Giáo trình Tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành cây Lily Sorbonne

Nội dung text: Giáo trình Tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành cây Lily Sorbonne

1. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành cây Lily Sorbonne Trần Thanh Thắng Trần Thanh Hương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (Bài nhận ngày 27 tháng 07 năm 2016, nhận đăng ngày 02 tháng 12 năm 2016) TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, các chất điều hòa phân chia tế bào với sự hình thành các tế bào có tăng trường thực vật 2,4-dichlorophenoxyacetic nhân to, vách mỏng và hầu như không chứa hạt acid (2,4-D), picloram, 6-benzylaminopurine tinh bột; tạo vùng phát sinh hình thái chồi; hình (BA) hay thidiazuron (TDZ) ở các nồng độ khác thành mô phân sinh ngọn chồi và cuối cùng là nhau, riêng lẻ hay phối hợp được dùng để cảm chồi với các phác thể lá. Trong sự phát sinh chồi ứng sự phát sinh chồi từ vảy hành Lily Sorbonne. có sự gia tăng cường độ hô hấp, hoạt tính IAA và Các biến đổi hình thái và sinh lý trong quá trình zeatin. Sự dùng các chất ức chế vận chuyển hình thành chồi được phân tích. Sự phát sinh auxin,1-naphthoxyacetic acid (1-NOA) và N-1- chồi đạt cao nhất trên môi trường Murashige và naphthylphthalamic acid (NPA) cho thấy vai trò Skoog (MS) có sự phối hợp bổ sung 2,4-D 1 của sự di chuyển hữu cực của auxin trong sự mg/L, BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L và indole-3- phát sinh chồi. Mối liên hệ giữa các chất điều acetic acid (IAA) 0,5 mg/L. Sự hình thành chồi có hòa tăng trưởng thực vật, cường độ hô hấp và sự nguồn gốc từ các tế bào nhu mô cách biểu bì vài phát sinh chồi được thảo luận. lớp tế bào và trải qua các giai đoạn: hoạt hóa và Từ khóa: chất điều hòa tăng trưởng thực vật, Lily, sự di chuyển hữu cực của auxin, sự phát sinh chồi, vảy hành MỞ ĐẦU Lily là một trong những loài hoa có giá trị thường được sử dụng làm giống vì giúp rút ngắn kinh tế cao được xếp thứ bảy trên thị trường hoa thời gian để thu hoạch hoa. Hiện nay, tại Việt cắt cành thế giới và thứ hai trong các loài hoa Nam hành giống Lily phần lớn được nhập khẩu thuộc nhóm thực vật có hành sau Tulip nhờ sự đa từ nước ngoài hoặc từ việc giâm vảy hành trong dạng về màu sắc, hình dạng, hương thơm và độ điều kiện vườn ươm. Tuy nhiên, phương pháp bền [1]. Ngoài ra, Lily còn là một loại thảo dược này gặp khá nhiều khó khăn như hệ số nhân có giá trị do chứa nhiều hợp chất thứ cấp như giống thấp, chất lượng cây giống không đồng acid gallic, rutin, epicatechin [2]. Trong tự điều và dễ bị thoái hóa. Bên cạnh đó, việc tạo nhiên, cây Lily có thể phát triển từ hột hoặc hành. hành giống theo phương pháp này dễ làm lây lan Tuy nhiên, sự nảy mầm của hột Lily cần thời gian các bệnh do nấm và virus. Vi nhân giống trong khá dài (khoảng 2 tháng). Bên cạnh đó, tỉ lệ nảy điều kiện in vitro là một trong những phương mầm của hột thấp và cây con sau khi nảy mầm pháp giúp tạo số lượng lớn cây con đồng nhất và tăng trưởng chậm dẫn đến thời gian cần để cây ra tương đối sạch bệnh [3]. Chính vì vậy, chúng tôi hoa bị kéo dài. Do đó, trong sản xuất, hành Lily tiến hành phân tích những thay đổi hình thái và Trang 105
2. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 sinh lý trong quá trình phát sinh chồi in vitro từ hợp với BA (0,5; 1,0; 1,5 hay 2,0 mg/L) hay TDZ vảy hành của cây Lily Sorbonne. (0,05; 0,10; 0,15 hay 0,20 mg/L). Các mẫu cấy o VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP được đặt nuôi trong tối, ở nhiệt độ 22 ± 2 C và Vật liệu ẩm độ 58 ± 3 %. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 erlen, mỗi erlen gồm 3 mẫu cấy. Sau 4 Hành (củ) Lily 8 tuần tuổi (Hình 1) tăng tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu trưởng trên môi trường Murashige và Skoog căn cấy, chiều cao chồi và số vảy lá/chồi được xác bản (MS) [4], có nguồn gốc từ sự nuôi cấy vảy định. hành Lily trồng trong vườn. Phương pháp Quan sát các biến đổi hình thái Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng Các biến đổi hình thái trong quá trình phát trưởng thực vật riêng lẻ trên sự phát sinh chồi từ sinh chồi từ vảy hành được quan sát trực tiếp, vảy hành Lily dùng kính hiển vi soi nổi hay kính hiển vi quang học sau sự cắt bằng tay hay máy vi phẫu. Sự cắt Các vảy hành có chiều rộng khoảng 1 cm và bằng máy vi phẫu được thực hiện như sau: Mẫu dài 2 cm từ các hành Lily in vitro 8 tuần tuổi tăng cấy được cố định trong dung dịch FAA (ethanol trưởng trên môi trường MS được cô lập và cấy 70 % : formalin : acetic acid = 8:1:1 v/v). Sau 18 vào trong erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường giờ, loại FAA bằng ethanol 70 % rồi đặt lần lượt MS căn bản hay MS có bổ sung các chất điều hòa trong một chuỗi các dung dịch ethanol (80, 85, tăng trưởng thực vật riêng lẻ, ở các nồng độ thay 90, 95, 100 %) và butanol. Sau khi loại nước, đổi như sau: mẫu được vùi trong parafin tan ở 56 oC (mã số Picloram ở nồng độ 1, 2, 3 hay 4 mg/L; 1.07337.1000, Merck) và cắt dọc thành các lát 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) ở mỏng 7 µm bằng máy vi mẫu (Rotary microtome, nồng độ 0,5; 1,0; 2,0 hay 3,0 mg/L; Microm HM340E). Các lát mỏng parafin mang 6-Benzylaminopurine (BA) ở nồng độ 0,5; mẫu được dán trên lam nhờ dung dịch gelatin 3 1,0; 1,5 hay 2,0 mg/L; hay %. Sự loại parafin được thực hiện nhờ một chuỗi Thidiazuron (TDZ) (0,05; 0,10; 0,15 hay 0,20 các dung dịch methylcyclohexan, ethanol (100, 95, 85, 70, 50, 30) và nước cất [5]. Cuối cùng, mg/L). mẫu được nhuộm bằng phẩm nhuộm hai màu đỏ Các mẫu cấy được đặt nuôi trong tối, ở nhiệt carmin – xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi độ 22 ± 2 oC và ẩm độ 58 ± 3 %. Thí nghiệm quang học. được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 erlen, mỗi erlen gồm Đo cường độ hô hấp 3 mẫu cấy. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi và số vảy Cường độ hô hấp (µmol O2/g trọng lượng lá/chồi được xác định. tươi/giờ) của mẫu cấy được xác định bằng điện cực oxygen dựa trên sự giảm tỉ lệ oxygen trong Khảo sát ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ buồng đo (LeafLab2, Hansetech) theo thời gian, ở nhiệt độ 22 oC, trong tối. Kết quả là giá trị vảy hành Lily trung bình của 5 lần lặp lại. Các vảy hành có chiều rộng khoảng 1 cm và dài 2 cm từ các hành Lily in vitro 8 tuần tuổi tăng Ly trích và đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật trưởng trên môi trường MS được cô lập và cấy vào trong erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật auxin MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/L riêng lẻ hay phối (indole-3-acetic acid) (IAA), cytokinin (zeatin), Trang 106
3. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 gibberellin và abcisic acid (ABA) có trong mẫu trưởng trên môi trường MS được cô lập và cấy cấy được ly trích và cô lập bằng cách dùng các vào trong erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường dung môi thích hợp và thực hiện sắc ký trên bản MS có phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mỏng silicagel 60 F254 (mã số 1.05554, Merck), mg/L hay MS có phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L, ở nhiệt độ 29 oC với dung môi di chuyển BA 1,5 mg/L zeatin 0,2 mg/L và IAA 0,2 mg/L. chloroform : methanol : acetic acid (80:15:5 v/v). Các mẫu cấy được đặt nuôi trong tối, ở nhiệt độ Vị trí của các hormone tăng trưởng thực vật được 22 ± 2 oC và ẩm độ 58 ± 3 %. Thí nghiệm được phát hiện nhờ quan sát trực tiếp dưới tia lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 erlen, mỗi erlen gồm 3 ultraviolet (UV). Hoạt tính các hormone tăng mẫu cấy. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo chồi, trưởng thực vật được đo bằng sinh trắc nghiệm: số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi, chiều rộng chồi diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) cho auxin và acid và số vảy lá/chồi được xác định. abcisic, tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.) cho Xử lý thống kê cytokinin và cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) Kết quả thí nghiệm được phân tích bằng cho gibberellin [6, 7]. chương trình thống kê SPSS (Statistical Package Khảo sát ảnh hưởng của chất ức chế sự vận for the Social Sciences) dùng cho Window phiên chuyển auxin trên sự phát sinh chồi từ vảy hành bản 15.0. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95 % Lily của giá trị được thể hiện bởi các mẫu tự hoặc chữ Các vảy hành có chiều rộng khoảng 1 cm và số kèm theo. dài 2 cm từ các hành Lily in vitro 8 tuần tuổi tăng KẾT QUẢ trưởng trên môi trường MS được cô lập và cấy Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng vào trong erlen 100 mL chứa 30 mL môi trường thực vật riêng lẻ trên sự phát sinh chồi từ vảy MS có sự phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L và BA hành Lily 1,5 mg/L hay MS có sự phối hợp bổ sung 2,4-D 1 Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có mg/L, BA 1,5 mg/L và N-1-Naphthylphthalamic bổ sung auxin hay cytokinin riêng lẻ ở các nồng acid (NPA) 3,45 mg/L (10 µM) (chất ức chế sự độ thay đổi, tỉ lệ mẫu tạo chồi đạt cao nhất ở mẫu vận chuyển auxin ra khỏi tế bào) hay 1- cấy tăng trưởng trên môi trường có bổ sung 2,4-D Naphthoxyacetic acid (1-NOA) 4,95 mg/L (10 1 mg/L. Số chồi/mẫu cấy đạt cao nhất khi nuôi µM) (chất ức chế sự vận chuyển auxin vào trong cấy trên môi trường có bổ sung BA 1,5 hay 2 và ra khỏi tế bào). Các mẫu cấy được đặt nuôi mg/L. Số vảy lá/chồi đạt cao nhất ở mẫu cấy tăng trong tối, ở nhiệt độ 22 ± 2 oC và ẩm độ 58 ± 3 trưởng trên môi trường có bổ sung BA 1 hay 1,5 %. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 erlen, mg/L. Chiều cao chồi đạt cao nhất ở mẫu cấy mỗi erlen gồm 3 mẫu cấy. Sau 4 tuần nuôi cấy, tỉ tăng trưởng trên môi trường có bổ sung TDZ ở lệ mẫu tạo chồi, số chồi/mẫu cấy, chiều cao chồi nồng độ 0,1; 0,15 hay 0,2 mg/L. Trên môi trường và số vảy lá/chồi được xác định. có bổ sung picloram, bên cạnh sự phát sinh chồi Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có sự hình thành mô sẹo, nồng độ picloram càng trên sự phát sinh chồi từ vảy hành Lily cao sự hình thành mô sẹo càng nhiều (Hình 2A- Các vảy hành có chiều rộng khoảng 1 cm và E, Bảng 1). dài 2 cm từ các hành Lily in vitro 8 tuần tuổi tăng Trang 107
4. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Bảng 1. Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở các nồng độ thay đổi trên sự phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau 4 tuần nuôi cấy Chất điều hòa Sự hình Nồng độ Tỉ lệ mẫu tạo Chiều cao tăng trưởng Số chồi/mẫu cấy Số vảy lá/chồi thành (mg/L) chồi (%) chồi (mm) thực vật mô sẹo Đối chứng (MS) 22,22 ± 2,22f 1,33 ± 0,33cd 5,50 ± 0,29e 2,67 ± 0,33e 0,50 51,11 ± 2,22d 1,67 ± 0,33bcd 5,67 ± 0,17e 2,33 ± 0,33e 1,00 75,55 ± 2,22a 1,53 ± 0,26bcd 7,50 ± 0,29cd 3,00 ± 0,00de 2,4-D 2,00 64,45 ± 2,22bc 1,83 ± 0,17bc 7,67 ± 0,33c 3,67 ± 0,33d 3,00 48,89 ± 2,22d 1,33 ± 0,33cd 5,67 ± 0,33e 3,00 ± 0,58de 1,00 15,50 ± 1,50g 1,12 ± 0,12d 7,67 ± 0,33cd 2,53 ± 0,67e + 2,00 9,53 ± 1,84h 1,11 ± 0,26d 6,67 ±0,33d 2,53 ± 0,33e ++ Picloram 3,00 2,20 ± 1,50i 1,00 ± 0,04d 5,67 ± 0,33e 2,33 ± 0,33e +++ 4,00 - - - - ++++ 0,50 37,78 ± 2,22e 1,30 ± 0,15cd 4,50 ± 0,29f 6,67 ± 0,33c 1,00 48,89 ± 2,22d 1,88 ± 0,19bc 6,83 ± 0,17d 11,67 ± 0,33a BA 1,50 55,56 ± 4,44cd 3,33 ± 0,17a 7,00 ± 0,00cd 12,33 ± 0,33a 2,00 64,45 ± 2,22bc 3,76 ± 0,15a 7,17 ± 0,17cd 10,00 ± 0,00b 0,05 26,67 ± 0,00f 1,17 ± 0,08cd 8,50 ± 0,29b 2,67 ± 0,33e 0,10 53,33 ± 6,67c 1,48 ± 0,26cd 9,50 ± 0,29a 2,67 ± 0,33e TDZ 0,15 55,55 ± 2,22cd 1,31 ± 0,03cd 9,83 ± 0,17a 2,67 ± 0,33e 0,20 66,67 ± 0,00b 1,13 ± 0,07d 9,33 ± 0,33a 3,00 ± 0,58e Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05. (-), Không có sự phát sinh chồi; (+), Mẫu cấy có sự hình thành mô sẹo. Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất điều hòa nhất trên môi trường có bổ sung 2,4-D 1 mg/L và tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ BA ở nồng độ 1,5 mg/L hay 2 mg/L. Sự phối hợp vảy hành Lily bổ sung 2,4-D với BA hay TDZ ở các nồng độ Sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có thay đổi không giúp gia tăng chiều cao chồi. Sự sự phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L và BA hay bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau (0,5-2,0 TDZ ở các nồng độ thay đổi, tỉ lệ mẫu tạo chồi mg/L) đều giúp các chồi gia tăng số vảy lá (Hình đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 2,4-D 1 2F, Bảng 2). mg/L và BA 1,5 mg/L. Số chồi/mẫu cấy đạt cao Bảng 2. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2,4-D và BA hay TDZ ở các nồng độ thay đổi trên sự phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau 4 tuần nuôi cấy Chất điều hòa tăng Nồng độ Tỉ lệ mẫu tạo Số chồi/mẫu Chiều cao Số vảy lá/chồi trưởng thực vật (mg/L) chồi (%) cấy chồi (mm) Đối chứng (MS với 2,4-D 1 mg/L) 75,55 ± 2,22b 1,53 ± 0,26d 7,50 ± 0,29a 3,00 ± 0,00c 0,50 71,11 ± 2,22b 2,33 ± 0,17c 5,17 ± 0,17cd 12,67 ± 0,33a 1,00 68,89 ± 2,22b 3,00 ± 0,29b 4,23 ± 0,15e 13,00 ± 0,00a BA 1,50 84,45 ± 2,22a 4,43 ± 0,07a 4,10 ± 0,06e 13,33 ± 0,33a 2,00 73,33 ± 0,00b 4,53 ± 0,17a 4,07 ± 0,15e 13,33 ± 0,33a 0,05 55,56 ± 2,22d 1,17 ± 0,17d 5,73 ± 0,15b 3,33 ± 0,33c 0,10 71,11 ± 2,22b 1,23 ± 0,15d 5,13 ± 0,07d 6,00 ± 0,58b TDZ 0,15 62,22 ± 2,22c 1,17 ± 0,17d 4,50 ± 0,29e 3,67 ± 0,33c 0,20 57,78 ± 2,22cd 1,07 ± 0,17d 4,53 ± 0,29e 3,00 ± 0,00c Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05. Trang 108
5. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Sự phát sinh hình thái chồi sinh ngọn chồi đang trong giai đoạn phân chia Vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy, các tế bào hình thành phác thể lá đầu tiên hình thành (Hình nhu mô của vảy hành có sự sắp xếp tương đối 6). Sau 20 ngày nuôi cấy, xuất hiện vòm mô phân đồng đều và chứa nhiều hạt tinh bột (Hình 3). sinh ngọn chồi với hai phác thể lá (Hình 7) và sau Sau 5 ngày nuôi cấy, một số tế bào nhu mô dưới 24 ngày nuôi cấy, là sự xuất hiện của chồi hoàn biểu bì được hoạt hóa và phân chia. Các tế bào chỉnh (Hình 8). đang ở trạng thái phân chia có nhân to và hầu như Cường độ hô hấp không chứa các hạt tinh bột (Hình 4). Sau 10 Cường độ hô hấp của mẫu cấy tăng trưởng ngày nuôi cấy, vùng phát sinh hình thái chồi xuất trên môi trường MS có sự phối hợp bổ sung 2,4- hiện với sự hiện diện của các tế bào có kích D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L cao hơn so với mẫu thước nhỏ, nhân to và không chứa hạt tinh bột cấy tăng trường trên môi trường MS không hay (Hình 5). Sau 17 ngày nuôi cấy, vòm mô phân có bổ sung 2,4-D hay BA riêng lẻ (Bảng 3). Bảng 3. Cường độ hô hấp của mẫu cấy phát sinh chồi trên các môi trường khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy Các chất điều hòa tăng trưởng Cường độ hô hấp thực vật xử lý (µL O2/ g trọng lượng tươi/giờ) Đối chứng (MS) 40,48 ± 7,70b 2,4-D 1 mg/L 45,01 ± 7,12b BA 1,5 mg/L 50,17 ± 2,17b 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L 57,88 ± 3,46a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực trưởng trên môi trường MS có sự phối hợp bổ vật sung 2,4-D 1 mg/L với BA 1,5 mg/L và thấp nhất Hoạt tính IAA và gibberellin đạt cao nhất ở ở mẫu cấy tăng trưởng trên môi trường MS hay mẫu cấy tăng trưởng trên môi trường MS có bổ MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/L. Hoạt tính ABA đạt sung 2,4-D 1 mg/L. Hoạt tính zeatin đạt cao nhất cao nhất ở mẫu cấy tăng trưởng trên môi trường ở mẫu cấy tăng trưởng trên môi trường MS có bổ đối chứng MS (Bảng 4). sung BA 1,5 mg/L, thấp hơn ở mẫu cấy tăng Bảng 4. Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật của mẫu cấy phát sinh chồi trên các môi trường khác nhau sau 3 tuần nuôi cấy Các chất điều hòa tăng trưởng Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh (mg/L) thực vật xử lý IAA Zeatin Gibberellin ABA Đối chứng (MS) 0,39 ± 0,05b 0,15 ± 0,02c 0,17 ± 0,02b 0,61 ± 0,01a 2,4-D 1 mg/L 0,84 ± 0,01a 0,15 ± 0,01c 0,37 ± 0,08a 0,19 ± 0,02b BA 1,5 mg/L 0,41 ± 0,02b 0,52 ± 0,03a 0,15 ± 0,04b 0,16 ± 0,03b 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L 0,32 ± 0,03b 0,33 ± 0,01b 0,17 ± 0,02b 0,14 ± 0,03b Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05. Ảnh hưởng của các chất ức chế sự vận chuyển auxin trên sự phát sinh chồi từ vảy hành in vitro Sau 4 tuần nuôi cấy, các xử lý với NPA 3,45 tạo chồi của mẫu cấy. Tỉ lệ mẫu cấy tạo chồi mg/L hay 1-NOA 4,95 mg/L (các chất ức chế sự giảm mạnh hơn khi xử lý với 1-NOA (Hình 2G- vận chuyển của auxin) đều làm giảm khả năng H, Bảng 5). Trang 109
6. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Bảng 5. Ảnh hưởng của các chất ức chế sự vận chuyển auxin trên sự phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau 4 tuần nuôi cấy Xử lý Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi/mẫu cấy Chiều cao chồi (mm) Số vảy lá/chồi Đối chứng * 84,45 ± 2,22a 4,43 ± 0,07a 4,10 ± 0,06a 13,33 ± 0,33a NPA 3,45 mg/L 66,67 ± 0,00b 2,17 ± 0,17b 3,67 ± 1,86ab 12,67 ± 0,67a 1-NOA 4,95 mg/L 33,33 ± 19,25c 1,67 ± 0,33b 3,33 ± 0,33b 11,67 ± 1,93a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05. (*), MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành cây Lily in vitro Sự phối hợp bổ sung zeatin 0,2 mg/L và IAA chồi/mẫu cấy. Chiều rộng và chiều cao chồi, số 0,5 mg/L vào môi trường 2,4-D 1 mg/L và BA vảy lá/chồi không có sự thay đổi (Hình 2I, Bảng 1,5 mg/L giúp gia tăng tỉ lệ mẫu tạo chồi và số 6). Bảng 6. Áp dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành in vitro sau 4 tuần nuôi cấy Chất điều hòa tăng trưởng thực vật áp dụng (mg/L) Chỉ tiêu theo dõi T-Test Đối chứng * Zeatin 0,2 mg/Lvà IAA 0,5 mg/L Tỉ lệ mẫu tạo chồi 84,45 ± 2,22 100,00 ± 0,00 + Số chồi/mẫu cấy 4,43 ± 0,07 5,17 ± 0,17 + Chiều rộng chồi (mm) 3,67 ± 0,67 4,77 ± 0,33 - Chiều cao chồi (mm) 4,10 ± 0,06 4,33 ± 0,33 - Số vảy lá/chồi 13,33 ± 0,33 13,67 ± 0,67 - (+), Các số trung bình trong cột khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 (T-Test). (*), MS với 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L. THẢO LUẬN nuôi cấy, vùng phát sinh hình thái chồi hình Vào thời điểm trước khi nuôi cấy, các tế bào thành gồm một nhóm tế bào nhỏ có nhân to, tế nhu mô dưới biểu bì của vảy hành Lily có sự sắp bào chất đậm đặc và không còn chứa hạt tinh bột xếp tương đối đồng đều. Tuy nhiên, vì đóng vai (Hình 5). Sau đó, vùng phát sinh hình thái này trò là mô dự trữ, các tế bào này chứa rất nhiều hạt tiếp tục phát triển để hình thành mô phân sinh tinh bột (Hình 3). Sau 5 ngày nuôi cấy trên môi ngọn chồi với sự hiện diện của sơ khởi lá đầu tiên trường có bổ sung phối hợp 2,4-D 1 mg/L và BA vào ngày thứ 17 (Hình 6), mô phân sinh ngọn 1,5 mg/L, các tế bào nhu mô được hoạt hóa và chồi với hai phác thể lá vào ngày 20 (Hình 7) và phân chia để hình thành vùng phát sinh hình thái chồi vào ngày 24 (Hình 8). Như vậy, tương tự (Hình 4) với sự hiện diện của các tế bào có nhân như sự phát sinh chồi từ lá ở một số đối tượng to, vách mỏng và hạt tinh bột nhỏ (hay hầu như thực vật hay từ mô phân sinh ngọn chồi ở chuối, không còn). Các đặc điểm hình thái này cũng sự phát sinh chồi từ vảy hành Lily trải qua các được tìm thấy trong tế bào mô phân sinh ngọn giai đoạn: hoạt hóa và phân chia tế bào, tạo vùng chồi có khả năng phát sinh cơ quan [8] hay các tế phát sinh hình thái chồi, hình thành mô phân sinh bào dịch treo có khả năng phát sinh phôi ở chuối ngọn chồi và cuối cùng là chồi với các phác thể Cau Mẵn [9]. Các hạt tinh bột nhỏ thường được lá. xem như dấu hiệu của sự dùng tinh bột dự trữ cho Ở cùng nồng độ, khả năng cảm ứng tạo chồi các phản ứng biến dưỡng của tế bào trong sự của 2,4-D mạnh hơn so với picloram (Hình 2B-C, phân hóa tế bào [10]. Chính vì vậy, sau 10 ngày Bảng 1). Theo Bukowska (2006), 2,4-D và Trang 110
7. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 picloram đều có vai trò giúp tế bào đi vào con hay BA riêng lẻ (Bảng 3). Điều này dẫn đến khả đường phản phân hóa [11]. Sau đó, 2,4-D giúp tế năng phát sinh chồi ở mẫu cấy tăng trưởng trên bào tiếp tục đi vào con đường tái phân hóa trở về môi trường có sự phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L trạng thái mô phân sinh cấp hai hoạt động và và BA 1,5 mg/L cao hơn so với các mẫu cấy tăng phân hóa thành chồi. Trong khi đó, picloram là trưởng trên các môi trường còn lại (Bảng 2). một auxin mạnh, thường được sử dụng như một Ngoài việc cung cấp năng lượng, hoạt động hô chất cảm ứng có tác dụng khử phân hóa tế bào hấp của tế bào còn cung cấp các sản phẩm biến trong quá trình tạo mô sẹo hay phôi thể hệ. Có lẽ, dưỡng và các tiền chất cho quá trình sinh tổng chính tác động quá mạnh của picloram trên sự hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội phân chia tế bào đã cản tế bào đi vào con đường sinh. Trong trường hợp vảy hành Lily, sự tăng tái phân hóa để hình thành mô phân sinh cấp hai mạnh hoạt tính IAA hay zeatin trong mẫu cấy hoạt động, do đó làm giảm khả năng phát sinh vảy hành không phải là yếu tố giúp cho sự phát chồi. Ảnh hưởng của nồng độ auxin trên sự phát sinh chồi xảy ra mạnh nhất, mà chính hiện diện sinh chồi thể hiện rõ khi tăng nồng độ 2,4-D từ 1 của IAA và zeatin với nồng độ thích hợp mới là đến 3 mg/L. Tỉ lệ mẫu tạo chồi giảm dần theo sự yếu tố quyết định (Bảng 5). Thật vậy, việc xử lý gia tăng nồng độ 2,4-D (Bảng 1). Theo Bùi Trang phối hợp IAA 0,5 mg/L và zeatin 0,2 mg/L vào Việt (2000), sự gia tăng nồng độ 2,4-D sẽ dẫn môi trường nuôi cấy đã giúp gia tăng tỉ lệ mẫu đến sự cạnh tranh thể nhận giữa các phân tử tạo chồi và số chồi/mẫu cấy (Bảng 6). Bên cạnh auxin làm hình thành các phức hợp bất hoạt auxin tác động phối hợp với cytokinin, sự di chuyển mang hai thể nhận [10]. Do đó, sự truyền tín hiệu hữu cực của auxin cũng có vai trò rất quan trọng nội bào không xảy ra. Bên cạnh việc dùng auxin trong sự tạo chồi. Sự dùng 1-NOA và NPA, các riêng lẻ, TDZ (một chất điều hòa tăng trưởng chất ứ c chế sư ̣ di chuyển của auxin , đã chứ ng thực vật vừa có hoạt tính auxin vừa có hoạt tính minh tác động của sự di chuyển hữu cực của cytokinin) cũng thường được sử dụng và cho khả auxin trong sự tạo chồi. Khả năng tạo chồi của năng tạo chồi rất hiệu quả ở các giống trồng Lily mẫu cấy tăng trưởng trên môi trường có sự hiện như L. oxypetalum, L. longforium, [12, 13]. diện của 1-NOA (4,95 mg/L) hay NPA (3,45 Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, với giống trồng mg/L) đều giảm mạnh so với đối chứng. Theo Sorbonne, việc xử lý TDZ không đạt hiệu quả Balzan và cộng sự (2014), sự vận chuyển hữu cảm ứng cao trong quá trình tạo chồi như 2,4-D cực của auxin được điều hòa bởi hoạt động của hay BA (Bảng 1). Điều này có thể do sự khác các phức hợp protein đóng vai trò là thể mang nhau về kiểu gene. Ảnh hưởng của BA trên sự auxin vào trong tế bào (AUX, LAX và ABCB) và phát sinh chồi cũng đã được ghi nhận ở nhiều đối ra khỏi tế bào (PIN và ABCB) [14]. Các nghiên tượng thực vật [8], [10]. Trong sự phát sinh chồi cứu gần đây cho thấy NPA ức chế sự hoạt động từ vảy hành Lily, sự bổ sung BA vào môi trường của các thể mang auxin ra khỏi tế bào trong khi nuôi cấy không những giúp mẫu cấy gia tăng số 1-NOA vừa ức chế hoạt động của thể mang auxin chồi mà còn gia tăng số vảy lá của chồi. Sự phát vào trong tế bào vừa có khả năng ức chế hoạt sinh chồi là một hoạt động sinh lý mạnh của mẫu động của thể mang auxin ra khỏi tế bào [15]. cấy đòi hỏi nguồn năng lượng lớn để cung cấp Điều này giải thích tại sao khả năng phát sinh cho hoạt động phân chia của tế bào. Cường độ hô chồi của mẫu cấy tăng trưởng trên môi trường có hấp của mẫu cấy vảy hành tăng trưởng trên môi sự hiện diện của 1-NOA thấp hơn so với mẫu cấy trường có sự phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L và tăng trưởng trên môi trường có NPA (Hình G-H, BA 1,5 mg/L gia tăng mạnh hơn so với mẫu cấy Bảng 5). Cùng với tác động phối hợp của zeatin tăng trưởng trên môi trường có bổ sung 2,4-D và auxin, sự giảm hoạt tính ABA trong mẫu cấy Trang 111
8. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 cũng góp phần giúp gia tăng sự tạo chồi (Hình thành mô phân sinh ngọn chồi và cuối cùng là 2F-I, Hình 4-6). IAA và zeatin có vai trò cảm ứng chồi với các phác thể lá. Môi trường MS có sự tạo chồi trong khi ABA thì ngược lại, cản quá phối hợp bổ sung 2,4-D 1 mg/L, BA 1,5 mg/L, trình này [10]. zeatin 0,2 mg/L và IAA 0,5 mg/L thích hợp cho KẾT LUẬN sự phát triển chồi từ vảy hành Lily. Trong sự phát sinh chồi có sự gia tăng cường độ hô hấp, hoạt Sự phát sinh chồi từ vảy hành Lily in vitro có tính IAA và zeatin. Sự dùng 1-NOA (4,95 mg/L) nguồn gốc từ các tế bào nhu mô cách biểu bì vài hay NPA (3,45 mg/L) cho thấy vai trò của sự di lớp tế bào, trải qua các giai đoạn: hoạt hóa và chuyển hữu cực của auxin trong sự phát sinh phân chia tế bào với sự hình thành các tế bào có chồi. nhân to, vách mỏng và hầu như không chứa hạt tinh bột; tạo vùng phát sinh hình thái chồi; hình Role of plant growth regulators on shoot formation from bulb sacles of Lily Sorbonne Tran Thanh Thang Tran Thanh Huong University of Science, VNU-HCM ABTRACT In this study, plant growth regulators were derived from parenchymal cells, which included 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), placed under epidermis cells. This process picloram, 6-benzylaminopurine (BA) and included the following stages: activation of cell thidiazuron (TDZ), at different concentrations division with large nucleus, thin-walled and were used individually or in combination to without starch granules; initiating of induce adventitious shoots from bulb scales of meristematic region; formation of shoot Lily Sorbonne. Morphological and physiological primordium and shoot with leaves. Use of 1- changes in shoot formation from bulb scales were naphthylphthalamic acid (1-NOA) and N-1- analysed. The maximum number of shoots per naphthoxyacetic acid (NPA), auxin transport explant were obtained on Murashige and Skoog inhibitors, showed the role of polar auxin medium (MS) supplemented with 2,4-D 1 mg/L, transport in shoot formation. The correlation of BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L and indole-3-acetic plant hormone, respiration rate and shoot acid (IAA) 0,5 mg/L. The adventitious shoots formation from bulb scales was discussed. Key words: adventitious shoots, bulb scales, Lily, plant growth regulators, polar auxin transport TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. A.V. Varshney, P.S. Dhawan, Srivastava, [2]. J. Lei, Z. Yanlong, Y. Linmao, G. Yulong, A protocol for in vitro mass propagation N. Lixin, Phenolic compounds and of asiatic hybrids of Lily through liquid antioxidant activity of bulb extracts of xix stationary culture, In Vitro Cell Develop, Lilium species native to China, Molecules, 36, 383–391 (2000). 17, 9361–9378 (2012). Trang 112
9. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 [3]. T.T. Vân, V.T. Đông, Cơ sở khoa học và kỹ cultures of the banana cultivar 'Cau Man', thuật sản xuất hoa Lily, Nhà xuất bản Nông Acta Hort, 1114, 219–226 (2016b). Nghiệp, Hà Nội (2005). [10]. B.T Việt, Sinh lý thực vật đại cương, phần [4]. T. Murashige, F. Skoog, A revised medium II: Phát triển, Nhà xuất bản Đại học Quốc for rapid growth and bioassays Gia Thành phố Hồ Chí Minh (2000). withtobacco tissue cultures, Plant Physiol, [11]. B. Bukowska, Toxicity of 2,4- 15, 3, 473–497 (1962). Dichlorophenoxyacetic acid – molecular [5]. K.S. Lee, F.J. Zapata-Arias, H. Brunner, R. mechanisms, Polish J. of Environ. Stud., Afza, Histology of somatic 15, 3, 365–374 (2006). embryoinitiation and organogenesis from [12]. L. Bacchetta, P.C. Remotti, C. Bernardini, rhizome explants of Musa sp., Tissue and F. Saccardo, Adventitious shoot Organ Culture, 51, 1–8 (1997). regeneration from leaf explants and stem [6]. H. Meidner, Class experiments in Plant nodes of Lilium, Plant Cell Tissue Organ Physiology, George Allen and Unwin, Cult, 74, 37–44 (2003). London (1984). [13]. X. LingFei, M. FengWang, L. Dong, Plant [7]. B.T. Việt, Tìm hiểu hoạt động của các chất regeneration from in vitro cultured leaves điều hòa sinh trưởng thực vật thiên nhiên of Lanzhou Lily (Lilium davidii var. trong hiện tượng rụng "bông" và "trái non" unicolor), Sci Hortic, 119, 458–461 (2009). Tiêu (Piper nigrum L.), Tập san khoa học [14]. S. Balzan, G.S. Johal, N. Carraro, The role ĐHTH TPHCM, 1, 155–165 (1992). of auxin transporters in monocots [8]. T.H. Tran, T.V. Bui, T.Y. Feng, Role of development, Frontiers in plant science, 5, plant growth regulators on shoot 380–393 (2014). development of shoot apical meristems of [15]. P. Klíma, M. Laňková, E. Zažímalová, banana genotypes. Acta Hort, 1114, 211– Inhibitors of plant hormone 218 (2016a). transport, Protoplasma, 253, 6, 1–14 [9]. T.H. Tran, T.V. Bui, T.Y. Feng, The role (2015). of auxin and cytokinin on somatic embryogenesis from cell suspension 8 mm Hình 1. Hành Lily in vitro 8 tuần tuổi tăng trưởng trên môi trường MS Trang 113
10. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 A B C 3 mm 3 mm 3 mm D E F 3 mm 3 mm 3 mm G H I 3 mm 3 mm 3 mm Hình 2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh chồi từ vảy hành Lily in vitro sau 4 tuần nuôi cấy trong điều kiện tối (A), MS (B), MS với 2,4-D 1 mg/L (F), MS với 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L (C), MS với picloram 4 mg/L (G), MS với 2,4-D 1 mg/L, BA 1,5 mg/L và NPA 3,45 mg/L (D), MS với TDZ 0,1 mg/L (H), MS với 2,4-D 1 mg/L, BA 1,5 mg/L và NOA 4,95 mg/L (E), MS với BA 1,5 mg/L (I), MS với 2,4-D 1 mg/L, BA 1,5 mg/L, zeatin 0,2 mg/L và IAA 0,5 mg/L Trang 114
11. TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T5- 2016 Hình 4. Lát cắt ngang qua mẫu cấy đang tăng trưởng trên Hình 3. Lát cắt ngang qua vảy hành in vitro (mẫu cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L ngày 0) với sự hiện diện của các tế bào nhu mô chứa sau 5 ngày nuôi cấy. Mũi tên: tế bào đang phân chia nhiều hạt tinh bột chuẩn bị cho sự hình thành vùng phát sinh hình thái Hình 5. Sự hình thành vùng phát sinh hình thái (mũi Hình 6. Vòm mô phân sinh ngọn chồi (mũi tên) đang tên) sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ trong giai đoạn chuẩn bị hình thành phác thể lá đầu tiên sung 2,4-D 1 mg/L và BA 1,5 mg/L sau 17 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/L và BA 1,5 mg/L Trang 115
12. Science & Technology Development, Vol 19, No.T5-2016 Hình 7. Vòm mô phân sinh ngọn chồi với hai phác thể Hình 8. Chồi hoàn chỉnh sau 24 ngày nuôi cấy trên môi lá sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/L và BA 1,5 mg/L 2,4-D 1mg/L và BA 1,5 mg/L Trang 116