ ch a thơng tin di truy n sinh t ng h p t t c các Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 21
24. lo i axit amin c n thi t c a chúng thì khơng c n thêm axit amin vào mơi tr ưng. Ho c n u VSV bình th ưng c n 2 lo i axit amin, ch c n b sung 2 lo i đĩ mà khơng c n thêm b t k ỳ lo i nào khác. Tu ỳ t ng tr ưng h p, mơi tr ưng t i thi u cho t ng lo i VSV khác nhau cũng khác nhau. Nhi u mơi tr ưng t i thi u ch dùng đ nuơi c y m t ph m vi tươ ng đi h p các VSV. 3.2.2. Mơi tr ưng đ ho c giàu (All purpose ho c Rich medium) Mơi tr ưng ch a hàng lo t ch t dinh d ưng v ưt xa nhu c u t i thi u c a VSV. Mơi tr ưng giàu tr giúp sinh tr ưng c a nhi u lo i VSV. Trong mơi tr ưng giàu, VSV sinh tr ưng và phát tri n nhanh và t t h ơn so v i mơi tr ưng t i thi u. S d ĩ nh ư v y là vì các ngu n dinh d ưng mà VSV c n cĩ th l y d dàng t các hp ch t nh ư axit amin, axit béo, vitamin, nucleic cĩ s n trong mơi tr ưng. 3.3. Phân lo i mơi tr ưng theo cơng d ng 3.3.1. Mơi tr ưng ch n l c hay mơi tr ưng tuy n ch n (Selective medium) Mơi tr ưng này đm b o cho s phát tri n c a các VSV mà ta mong mu n và c ch s phát tri n c a các VSV ngồi ý mu n. Mơi tr ưng ch n l c ch y u dùng đ phân l p các ch ng VSV thu n khi t t t nhiên ho c dùng đ nuơi c y tích lu (enrichment). Cĩ 2 cách làm tăng tính ch n l c c a mơi tr ưng: - Cho thêm ch t c ch các VSV khơng mong mu n nh ưng khơng nh hưng t i sinh tr ưng c a các lo i VSV ta đ nh nuơi c y ho c tuy n ch n. Các ch t c ch bao g m các lo i thu c nhu m nh ư tím k t tinh (crystal violet), các ch t kháng sinh, các ch t ch ng n m, NaN 3 N ng đ cao c a mu i, đưng tác đng đ n áp su t th m th u c a t bào đưc s d ng nh ư m t nhân t đ ch n lc VSV. - Lo i b m t ch t mà các VSV khác c n t i khi n chúng khơng phát tri n đưc. 3.3.2. Mơi tr ưng phân bi t (differental medium) Mơi tr ưng phân bi t cho phép nhi u lo i VSV phát tri n và phân bi t nhanh chĩng lồi này v i lồi khác. Ví d mơi tr ưng cĩ ch a bromcresol (ch t ch th màu) tr giúp sinh tr ưng c a nhi u lồi VSV nh ưng d a vào kh n ăng chuy n màu c a ch t ch th cĩ th nh n bi t ngay lo i nào cĩ kh n ăng hình thành axit t đưng. 3.3.3. Mơi tr ưng ch n l c - phân bi t (Selective - differental medium) Mơi tr ưng này bao g m c 2 ch c n ăng ch n l c và phân bi t. Nĩ giúp cho vi c ch n l c m t nhĩm nh VSV đ ng th i phân bi t chúng v i nh ng nhĩm VSV khác. 3.4. Phân lo i mơi tr ưng theo tr ng thái v t lý 3.4.1. Mơi tr ưng l ng (d ch th ) -Liquid medium Th ưng đưc s d ng đ nuơi c y VSV nh m thu nh n sinh kh i, các s n ph m trao đ i ch t (enzim, kháng sinh, vitamin ) hay phát hi n các đ c đim Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 22
25. sinh hố và đ gi gi ng và b o qu n nhi u lo i VSV khơng phát tri n đưc t t trên các mơi tr ưng đ c. 3.4.2. Mơi tr ưng đ c (c th ) - Solid medium ð làm đơng mơi tr ưng, ng ưi ta th ưng s d ng th ch (agar) đơi khi s dng gelatin (keo da, x ươ ng đng v t) ho c s d ng silicagel (ch t o t thu tinh l ng và HCl). Mơi tr ưng đ c dùng đ phân l p gi ng thu n khi t, đ m s l ưng VSV, gi gi ng VSV, nghiên c u hình thái khu n l c, ho t đ ng đ i kháng Th ch là m t lo i polysaccharit chi t t m t lo i t o bi n. Vì khơng b VSV phân gi i nên th ch là ch t làm đơng mơi trưng khá lý t ưng. Trong nưc, th ch nĩng ch y g n 100 oC và đơng đc kho ng 43 oC. Th ch th ưng đưc b sung vào mơi tr ưng v i s l ưng kho ng 16-20g/l. Trong mơi tr ưng trung tính, h ơi axit ho c h ơi ki m, th ch v n gi đưc kh n ăng t o gel khá b n vng. Trong mơi tr ưng axit pH <5,0 th ch b thu phân trong quá trình kh trùng, m t tính t o gel sau khi đ ngu i. 3.4.3. Mơi tr ưng m m Th ưng s d ng đ gi ch ng. Th ch đưc b sung v i s l ưng 6-10g/l 3.4.4. Mơi tr ưng bán l ng Thêm th ch vào v i l ưng 2-5 g/l. Do n ng đ oxi xâm nh p vào bên trong mơi tr ưng bán l ng ch m c đ nh t đ nh nên mơi tr ưng này đưc s dng đ nuơi các vi khu n h o khí (microaerophilic). 3.4.5. Mơi tr ưng x p Mơi tr ưng x p đưc ng d ng trong s n xu t (VSV h c cơng nghi p). Ch t x p nh ư tr u, cám đưc tr n v i các thành ph n dinh d ưng khác. 4. Chu n b mơi tr ưng Cn đ c k cơng th c c u t o mơi tr ưng, chu n b các hố ch t và d ng c liên quan 4.1. Pha ch Nhìn vào các cơng th c mơi tr ưng, l n l ưt cân đong các thành ph n. ðánh d u vào cơng th c các thành ph n đã cân ho c đong. N u cơng th c cĩ th ch thì nên đong n ưc cho vào n i đ ng, cân th ch cho vào n ưc đ th ch ng m d tan khi đưc đun sơi và l n l ưt cân đong các thành ph n khác. Nu mơi tr ưng ph i đun n u, ngồi th tích n ưc theo cơng th c nên b sung m t l ưng nh n ưc đ bù l i th tích bay h ơi khi đun (kho ng 15-20ml/l) Mi hố ch t xúc b ng m t thìa riêng khi cân. Cho hố ch t ho c các thành ph n đưc cân lên đĩa cĩ gi y cân m t cách t t t i khi v a đ . N m vng cách s d ng các lo i cân. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 23
26. Vi các thành ph n cĩ hàm l ưng nh nên pha dung d ch m (stock solution), tính hàm l ưng cĩ trong 1 đơn v th tích suy ra th tích c n l y đ b sung vào mơi tr ưng. Các lo i b t g o, ngơ, cám đưc cân và cho vào n ưc l nh, v a đun v a khu y cho t i khi b t chín. Các thành ph n kém b n nhi t nh ư ch t kháng sinh, vitamin ph i đưc kh trùng theo ph ươ ng pháp riêng (th ưng s d ng màng l c khu n) ðơi khi m t s thành ph n đưc cân riêng, kh trùng riêng và ch đưc tr n l i v i nhau sau khi đã kh trùng đ tránh ph n ng t o thành k t t a khi tồn b thành ph n đưc kh trùng chung (x y ra khi cĩ m t đ ng th i các mu i phơtphat và MgSO 4). 4.2. ðun mơi tr ưng Mơi tr ưng d ch th : N u các thành ph n tan đ u trong n ưc thì khơng cn đun. Mơi tr ưng đ c: ð t n i lên b p v a đun v a khu y đ u b ng đũ a thu tinh. Khi mơi tr ưng sơi m t lúc, th ch tan h t là đưc, tránh đun lâu n ưc bay hơi s làm c n mơi tr ưng. H t b t ho c l c trong n u c n. 4.3. ðiu ch nh pH Nu mơi tr ưng d ng d ch th trong su t, khơng màu khơng ch a các ch t dính nh t nh ư tinh b t, cĩ th đo pH b ng máy đo. Mơi tr ưng cĩ màu, ch a các ch t dính nh t khơng đưc đo pH b ng máy (đin c c d b h ng), nên s d ng gi y đo pH. C ũng cĩ th nh n bi t pH qua màu s c c a mơi tr ưng do các ch t ch th màu t o nên. Nhìn chung, n u các thành ph n mơi tr ưng đưc cân đong chính xác, các hố ch t đ t tiêu chu n, sau khi pha ch mơi tr ưng s đ t đưc giá tr pH c n cĩ. N u pH sai l nh quá l n c n xem l i các khâu và ph i pha l i mơi tr ưng. Nu sai khác khơng l n, cĩ th điu ch nh b ng dung d ch ki m (KOH, NaOH) ho c axit (HCl, CH 3COOH) lỗng ho c các mu i theo ch d n cơng th c. Vi c điu ch nh pH c n th n tr ng đ sau khi ch nh xong th tích mơi tr ưng khơng b thay đi ngồi ph m vi cho phép. * Lưu ý: Khi pH mơi tr ưng th p h ơn 6,0 - 6,5 thì s x y ta vi c pepton hố gelatin và sau khi kh trùng, mơi tr ưng s khơng đơng l i đưc. Khi pH th p h ơn 5,0 s x y ra s thu phân và th ch m t kh n ăng to gel. Nu mơi tr ưng cĩ ph n ng ki m thì khi kh trùng s xu t hi n k t t a st, xu t hi n vi c caramen hố đưng và đưng tr nên khơng h p thu đưc đ i vi vi sinh v t. ð tránh nh ng hi n t ưng này, các mơi tr ưng đưc dùng đ nuơi c y các vi sinh v t ưa axit ho c ưa ki m ph i đưc ti n hành kh trùng pH trung tính và sau khi h p áp l c m i axit hố ho c ki m hố mơi tr ưng. Ngồi ra cĩ nhi u thành ph n c a mơi tr ưng th ưng đưc kh trùng riêng nh ng ch đ pH khơng nh h ưng t i chúng, sau đĩ m i đưa vào mơi tr ưng mt cách vơ trùng v i s l ưng thích h p. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 24
27. Sau khi kh trùng, pH mơi tr ưng cĩ th b thay đ i đơi khi ph i ki m tra l i. 4.4. Phân ph i mơi tr ưng vào các d ng c Dng c đưc dùng ph i vơ trùng. ð kh trùng t t, mơi tr ưng ch đưc rĩt t i 1/2 dung tích c a v t ch a. V i các ng nghi m làm th ch nghiêng ch rĩt kho ng 1/4 chi u cao ng và 1/2 v i ng làm th ch đ ng. Lp mơi tr ưng càng d y vi c ti t trùng càng khĩ, h ơn n a áp l c cao mơi tr ưng s sơi m nh làm đy nút và ph t ra ngồi. ði v i các bình dùng đ nuơi VSV hi u khí trên máy l c ch rĩt kho ng 1/5 dung tích bình. ði v i bình dùng nuơi k khí, sau khi kh trùng d n m t s bình l i v i nhau trong điu ki n vơ trùng đ đ t đưc th tích c n thi t. 5. Kh trùng mơi tr ưng dinh d ưng Kh trùng là m t trong nh ng bi n pháp c n thi t và quan tr ng nh t trong th c nghi m vi sinh v t h c. Thu t ng " kh trùng" b t ngu n t ti ng La tinh v i ngh ĩa là s " làm tuy t d c". Trong vi sinh v t h c, kh trùng đưc hi u là làm ch t t t c m i vi sinh v t. Ti n hành kh trùng mơi tr ưng, d ng c , thi t b và các th khác đ tránh s phát tri n l n l n c a các h vi sinh v t ngo i lai vào gi ng đang nghiên c u. Vi c kh trùng mơi tr ưng và d ng c là vi c b t bu c ph i làm khi th c hi n t t c các bài t p. 5.1. Ph ươ ng pháp kh trùng mơi tr ưng dinh d ưng Mơi tr ưng dinh d ưng đưc kh trùng ch y u b ng cách h p trong n i hp áp l c. Ph ươ ng pháp này d a trên nguyên t c làm gia nhi t các v t b ng h ơi nưc bão hồ d ưi m t áp su t l n h ơn áp su t c a khí quy n. Khi áp su t h ơi nưc t ăng lên thì nhi t đ c ũng t ăng theo. Tác d ng ph i h p gi a nhi t đ cao và áp su t b o đ m cho vi c kh trùng th c hi n đưc t t. Khi h p áp l c s làm tiêu di t c t bào dinh d ưng l n bào t c a vi sinh v t. Khi ghi ch đ kh trùng b ng các đơn v áp su t 0,5 ; 1,0; 1,6; 2,0 atm cĩ ngh ĩa là ng ưi ta mu n nĩi đ n các áp su t b sung.Vi c t ăng áp su t h ơi n ưc đưc t o ra trong nh ng thi t b đ y kín thành dày, đĩng kín các ni h p áp l c. 5.2. Ch đ kh trùng mơi tr ưng Nhi t đ và th i gian kh trùng b ng cách h p áp l c tr ưc h t đưc quy t đnh b i thành ph n c a mơi tr ưng dinh d ưng. Các c ơ ch t cĩ ch a nh ng ch t khơng b n đ i v i nhi t đ 120 0C ph i đưc kh trùng 0,5 atm. S a, d ch t phân n m men, n ưc n m men và các mơi tr ưng ch a gelatin đưc kh trùng 0,5 atm trong 15 phút. Các mơi tr ưng cĩ ch a đưng, ch ng h n nh ư mơi tr ưng m ch nha, mơi tr ưng n ưc ép th c v t đưc kh 0,5 atm trong 20 -30 phút. Canh th t - pepton và th ch - th t - pepton đưc kh trùng 1 atm trong 20 -30 phút. Mơi tr ưng khoai tây n ưc chi t đ t đưc kh trùng 1,5 atm trong 30 phút. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 25
28. ð l a ch n ch đ kh trùng ph i tính đ n pH c a mơi tr ưng. Khi mơi tr ưng cĩ ph n ng axit, các h p ch t cao phân t trong đĩ cĩ th b thu phân khi h p áp l c. * V i các thành ph n mơi tr ưng kém b n nhi t cĩ th kh trùng theo các cách sau: - Ph ươ ng pháp Pasteur: đun nĩng dung d ch 80 oC/15 phút r i làm ngu i ngay. - Ph ươ ng pháp Tyndal: đun sơi cách thu dung d ch trong 30 phút, l p l i 3 ln m i l n cách nhau 24 gi . Hai ph ươ ng pháp này ch cĩ th di t các t bào dinh d ưng, khơng di t đưc các bào t kháng nhi t. - S d ng màng l c vi khu n: th ưng dùng đ kh trùng các thành ph n nh ư ch t kháng sinh, vitamin .Kích th ưc c a l màng l c vào kho ng 0,2 - 0,45àm. L c khu n khơng lo i đưc virus. 5.3. Cách làm đĩa th ch vơ trùng Ti n hành đ mơi tr ưng ra đĩ a trong điu ki n vơ trùng (s d ng phịng vơ trùng ho c t c y vơ trùng đã đưc lau c n và kh trùng b ng tia t ngo i). Tay ng ưi làm c ũng ph i đưc kh trùng b ng c n ho c dung d ch sát khu n. Các đĩa petri ph i đưc m i kh trùng trong vịng 24 gi . Bình mơi tr ưng m i đưc kh trùng, đ ngu i đ n 50-60 oC r i m i đ ra đĩa. Khơng đ khi mơi tr ưng nĩng >60 oC đ tránh h ơi n ưc đ ng trên n p đĩ a và m t th ch s d n đ n d b t p nhi m trong quá trình nuơi c y. Tr ưc khi đ nên quay trịn bình đ tr n đ u mơi tr ưng, tránh l c m nh sinh b t khí. Sau khi đ mơi tr ưng ra đĩ a, n u th y các b t khí ph i dùng que c y nung nĩng đ châm v b t khí khi th ch cịn nĩng, ch ưa đơng. ð yên cho th ch đơng trong đĩa và ngu i d n đ n nhi t đ phịng. X p các đĩ a mơi tr ưng thành t ng ch ng, bao kín b ng gi y vơ trùng. Cĩ th làm khơ m t th ch và ki m tra đ vơ trùng b ng cách m hé n p đĩa trong t c y th i khí vơ trùng ho c đ t các gĩi petri theo chi u ng ưc trong t m 2-3 ngày. Sau đĩ, ch n l a các đĩ a khơng nhi m VSV đ s d ng. 5.4. Cách làm mơi tr ưng th ch nghiêng Tr ưc tiên c n lau s ch m t bàn n ơi s đ t th ch nghiêng, đt m t th ưc (g , nh a) s ch cao kho ng 2-3 cm lên m t bàn, kh trùng m t bàn và th ưc bng c n. Tr i m t m nh v i ho c gi y vơ trùng trùm lên m t bàn và th ưc g . Sau khi kh trùng trong n i h p áp l c, c n làm ngu i các ng mơi tr ưng nhi t đ phịng ho c d ưi qu t mát m t lúc đ n khi ch cịn kho ng 50-60 oC đ tránh h ơi n ưc đ ng l i nhi u trên b m t th ch. Nh nhàng đt ng mơi tr ưng n m trên l p v i ho c gi y vơ trùng, đu cĩ nút kê trên th ưc, điu ch nh sao cho mép th ch cách xa nút bơng 3-4 cm. ðt các ng thành hàng xít nhau, h t m t hàng l i đ t ti p hàng sau g i lên hàng tr ưc. ð i Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 26
29. vi ng th ch dùng đ gi gi ng VSV ch c n đ t nghiêng vát m t chút đ mơi tr ưng gi đưc đ m trong th i gian dài. Nu cĩ đ d ng c , cĩ th cho các ng mơi tr ưng cĩ cùng kích c vào giá đng nhi u hàng, r i đ t c giá ng nghi m nghiêng đu m t gĩc trên th ưc. Do tính ch t đ ng đ u c a các ơ trên giá s giúp các ng mơi tr ưng đưc nghiêng đu nh ư ý mu n. Cách này giúp thao tác đt nghiêng đưc nhanh và b m t th ch nghiêng đu h ơn, cĩ th d dàng th c hi n v i m t s l ưng l n mơi tr ưng. Trong quá trình làm th ch đơng, khơng đưc rung bàn hay rung ng th ch. Sau khi th ch đơng, ng ngu i h n m i gĩi các ng th ch nghiêng b ng gi y vơ trùng, đt vào t m 30-37 oC đ ki m tra đ vơ trùng và làm khơ m t th ch. Sau vài ngày l y ra quan sát k b m t th ch phát hi n các khu n l c VSV. Soi ng nghi m d ưi ánh đèn đ tìm các khu n l c chìm trong th ch. Nh ng ng th ch nghiêng vơ trùng (khơng ch a các khu n l c VSV) đưc dùng đ làm thí nghi m và gi gi ng VSV. * Câu h i ơn t p: Bài s 3 1. Th nào là mơi tr ưng chuyên tính? 2. Trình bày S sai khác c ơ b n c a mơi tr ưng l ng, r n, bán r n? 3. Trình bày các b ưc c n thi t đ ti n hành ch t o mơi tr ưng? 4. Các d ng c , hĩa cht c n thi t đ ch t o mơi tr ưng? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 27
30. Bài s 4 NUƠI C Y VI SINH V T Mc đích, yêu c u: + Hi u rõ yêu c u đ i v i nghiên c u VSV là m i d ng c và điu ki n làm vi c ph i tuy t đ i vơ trùng. + Bi t đưc các k thu t nuơi c y VSV thơng d ng. +Bi t đưc m i lo i vi sinh v t yêu c u mơi tr ưng và điu ki n nuơi c y khác nhau. Ni dung : + Th c hành thao tác nuơi c y vơ trùng trên đĩa th ch và ng th ch ngiêng. + Ph ươ ng pháp ria c y phân l p VSV + Xác đnh mơi tr ưng chuyên tính thích h p cho m t s loi VSV. I. K THU T VƠ TRÙNG Trong phịng thí nghi m, VSV đưc nuơi c y nh m đ d dàng xác đnh và ki m tra kh n ăng sinh tr ưng c ũng nh ư trao đi ch t c a chúng. VSV đưc nhi m ho c đưa vào trong vài d ng mơi tr ưng nuơi c y giúp gi cho chúng sng, ho t đng và đ nghiên c u s sinh tr ưng c a chúng. Vi c nhi m VSV ph i đưc th c hi n trong điu ki n khơng cĩ các VSV khơng mong mu n khác ho c khơng b t p nhi m trong mơi tr ưng nuơi c y. K thu t vơ trùng đưc s dng trong nghiên c u VSV nh m lo i tr các s t p nhi m. Tt c các mơi tr ưng nuơi c y đưc kh trùng tr ưc khi s d ng. Vi c kh trùng th ưng đưc th c hi n b ng s d ng n i h p áp l c. Các d ng c ch a mơi tr ưng nh ư ng nghi m hay đĩ a Petri khơng nên m ra cho t i khi th c s làm vi c v i chúng, và th m chí sau đĩ c ũng v y. C hai ph ươ ng pháp nuơi c y trên đĩa petri hay trong ng nghi m cung cp s l ưng l n VSV trong m t di n tích nh và d dàng cho vi c v n chuy n. Th ch nghiêng là các ng nghi m ch a mơi tr ưng đ c đã đưc đ t nghiêng trong khi th ch đơng l i. Th ch nghiêng gi ng nh ư đĩa Petri cung c p m t b mt sinh tr ưng cho VSV nh ưng ng th ch nghiêng thì d b o qu n và v n chuy n h ơn. Th ch cho phép làm đơng c ng t n đáy ng nghi m t o ra m t mơi tr ưng th ch sâu. ð sâu th ưng đưc s d ng cho VSV c n ít oxy h ơn lưng đang cĩ trên b m t mơi tr ưng. Mơi tr ưng th ch bán r n ch ch a 0,5- 0,7% th ch thay cho 1,5% th ch cĩ th th ưng s d ng đ xác đ nh li u VSV cĩ di đng đưc hay khơng. Vi khu n di đ ng đưc s chuy n đ ng t đim nuơi cy t o ra s xu t hi n c a “cây noen” đ o ng ưc. S c y truy n và nhi m VSV th ưng đưc th c hi n v i m t que c y vơ trùng, đưc ph m t dây Niken-crom khơng b ăn mịn, ch u nhi t. Trong đĩ, đon cu i c a dây đưc u n cong thành m t cái mĩc vịng, nĩ đưc g i là m t que c y trịn, n u đ u dây kim lo i th ng thì g i là qua c y th ng. ð i v i nh ng Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 28
31. mc đích đ c bi t, s nuơi c y cĩ th c ũng đưc c y chuy n v i các mi ng g c cotton, pipet, que g t thu tinh ho c xilanh vơ trùng. Nh ng k thu t này r t thơng d ng trong nghiên c u VSV. Mt que c y trịn hay th ng đưc s d ng ph thu c vào d ng (tr ng thái) ca mơi tr ưng. Ng ưi ta cĩ th quy t đ nh trong khi làm thí nghi m tu ỳ điu ki n và m c đích thí nghi m. 1. V t li u thí nghi m - ng nghi m ch a mơi tr ưng n ưc th t - ng mơi tr ưng th ch nghiêng - ng mơi tr ưng th ch bán r n - Que c y đ u trịn, que c y đ u th ng - Giá ng nghi m, thu c nhu m Gram - Nuơi c y: d ch vi khu n Lactococcus lactic , Pseudomonas 2. K thu t yêu c u Ti n hành thí nghi m theo th t c sau: a) Th c hi n v i ch m t lo i d ch vi khu n trong 1 l n, ng ăn ch n b t k ỳ s tr n l n ho c nhi m chéo. B t đ u v i m t lo i n ưc canh thang, nh nhàng khố đáy và l c đ u l ng c n. b) ð c y vào dung d ch n ưc th t, gi que c y cĩ gi ng VSV trong tay thu n, m t ng mơi tr ưng tay kia. B1- Kh trùng đu que c y trịn b ng cách gi trên ng n l a ( đèn gas ho c đèn c n) cho đ n khi nĩng đ . B2- Gi que c y gi ng nh ư m t cái bút, u n cong ngĩn tay út ph i h p vi lịng bàn tay nh nhàng rút nút ra kh i ng nghi m trong khi quay ng. Khơng đưc đ t nút l y ra xu ng m t bàn làm vi c. B3- Gi ng nghi m nghiêng m t gĩc, chuy n mi ng c a ng nghi m hưng v ng n l a. Luơn gi ng nuơi c y và ng mơi tr ưng m i đ nghiêng đ gi m thi u l ưng b i b n cĩ th r ơi vào trong ng. Khơng đ đ u ng nghi m quá xa ho c dung d ch s c y r i kh i nút. B4- Nhúng đu que c y trịn đã kh trùng, đưc làm ngu i vào dung d ch nưc th t đ l y m t vịng s c c ăng b m t d ch nuơi c y. ðưa que c y ra ngồi, trong khi c m que c y đ t mi ng ng nghi m và đút nút l i b ng cách quay ng vào nút. ðt ng nghi m vào giá. B5- L y đ u nút ra kh i m t ng nghi m ch a mơi tr ưng n ưc th t đã kh trùng, h ơ mi ng ng trên ng n l a. Nhúng đ u que c y cĩ gi ng VSV vào mơi tr ưng và sau đĩ v m t đưng t đáy ng. H ơ mi ng ng mơi tr ưng và đy nút l i tr ưc khi đ t lên giá. B6- Kh trùng l i đ u que c y đ n khi nĩng đ r i đ ngu i. Nhi u khi ng ưi ta hay c m nhi u ng nghi m trên tay trong cùng m t l n c y (hình). Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 29
32. Khơng n m ngồi m c đích gi và c y chuy n gi a các ng nghi m nh ưng ph i th c hi n đưc k thu t c y chuy n vơ trùng. c) ði v i mơi tr ưng th ch nghiêng, l p l i b ưc 1-4 và c y trên th ch nghiêng b ng cách di chuy n đ u que c y nh nhàng ngang trên m t th ch t đáy ng lên phía đnh, ph i c n th n đ khơng ch c th ng m t th ch. H ơ mi ng ng nghi m trên ng n l a và đút nút l i. Kh trùng đu que c y, đ ngu i, dán nhãn trên ng nuơi c y. d) ði v i mơi tr ưng th ch bán r n, s d ng que c y th ng, l p l i b ưc 1-4. C y sâu vào mơi tr ưng b ng cách đâm sâu đ u que c y th ng vào gi a, sau đĩ rút ra. H ơ mi ng ng nghi m trên ng n l a và đy nút l i. ð t nĩng que c y, đ ngu i, dán nhãn ng nuơi c y. e) Nuơi các ng nuơi c y 35 oC v i th i gian thích h p. g) Ghi nh n hi n t ưng xu t hi n m i ng nuơi c y, tham kh o các hình m u. h) Xem mùi v xu t hi n c a các ng nuơi c y. Nhu m Gram và so sánh chúng. II. K THU T PHÂN L P VI SINH V T B NG PHA LỖNG Trong t nhiên, h u h t VSV sinh tr ưng trong mơi tr ưng cĩ ch a nhi u loi VSV khác nhau. Vi c nuơi c y h n h p ít đưc s d ng trong nghiên c u VSV b i vì khĩ kh ăn trong vi c xác đ nh riêng r t ng lo i vì khi đĩ chúng cùng các vi sinh v t khác cùng bi u l các ho t tính. Nuơi c y thu n khi t, ch ch a mt lo i VSV đơn là yêu c u trong các khái ni m nghiên c u nh ư đc tính, b nh phát sinh, trao đi ch t và kh n ăng kháng kháng sinh Trong nh ng n ăm 1970, Joseph Lister đã đt v n đ nuơi c y thu n khi t bng cách ti n hành dãy pha lỗng t i khi m i m t ơ v m t lý thuy t ch ch a mt vi khu n. Tuy nhiên, s thành cơng là r t gi i h n và s t p nhi m (cĩ m t các VSV khơng mong mu n) r t ph bi n. N ăm 1980, Robert Koch đ t n n mĩng cho mơi tr ưng đ c, nh đĩ các nhà VSV h c cĩ th tách r i VSV b ng pha lỗng và thu nh n chúng trên mơi tr ưng đ c. M t vi khu n đưc phát hi n da trên s hình thành khu n l c cĩ th nhìn th y đưc ch ch a m t lo i VSV. Hi n nay cĩ 3 ph ươ ng pháp nuơi c y th ưng đưc s d ng đ phân l p VSV: ria đĩa, g t đĩ a và đ đĩ a. Trong k thu t ria đĩ a, m t que c y trịn đưc s dng đ t o v t m u tr n nhi u l n trên b m t c a mơi tr ưng nuơi c y r n trong đĩa Petri. V m t lý thuy t, dùng que c y trịn t o v t nh c l i cho b m t th ch, VSV l n l ưt r ơi kh i que c y đưc phân b đ ng đ u trên m t th ch, mi t bào s phát tri n thành m t khu n l c. C y ria đĩ a là m t k ĩ thu t phân l p đang đưc s d ng ngày nay. Cy g t và đ đĩ a là k thu t đ nh l ưng cho phép xác đ nh s l ưng VSV trong m t m u c ơ ch t. Trong k thu t g t đĩ a, m t s l ưng nh m u pha lỗng xác đnh đưc g t trên đĩa mơi tr ưng đ c b ng cách s d ng m t que u n cong (hình d ng gi ng nh ư m t chi c g y hockey). Trong k thu t đ đĩ a, m t l ưng nh m u pha lỗng đưc tr n v i th ch nĩng ch y và đ tr c ti p vào đĩa Petri vơ trùng cịn r ng. Sau khi nuơi, VSV sinh tr ưng cĩ th nhìn th y là các khu n Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 30
33. lc trên ho c trong đĩ a th ch đã đ. ð xác đ nh s l ưng VSV trong m t m u ban đu, các đĩ a v i s khu n l c t 25-250 đưc l a ch n. ít h ơn 25 khu n l c là khơng đúng b i vì m t s t p nhi m đơn gây ra ít nh t 4% sai s . M t đĩ a cĩ ln h ơn 250 khu n l c thì khĩ đm. S l ưng VSV trong m u ban đ u đưc tính theo ph ươ ng trình sau: S l ưng khu n l c VSV/ml = đ pha lỗng 1. V t li u ðĩa Petri ch a mơi tr ưng th ch ng nghi m ch a th ch nĩng ch y ðĩa Petri vơ trùng, bình nĩn 250 ml Pipet 1 ml vơ trùng, pipet bĩp bĩng Mơi tr ưng th ch nghiêng Dch nuơi c y: 2 lo i vi khu n 2. Th t c ti n hành a. Dán nhãn vào đáy c a 2 đĩ a mơi tr ưng t ươ ng ng v i 2 lo i d ch nuơi c y. b. Kh trùng que c y: h ơ nĩng đ đ u que c y, làm ngu i r i l y vơ trùng mt vịng que c y d ch VSV c. Thao tác t o v t c y cĩ th th c hi n v i các đĩ a Petri đ t trên bàn ho c trên tay. - Nh c m t mép c a đĩ a petri lên và c y ph n đ u tiên b ng cách t o các đưng khơng ch ng nhau ( đưng rích r c). Khơng đưc làm x ưc m t th ch trong khi c y. - Kh trùng que c y, quay đĩ a ti p và ria qua m t khu v c c a ph n th hai sang ph n th ba ho c ria trên ph n cịn l i c a b m t th ch, c n c n th n tránh t o các đưng ch m vào các ph n c y tr ưc đĩ. - Kh trùng que c y tr ưc khi c m l i vào giá đng. d. Cĩ th ria c y trên nhi u đĩ a v i m t vài lo i d ch VSV. Sau đĩ dán nhãn, ghi tên ng ưi th c hi n, ngày và ngu n d ch nuơi c y. e. Nuơi các đĩa v a c y 30- 35 oC trong t đ nh ơn cho t i khi phát hi n các khu n l c riêng r phát tri n (th ưng t 24-48 h). Chú ý khi đt các đĩ a Petri trong t ph i đ ng ưc l i cho ph n n p đĩ a xu ng phía d ưi. g. Sau khi nuơi c y, ghi l i k t qu h. Ti p t c c y chuy n t m t khu n l c đơn dịng sang đĩa mơi tr ưng mi nhi u l n cho đ n khi thu đưc gi ng thu n khi t. Sau đĩ c y t m t khu n lc trên đĩa đã thu n vào ng mơi tr ưng th ch nghiêng đ gi gi ng. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 31
34. III. MƠI TR ƯNG CHUYÊN TÍNH Mơi tr ưng chuyên tính đưc s d ng đ phân l p các VSV mà s l ưng là gi i h n trong d ch pha lỗng cĩ nhi u VSV ưu th khác nhau. Ví d n u d ch đ phân l p cĩ 1 tri u t bào vi khu n A và ch cĩ 1 t bào vi khu n B, vi khu n B cĩ th b h n ch trong ph n ria c y th nh t đĩ a phân l p. ð giúp phân l p các VSV thi u s , các ph ươ ng pháp nuơi c y làm giàu và ch n l c cĩ th làm t ăng cưng s sinh tr ưng c a m t s VSV và h n ch s sinh tr ưng c a các VSV khác. Mơi tr ưng ch n l c ch a các hố ch t ng ăn ch n s sinh tr ưng c a các VSV khơng mong mu n mà khơng nh h ưng t i s sinh tr ưng c a các VSV c n phân l p. Mơi tr ưng làm giàu ch a các hố ch t kích thích s sinh tr ưng c a các VSV mong mu n. Các VSV khác s sinh tr ưng nh ưng s sinh tr ưng c a các VSV mong mu n s đơc t ăng lên. Mơi tr ưng chuyên tính là mơi tr ưng mà ch t o điu ki n cho s phát tri n thu n l i c a VSV A mà khơng t o điu ki n thu n l i cho VSV B (hay VSV B khơng phát tri n ho c phát tri n kém trên mơi tr ưng này). Da vào mơi tr ưng chuyên tính mà xác đnh đưc VSV A thơng qua vi c hình thành khu n l c c a VSVS đĩ. Mt lo i mơi tr ưng h u ích khác đ phân l p VSV là mơi tr ưng phân bi t. Mơi tr ưng này ch a vài lo i dinh d ưng cho phép kh o sát đ phân bi t mt lo i VSV này v i các lo i khác b ng trao đ i cht ho c thay đ i mơi tr ưng. Do cĩ nhi u ph ươ ng pháp và nhi u lo i mơi tr ưng nên ph i ch n th t c phù h p v i lo i VSV mong mu n. Ví d n u vi khu n B ch u đưc mu i cĩ th đưc thêm vào mơi tr ưng nuơi c y. Các điu ki n v t lý cĩ th đưc s dng đ l a ch n m t lo i vi khu n. N u vi khu n B cĩ kh n ăng kháng nhi t, mu cĩ th đưc đun lên tr ưc khi phân l p. Trong thí nghi m này, s xác đ nh tiêu chu n s d ng đ ch n m t mơi tr ưng nuơi c y. Hai lo i mơi tr ưng s đưc so sánh. 1. V t li u ðĩa Petri ch a mơi tr ưng phenylethyl alcohol agar ðĩa Petri ch a mơi tr ưng trypton agar Thu c nhu m Gram Hn h p d ch nuơi E. coli và Staphylococcus 2. Th t c ti n hành Mơi tr ưng trypton agar Mơi tr ưng phenylethyl alcohol agar Trypton: 1,0% Trypton: 1,0% Cao th t: 0,3 g Cao th t: 0,3 g NaCl: 0,5 g Phenylethyl alcohol: 0,25 Agar: 1,5 g NaCl: 0,5 g Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 32
35. a. S d ng m t cái bút đánh d u chia m i đĩ a thành 3 ph n b ng cách đánh d u d ưi đáy. Dán nhãn m t ph n trên m i đĩ a cho m i lo i d ch VSV. b. Ria m i lo i d ch VSV trên m t th ch nh ư hình v . c. ðt ng ưc các đĩ a nuơi trong t đ nh ơn 30-35 oC. Ghi l i k t qu sau 24, 48 và 72h nuơi c y. Nhu m Gram các khu n l c xu t hi n khác nhau và quan sát d ưi kính hi n vi. V hình quan sát đưc. * Câu h i ơn t p: Bài s 4 1. Các lo i d ng c hĩa ch t c n thi t đ ch t o mơi tr ưng? 2. Trình bày kh trùng t ng lo i d ng c , mơi tr ưng nuơi c y VSV? 3. Các b ưc ti n hành và cách làm phân l p, tuy n ch n và c y truy n VSV? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 33
36. Bài s 5 PH ƯƠ NG PHÁP L Y M U PHÂN TÍCH VI SINH V T Mc đích : + Hi u rõ ph ươ ng pháp và nguyên t c l y m u c ơ ch t đ phân tích VSV. + N m đưc các cách b o qu n và chu n b m u c ơ ch t phân tích VSV. Ni dung : + Ph ươ ng pháp l y m u c ơ ch t trên th c đ a. + B o qu n m u + Chu n b m u đ phân tích VSV. Nguyên lý: Mi m t bi n pháp k thu t tác đ ng vào đt hay c ơ ch t đ u gây ra s thay đi sinh v t đ t và ho t đ ng c a chúng trong mơi tr ưng. M c đ thay đ i ho t tính ph thu c vào kích c c a m u c ơ ch t và vi c x lý m u ti p theo (sàng, ph ơi khơ ho c làm l nh các m u c ơ ch t t ươ i l y t th c đ a). 1. Xác đnh s l ưng m u và d ng c đ l y m u 1.1 Xác đnh s l ưng m u c n l y: - Ph thu c vào m c tiêu, n i dung nghiên c u mà đnh ra yêu c u s l ưng và v trí l y m u ph i đ i di n. - Ph thu c vào điu ki n c th ngồi th c đ a, hay khu v c c n l y m u phân tích ðiu quan tr ng nh t ng ưi l y m u ph i th c hi n là l y m u sao cho đ ng nh t và ph i đ i di n đưc khu v c, khoanh đ t hay c ơ ch t cho khu đĩ, vùng đĩ. Ví d : s l ưng t ươ ng ng các m u c ơ ch t trong các đ ng ph th i, rác th i đưc l y t khu v c đã điu tra và đưc tr n l n đ t o thành m t m u đi di n. 1.2. Các v t li u c n chu n b đ l y m u - D ng c l y m u ( Dao, kéo, lõi tr , mai thu ng ) - C n, bơng vơ trùng - Xơ đng - Túi đng m u - Thùng làm l nh 1.3. M u đ i di n Các m u ng u nhiên cĩ th ch đ tr n đ u n u chúng đưc l y t m t khu vc đ ng nh t và đi di n. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 34
37. Ví d : N u l y m u đ t đ phân tích VSV đ t (c n d a vào yêu c u c a m c tiêu nghiên c u, đ chính xác đ n đâu, l y bao nhiêu m u, di n tích r ng h p c a t ng khoanh đt ) - Di n tích - ða hình - ð sâu theo t ng ph u di n đ t - Lo i hình s d ng đ t (th m chí l y theo ki u s d ng đ t) - Cây tr ng - ðiu ki n đ m Các m u đ t c n đưc l y khác bi t th c s . Nh ng khác bi t l n trong vùng lân c n ph i đưc lo i tr kh i m u. N u chúng cĩ t m quan tr ng đ c bi t thì m u ph i đưc l y riêng r . 2. Ph ươ ng pháp l y m u và v n chuy n m u 2.1 Nguyên t c l y m u ð đ m b o m u đ i di n, các đim l y m u ph i đưc phân b ng u nhiên trong di n tích điu tra. ðiu này t t nh t đưc ti n hành theo ph ươ ng pháp l y đim theo đưng chéo n u đ a hình đng nh t và di n tích < 1000 m 2 s l y 5 đim đ i di n. Ly m u khơng nên g n b ru ng ho c đưng, vì s l ưng VSV trong mu đ t đĩ s khơng đ i di n cho khoang đ t chính vùng đĩ. Khi l y m u g t b l p r c b m t (n u cĩ), sau đĩ c t vuơng xu ng phía d ưi. C nh ư v y l y càng nhi u đim càng t t. L y đưc đim nào l p t c ph i cho ngay vào túi đng m u đ trách s nhi m t p. Nu đ tài yêu c u phân tích VSV theo ph u di n đ t, thì đào ph u di n (nh ư ph n h c th nh ưng), sau đĩ l y đ t theo t ng t ng riêng bi t đ phân tích. Nu ru ng l y m u đang thâm canh các lo i cây tr ng c n, m t ru ng khơng đng nh , thì ph i xem xét c th th c đ a đ l y m u sao cho đ ng nh t và chính xác. Ví d : lu ng khoai, ngơ, s n, đ u, l c, rau thì khơng đưc l y đ t trên m t lu ng và d ưi rãnh lu ng, mà ph i l y s ưn lu ng, khơng đưc ly g n g c cây tr ng. Ly m u đ t đ phân tích t t nh t vào th i gian đ t t ươ ng đi n đ nh, ngh ĩa là ng ưi dân khơng tác đ ng nhi u vào đt (th ưng sau thu ho ch) Ly m u t các c ơ ch t khác, nh ư: đng rác th i, ph th i, c ũng c n ph i xem xét rt c th th c đ a sao cho l y m u chu n nh t, đ i di n nh t khu vc nghiên c u. Tr ng l ưng c n l y kho ng 200 gam/1 m u Ly m u phân tích VSV ph i đ m b o nguyên t c là vơ trùng, trách s nhi m t p, l y xong ph i cho m u vào phích l nh đ ng m u (vì sinh s n c a Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 35
38. VSV c c nhanh, n u khơng b o qu n trong điu ki n l nh ngay s li u phân tích s khơng chính xác) 2.2 V n chuy n m u Mu đ phân tích VSV, t t nh t l y xong chuy n ngay v phịng phân tích đ b o qu n. Trong quá trình v n chuy n m u khơng đưc làm th ng túi đ ng mu và luơn luơn gi trong phích l nh ( đ kìm hãm sinh tr ưng và phát tri n c a VSV trong m u) 3. B o qu n m u Tt nh t khi m u đã v t i phịng thí nghi m c n x lý m u và phân tích ngay (cơng vi c x lý m u ph i đưc th c hi n trong phịng vơ trùng đ trách t p khu n vào m u phân tích) Nu khơng k p phân tích, thì ph i b o qu n m u t l nh, nhi t đ < 3 0C. Mu đưc b o qu n khơng quá 30 ngày, t t nh t phân tích càng s m càng t t. * Câu h i ơn t p: Bài s 5 1. Chu n b d ng c trang thi t b c n thi t đ l y m u phân tích VSV? 2. Các b ưc ti n hành phân tích VSV trong m u c ơ ch t? 3. Trình bày các v n đ c n l ưu tâm trong b o qu n và phân tích VSV t m u c ơ ch t Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 36
39. Bài s 6 PH ƯƠ NG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH V T Mc đích : - Giúp cho h c viên bi t và th c hành m t s ph ươ ng pháp phân tích VSV trong c ơ ch t - Nm đưc ph ươ ng pháp phân tích VSV (nuơi c y trong mơi tr ưng d ch th và trên mơi tr ưng r n ho c bán r n) Ni dung: - Gi i thi u ph ươ ng pháp pha lỗng (chu n b d ch c y) - Nuơi c y VSV trong mơi tr ưng dung d ch - Nuơi c y VSV trên mơi tr ưng r n, bán r n - Ki m tra k t qu nuơi c y - Tính s l ưng VSV trong 1 gam hay 1 ml d ch mơi tr ưng. 1. Các b ưc phân tích 1.1 D ng c phân tích: - Bình tam giác, bình c u, ng nghi m (dung tích: 10ml, 100ml, 250 ml), Pipét chia đ 0,1 - 1,0 ml, 2ml, 5 ml, 10 ml), h p nhơm, que c y, que g t, bi th y tinh, gi y qu ỳ, khay men, cu c, khoan .T t c các d ng c đ u ph i ti t trùng. + Mơi tr ưng nuơi c y VSV đã kh trùng (Bài 3) 1.2 Chu n b bình n ưc vơ trùng làm dãy pha lỗng: Chu n b 10 bình tam giác ho c bình c u cĩ dung tích 100ml ho c 250 ml. Cho vào m i bình 90 ml n ưc máy (th ưng cho 92 ml, vì khi kh trùng b c h ơi kho ng 2 ml). ðem bình các bình đã cĩ n ưc ti t trùng h ơi 1 atm (121 0C) qua 30 phút. L y ra đ nguơi s đưc dãy pha lỗng, đánh s th t t 1 đ n 10. 1.3 Xác đnh đ m m u c n phân tích: Cân 10 gam m u c ơ ch t t ươ i cho vào h p nhơm, cĩ th cân c trong l ưng hpp nhơm khi ch ưa cĩ m u phân tích, sau đĩ đem s y t s y nhi t đ 105 0C qua 4 gi , đem h p nhơm đã s y ra cho vào bình hút m cho đ n khi ngu i. ðem cân tr ng l ưng, sau đĩ s y nhi u l n nh ư v y đ n khi tr ng l ưng khơng thay đ i, thì tính đ m c a m u phân tích theo cơng th c sau: A - B ð m X% = x 100 B - C X: ð m % A: Kh i l ưng h p + c ơ ch t cịn ưt. B: Kh i l ưng h p + c ơ ch t đã s y khơ. C: Kh i l ưng h p. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 37
40. Tính h s khơ ki t k: 1 k = 1 - x 1.4. Chu n b dãy pha lỗng Mu n đ m đưc s l ưng vi sinh v t d dàng, khi phân tích c n pha lỗng cơ ch t đ n m t đ nh t đ nh. C n l ưu ý r ng làm dãn m t đ VSV ph i pha lỗng t l luơn luơn = 1/10 - Cân 10g c ơ ch t cho vào bình th nh t đã cĩ 90 ml n ưc vơ trùng, l c 15 - 20 phút, trên máy l c 150 l n/ phút. Nh ư v y chúng ta đã cĩ dung d ch pha lỗng 10 -1, ngh ĩa là t l 1:10. - Dùng pipet 10ml hút 10 ml dung d ch n ng đ 10 -1 cho vào 90 ml nưc ng bình th 2, l c đ u, chúng ta cĩ n ng đ pha lỗng 10 -2 , t l 1:100. - Ti p t c làm nh ư v y đ i v i các bình th 3, 4 đ n khi chúng ta cĩ đưc dãy pha lỗng c n thi t, t l 10 -3 , 10 -4 , 10 Chú ý: các pipet đu ph i kh trùng, m i m t n ng đ pha lỗng ph i dùng 1 pipet riêng. Cĩ th chu n b dãy pha lỗng b ng ng nghi m cĩ ch a 9 ml n ưc, ho c bình tam giác cĩ ch a 45 ml n ưc vơ trùng . r i đem kh trùng nh ư làm v i bình tam giác. N u làm b ng ng nghi m, thì ch cân 1 gam c ơ ch t khơ, ho c 5 gam c ơ ch t khơ. Ngh ĩa là ta v n t o đưc dãy pha lỗng t l 1:10. ð phân tán đu d ch c ơ ch t trong ng nghi m dùng pipet hút d ch đư a lên đư a xu ng nhi u ln nh ưng khơng th i khí. 2. Nuơi c y Khi đã cĩ dung d ch pha lỗng r i, dùng pipét 0,1 ml l y t bình pha lỗng nào đĩ trong dãy pha loang c y vào trong mơi tr ưng đã chu n b s n cho tng nhĩm ho c t ng gi ng VSV đ nh phân tích. M i n ng đ ít nh t ph i c y 3 - 5 l n nh c l i (s l n nh c l i càng nhi u, thì k t qu cĩ đ tin c y càng cao). Cn c y ít nh t 3 n ng đ pha lỗng liên ti p. C y xong dung que g t th y tinh vơ trùng dàn đu d ch c y trên m t mơi tr ưng (n u mơi tr ưng rn ho c bán r n trên đĩa mơi tr ưng th ch). Cịn c y vào trong mơi tr ưng dung d ch trong các ng nghi m ho c bình dung d ch dinh d ưng ch cân l c nh là xong. Chú ý t t c các h p l ng ho c các bình mơi tr ưng thí nghi m đ u ph i đánh s th t theo nguyên t c sau: s m u nghiên c u n ng đ pha lỗng - s ln nh c l i. Ví d : 5.4.3 - ngh ĩa là m u phân tích s 5; c y n ng đ pha lỗng th 4; cy đĩ a mơi tr ưng cĩ s l n nh c l i th 3. Sau khi c y xong cho đĩ a, ho c bình nuơi c y vào trong t nuơi, nuơi nhi t đ thích h p cho t ng ch ng gi ng VSV khác nhau trong th i gian nh t đ nh (cĩ th t 48 - 72 gi , cĩ gi ng ph i nuơi lâu h ơn m i hình thành khu n l c) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 38
41. Cùng m t dung d ch c ơ ch t pha lỗng cĩ th phân tích nhi u m t nh ư nm, x khu n và các lo i vi khu n b ng cách c y vào mơi tr ưng thích h p. Mơi tr ưng cĩ th là d ch th , cĩ th là th ch b ng và t nh ng khu n l c đã mc trên mơi tr ưng th ch b ng và nh ng đ c tr ưng c a mơi tr ưng d ch th , chúng ta cĩ th tính s l ưng c a vi sinh v t. 3. Tính s l ưng vi sinh v t 3.1. Ph ươ ng pháp th ch b ng ( trên mơi tr ưng th ch ) - M i t bào vi sinh v t trên mơi tr ưng thích h p s phát tri n và cho chúng ta m t khu n l c. Do đĩ s l ưng khu n l c cho ta bi t s l ưng vi sinh vt trong m t gam c ơ ch t. - Sau khi VSV đã m c trên mơi tr ưng th ch đĩ a (h p l ng), đem đ m s lưng khu n l c đưc hình thành b ng máy đ m khu n l c, ho c đ m tr c ti p theo ph ươ ng pháp chia ơ trên đĩa mơi tr ưng. Kt qu đưc tính theo cơng th c sau: S = T x 10 x N x K S: S l ưng vi sinh v t trong m t gam c ơ ch t. T: S khu n l c trung bình trong m t h p petri 10: S khu n l c qui ra 1 ml ( vì lúc nuơi c y trong h p l ng chúng ta dùng 0,1 ml dung d ch c ơ ch t ) N: S ngh ch đ o c a n ng đ pha lỗng K: h s khơ ki t (N u khơng quy đi t khơ sang t ươ i) 3.2 Tính s l ưng vi sinh v t trong mơi tr ưng l ng ( ph ươ ng pháp đnh tính ) Cĩ nh ng lo i vi khu n khơng th dùng m t th ưng quan sát khu n l c ho c s n ph m sinh ra c ũng khơng cĩ màu gì đc bi t đ đánh giá vi khu n ho t đng. Trong tr ưng h p này ph i dùng ph n ng màu đ xác đ nh. C m i ng nghi m cĩ ph n ng màu g i là ng ( + ). D a vào các ng d ươ ng tính, c ăn c vào b ng Mc.Crady chúng ta tính ra s l ưng vi sinh v t. Ví d : ð pha 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8 10 -9 lỗng S ng 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ 0 dươ ng - Tìm s ch tiêu: 321 S ch tiêu là con s cĩ 3 hàng s . Hàng s đ u là s bi u hi n n ng đ lỗng nh t các ng nghi m đ u d ươ ng. Hai s ti p theo là s ng d ươ ng 2 nng đ ti p theo sau. - ðem s ch tiêu này tra b ng Mc.Crady ta s cĩ s l ưng vi khu n t ươ ng ng: 15 Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 39
42. - T con s này ta tính ra s l ưng vi khu n trong m t gam c ơ ch t theo cơng th c: S = t x 10 x n x k S: S l ưng vi sinh v t. t: S l ưng vi khu n tra b ng 10: S l ưng vi khu n qui ra 1 ml n: S ngh ch đ o c a n ng đ pha lỗng k: H s khơ ki t S= 15 x 10 x 10 3 x 1,52 = 2,28 . 10 5 t bào/1g * Câu h i ơn t p: Bài s 6 1. Trình bày ph ươ ng pháp pha lỗng? 2. Nh ng d ng c c n thi t đ làm dãy pha lỗng là gì? 3. Nguyên t c c ơ b n nh t c a ph ươ ng pháp pha lỗng đ nuơi c y VSV là gì? 4. Ph ươ ng pháp và cách tính s l ưng VSV trên mơi tr ưng đ c, mơi tr ưng l ng? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 40
43. Bài s 7 ðÁNH GIÁ ðC TÍNH SINH H C C A VI SINH V T Mc đích: - Giúp cho h c viên hi u rõ t m quan tr ng ph i đánh giá đ c tính sinh hc c a các VSV - Bi t đưc các ph ươ ng pháp c ơ b n đ đánh giá đ c tính sinh h c c a VSV N i dung: - ðánh giá th i gian m c c a ch ng gi ng c n nghiên c u - ðánh giá đưng kính khu n lc c c a ch ng gi ng c n nghiên c u - Xác đnh kh n ăng thích ng mơi tr ưng pH c a ch ng gi ng c n nghiên c u - Kh n ăng c nh tranh c a ch ng gi ng c n nghiên c u - Ho t tính c a ch ng gi ng c n nghiên c u 1. D ng c và nguyên v t li u 1.1 Dng c : ðĩa Petri, c n 76 0, n ưc vơ trùng, bình tam giác ho c bình c u 100, 250, 500, 1000 ml. Bình tia, lam kính, đèn c n, thu c nhu m, kính hi n vi. Mơi tr ưng nuơi c y ch ng gi ng VSV nghiên c u 2. ðánh giá đc tính sinh h c theo t ng ch tiêu: Vi c đánh giá đ c tính sinh h c c a các vi sinh v t đc tuy n ch n d a vào các ch tiêu sau: 2.1. Xác đnh th i gian m c c a các VSV Theo ph ươ ng pháp nuơi c y trên mơi tr ưng th ch b ng ho c trong mơi tr ưng dung d ch (tùy t ng gi ng VSV) t đ nh ơn nhi t đ t 28 - 60 0c (tùy thu c vào đc đim c a t ng lo i vi sinh v t). Theo dõi t ng th i gian khác nhau t 24, 48 ,72, 96, 120, 144, 168 gi . T ng th i gian trên quan sát khi VSV đã m c đưc trong th i gian nuơi t đnh ơn, thì tính gi . Xác đ nh xem ch ng gi ng đĩ thu c nhĩm m c nhanh hay mc ch m ( 72 gi thu c nhĩm m c ch m) 2.2. Xác đnh kích th ưc khu n l c đo tr c ti p b ng th ưc (mm). Do nhi u khu n l c sau đĩ tính trung bình trung (t t nh t nuơi 5 ngày mi đo) 2.3. Xác đnh kích th ưc t bào b ng ph ương pháp do tr c ti p b ng kính hi n vi (àm) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 41
44. C đ nh tiêu b n, nhu m t bào sau đĩ do b ng d ng c đo chuyên d ng d ưi kính hi n vi 2.4. Xác đnh kh n ăng thích ng mơi tr ưng pH khác nhau B ng ph ươ ng pháp nuơi c y tr c ti p các m c pH khác nhau, c th là: pH = 4,0; pH = 5,0; pH = 6,0; pH = 7,0; pH = 8,0. (pH kcl ) Cách làm nh ư sau: - Pha dung d ch đ m Sorensen 1: + Cân chính xác 9,078 g KH 2PO 4 1/15 M. + Cân chính xác 11,876g Na 2HPO 4. 2H 2O hồ vào 1 lít n ưc c t đưc dung d ch Na 2HPO 4 1/25 M. Sau đĩ pha 2 dung d ch này theo t l nh sau: ( đi v i 1000ml mơi tr ưng). pH T l trong dung d ch (ml) Na 2HPO 4 KH 2PO 4 4,0 0 100 5,0 5 95 6,0 30 70 7,0 80 20 8,0 99 1 pH chính xác c a mơi tr ưng đưc t o ra nh s giúp đ c a dung d ch đm photphat đc b sung vào mơi tr ưng vơ trùng v i s l ưng 10% so v i th tích c a mơi tr ưng. - Chu n b mơi tr ưng chuyên tính c a các ch ng vi sinh v t sau đĩ pha mơi tr ưng v i các n ng đ pH khác nhau, đem h p kh trùng (1at, 20 phút), đ ra đĩ a pettri (15 - 20 ml/1 đĩa pettri). Thí nghi m đưc nh c l i 4 l n 5 m c pH khác nhau. - Mơi tr ưng d ch th đưc cho vào các bình tam giác 100 ml ( 50 ml mơi tr ưng d ch th / 1 bình tam giác). C y 1 ml d ch khu n chuyên tính c a t ng ch ng vi sinh v t vào các bình tam giác đã chu n b trên r i đư a lên máy l c (150 vịng/ phút, trong vịng 48 gi ). Sau đĩ l y 0,05 ml d ch vi khu n đĩ c y vào mơi tr ưng th ch b ng ( đã đưc chu n b trên), dùng que g t ( đã kh trùng) g t đ u d ch vi khu n trên b m t th ch. Sau đĩ đem nuơi trong t đ nh ơn (nhi t đ t 28 - 30 0c). Sau 48 gi nuơi c y đưa ra đm s l ưng khu n l c m c t ng n ng đ pH khác nhau. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 42
45. 2.5. Xác đnh kh n ăng kháng kháng sinh (kh n ăng c nh tranh) Theo ph ương pháp nuơi c y tr c ti p trên mơi tr ưng cĩ Steptomixin v i các n ng đ khác nhau: 300, 500, 600, 800, 1000 mg/1lít mơi trưng (Obtin,1971). Cách làm nh ư sau: Pha thu c kháng sinh theo n ng đ đã đnh s n cho vào mơi tr ưng chuyên tính c a t ng ch ng vi sinh v t ( mơi tr ưng đã đưc kh trùng 1at, 30'). Sau đĩ chia ra các đĩa pettri r i đ ngu i. C y 0,05 ml d ch khu n chuyên tính c a t ng ch ng vi sinh v t đĩ a pettri, đem nuơi trong t đ nh ơn (nhi t đ t 28 - 30 0c). Sau 3 ngày nuơi c y đưa ra đm và quan sát s l ưng khu n l c m c t ng n ng đ kháng sinh khác nhau. 2.6. ðánh giá ho t tính c a các ch ng gi ng VSV Ch tiêu này ph thu c vào t ng VSV khác nhau, mà đánh giá ho t tính ca chúng khác nhau. Ví d : Nghiên c u v ho t tính phân h y cellulơ, ho t tính c đ nh nit ơ, ho t tính phân huye chuy n hĩa phospho khĩ tan Thí nghi m v xác đ nh ho t tính phân h y chuy n hĩa lân, thì: xác đnh c ưng đ phân gi i lân khĩ tan Dùng vi sinh v t: T 1, T 2. Nguyên li u: Apatit, photphorit, canxiphotphat. Vi c đánh giá c ng đ phân gi i lân khĩ tan theo 2 ph ơng pháp sau: ðo đưng kính vịng phân gi i c a vi sinh v t, cách làm nh ư sau: Cân 10g các ch t trên l n l ưt cho vào t ng lo i mơi tr ưng chuyên tính. ðem kh trùng ( 1at, 45') r i đ ra đĩ a pettri (kho ng 20 - 25 ml/1 đĩa) sau đĩ đ ngu i. Các ch ng vi sinh v t đưc hồ tan thành d ch huy n phù b ng n ưc c t vơ trùng. Dùng que c y l y d ch đĩ c y đim vào mơi tr ưng th ch b ng cĩ apatit, photphorit, canxiphotphat - Ca 3(PO 4)2. ðem nuơi trong t đ nh ơn (nhi t đ t 28 - 30 0c). Theo dõi sau 3 ngày/ 1 l n đo đưng kính vịng phân gi i c a tng ch ng vi sinh v t. Xác đnh c ưng đ phân gi i lân khĩ tan trên mơi tr ưng d ch th b ng ph ương pháp Oniani trên máy so m u. Cân 20g các ch t trên l n l ưt cho vào t ng lo i mơi tr ưng d ch th , kh trùng ( 1at, trong vịng 45'), sau đĩ đ ngu i. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 43
46. Cy gi ng vi sinh v t vào t ng mơi tr ưng chuyên tính trên và đư a lên máy l c (150 vịng/phút). C sau 3, 7, 15, 21, 30 ngày thì đo 1 l n trên máy so m u. * Câu h i ơn t p: Bài s 7 1. Trình bày nh ng ch tiêu c ơ b n đ đánh giá đc tính sinh h c c a các ch ng gi ng VSV c n nghiên c u? 2. Ph ươ ng pháp ch n và đánh giá t ng đ c tính sinh h c c a VSV đ tuy n ch n làm gi ng cho h c t p và nghiên c u? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 44
47. Bài s 8 PHÂN L P TUY N CH N VI KHU N AZOTOBACTER T ðT M c đích: - Gi i thi u cho h c viên bi t cách phân l p tuy n ch n ch ng gi ng VSV thu n khi t t đ t, mà c th trong bài là gi ng vi khu n Azotobacter. Ni dung: - Ph ươ ng pháp phân l p vi khu n Azotobacter. - Mơi tr ưng dinh d ưng đ phân l p vi khu n Azotobacter. - ðánh giá đc tính sinh h c c a vi khu n Azotobacter. - Bo qu n gi ng vi khu n Azotobacter. 1. Chu n b d ng c , nguyên v t li u và mơi tr ưng phân l p 1.1. D ng c , nguyên li u ðĩa Petri, c n 76 0, n ưc vơ trùng, bình tam giác ho c bình c u 100, 250, 500, 1000 ml. Bình tia, lam kính, đèn c n, thu c nhu m, kính hi n vi. Mu đ t đã sàng qua rây 2mm. Bình ch a 45 ho c 90 ml n ưc vơ trùng 1.2. Mơi tr ưng phân l p: s d ng mơi tr ưng Asby Glucơ 10g K 2HPO 4 0,5g MgSO 4 0,2g NaCl 0,2g K2SO 4 0,1g CaCO 3 5g Th ch 15 - 20g N ưc c t 1000ml Cân mơi tr ưng, đun tan th ch cho vào bình thu tinh cĩ nút mài, kh trùng 0,6 - 0,8 atm (105- 110 0C) trong 30 phút. ð m (50-60 oC) phân vào đĩa Petri 20-25 ml/ đĩa ( đưng kính 9 cm), cơng vi c này đưc ti n hành hồn tồn trong phịng vơ trùng. 2. Các b ưc phân l p vi khu n Azotobacter Cân 5g m u đ t cho vào bình tam giác 100 ml đã cĩ s n 45 ml n ưc vơ trùng, cho lên máy l c trong 20 phút t c đ 150 -200 l n/phút. Dùng que c y l y dung d ch l c ria c y lên mơi tr ưng th ch b ng. C y thành nhi u đưng th ng song song ho c c y ria 3 pha v i l ưng d ch gi m d n. Sau đĩ đem nuơi trong t đ nh ơn 25 - 28 0C trong 2 - 3 ngày đi v i vi khu n mc nhanh. ð 5 - 7 ngày đi v i vi khu n m c ch m. Khu n l c Azotobacter cĩ màu tr ng trong, l i nh y khi cịn non, khi già cĩ màu vàng l c ho c màu nâu s m, biên khu n l c đ u. Vi khu n gram âm, khơng sinh bào t , di đ ng nh tiên mao. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 45
48. 3. Xác đnh hình thái khu n l c, t bào và kh n ăng di đng c a Azotobacter - Quan sát các khu n l c VSV đã m c trong đĩ a petri. Nh n xét miêu t và v hình d ng các khu n l c đ ng riêng r . Khi miêu t các khu n l c khơng m n p đĩa petri. Ghi chép các đ c đim c a khu n l c vào b ng theo m u sau: Khu n Hình ðưng ð Màu B Nhìn Mép Cu ð Hu ỳnh Hình lc dng kính, sáng, sc mt nghiêng trúc ch t quang v s mm đ khu n trong lc - Làm tiêu b n gi t treo quan sát s di đ ng c a Azotobacter . V d ng di chuy n. - Làm tiêu b n khơ, nhu m Gram, quan sát hình thái c a vi khu n. V hình. ð phân l p đưc gi ng Azotobacter thu n khi t, dùng ph ươ ng pháp lo i dn tr c ti p trên đĩa mơi tr ưng Asby. Nu quan sát khu n l c khơng thu n ho c b nhi m t p ta lo i ngay. 4. Tuy n ch n ch ng gi ng Azotobacter Khi đã phân l p đưc ch ng gi ng Azotobacter thu n khi t r i, cơng vi c ti p theo bu c ph i ti n hành đánh giá đc tính sinh h c c a ch ng gi ng m i đưc phân l p. ðánh giá đc tính sinh h c b ng các ch tiêu sau: (trong bài th c hành v đánh giá đc tính sinh h c c a VSV) - Th i gian m c - Kích th ưc khu n l c - Kh n ăng m c mơi tr ưng pH r ng - Kh n ăng c nh tranh (Kháng kháng sinh) - Ho t tính c đ nh nit ơ phân t - Kh n ăng phát tri n trên mơi tr ưng t o các enzym 5. B o qu n ch ng gi ng Azotobacter Cơng tác b o qu n ch ng gi ng VSV là vi c làm r t c n thi t và di n ra th ưng xuyên. Khi đã phân l p tuy n ch n đưc ch ng gi ng VSV nh ư ý mu n r i, thì vi c thu n hĩa, b o qu n là r t quân tr ng. Ph i c y truy n và nuơi nh c l i r t nhi u l n đ nh n đưc gi ng ch ng thu n khi t. Sau đĩ ph i th c hiên đúng nguyên t c trong cơng tác b o qu n gi ng VSV t i phịng thí nghi m. (s gi i thi u trong bài th c hành v b o qu n và gi gi ng VSV) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 46
49. * Câu h i ơn t p: Bài s 8 1. Trình bày các tiêu trí đ phân l p, tuy n ch n ch ng gi ng Azotobacter trong đt? Mơi tr ưng nuơi c y? 2. Nêu đc tính sinh h c c a ch ng gi ng Azotobacte c n tuy n ch n? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 47
50. Bài s 9 PH ƯƠ NG PHÁP L Y M U VÀ PHÂN L P TUY N CH N VI KHU N NT S N (VKNS) – RHIZOBIUM Mc đích: - Gi i thi u cho h c viên bi t ph ươ ng pháp l y m u n t s n r cây h đ u đ phân l p ch ng gi ng vi khu n Rhizobium (vi khu n c đ nh nit ơ phân t c ng sinh) Ni dung: - Hi u đưc các b ưc phân l p tuy n ch n vi khu n Rhizobium - Xác đnh đưc ch ng gi ng vi khu n Rhizobium m i phân l p - ðánh giá đc tính sinh h c c a ch ng gi ng Rhizobium m i phân l p - Bo qu n và s d ng ch ng gi ng Rhizobium m i phân l p 1. Dng c và nguyên v t liêu a. Dng c : Dao, kéo, k p s t, kéo, h p l ng, c n 76 0, 95 0 n ưc vơ trùng, bìng tam giác ho c bình c u 100, 250, 500, 1000ml, dung d ch HgCl 2 0,1%. bình tia, lam kính, đèn c n, thu c nhu m, kính hi n vi, b. Mơi tr ưng Pochon Manit hay glucơ 10g K 2HPO 4 0.5g MgSO 4 0,2g NaCl 0,2g Nưc men bia 100ml CaCO 3 1g Cơngơ đ 1% 10ml Th ch 15 - 20g Nưc c t 880ml Cân mơi tr ưng cho vào bình thu tinh cĩ nút mài, kh trùng 0,6 - 0,8 át.m (105- 110 0C) qua 30 phút. ð m phân vào h p l ng 25- 30ml/ h p, cơng vi c này đưc ti n hành hồn tồn trong phịng vơ trùng. 2. Phân l p vi khu n Rhizobium Ly r cây đ u đ cĩ n t s n to, nhi u k s c tr ng, màu h ng th i k ỳ cây ra hoa, mang v phịng thí nghi m phân l p. Bên ngồi n t s n cĩ nhi u t p khu n, ph i ti t trùng tr ưc khi phân l p. R a s ch n t s n, l y kéo c t n t s n ra kh i r . Chú ý khơng làm n t s n xây xát. Cho n t s n vào n ưc trong r a th t 0 sch, cho vào c n 95 trong 3 phút, cho ti p vào dung d ch HgCl 2 0,1% trong 5 phút, r a b ng n ưc vơ trùng 5 - 6 l n, m i l n 3 - 5 phút. Cho n t s n vào h p lng cĩ m t ít n ưc vơ trùng. Dùng k p s t bĩp nát và làm thành dung d ch n t s n (cĩ th dùng dao lam đã kh trùng c t n t s n). Dùng que c y l y dung d ch n t s n cy lên mơi tr ưng th ch ph ng. C y thành nhi u đưng th ng song song v i l ưng dch gi m d n. Sau đĩ đem nuơi t nuơi cĩ 25 - 28 0C trong 2 - 3 ngày đi v i vi khu n m c nhanh. ð 5 - 7 ngày đi v i vi khu n m c ch m. Khu n l c n t s n cĩ màu trong su t ho c 1/2 trong su t. Biên khu n l c đ u. N u cĩ cơngơ đ hay Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 48
51. violet gentian khu n l c v n khơng b nhu m màu. Vi khu n gram âm, khơng bào t , di đ ng nh tiên mao. 3. Xác đnh kh n ăng c đnh nit ơ 3. 1. Thí nghi m tr ng cây trong ng th ch: Ph ươ ng pháp này cho phép nh n bi t cĩ kh n ăng c đ nh nit ơ c a vi khu n n t r . Mơi tr ưng dùng đ tr ng cây gây nhi m: Mơi tr ưng Jenhsen (1942) ho c mơi tr ưng Thornton (1930) Mơi tr ưng Jenhsen Mơi tr ưng Thornton CaHPO 4 1,0g CaHPO 4 2,0g K2HPO 4 0,2g K2HPO 4 0,5g MgSO 4.7H 2O 0,2g MgSO 4.7H 2O 0,2g FeCl 3 0,1g NaCl 0,1g Nưc 1000ml Nưc 1000ml Th ch 8 - 15g Th ch 8 - 15g pH = 6,5 - 7,0 pH = 6,5 - 7,0 Cĩ th dùng ng mơi tr ưng th ch nghiêng ho c đ ng. Dùng dung d ch dinh d ưng Gibson (1963) 1ml/lit mơi tr ưng. Thành ph n dung d ch vi l ưng nh sau: H3PO 3 0,05g; (NH 4)2MoO 4 0,05g KCl 0,005g NaBr 0,005g ZnSO 4 0,003g Al(SO 4).18H 2O 0,003g MnSO 4 0,002g N ưc c t 1000ml Chu n b ng mơi tr ưng: ng nghi m 150 x 20mm cho h t đ u nh ng nghi m 200 x 30mm cho h t đ u l n Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình th c t p vi sinh v t chuyên ngành 49