›
›

Giáo trình Tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng - Chương 5 đến Chương 7

pdf 242 trang huongle 1960
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng - Chương 5 đến Chương 7", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfgiao_trinh_tuyen_trung_ki_sinh_gay_benh_con_trung_chuong_5_d.pdf

Nội dung text: Giáo trình Tuyến trùng kí sinh gây bệnh côn trùng - Chương 5 đến Chương 7

  1. Chương V HIỆU LỰC PHÒNG TRỪ SÂU HẠI CỦA MỘT SỐ CHỦNG EPN I. CƠ SỞ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC GÂY CHẾT SÂU HẠI CỦA CÁC CHỦNG EPN Mặc dù hầu hết các chủng / loài tuyến trùng EPN có thể ký sinh gây bệnh cho nhiều loài sâu hại khác nhau thuộc một số bộ côn trùng chính như Lepidoptera, Coleoptera, Diptera, Orthoptera, v.v. nhưng khả năng ký sinh gây chết vật chủ của các chủng tuyến trùng trên từng đối tượng sâu hại lại rất khác nhau. Do vậy, để có cơ sở phòng trừ thành công đối với mỗi loại sâu hại cần phải đưa ra các quyết định là: i) sử dụng loại tuyến trùng nào để cho kết quả phòng trừ cao nhất; ii) nồng độ v à liều xử lý (phun rải) bao nhiêu là tối ưu; iii) thời điểm nào của sâu hại xuất hiện trên đồng ruộng cần xử lý; v à iv) cách thức phun rải tuyến trùng trên đồng ruộng (trong trường hợp phòng trừ các loại sâu hại các phần cây trồng tr ên mặt đất, trong thân cây th ì cần phối chế với những chất thích hợp để giữ ẩm và tăng khả năng bám dính của tuyến trùng. Để có được các quyết định như trên cần thiết phải tiến hành thử nghiệm, đánh giá khả năng ký sinh gây chết vật chủ sâu hại của từng chủng tuyến tr ùng đối với mỗi loại sâu hại. Các chỉ tiêu cần đánh giá bao gồm: i) chỉ số LC 50 (lethal concentration) - tức là nồng độ tuyến trùng mà ở đây được hiểu là số lượng tuyến trùng cảm nhiễm gây chết 50% sâu hại thử nghiệm (trong trường hợp thử nghiệm tuyến tr ùng EPN chỉ tiêu LC50 này cũng đồng nghĩa với chỉ ti êu LD50 (lethal dose) hay liều lượng gây chết 50%). Một chủng tuyến tr ùng có LC50 càng thấp chứng tỏ có độc lực của tổ h ợp tuyến trùng vi khuẩn càng
  2. 110 Nguyễn Ngọc Châu mạnh, đồng thời cũng chứng tỏ l à loại sâu hại mẫn cảm với tuyến trùng. ii) chỉ số LT50 (lethal time) là thời gian gây chết 50% sâu hại thử nghiệm. Thời gian n ày càng ngắn cũng có nghĩa hoạt tính gây chết của chủng EPN c àng mạnh và cũng chứng tỏ là loại sâu hại mẫn cảm với tuyến tr ùng. iii) một chỉ tiêu nữa cũng cho phép đánh giá về hoạt tính của một chủng tuyến trùng đối với một đối tượng sâu hại là khả năng sinh sản (reproduction capacity) c ủa tuyến trùng trong cơ thể côn trùng. Sản lượng tuyến trùng cảm nhiễm được sinh ra trong xác chết của sâu hại càng lớn chứng tỏ đối tượng sâu hại thử nghiệm l à vật chủ thích hợp đối với chủng tuyến tr ùng ký sinh. Tuy nhiên, trong thực tế chỉ cần xác định LC 50 cũng đủ cơ sở để kết luận về độc lực của một chủng EPN. Để xác định LC 50 cần phải thiết kế thí nghiệm vớ i ít nhất 10 công thức thí nghiệ m với các nồng độ khác nhau từ thấp đến cao v à một công thức đối chứng. Đối với đa số sâu hại nồng độ ph ơi nhiễm thường từ 10 - 100 IJs/sâu hại. Mỗi công thức thí nghiệm thường sử dụng 5 sâu hại cùng lứa tuổi; mỗi sâu được đặt riêng rẽ trong 1 đĩa petri (35 x 15 mm) tr ên giấy lọc ẩm. Mỗi đĩa sâu thí nghiệm cho một lượng chính xác IJs cần thiết. Thí nghiệm được theo dõi trong 5 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm. Sau 5 ngày tất cả các sâu chết được chuyển sang bẫy n ước (White trap) và ủ tiếp 5-7 ngày để thu lại tuyến trùng (Cabanillas & Raulston, 1994). Để xử lý thống kê các thí nghiệm như vậy ít nhất phải được lập lại 3-5 lần, tùy thuộc khả năng cung cấp s âu thí nghiệm. Các sâu thử nghiệm chỉ được xác nhận bị chết do tuyến trùng khi có đủ các yếu tố sau: (i) có đặc tr ưng chết do tổ hợp tuyến trùng-vi khuẩn như có mầu đặc trưng, không có mùi thối do vi sinh vật khác phân giải gây n ên; (ii) sự có mặt của tuyến trùng trong sâu và số lượng tuyến trùng tăng do IJs đã được sản sinh trong sâu hại; (iii) thử nghiệm gây nhiễm trở lại đánh giá sự tăng hiệu lực diệt sâu hại của tuyến tr ùng qua mỗi lần gây nhiễm trên cùng một loài sâu hại. Số liệu thí nghiệm được xử lý thống kê theo chương trình SPSS 11.0. và ANOVA đ ể đánh giá sự sai khác có ý nghĩa hoặc không (với P < 0,05). Để xác định giá trị LC 50 thì các số liệu sâu chết ở các công thức nồng độ đ ược xử lý theo quy trình SAS
  3. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 111 PROBIT. Đánh giá nồng độ phơi nhiễm tối ưu cho sinh sản của tuyến trùng trong vật chủ sâu hại theo quy trình SAS. Hi ệu lực của tuyến trùng khi phun thử nghiệm ngoài đồng ruộng được xác định theo Henderson – Tilton. Một chủng tuyến trùng EPN hội nhập được tất cả các chỉ tiêu đánh giá được coi là tác nhân tiềm năng lý tưởng cho PTSH. Tuy nhiên, trong th ực tế không nhất thiết phải đáp ứng được tất cả các tiêu chí của tác nhân PTSH lý t ưởng. Khả năng ký sinh gây chết vật chủ là tiêu chí quan trọng nhất khi quyết định sử dụng một chủng tuyến tr ùng trong phòng trừ một loài sâu hại. Trong phần này, khả năng ký sinh gây chết vật chủ của 4 chủng tuyến trùng bản địa đã được đánh giá trên một số sâu hại chính ở Việt Nam. II. HIỆU LỰC GÂY CHẾT CỦA MỘT SỐ CHỦNG EPN TRONG ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM 1. Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng S-TK10 Khả năng ký sinh gây chết của chủng tuyến tr ùng S-TK10 đã được thử nghiệm với 5 lo ài sâu hại quan trọng và rất phổ biến ở Việt Nam là sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius), sâu tơ (Plutela xylostella Linnaeus), sâu xanh b ướm trắng (Pieris rapae Linnaeus), sâu cuốn lá đậu tương (Omiodes indicata Fabricius) và bọ hung đen (Alissonotum impressicolle Arrow). Thí nghiệm trên sâu khoang được tiến hành với 10 công thức nồng độ phơi nhiễm và lặp lại 4 lần với tổng số 225 sâu. Theo dõi số sâu chết 5 ngày phơi nhiễm cho thấy: ở công thứ c nồng độ 10 IJs chỉ có 15% sâu khoang chết. Tỷ lệ chết n ày tăng dần lên đến 35 và 45% ở nồng độ phơi nhiễm là 20 và 30 IJs. Ở các công thức nồng độ phơi nhiễm cao hơn từ 40 đến 70 IJs thì tỷ lệ sâu khoang chết là khoảng 60-65%. Ở nồng độ phơi nhiễm cao nhất 100 IJs thì tỷ lệ sâu khoang chết đạt cao nhất l à 85% (Bảng 16). Với LC 50 = 35 IJs cho thấy độc tố của chủng S-TK10 đối với sâu khoang là khá mạnh.
  4. 112 Nguyễn Ngọc Châu Bảng 16. Hiệu lực gây chết sâu khoang của chủng S -TK10 (Nhiệt độ: 21,3-26,1ºC, độ ẩm: 80-86%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 20 3 15,0 20 20 7 35,0 30 20 9 45,0 40 20 12 60,0 50 20 13 65,0 60 20 12 60,0 70 20 13 65,0 80 20 15 75,0 90 20 15 75,0 100 20 17 85,0 LD50 = 35 Log (Số lượng IJs) 1.0 1.3 1.5 1.6 1.7 1.8 1.8 1.9 2.0 2.0 100 1.2 y = 0.1839x - 0.7998 80 0.8 R2 = 0.8716 0.4 60 0.0 40 Tỷchết lệ -0.4 20 -0.8 Normonv(Tỷ chết) lệ 0 -1.2 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Normonv (Tỷ lệ chết) Linear (Normonv (Tỷ lệ chết)) Hình 26. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TK10 trên sâu khoang
  5. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 113 Với R2 = 0,87 chứng tỏ giữa nồng độ phơi nhiễm và tỷ lệ chết trong thí nghiệm có mối tương quan khá chặt chẽ (Hình 26). Đánh giá khả năng ký sinh gây chết s âu tơ của tuyến trùng S- TK10 được thực hiện ở 6 công thức khác nhau từ 5 đến 30 IJs. Mỗi công thức thí nghiệm 5 sâu t ơ, được lặp lại 4 lần với tổng số 120 sâu. Bảng 17. Hiệu lực gây chết sâu tơ của chủng S-TK10 (Nhiệt độ: 23,7-26,5ºC, độ ẩm: 79-85%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 5 20 6 30,0 10 20 7 35,0 15 20 10 50,0 20 20 12 60,0 25 20 15 75,0 30 20 16 80,0 LD50 = 12 Khác với thí nghiệm đối với sâu khoang, các công thức nồng độ thí nghiệm trên sâu tơ được thiết kế với cấp độ nồng độ phơi nhiễm nhỏ hơn. Bởi vì thực tế trước khi thí nghiệm xác định LC50 đối với mỗi loại sâu hại, thường tiến hành các test cùng một nồng độ cho một số loại sâu hại nhằm xác định s ơ bộ độc tố của mỗi chủng tuyến trùng đối với mỗi loài côn trùng. Trên cơ sở test này có thể thiết kế các công thức nồng độ thích hợp cho mỗi loại sâu hại. Kết quả thí nghiệm cho thấy sâu t ơ rất mẫn cảm với chủng S- TK10. Ngay ở công thức nồng độ phơi nhiễm ban đầu là 5 IJs của S-TK10 đã có 30% sâu tơ chết sau 5 ngày thí nghiệm và nồng độ phơi nhiễm cao nhất là 30 IJs thì tỷ lệ sâu tơ chết đạt 80%. Giá trị LC50 trong thí nghiệm này là 12 IJs cho thấy sâu tơ rất mẫn cảm với
  6. 114 Nguyễn Ngọc Châu chủng S-TK10 và cũng có nghĩa là chủng tuyến trùng này có độc tố cao đối với sâu tơ. Log (Số lượng IJs) 0.7 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5 100 1.2 y = 0.2932x - 0.883 80 0.8 R2 = 0.9849 60 0.4 40 0.0 Tỷchết lệ 20 -0.4 Norminv(Tỷ chết) lệ 0 -0.8 5 10 15 20 25 30 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 27. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TK10 trên sâu tơ Thí nghiệm với sâu xanh bướm trắng được tiến hành ở 8 công thức thí nghiệm, với nồng độ ph ơi nhiễm từ 5 đến 40 IJs. Thí nghiệm được lặp lại 4 lần và tổng số 160 sâu xanh bướm trắng thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cho thấy S -TK10 có khả năng ký sinh gây chết sâu xanh bướm trắng rất cao. Chỉ với những nồng độ phơi nhiễm ban đầu rất thấp l à 5 và 10 IJs thì tỷ lệ sâu chết đã đạt 25 và 35%. Ở công thức nồng độ ph ơi nhiễm 35 và 40 IJs thì tỷ lệ chết của sâu xanh b ướm trắng đã đạt tới 90 và 100% (Bảng 18). Giá trị LC 50 = 13 IJs cho thấy chủng S- TK10 có độc tố cao đối với sâu xanh b ướm trắng. Giá trị R 2 = 0,98 cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ gây nhiễm và tỷ lệ chết của sâu xanh bướm trắng.
  7. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 115 Bảng 18. Hiệu lực gây chết sâu xanh bướm trắng của chủng S-TK10 (Nhiệt độ: 21,1-25,4ºC, độ ẩm: 77-90%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 5 20 5 25,0 10 20 7 35,0 15 20 8 40,0 20 20 12 60,0 25 20 13 65,0 30 20 17 85,0 35 20 18 90,0 40 20 20 100 LD50 = 13 Log (Số lượng IJs) 0.7 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5 1.5 1.6 100 3.2 y = 0.3969x - 1.2899 80 2.4 R2 = 0.9401 1.6 60 0.8 40 0.0 Tỷchết lệ 20 -0.8 Norminv (TỷNorminv chết) lệ 0 -1.6 5 10 15 20 25 30 35 40 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 28. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TK10 trên sâu xanh bướm trắng Trên đối tượng sâu cuốn lá đậu tương, thí nghiệm được bố trí với 9 công thức từ 10 đến 100 IJs của S -TK10 trên một sâu. Mỗi công thức thí nghiệm được nhắc lại 4 lần. Tổng cộng có 180 sâu cuốn lá đậu tương được sử dụng cho thí nghiệm.
  8. 116 Nguyễn Ngọc Châu Bảng 19. Hiệu lực gây chết sâu cuốn lá đậu t ương của chủng S-TK10 (Nhiệt độ: 22,4-27,4ºC, độ ẩm: 74-89%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 20 4 20,0 20 20 5 25,0 30 20 9 45,0 40 20 13 65,0 50 20 16 80,0 60 20 15 75,0 70 20 16 80,0 80 20 18 90,0 100 20 19 95,0 LD50 = 28 Kết quả thí nghiệm cho thấy tỷ lệ chết sâu cuốn lá đậu t ương tăng nhanh ở nồng độ phơi nhiễm 30 và 40 IJs và tỷ lệ sâu chết cao nhất là 95% ở nồng độ gây nhiễm 100 IJs (Bảng 19). Log (Số lượng IJs) 1.0 1.3 1.5 1.6 1.7 1.8 1.8 1.9 2.0 100 2.4 y = 0.3006x - 1.0556 80 1.6 R2 = 0.944 60 0.8 40 0.0 Tỷ lệ chết lệ Tỷ 20 -0.8 Norminv (Tỷ lệ chết) lệ (Tỷ Norminv 0 -1.6 10 20 30 40 50 60 70 80 100 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 29. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TK10 trên sâu cuốn lá đậu tương
  9. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 117 Giá trị LC50 = 28 IJs chỉ cho thấy chủng S-TK10 cũng có độc tố khá cao đối với sâu cuốn lá đậu tương. Thí nghiệm trên bọ hung đen trưởng thành được bố trí 10 công thức nồng độ cao từ 100 đến 5000 IJs v à mỗi công thức thí nghiệm sử dụng 10 bọ hung đen, nhắc lại 5 lần. Tổng cộng có 500 bọ hung đen được sử dụng cho thí nghiệm này. Sau 5 ngày phơi nhiễm, tỷ lệ bọ hung chết là 10% ở công thức nồng độ 100 IJs. Tỷ lệ chết tăng lên mức 30% trở lên ở các công thức nồng độ phơi nhiễm 400, 600, 800 IJs. Sau đó tỷ lệ chết tăng chậm v à đến số lượng 2000 IJs thì mới gây chết được 58%. Ở công thức nồng độ cao nhất là 5000 IJs thì tỷ lệ bọ hung chết đạt 80% (Bảng 20). Giá trị LC50 = 1492 IJs là cao hơn hàng trăm l ần so với LC50 của các loại sâu hại khác. Điều n ày cho thấy để phòng trừ có hiệu quả bọ hung đen cần phải xử lý S-TK10 ở liều cao hơn nhiều so với liều xử lý nhiều loại sâu hại khác. Bảng 20. Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng S-TK10 (Nhiệt độ: 25,2-28,3ºC, độ ẩm: 71-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 5 10,0 200 50 10 20,0 400 50 15 30,0 600 50 17 34,0 800 50 15 30,0 1000 50 20 40,0 1200 50 20 40,0 1600 50 22 44,0 2000 50 29 58,0 5000 50 40 80,0 LD50 = 1492 Tuy nhiên, kết quả trên đây cũng phù hợp với kết quả thử nghiệm gây chết bọ hung của các tác giả khác (Wang & Li,1987 ; Li et al., 1983). Mặc dù bọ hung là đối tượng khá mẫn cảm với hầu hết các chủng EPN, nhưng do đối tượng này to khỏe và sinh khối lớn nên để tiêu diệt được bọ hung cần phải sử dụng liều EPN cao.
  10. 118 Nguyễn Ngọc Châu Log (Số lượng IJs) 2.0 2.3 2.6 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.7 100 1.2 y = 0.1759x - 1.2875 0.8 80 R2 = 0.8662 0.4 60 0.0 40 -0.4 Tỷ lệ chết -0.8 20 Norminv (Tỷ lệ chết) -1.2 0 -1.6 100 200 400 600 800 1000 1200 1600 2000 5000 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 30. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TK10 trên bọ hung đen Như vậy, cả 5 loại sâu hại được thử nghiệm với chủng S-TK10 đều mẫn cảm với chủng S-TK10 và đều có giá trị LC50 thấp (ngoại trừ trên đối tượng bọ hung đen). Trên cơ sở kết quả thử nghiệm này có thể khẳng định rằng chủng S-TK10 hoàn toàn có thể đáp ứng yêu cầu của một tác nhân PTSH đối với các lo ài sâu hại này. 2. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của S-TX1 Chủng tuyến trùng S-TX1 cũng được thử nghiệm trên 3 loài sâu hại là sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner), sâu tơ (Plutella xylostella Linnaeus) và bọ hung đen (Alissonotum impressicolle Arrow) để đánh giá khả năng ký sinh gây chết đối với 3 loài sâu hại này. Đối với sâu xanh, thí nghiệm được thiết kế với 10 công thức nồng độ, từ 1 đến 100 IJs. Mỗi công thức 5 sâu xanh , lặp lại 4 lần và có tất cả 225 sâu xanh được sử dụng cho thí nghiệm. Kết quả thí nghiệm cho thấy: ở công thức nồng độ ph ơi nhiễm 1 IJs đã không có sâu chết sau 5 ngày theo dõi. Tỷ lệ sâu chết chỉ được ghi nhận là 10% ở công thức nồng độ phơi nhiễm 5 IJs và tỷ lệ này tăng lến đến
  11. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 119 15% rồi 30% ở các công thức số lượng 10 và 20 IJs. Đến các công thức nồng độ phơi nhiễm 80 và 100 IJs thì tỷ lệ chết đạt 100%. Bảng 21. Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng S -TX1 (Nhiệt độ: 25,7-30,3ºC, độ ẩm: 70-83%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 1 20 0 0 5 20 2 10,0 10 20 3 15,0 20 20 6 30,0 30 20 11 55,0 40 20 15 75,0 50 20 14 70,0 60 20 18 90,0 80 20 20 100 100 20 20 100 LD50 = 18 Giá trị LC50 của chủng S-TX1 là 18 IJs cho thấy khá mẫn cảm đối với chủng tuyến trùng này, mặc dù đây là đối tượng sâu hại có khả năng kháng mạnh với nhiều loại thuốc hóa học. Log (Số lượng IJs) 0.0 0.7 1.0 1.3 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 120 4.0 y = 0.6152x - 3.0983 100 3.0 R2 = 0.9402 2.0 80 1.0 60 0.0 -1.0 Tỷ lệ chết lệ Tỷ 40 -2.0 20 -3.0 Norminv (Tỷ lệ chết) (Tỷlệ Norminv 0 -4.0 1 5 10 20 30 40 50 60 80 100 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 31. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TX1 trên sâu xanh
  12. 120 Nguyễn Ngọc Châu Thí nghiệm xác định hiệu lực gây chết của chủng S -TX1 trên sâu tơ được tiến hành với 10 công thức nồng độ từ 5 đến 50 IJs v à được lặp lại 4 lần với tổng số 225 sâu đ ược sử dụng. Bảng 22. Hiệu lực gây chết sâu tơ của chủng S-TX1 (Nhiệt độ: 25,4-27,7ºC, độ ẩm: 81-86%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 5 20 6 30,0 10 20 10 50,0 15 20 12 60,0 20 20 13 65,0 25 20 15 75,0 30 20 16 80,0 35 20 15 75,0 40 20 18 90,0 45 20 19 95,0 50 20 20 100 LD50 = 11 Log (Số lượng IJs) 0.7 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5 1.5 1.6 1.7 1.7 100 2.8 y = 0.2627x - 0.6891 2.4 80 R2 = 0.9252 2.0 1.6 60 1.2 40 0.8 Tỷ lệ chết Tỷlệ 0.4 20 0.0 -0.4 chết) (Tỷ lệ Norminv 0 -0.8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 32. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TX1 trên sâu tơ
  13. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 121 Kết quả thử nghiệm cho thấy: chỉ với 5 IJs đ ã có khả năng gây chết 30% sâu tơ ở công thức nồng độ phơi nhiễm ban đầu và tỷ lệ chết đạt 50% ở nồng độ phơi nhiễm 10 IJs. Tỷ lệ chết sâu tơ đạt 95% và 100% ở nồng độ phơi nhiễm 45 và 50 IJs (Bảng 22). Giá trị LD50 của S-TK10 là 12 IJs cho thấy sâu tơ là đối tượng rất mẫn cảm với chủng S-TX1, mặc dù đây cũng là đối tượng kháng mạnh với nhiều loại thuốc hóa học. Hiệu lực gây chết bọ hung đen trưởng thành của chủng S-TX1 được thử nghiệm với 10 công thức nồng độ, từ 100 đến 5000 IJs. Mỗi công thức 10 bọ hung, lặp lại 5 lần tổng số là 550 bọ hung đen cho thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm cho thấy: bọ hung bắt đầu chết với tỷ lệ 10% ở công thức nồng độ phơi nhiễm ban đầu là 100 IJs và tỷ lệ này tăng lên ở các công thức nồng độ phơi nhiễm cao hơn, đạt tỷ lệ cực đại là 82% ở công thức nồng độ phơi nhiễm cao nhất 5000 IJs (Bảng 23). Bảng 23. Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng S -TX1 (Nhiệt độ: 26,1-28,9ºC, độ ẩm: 74-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 5 10,0 200 50 8 16,0 400 50 12 24,0 600 50 17 34,0 800 50 18 36,0 1000 50 20 40,0 1200 50 22 44,0 1600 50 26 52,0 2000 50 32 64,0 5000 50 41 82,0 LD50 = 1286 Giá trị LC50 = 1286 IJs là thấp hơn so với kết quả thử nghiệm với chủng S-TK10 (LC50 = 1492 IJs). Như vậy, kết quả này cho thấy: mặc dù cả hai chủng S-TX1 và S-TK10 đều có khả năng diệt bọ hung đen, nhưng sử dụng chủng S-TX1 để diệt hung đen trưởng thành sẽ cho hiệu quả cao hơn.
  14. 122 Nguyễn Ngọc Châu Log (Số lượng IJs) 2.0 2.3 2.6 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.7 100 1.2 y = 0.2055x - 1.4138 0.8 80 R2 = 0.9467 0.4 60 0.0 40 -0.4 Tỷ chết lệ -0.8 20 -1.2 Norminv (Tỷ chết) lệ 0 -1.6 100 200 400 600 800 1000 1200 1600 2000 5000 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 33. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng S-TX1 trên bọ hung đen 3. Hiệu lực gây chết sâu hại của H-MP11 Hiệu lực gây chết sâu hại của chủng tuyến tr ùng H-MP11 được đánh giá trên 4 đối tượng sâu hại quan trọng ở Việt Nam l à: sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner), sâu keo da láng (Spodoptera exigua Hübner), sâu tơ (Plutella xylostella Linnaeus) và bọ hung đen (Alissonotum impressicolle Arrow). Thử nghiệm với chủng H-MP11 được tiến hành với 10 công thức từ 1 đến 100 IJs, mỗi công thức 5 sâu, TN đ ược lặp lại 4 lần tổng cộng là 225 sâu thí nghiệm. Kết quả thử nghiệm cho thấy: ở công thức nồng độ phơi nhiễm 1 IJs sâu xanh không bị chết. Đến công thức 5 IJs mới có 15% sâu xanh chết. Phải đến 50 IJs th ì tỷ lệ sâu chết mới đạt trên 50%. Tỷ lệ chết cao nhất trong thí nghiệm n ày là 75% ở công thức nồng độ phơi nhiễm 100 IJs (Bảng 24). Giá trị LC50 của H-MP11 đối với sâu xanh trong thí nghiệm này là 45 IJs cao hơn khá nhi ều so với LD50 của S-TX1 đối với sâu xanh (là 18 IJs). Điều này chứng tỏ khả năng ký sinh gây chết sâu xanh của H-MP11 kém hơn S-TX1. Nói cách khác sâu xanh mẫn cảm với tuyến trùng S-TX1 hơn là H-MP11. Như vậy, để xử lý sâu xanh sử dụng chủng S-TX1 sẽ cho hiệu quả cao hơn. Tuy
  15. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 123 nhiên cũng cần thấy rằng các chủng Heterorhabditis thường có khả năng sinh sản trong môi tr ường in vivo cao hơn nhiều so với các chủng Steinernema. Bảng 24. Hiệu lực gây chết sâu xanh của chủng H -MP11 (Nhiệt độ: 24,3-27,9ºC, độ ẩm: 80-90%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 1 20 0 0 5 20 3 15,0 10 20 5 25,0 20 20 6 30,0 30 20 8 40,0 40 20 7 35,0 50 20 11 55,0 60 20 11 55,0 80 20 11 55,0 100 20 15 75,0 LD50 = 45 Log(Số lượng IJs) 0.0 0.7 1.0 1.3 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 80 2 70 y = 0.2899x - 2.0858 1 60 R2 = 0.7182 50 0 40 -1 30 -2 T 20ỷ l ệ ch ế t 10 -3 Norminv(T ỷ l ệ ch ế t) 0 -4 1 5 10 20 30 40 50 60 80 100 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 34. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-MP11 trên sâu xanh
  16. 124 Nguyễn Ngọc Châu Thử nghiệm xác định hiệu lực gây chết của chủng H -MP11 đối với sâu keo da láng với 10 công thức nồng độ phơi nhiễm từ 10 đến 100 IJs. Mỗi công thức 4 sâu và 4 lần lặp lại với tổng số 176 sâu. Kết quả thử nghiệm cho thấy sâu keo da láng rất mẫn cảm với chủng H - MP11 (Bảng 25). Ngay ở các công thức đầu ti ên đã có 56,3-62,5% sâu bị chết và tỷ lệ sâu chết đạt 93,8-100% ở các công thức gây nhiễm 80-100 IJs. Bảng 25. Hiệu lực gây chết sâu keo da láng của chủng H -MP11 (Nhiệt độ: 27,7-28,3ºC, độ ẩm: 77-81%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 16 10 62,5 20 16 9 56,3 30 16 13 81,3 40 16 12 75,0 50 16 13 81,3 60 16 13 81,3 70 16 14 87.5 80 16 16 100 90 16 15 93,8 100 16 16 100 LD50 = 12 Log (Số lượng IJs) 1.0 1.3 1.5 1.6 1.7 1.8 1.8 1.9 2.0 2.0 100 2.8 2.4 80 2.0 60 1.6 40 1.2 Tỷ chết lệ y = 0.2202x - 0.0961 0.8 20 2 0.4 R = 0.7979 Norminv (Tỷ chết) lệ 0 0.0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 35. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-MP11 trên sâu keo da láng
  17. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 125 Thử nghiệm với sâu tơ đã được triển khai với 10 công thức nồng độ phơi nhiễm từ 5 đến 50 IJs. Mỗi công thức 5 sâu, nhắc lại 4 lần với tổng số là 225 sâu. Thí nghiệm cho thấy ở nồng độ phơi nhiễm 5 IJs có 30% sâu tơ chết. Ở các công thức 15, 20, 25 IJs tỷ lệ sâu t ơ chết là 50%. Ở công thức cao nhất 50 IJs thì tỷ lệ sâu tơ chết đạt cao nhất là 95% (Bảng 26). Bảng 26. Hiệu lực gây chết sâu tơ của chủng H-MP11 (Nhiệt độ: 23,6-27,7ºC, độ ẩm: 71-86%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 5 20 6 30,0 10 20 8 40,0 15 20 10 50,0 20 20 10 50,0 25 20 10 50,0 30 20 13 65,0 35 20 14 70,0 40 20 14 70,0 45 20 14 70,0 50 20 19 95,0 LD50 = 15 Log (Số lượng IJs) 0.7 1 1.18 1.3 1.4 1.481.54 1.6 1.65 1.7 100 2.0 1.6 80 y = 0.1791x - 0.7024 R2 = 0.8217 1.2 60 0.8 40 0.4 Tỷchết lệ 0.0 20 -0.4 Norminv (TỷNorminv chết) lệ 0 -0.8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 36. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-MP11 trên sâu tơ
  18. 126 Nguyễn Ngọc Châu Giá trị LD50 đối với sâu tơ là 15 IJs này cao hơn so với giá trị LD50 của các chủng tuyến trùng S-TK10 là 12 và S-TX1 là 11 IJs. Như vậy là khả năng ký sinh gây chết sâu tơ của H-MP11 kém hơn S-TK10 và S-TX1, sâu tơ tỏ ra mẫn cảm với S-TK10 và S-TX1 hơn H-MP11. Thí nghiệm xác định khả năng gây chết của H-MP11 trên bọ hung đen trưởng thành được bố trí với 10 công thức từ 100 đến 5000 IJs, mỗi công thức 10 bọ hung và tổng số 550 bọ hung cho thử nghiệm. Bảng 27. Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng H -MP11 (Nhiệt độ: 25,7-29,4ºC, độ ẩm: 80-91%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 6 12,0 200 50 9 18,0 400 50 12 24,0 600 50 16 32,0 800 50 20 40,0 1000 50 21 42,0 1200 50 26 52,0 1600 50 28 56,0 2000 50 30 60,0 5000 50 45 90,0 LD50 = 1077 Sau 5 ngày phơi nhiễm tỷ lệ bọ hung đen chết ở các công thức nồng độ phơi nhiễm 100 và 200 IJs khá thấp, chỉ đạt 12 đến 18%. Tỷ lệ chết tăng l ên ở các công thức tiếp theo. Ở công thức 1200 IJs thì tỷ lệ chết đạt 52%. Còn ở công thức 5000 IJs tỷ lệ chết đạt 90% số l ượng bọ hung thử nghiệm (Bảng 27). Giá trị LD50 trong thí nghiệm này là 1077 IJs. Giá trị này là thấp
  19. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 127 hơn khi so sánh với thí nghiệm trước cùng trên đối tượng bọ hung đen (1492 IJs đối với S-TK10 và 1286 IJs đối với S-TX1). Điều này cũng có nghĩa là chủng H-MP11 có khả năng diệt bọ hung đen tốt hơn 2 chủng S-TK10 và S-TX1. Nhìn chung đối với cả 4 loại sâu được thử nghiệm là sâu xanh, sâu keo da láng, sâu tơ và bọ hung đen, đều tỏ ra mẫn cảm với chủng tuyến trùng H-MP11 và như vậy chủng tuyến trùng H-MP11 có thể sử dụng để thử nghiệm phòng trừ các loài sâu hại này. Log (Số lượng IJs) 2.0 2.3 2.6 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.7 100 1.6 y = 0.2193x - 1.4044 1.2 80 2 R = 0.9058 0.8 60 0.4 0.0 40 -0.4 Tỷ chết lệ -0.8 20 -1.2 Norminv (Tỷ chết) lệ 0 -1.6 100 200 400 600 800 1000 1200 1600 2000 5000 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Đồ thị 37. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-MP11 trên bọ hung đen 4. Hiệu lực gây chết sâu hại của H-NT3 Chủng tuyến trùng H-NT3 là một trong 2 chủng của loài tuyến trùng Heterorhabditis indica ở Việt Nam được coi là một trong
  20. 128 Nguyễn Ngọc Châu những chủng tuyến trùng bản địa có rất nhiều ưu điểm nổi bật như khả năng di chuyển tốt và khả năng sinh sản cao trong cơ thể côn trùng vật chủ. Nghiên cứu khả năng gây chết sâu hại của chủng H - NT3 được tiến hành trên 5 đối tượng sâu hại là sâu keo da láng, sâu xám, sâu khoang, sâu tơ và bọ hung đen. Thử nghiệm đánh giá khả năng gây chết sâu keo da láng của chủng H-NT3 được tiến hành với 9 công thức nồng độ gây nhiễm từ 10 đến 100 IJs. Mỗi công thức gồm 8 sâu, lặp lại 4 lần với tổng số 320 sâu trong thử nghiệm này. Trong thí nghiệm này sâu keo da láng bắt đầu chết ở các công thức nồng độ 10, 20, 30, 40 IJs đều với tỷ lệ khá cao l à 62,5%. Ở công thức 80 và 100 IJs thì tỷ lệ sâu chết 100% (Bảng 28). Gi á trị LD50 = 14 IJs đối với sâu keo da láng cho thấy sự mẫn cảm của sâu này đối với chủng tuyến trùng H-NT3. Giá trị này mặc dù cao hơn một chút so với chủng H-MP11 nhưng đều là chủng có tiềm năng lớn để phòng trừ sâu keo da láng. Bảng 28. Hiệu lực gây chết sâu keo da láng của chủng H -NT3 (Nhiệt độ: 27,9-28,9ºC, độ ẩm: 79-84%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 32 20 62,5 20 32 20 62,5 30 32 20 62,5 40 32 20 62,5 50 32 22 68,7 60 32 24 75,0 70 32 28 87,5 80 32 32 100 100 32 32 100 LD50 = 14
  21. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 129 Log (Số lượng IJs) 1.0 1.3 1.5 1.6 1.7 1.8 1.8 1.9 2.0 100 2.8 y = 0.2679x - 0.4238 2.4 80 R2 = 0.7552 2.0 60 1.6 1.2 40 0.8 Tỷchết lệ 0.4 20 0.0 (Tỷ Norminv chết) lệ 0 -0.4 10 20 30 40 50 60 70 80 100 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 38. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên keo da láng Đánh giá khả năng gây chết của H-NT3 trên sâu xám được tiến hành với 10 công thức nồng độ từ 20 đến 200 IJs. Mỗi công thức sử dụng 10 sâu, lặp lại 3 lần với tống số 330 sâu cho thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm cho thấy, ở công thức nồng độ thấp nhất 10 IJs mới chỉ có 17,6% số lượng sâu xám chết và tỷ lệ chết tăng lên ở các công thức nồng độ cao hơn và đạt giá trị cực đại là 88,2% ở công thức nồng độ phơi nhiễm 200 IJs (Bảng 29). Giá trị LD 50 đối với sâu xám là 80 IJs. Bảng 29. Hiệu lực gây chết sâu xám của chủng H -NT3 (Nhiệt độ: 25,2-27,7ºC, độ ẩm: 84-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 20 34 6 17,6 40 34 10 29,4 60 34 12 35,3 80 34 14 41,2 100 34 17 50,0 120 34 20 58,8 140 34 23 67,6 160 34 24 70,6 180 34 26 76,5 200 34 30 88,2 LD50 = 80
  22. 130 Nguyễn Ngọc Châu Log (Số lượng IJs) 1.3 1.6 1.8 1.9 2.0 2.1 2.1 2.2 2.3 2.3 100 1.6 y = 0.2106x - 1.0521 1.2 80 R2 = 0.9839 0.8 60 0.4 40 0.0 Tỷchết lệ -0.4 20 -0.8 Norminv(Tỷ chết) lệ 0 -1.2 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 39. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên sâu xám Thử nghiệm đánh giá khả năng gây chết của H-NT3 đối với sâu khoang được chia thành 3 nhóm tuổi khác nhau là, nhóm I ấu trùng tuổi 1+2, nhóm II ấu trùng tuổi 3+4 và nhóm III ấu trùng tuổi 5+6. Cả 3 nhóm tuổi của sâu khoang đều được bố trí thử nghiệm với 10 công thức nồng độ từ 10 đến 200 IJs. Mỗi công thức nồng độ 5 sâu và lặp lại 3 lần. Tổng số có 495 sâu ở 3 nhóm tuổi được sử dụng cho thử nghiệm. Bảng 30. Hiệu lực gây chết sâu khoang (tuổi 1+2) của chủng H -NT3 (Nhiệt độ: 25,2-30,0ºC, độ ẩm: 71-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 10 2 20,0 20 10 2 20,0 30 10 3 30,0 50 10 5 50,0 60 10 5 50,0 80 10 6 60,0 100 10 7 70,0 120 10 7 70,0 150 10 8 80,0 200 10 9 90,0 LD50 = 50
  23. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 131 Kết quả thử nghiệm trên sâu khoang nhóm I (tuổi 1+2) cho thấy tỷ lệ sâu khoang chết sau 5 ngày là 20% ở công thức nồng độ 10 và 20 IJs. Tỷ lệ chết tăng dần đến 90% ở công thức nồng độ 200 IJs trên một sâu khoang. Trong thí nghiệm n ày, tỷ lệ chết của sâu khoang tỷ lệ thuận với nồng độ phơi nhiễm ban đầu. Giá trị LD 50 = 50 IJs (Bảng 30). Trong thí nghiệm đối với sâu khoang nhóm II (tuổi 3+4) th ì có 10% sâu khoang bị chết ở công thức nồng độ 10 IJs. Tỷ lệ chết sâu khoang tăng lên ở các công thức nồng độ cao hơn và đạt giá trị cao nhất là 95% ở công thức nồng độ 200 IJs. Giá trị LD 50 của H-NT3 đối với sâu khoang tuổi này (tuổi 3+4) là 84 IJs (Bảng 31). Trong thí nghiệm trên sâu khoang nhóm III (tuổi 5+6) là độ tuổi chuẩn bị hoá nhộng cho thấy: tỷ lệ sâu chết 20% ở 2 công thức nồng độ 10 và 20 IJs và đạt giá trị cao nhất là 80% ở công thức nồng độ phơi nhiễm 200 IJs (Bảng 32). Giá trị LD50 của H-NT3 đối với sâu khoang tuổi 5+6 là 82 IJs thấp hơn một chút so với LD50 đối với sâu khoang tuổi 3+4 (84 IJs), nhưng cao hơn khá nhiều so với LD50 đối với sâu khoang tuổi 1+2 (50 IJs). Log (Số lượng IJs) 1 1.3 1.48 1.7 1.78 1.9 2 2.082.18 2.3 100 1.5 y = 0.2301x - 1.1436 80 1.0 R2 = 0.9687 0.5 60 0.0 40 Tỷchết lệ -0.5 20 -1.0 Norminv(Tỷ chết) lệ 0 -1.5 10 20 30 50 60 80 100 120 150 200 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 40. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên sâu khoang (tuổi 1+2)
  24. 132 Nguyễn Ngọc Châu Bảng 31. Hiệu lực gây chết sâu khoang (tuổi 3+4) của chủng H -NT3 (Nhiệt độ: 25,2-30,0ºC, độ ẩm: 71-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 20 2 10,0 20 20 5 25,0 30 20 6 30,0 50 20 7 35,0 60 20 9 45,0 80 20 12 60,0 100 20 14 70,0 120 20 14 70,0 150 20 16 80,0 200 20 19 95,0 LD50 = 84 Như vậy, đối với sâu khoang cùng một nồng độ tỷ lệ gây chết sâu khoang khác nhau ở các tuổi sâu khác nhau. Tuổi sâ u còn non 1+2 rõ ràng mẫn cảm hơn nhiều so với tuổi sâu già hơn. Log (Số lượng IJs) 1.3 1.6 1.78 1.9 2 2.082.15 2.2 2.26 2.3 100 2.0 y = 0.2746x - 1.4304 1.6 80 R2 = 0.9566 1.2 0.8 60 0.4 40 0.0 -0.4 T ỷ l ệ ch ế t 20 -0.8 -1.2 Norminv (T Norminv ỷ l ệ ch ế t) 0 -1.6 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv(Tỷ lệ chết) Linear (Norminv(Tỷ lệ chết)) Hình 41. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên sâu khoang (tuổi 3+4)
  25. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 133 Bảng 32. Hiệu lực gây chết sâu khoang (tuổi 5+6) của chủng H -NT3 (Nhiệt độ: 25,2-30,0ºC, độ ẩm: 71-87%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 10 10 2 20,0 20 10 2 20,0 30 10 4 40,0 50 10 5 50,0 60 10 6 60,0 80 10 6 60,0 100 10 6 60,0 120 10 7 70,0 150 10 7 70,0 200 10 8 80,0 LD50 = 82 Log (Số lượng IJs) 1.3 1.6 1.78 1.9 2 2.082.15 2.2 2.26 2.3 100 1.2 y = 0.1779x - 0.9073 80 0.8 R2 = 0.9068 0.4 60 0.0 40 -0.4 T ỷ l ệ ch ế t 20 -0.8 Norminv (T Norminv ỷ l ệ ch ế t) 0 -1.2 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv(Tỷ lệ chết) Linear (Norminv(Tỷ lệ chết)) Hình 42. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên sâu khoang (tuổi 5+6) Thử nghiệm đánh giá khả năng gây chết của H -NT3 đối với sâu tơ được tiến hành với 10 công thức nồng độ từ 5 đến 50 IJs, mỗi công thức 10 sâu, nhắc lại 4 lần và tổng số 440 sâu cho thử nghiệm.
  26. 134 Nguyễn Ngọc Châu Bảng 33. Hiệu lực gây chết sâu tơ của chủng H-NT3 (Nhiệt độ: 23,0-24,6ºC, độ ẩm: 71-81%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 5 41 12 29,3 10 41 19 46,3 15 41 20 48,8 20 41 28 68,3 25 41 28 68,3 30 41 28 68,3 35 41 33 80,8 40 41 35 85,4 45 41 37 90,2 50 41 39 95,1 LD50 = 12 Kết quả thí nghiệm (Bảng 33) ghi nhận tỷ lệ sâu chết 29,3% ở công thức nồng độ 5 IJs. Tỷ lệ này nhanh chóng tăng lên gần 50% ở công thức nồng độ 15 IJs và đạt giá trị cao nhất là 95,1% ở công thức nồng độ phơi nhiễm 50 IJs. Giá trị LD50 đối với sâu tơ 12 IJs là thấp và tương đương với giá trị LD50 của 2 chủng S-TK10 và S-TX1. Log (Số lượng IJs) 0.7 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5 1.5 1.6 1.7 1.7 100 2.0 y = 0.2188x - 0.6409 1.6 80 2 R = 0.9647 1.2 60 0.8 40 0.4 Tỷ chết lệ 0.0 20 -0.4 Norminv (Tỷ chết) lệ 0 -0.8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 43. Tương quan giữa nồng độ IJs gây nhiễm với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên sâu tơ
  27. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 135 Đối với bọ hung đen, thử nghiệm xác định hiệu lực gây chết của chủng H-NT3 được tiến hành với 10 công thức nồng độ từ 100 đến 5000 IJs. Mỗi công thức nồng độ gồm 10 bọ hung đen tr ưởng thành lặp lại 5 lần, tổng số có 550 bọ hung đ ược sử dụng cho thử nghiệm. Kết quả thí nghiệm (Bảng 34) đã ghi nhận: có 12% bọ hung đen chết sau 5 ngày phơi nhiễm ở nồng độ phơi nhiễm 100 IJs và tỷ lệ này tăng lên 52% ở công thức nồng độ 1200 IJs. Tỷ lệ bọ hung chết cao nhất là 90% ở công thức nồng độ phơi nhiễm 5000 IJs. Giá trị LC50 của H-NT3 đối với bọ hung đen là 1070 IJs là tương đương với LC50 của MP11 (1077 IJs) là thấp hơn so với các chủng Steinernema đã thử nghiệm. Các kết quả đánh giá hiệu lực gây chết một số lo ài sâu hại của 4 chủng tuyến trùng bản địa Việt Nam đều có chỉ số LD 50 khá thấp. Thông thường một chủng tuyến trùng có chỉ số LD50 nhỏ hơn 100 IJs đối với một loài sâu hại được coi là có tiềm năng để trở thành tác nhân sinh học trong phòng trừ loài sâu hại. Các thử nghiệm trên đây cho thấy cả 4 chủng tuyến trùng ở Việt Nam đều là những chủng có tiềm năng phòng trừ một số loài sâu hại quan trọng ở Việt Nam. Bảng 34. Hiệu lực gây chết bọ hung đen của chủng H -NT3 (Nhiệt độ: 25,2-27,4ºC, độ ẩm: 79-92%) Số lượng IJs Số sâu TN Số sâu chết Tỷ lệ chết (%) 100 50 6 12,0 200 50 8 16,0 400 50 13 26,0 600 50 15 30,0 800 50 18 36,0 1000 50 21 42,0 1200 50 26 52,0 1600 50 29 58,0 2000 50 32 64,0 5000 50 45 90,0 LD50 = 1070
  28. 136 Nguyễn Ngọc Châu Log (Số lượng IJs) 2.0 2.3 2.6 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.7 100 1.6 y = 0.2284x - 1.4567 1.2 80 R2 = 0.9276 0.8 60 0.4 0.0 40 Tỷ lệ chết -0.4 -0.8 20 Norminv (Tỷ lệ chết) -1.2 0 -1.6 100 200 400 600 800 1000 1200 1600 2000 5000 Số lượng IJs Tỷ lệ chết Norminv (Tỷ lệ chết) Linear (Norminv (Tỷ lệ chết)) Hình 44. Tương quan giữa nồng độ nhiễm IJs với tỷ lệ sâu chết của chủng H-NT3 trên bọ hung đen Đối với bọ hung đen, mặc d ù giá trị LD50 của cả 4 chủng EPN đều cao hơn 1000 IJs, nhưng kết quả này cũng phù hợp với công bố của các tác giả ở Trung Quốc (Wang & Li, 1987). Mặc dù các nghiên cứu này không chỉ ra LD50 nhưng đã cho biết kết quả thử nghiệm với nồng độ phơi nhiễm 2500 IJs trên một bọ hung đen thì có 5 trong số 9 chủng EPN của Trung Quốc đ ã gây chết bọ hung đen với tỷ lệ 56,5 -100% sau 7 ngày phơi nhi ễm. So với kết quả này thì cả 4 chủng EPN của Việt Nam cũng đều có tiềm năng trở thành tác nhân sinh học trong phòng trừ bọ hung đen.
  29. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 137 Bảng 35. Giá trị LD50 đối với sâu hại của các chủng tuyến tr ùng Giá trị LD50 của các chủng tuyến trùng TT Loài sâu hại S-TK10 S-TX1 H-MP11 H-NT3 Sâu xanh 1 18 45 (Helicoverpa armigera) Sâu khoang (tuổi 1+2) 2 35 50 (Spodoptera litura) Sâu khoang (tuổi 3+4) 3 35 84 (Spodoptera litura) Sâu khoang (tuổi 5+6) 4 35 82 (Spodoptera litura) Sâu keo da láng 5 12 14 (Spodoptera exigua) Sâu xám 6 80 (Agrotis ypsilon) Sâu tơ ( Plutella 7 12 11 15 12 xylostella) Sâu xanh bướm trắng 8 13 (Pieris rapae) Sâu cuốn lá đậu tương 9 28 (Omiodes indicata) Bọ hung đen 10 1492 1286 1077 1070 (Alissonotum impressicolle) Trên cơ sở xác định LC50 của các chủng tuyến trùng thử nghiệm đối với mỗi loại sâu hại trong điều kiện ph òng thí nghiệm, cho phép thiết kế các thử nghiệm phòng trừ tiếp theo ở quy mô nhà kính trước khi tiến hành các thử nghiệm ngoài đồng.
  30. 138 Nguyễn Ngọc Châu II. HIỆU LỰC PHÒNG TRỪ MỘT SỐ SÂU HẠI CHÍNH BẰNG TUYẾN TRÙNG Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thử nghiệm trong ph òng thí nghiệm chúng tôi đã triển khai thử nghiệm ph òng trừ một số đối tượng sâu hại quan trọng tr ên đồng ruộng. Năm đối tượng sâu hại cây trồng Việt Nam đ ã được thử nghiệm phòng trừ bằng các chế phẩm sinh học tuyến tr ùng là: sâu keo da láng (Spodoptera exigua) hại nho ở Ninh Thuận, sâu xám ( Agrostis ypsilon) hại thuốc lá và đậu tương ở Ba Vì, sâu đục thân cam chanh (Ceresium sp.) ở Vĩnh Phúc, bọ hung đen ( Alissonotum impressicolle) hại mía ở Thanh Hóa v à bọ nhảy (Phyllotreta striolata) hại rau ở Hải Phòng. Mục đích của các thử nghiệm l à đánh giá hiệu lực gây chết sâu hại nói riêng và hiệu lực phòng trừ nói chủng của một số chủng tuyến trùng đối với 5 đối tượng sâu hại. Ngoại trừ đối tượng bọ nhảy hại rau là chưa được thử nghiệm xác định hiệu lực gây chết còn 4 đối tượng còn lại đã được thử nghiệm xác định hiệu lực gây chết trong phòng thí nghiệm. 1. Hiệu lực phòng trừ sâu keo da láng hại nho Nho là một cây ăn quả đặc sản của tỉnh Ninh Thuận. Mặc d ù diện tích trồng nho chỉ chiếm 5,2% diện tích đất nông nghiệp (số liệu năm 1997 là 2200 ha), nhưng cây nho th ực sự đã tạo ra một thế mạnh của ngành nông nghiệp Ninh Thuận. Giá trị thu từ cây nho ở Ninh Thuận chưa tính đến chế biến và các dịch vụ khác chiếm gần 28% tổng giá trị sản xuất nông nghiệp, trong đó từ 1 ha đất trồng nho có thể cho thu nhập từ 50 triệu đến 160 triệu đồng (thời giá năm 2000), vì vậy cây nho Ninh Thuận thực sự đ ã mang lại nguồn lợi nhuận không nhỏ cho người trồng nho ở Ninh Thuận. Tuy nhiên, một trong những khó khăn lớn trong việc sản xuất nho ở Ninh Thuận l à vấn đề phòng trừ sâu bệnh hại, trong đó có việc áp dụng các biện pháp bảo vệ thực vật c òn nhiều bất cập. Vì sản phẩm nho tươi chủ yếu được sử dụng để ăn nên việc
  31. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 139 sử dụng thuốc hóa học l à một trong những vấn đề cần đặc biệt chú ý trong vệ sinh và an toàn thực phẩm. Thực tế, mỗi vụ nông dân phun thuốc khoảng 40 - 45 lần và hầu hết không có thời gian ngừng phun trước khi thu hoạch. Do cây nho l à cây trồng bị nhiều loại sâu bệnh hại gần nh ư quanh năm và sâu h ại luôn nhờn thuốc, nên người trồng nho phải luôn luôn đổi chủng loại thuốc mới. Điều này dẫn đến chi phí tăng cao v à để lại hậu quả lâu dài cho con người và môi trường sống. Việc áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp dịch hại cây nho trong đó bi ện pháp phòng trừ bằng các tác nhân sinh học đã được ngành nông nghiệp Ninh Thuận quan tâm đặc biệt. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phòng trừ sâu keo da láng hại nho tại Nin h Thuận bằng tuyến trùng. Trong các chủng tuyến trùng bản địa đã được nghiên cứu thì chủng tuyến trùng H-NT3 tỏ ra là một chủng có nhiều ưu thế để trở thành tác nhân sinh học trong phòng trừ sâu keo da láng có hiệu quả: i) H-NT3 có khả năng ký sinh gây chế t vật chủ sâu keo da láng nhanh chóng; ii) H -NT3 có khả năng di chuyển nhanh, xâm nhập vật chủ với tỷ lệ cao v à sinh sản rất tốt trong cơ thể vật chủ; iii) và quan trọng nhất là chủng H- NT3 được phân lập tại Ninh Thuận n ên chủng này mang tính địa phương rất cao và thích nghi tốt với khí hậu khô và nóng quanh năm tại Ninh Thuận. Thử nghiệm sử dụng tuyến trùng H-NT3 phòng trừ sâu keo da láng hại nho tại vùng nho Phan Rang - Tháp Chàm (tỉnh Ninh Thuận) được triển khai năm 2000 với diện tích 10.000m 2. Để tuyến trùng có thể bám dính và giữ ẩm trong điều kiện trên dàn nho chúng tôi đã phối chế tuyến trùng với rỉ đường (khá sẵn từ các xưởng chế biến đường mía) và phun rải tuyến trùng lên lá nho. Với số nồng độ 1100 IJs/ml phun vừa ướt đều mặt trên và mặt dưới lá nho, chế phẩm EPN có tác dụng diệt sâu khá nhanh, sau khi phun thuốc 2-3 ngày hiệu lực diệt sâu đã là 59-61%. Trong 3 ngày từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 6 hiệu lực ở trong khoảng 67-69%. Hiệu quả phòng trừ như vậy là khá cao đối với một chế phẩm sinh học v à
  32. 140 Nguyễn Ngọc Châu kết quả này có thể cho phép sử dụng tuyến trùng trong đấu tranh sinh học sâu keo da láng hại nho. Trong khi đó với thuốc sinh học SEBA thì sau khi phun 3 ngày thuốc vẫn chưa phát huy tác dụng khi hiệu lực vẫn bằng 0. Phải đến 4 ngày sau khi phun thuốc hiệu lực mới là 22%, sau 5 ngày hiệu lực mới đạt 27%. Hiệu lực của thuốc sinh học SEBA cao nhất ở ng ày thứ 6 sau khi phun đạt 66% (Bảng 36). So sánh hiệu lực phòng trừ sâu keo da láng của tuyến trùng H- NT3 với thuốc sinh học SEBA, tuyến tr ùng H-NT3 có hiệu lực phòng trừ cao hơn không đáng kể sau 6 ngày (68% so với 66%), nhưng khả năng gây chết của H-NT3 nhanh hơn rất nhiều (tác dụng gây chết của thuốc SEBA cao nhất v ào ngày thứ 6 sau khi phun, trong khi tuyến trùng H-NT3 là 2 ngày sau khi phun đã đạt hiệu lực hơn 60%). Điều này có ý nghĩa quan trọng bởi vì vào thời điểm bùng phát của dịch chỉ cần chậm một vài ngày sâu keo da láng cũng có khả năng phá trụi ruộng nho nếu không đ ược dập tắt kịp thời. Bảng 36. Hiệu lực phòng trừ sâu keo da láng của H-NT3 so với thuốc SEBA Công thức Hiệu lực thuốc (%) sau xử lý (ng ày) nồng độ thử nghiệm 1 2 3 4 5 6 H-NT3 18 61 59 67 69 68 SEBA 0 0 0 22 27 66 Như vậy kết quả thử nghiệm này cho thấy tuyến trùng H-NT3 có khả năng phòng trừ sâu keo da láng nhanh và hiệu quả cao hơn thuốc sinh học SEBA. H-NT3 hoàn toàn có thể trở thành tác nhân sinh học sử dụng phòng trừ sâu keo da láng trong tương lai. 2. Hiệu lực phòng trừ sâu đục thân cam chanh Sâu đục thân cam chanh (Ceresium sp.) là một trong những đối tượng hại quan trọng đối với các trang trại ở huyện M ê Linh, Vĩnh
  33. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 141 Phúc. Đối tượng sâu đục thân cây thường gây ra hậu quả lớn đối với cây trồng nhưng lại khó phòng diệt do chúng nằm bên trong thân cây, khó xử lý chúng bằng thuốc hóa học. Một số nghiên cứu ở nước ngoài cho thấy tuyến trùng EPN tỏ ra khá hữu hiệu khi sử dụng để phòng trừ sâu đục thân, đặc biệt đối với các cây ăn quả (Shanks & Agudelo-Silva ,1990; Wang, 1993) trong đó có sâu đục rễ cam chanh ở Mỹ (Shapiro-Ilan et al., 2005). Ở Việt Nam lần đầu tiên sử dụng tuyến trùng để phòng trừ sâu đục thân trên cây cam chanh. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm Kết quả thử nghiệm sử dụng 3 chủng tuyến tr ùng, trong đó có 2 chủng thuộc giống Steinernema (S-CTL và S-TN10) và 1 chủng thuộc giống Heterorhabditis (H-NT3) để diệt sâu đục thân cam chanh trong phòng thí nghi ệm (Bảng 37) cho thấy: với liều lượng 200 IJs / sâu thì chủng S-CTL cho kết quả diệt 100%, tiếp đến là chủng S.TN10 với kết quả diệt 82%, c òn chủng H-NT3 không có khả năng diệt sâu đục thân. Nh ư vậy, rõ ràng sâu đục thân cam chanh mẫn cảm rất khác nhau v ới các chủng EPN khác nhau. Từ t hử nghiệm này có thể khẳng định 2 chủng S-CTL (thuộc loài Steinernema carpocapsae ) và S- TN10 (thuộc loài Steinernema robustspiculum ) có khả năng sử dụng diệt sâu đục thân cam, chanh. Từ kết quả trên đây cũng cho phép tiến hành thử nghiệm phòng trừ sâu đục thân cam, chanh ngoài đồng ruộng. Bảng 37. Hiệu lực diệt sâu đục thân cam chanh của 3 chủng EPN trong phòng thí nghiệm Chủng Nồng độ Số sâu TN Số sâu Tỷ lệ chết TT EPN (IJs) (con) chết (%) 1 S-CTL 200 100 100 100 2 S.TN10 200 100 82 82 3 H. NT3 200 100 0 0 Thử nghiệm ngoài đồng ruộng
  34. 142 Nguyễn Ngọc Châu Tiến hành xử lý sâu đục thân bằng chủng tuyến tr ùng S-CTL tại 4 vườn chanh ở xã Ngọc Thanh, huyện Mê Linh (Vĩnh Phúc). Ở mỗi thân cây hoặc cành cây bị sâu đục thân, sử dụng xy ranh b ơm dịch tuyến trùng nồng độ 2.000 IJs/ml và bơm trực tiếp vào lỗ sâu đục phía trên thân hoặc cành. Bơm từ từ để dịch tuyến trùng có thể ngấm được nhiều vào các lỗ. Liều lượng từ 5-10 ml (tùy lỗ sâu đục nông hay sâu) và nồng độ 2000 IJs/ml. Sau đó dùng đất sét bịt miệng lỗ lại. Sau một tuần tiến hành kiểm tra bằng 2 cách: chẻ cành kiểm tra trực tiếp và theo dõi xem sâu có tiếp tục hoạt động và đùn mùn gỗ ra ngoài hay không? Kết quả thống kê cho thấy: tỷ lệ sâu chết sau khi xử lý 1 tuần đạt từ 57 -74%, trung bình là 66,15%. Mặc dù kết quả này là thấp hơn kết quả thử nghiệm trong phòng nhưng cũng đạt tỷ lệ khá cao và có thể chấp nhận được đối với một chế phẩm sinh học. Về nguyên tắc, nếu tuyến trùng EPN tiếp cận được với sâu đục thân chúng sẽ xâm nhập v ào sâu hại và giết sâu hại trong vòng 24-48h. Tuy nhiên, trong thực tế ở một số hang sâu đục thân có thể được bịt kín bằng mùn hoặc phân sâu nên có thể tuyến trùng EPN không tiếp cận được với sâu mà sâu có thể sống sót. Bảng 38. Hiệu lực phòng trừ sâu đục thân cam chanh của chủng S-CTL ngoài đồng ruộng Số cây Số cành Số sâu Tỷ lệ TT Lô thử nghiệm TN TN chết chết (%) 1 Ông Lâm (đồng Đầm) 12 32 22 65,6 2 Ông Tư (đồng Đầm) 12 54 40 74,1 3 Ông Thông (xóm 17 28 16 57,1 Trung) 4 Chị Dung (xóm Trung) 13 33 20 60,6 Tổng cộng cả 4 vườn 54 147 98 66,6 Ở Florida (Hoa Kỳ) đã nghiên cứu sử dụng EPN để phòng trừ một số đối tượng sâu đục rễ cam chanh như D. abbreviatus và Pachnaeus spp. với kết quả khá tốt (Shapiro -Ilan et al., 2005). Tuy nhiên, đến nay hầu như chưa có nghiên cứu nào đề cập đến việc sử dụng tuyến trùng EPN để phòng trừ sinh học sâu đục thân ở cam chanh. Như vậy, đây là thử nghiệm đầu tiên PTHS họ sâu
  35. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 143 đục thân, cành cam chanh bằng tuyến trùng. Kết quả thử nghiệm sử dụng tuyến tr ùng S-CTL để phòng trừ sâu đục thân Ceresium sp. hại cam chanh ở xã Ngọc Thanh cho kết quả bước đầu tương đối tốt với hiệu lực phòng trừ đạt 66,6%. Tuy nhiên, cần tiếp tục thử nghiệm ở qui mô lớn h ơn để đánh giá hiệu quả kinh tế trước khi áp dụng phòng trừ đại trà việc phòng trừ sinh học sâu đục thân bằng tuyến tr ùng EPN theo hướng này. 3. Hiệu lực phòng trừ sâu xám hại thuốc lá Kết quả thử nghiệm trong điều kiện nhà lưới đã cho thấy ba chủng EPN S-CTL, S-TN10 và S-XS4 có khả năng diệt sâu xám rất tốt. Do đó thử nghiệm ngo ài đồng ruộng để đánh giá khả năng phòng trừ sâu xám hại thuốc lá của các chủng EPN n ày đã được triển khai tại Trạm nghiên cứu thuốc lá Ba Vì, Hà Tây trong 3 năm 2001-2003, với diện tích 1080m 2 (năm 2001), 2160m 2 (năm 2003), và 5400m2 (năm 2003). Trước khi tiến hành thử nghiệm kiểm tra mật độ sâu xám trong đất thu đ ược kết quả trung bình có khoảng 45 sâu/ô thử nghiệm (tức l à khoảng 1,5 sâu/m2). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở Bảng 39 và Hình 45 cho thấy thuốc sinh học EPN có tác dụng ph òng trừ rõ rệt đối với sâu xám trên đồng ruộng. Nếu so sánh với ruộng đ ược xử lý thuốc hóa học Selecron 50EC th ì thuốc sinh học EPN đạt hiệu quả cao hơn rõ rệt (tỷ lệ số cây bị cắn chết sau khi phun thuốc ít hơn). Tuy nhiên, kết quả xử lý thuốc sinh học EPN phụ thuộc rất lớn vào thời điểm xử lý thuốc. Do tính chất gây hại của sâu xám là chỉ cắn cây thuốc lá còn non, trong vòng 2 tuần sau khi trồng, vì vậy việc chọn thời điểm phun thuốc l à rất quan trọng. Bảng 39. Hiệu lực của S-CTL, S-TN10 và S-XS4 đối với sâu xám trên ruộng thuốc lá Công Cây chết sau các ngày kiểm tra (%) thức HL (%) 1 3 5 7 10 15 Tổng* S-CTL 1,5 0,7 0,7 0,7 0,0 0,0 3,6a 85,3 S-TN10 0,7 0,7 0,7 0,7 0,0 0,0 2,8a 88,6 S-XS4 0,7 0,7 1,5 0,0 0,0 0,0 2,9a 88,2 CTĐC 0,0 3,0 8,9 6,7 5,9 0,0 24,5b 00,0
  36. 144 Nguyễn Ngọc Châu * Các giá trị, theo sau bằng các chữ cái giống nhau, l à sai khác không có ý nghĩa ( =0,05). Từ kinh nghiệm thực tế trong đợt th ử nghiệm trước đây tại vùng thuốc lá Sóc Sơn cho thấy: khi chọn thời điểm phun rải tuyến tr ùng cùng ngày hoặc muộn hơn 1 ngày sau khi trồng thuốc sẽ không có hiệu quả cao. Do đặc tính sinh học của sâu xám là đào hang trú ẩn trong đất gần gốc cây, ban ngày chúng nằm trong hang, ban đêm chui lên mặt đất cắn cây non và kéo vào hang để ăn. Chúng chỉ ăn cây còn nhỏ mềm, mỗi lần cắn đứt ngang gốc cây v à làm cây chết luôn. Khác với thuốc hóa học có khả năng ti êu diệt nhanh sâu hại, tác dụng diệt sâu của thuốc sinh học, trong đó có tuyến trùng là xảy ra từ từ. Đối với tuyến trùng EPN, từ lúc phun rải tuyến trùng đến lúc nhiễm có thể một vài giờ đến một vài ngày, từ lúc nhiễm đến lúc sâu chết cũng mất một vài ngày. Như vậy, ngay cả khi sâu đã bị nhiễm EPN thì chúng vẫn có thể tồn tại 24-48 giờ trước khi chết, thời gian đó đủ để sâu xám tiếp tục cắn cây con gây hại. Chính v ì suy luận này chúng tôi đã tiến hành phun rải thuốc trước khi trồng thuốc lá 7 ngày và cách làm này đã cho hiệu quả tốt. Hình 45. Biểu đồ so sánh hiệu lực diệt sâu xám của S-CTL, STN10 và S-XS4 ở điều kiện ngoài đồng
  37. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 145 Hiệu lực diệt sâu xám trên ruộng thuốc lá của cả 3 chủng EPN thử nghiệm đạt 85,3-88,6% (Bảng 39). So với thuốc hóa học Selecron 50EC thì thuốc sinh học EPN đạt hiệu quả cao h ơn rõ rệt (tỷ lệ số cây bị cắn chết sau khi phun thuốc ít h ơn). Tuy nhiên, kết quả xử lý thuốc sinh học EPN phụ thuộc rất lớn vào thời điểm xử lý thuốc. Do tính chất gây hại của sâu xám l à chỉ cắn cây thuốc lá còn non, trong vòng 2 tuần sau khi trồng, vì vậy việc chọn thời điểm phun thuốc trước khi trồng 5-7 ngày là có ý nghĩa quyết định. 4. Hiệu lực phòng trừ bọ hung đen hại mía Trong mấy năm trở lại đây bọ hung đen l à đối tượng gây thành dịch hại đối với các vùng trồng mía ở Thanh Hoá. Theo số liệu thống kê của phòng nông nghiệp huyện Thạch Thành năm 1996, bọ hung mới chỉ xuất hiện gây hại tr ên 4 ha mía nhưng đến năm 2002 dịch hại bọ hung đã lan ra gần 1000 ha chiếm gần 1/5 diện tích mía toàn huyện. Hiện tại, các địa ph ương đang áp dụng các biện pháp phòng trừ bọ hung là bắt thủ công, bẫy đèn và phun rải thuốc hóa học như Diazinon 10H, Furadan 10H, Diaphos 10H và một số loại thuốc khác. Thực tế cho thấy, tất cả các loại thuốc thử nghiệm đều đạt hiệu quả thấp nếu sử dụng đúng liều khuyến cáo. Nhưng khi tăng liều lượng lên gấp đôi và tăng cả lượng nước phun thì một số loại thuốc đạt hiệu quả 59 -66%. Việc dùng quá nhiều thuốc hóa học chắc chắn sẽ tác động xấu đến môi trường sinh thái, ảnh hưởng đến sức khỏe người trồng mía và chất lượng mía. Xuất phát từ thực tế nh ư trên, chúng tôi đã thử nghiệm sử dụng tuyến trùng để phòng trừ bọ hung hại mía tại Thạc h Thành, Thanh Hóa. Các th ử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy nhiều chủng tuyến tr ùng bản địa Việt Nam đều có hiệu lực gây chết khá cao đối với các loại bọ hung, trong đó có lo ài bọ hung hại mía. Tuy nhiên, tổng hợp các ưu thế của từng chủng tuyến trùng chúng tôi chọn chủng S-TX1 (một chủng thu được tại Thanh Hóa) để đưa ra thử nghiệm phòng trừ bọ hung hại mía tại Thạch Thành, Thanh Hóa.
  38. 146 Nguyễn Ngọc Châu Hiệu lực phòng trừ bọ hung đen của tuyến trùng S-TX1 Trước khi tiến hành thử nghiệm, chúng tôi tiến h ành điều tra về biến động số lượng bọ hung đen trong đất trồng mía. Kết quả cho thấy bọ hung đen xuất hiện quanh năm trong đất trồng mía, lúc nào trong đất trồng mía cũng có thể t ìm thấy trứng, ấu trùng và bọ trưởng thành. Tuy nhiên, bọ hung đen thường vũ hóa sau những trận mưa rào đầu mùa hạ từ cuối tháng 4 đến đầu tháng 5, xuất hiện rộ với mật độ lớn tập trung v ào cuối tháng 5 và đầu tháng 6 và giảm dần số lượng tới tháng 11. Mật độ bọ hung trưởng thành cao nhất vào cuối tháng 5 đầu tháng 6 l à 6,5 ± 2,2 con/m2, Thời gian sống của bọ hung đen tr ưởng thành kéo dài khoảng 210-217 ngày. Ấu trùng bọ hung đen thường sống ở đất xung quanh gốc mía và ăn rễ mía non. Bọ trưởng thành cũng ăn rễ và phần non của gốc mía trong một thời gian ngắn tích luỹ dinh dưỡng để đẻ trứng. Vì vậy, bọ trưởng thành tập trung phá mía trong thời gian đầu, đây cũng l à thời gian mầm mía xuân phát triển, mầm còn non, bọ hung thường cắn ngang gốc mầm làm cho mầm mía chết, cây héo v àng hay phát triển kém, còi cọc. Bọ hung đen trưởng thành đẻ trứng trong suốt thời gian sống, nhưng tập trung vào tháng 9 và tháng 10. Th ời gian trứng nở từ 14-18 ngày tuỳ thuộc vào nhiệt độ và ẩm độ của môi trường, ấu trùng có 3 tuổi, tuổi một và hai, mỗi tuổi khoảng 28 ngày, tuổi ba khoảng 56 ngày. Ấu trùng tuổi I ăn xác cây mục nát, tuổi II ngoài xác cây mục nát còn ăn rễ cây bé, tuổi III thường xuất hiện từ tháng 12 đến tháng 3 phá hại phần gốc của mía vụ xuân và vụ thu. Mật độ ấu trùng bọ hung đen cao nhất 7,0 ± 2,6 con/m 2 vào tháng 12 năm trước đến tháng 1 năm sau. Căn cứ vào biến động số lượng và tình hình gây hại của bọ hung đen trên ruộng mía, chúng tôi tiến hành thử nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ bọ hung đen của tuyến trùng với 2 đợt thử nghiệm ứng với 2 đợt bọ hung xuất hiện với mật độ cao nhất: đợt I từ tháng 12/2002 đến tháng 5/2003 chủ yếu để phòng trừ ấu trùng bọ hung đen, đợt II từ tháng 6/2003 đến tháng 11/2003 chủ yếu để phòng trừ bọ hung đen trưởng thành.
  39. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 147 Trong đợt thử nghiệm I, hiệu lực ph òng trừ ấu trùng bọ hung đen đạt 49% sau 3 ngày xử lý tuyến trùng. Hiệu lực tăng lên đến 59% sau 10 đến 20 ng ày sau xử lý tuyến trùng. Sau 30 ngày hiệu lực diệt bọ hung đạt 65% v à hiệu lực này vẫn được duy trì đến 60 ngày sau xử lý bằng tuyến trùng. Sau đó hiệu lực diệt bọ hung giảm nhưng vẫn duy trì ở mức 49% cho đến 180 ngày kể từ khi phun rải tuyến tr ùng (Bảng 40). Đối với công thức xử lý bằng thuốc hóa học Diaphos 10H, thì hiệu lực phòng trừ ấu trùng bọ hung sau 3 ngày xử lý thuốc là 70%. Hiệu lực này là khá cao nhưng đ ã không duy trì được lâu. Sau 30 ngày hiệu lực giảm còn 58%, và sau 60 ngày còn 53%. Sau khoảng thời gian này thì Diaphos 10H hầu như không còn hiệu lực phòng trừ bọ hung đen nữa (Bảng 40). Hiệu lực phòng trừ bọ hung đen trưởng thành bằng tuyến trùng S-TX1 được đánh giá trong đợt thử nghiệm lần II. Kết quả thử nghiệm cho thấy: sau 3 -10 ngày thử nghiệm, hiệu lực ph òng trừ đạt được từ 47 đến 51%. Ở thời điểm 20 -30 ngày sau khi phun rải tuyến trùng hiệu lực diệt bọ hung đạt mức cao nhất l à 53-54%. Sau đó hiệu lực có giảm dần nhưng vẫn duy trì ở mức 42% sau 180 ngày phun rải (Bảng 40). Bảng 40. Hiệu lực phòng trừ bọ hung của S-TX1 so với thuốc hóa học Diaphos 10H Đợt Công thức Hiệu lực thuốc (%) sau xử lý (ng ày) TN thử nghiệm 3 10 20 30 60 120 180 S-TX1 49 59 59 65 66 59 49 I Diaphos 10H 70 67 69 58 53 21 23 S-TX1 51 47 54 53 47 51 42 II Diaphos 10H 83 54 0 0 0 0 0 TN: Thí nghiệm
  40. 148 Nguyễn Ngọc Châu Tương tự như thử nghiệm đợt I, ở đợt thử nghiệm II mặc dù thuốc hóa học Diaphos 10H có hiệu lực 83% sau 3 ng ày xử lý, nhưng sau 10 ngày hiệu lực này giảm còn 54% và sau 20 ngày thì hiệu lực của thuốc Diaphos 10H bằng 0 tức l à thuốc hoàn toàn không còn tác dụng đối với bọ hung đen trưởng thành. Như vậy, đối với một đối tượng sâu hại rất khó phòng trừ như bọ hung đen, trong thí nghiệm này hiệu lực phòng trừ của tuyến trùng S-TX1 (đợt I, HL = 49-66%, đợt II, HL = 42-54%) là tương đối có hiệu quả và có thể chấp nhận được. Hiệu lực của S-TX1 đối với ấu trùng bọ hung đen cao nhất sau khi xử lý thuốc 20-60 ngày là 59-66% (đợt I) và đối với trưởng thành bọ hung đen thì hiệu lực phòng trừ cao nhất sau 20-30 ngày là 53-54% (đợt II). Kết quả này cho thấy tuyến trùng S-TX1 có khả năng phòng trừ ấu trùng bọ hung tốt hơn bọ hung trưởng thành. Kết quả theo dõi thử nghiệm cũng cho thấy: mặc dù hiệu lực phòng trừ của tuyến trùng ở tại thời điểm xử lý thuốc là không cao bằng thuốc hóa học Diaphos 10H, nhưng tuyến trùng S-TX1 lại có tác dụng lâu dài hơn và xét về hiệu quả phòng trừ bọ hung đen trong cả một thời vụ thì tuyến trùng vẫn có hiệu quả tốt hơn so với thuốc hóa học. Biến động số lượng bọ hung đen và tuyến trùng sau xử lý Ngoài đánh giá hiệu lực gây chết bọ hung đen ở các thời điểm khác nhau, chúng tôi còn theo dõi bi ến động mật độ của bọ hung và tuyến trùng ngoài đồng ruộng định kỳ sau khi xử lý. Việc l àm này nhằm mục đích xác định số lần xử lý và thời gian xử lý tuyến trùng EPN tối ưu trong một vụ mía. Số liệu thu được ở đợt thử nghiệm I cho thấy: ở thời điểm trước khi phun rải tuyến trùng, mật độ bọ hung là 5,4 con/m2 thấp hơn một chút so với ô đối chứng, nh ưng ở thời điểm 3 ngày sau rải thuốc thì mật độ là 3,6 con/m2, chỉ bằng một nửa mật độ ở ô đối chứng. Sau đó mật độ tiếp tục giảm chỉ c òn 2,6 con/m2 ở thời điểm 30 ngày sau xử lý tuyến trùng. Sau đó mật độ ấu trùng bọ hung đen cũng suy giảm theo quy luật m ùa vụ nhưng luôn thấp hơn và chỉ
  41. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 149 bằng khoảng một nửa so với mật độ ấu tr ùng bọ hung đen ở ô đối chứng (Hình 46). Biến động mật độ tuyến trùng trong đất ở ruộng mía thí nghiệm cũng được theo dõi định kỳ và dễ dàng nhận thấy mật độ tuyến trùng suy giảm nhanh chóng sau khi rải vào trong đất. Sau 3 ngày mật độ tuyến trùng chỉ còn khoảng 40% số lượng ban đầu. Mật độ tuyến trùng giảm dần ở các ngày sau và còn khoảng 25% ở 30 ngày sau khi rải vào trong đất. Ở các thời điểm 60, 120 ngày sau thử nghiệm, mật độ tuyến trùng tồn tại trong đất rất thấp và sau 180 ngày hầu như không còn tuyến trùng trong đất (Hình 46). 7 300 6.4 6.2 6.2 6 6 6 5.6 5.4 250 250 5 200 4 3.6 3.4 150 2.8 2.8 3 2.6 2.4 2.2 102.5 103 2 100 2 80.4 Mật độ bọ hung (con/ m2) (con/ hung bọ độ Mật 1.4 60 m2) (IJs/ 1000 x EPN độ Mật 1 50 10.4 0 6 0.5 0 0 3 10 20 30 60 120 180 Ngày sau xử lý AB/ ĐC (con/ m2) AB/ TN (con/ m2) EPN (IJs/ m2) AB/ĐC Ấu trùng bọ hung/ô đối chứng AB/TN Ấu trùng bọ hung/ô thí nghiệm Hình 46. Biến động mật độ tuyến trùng và ấu trùng bọ hung ở ruộng thí nghiệm Tương tự như trong đợt thử nghiệm I, số liệu thu được về sự biến động mật độ bọ hung đen tr ưởng thành trong đất ở đợt thử nghiệm II (Hình 47) cũng cho thấy có sự sai khác về biến động số lượng bọ hung đen trưởng thành giữa lô thí nghiệm và lô đối chứng. Sự suy giảm mật độ tuyến trùng trong đất chắc chắn do một lượng tuyến trùng đã từ đất xâm nhập vào bọ hung. Tuy nhiên,
  42. 150 Nguyễn Ngọc Châu trong điều kiện bình thường, sau thời gian xâm nhập giết chết bọ hung, tuyến trùng sẽ phát triển và sinh sản trong xác chết bọ hung và tạo ra một lượng lớn ấu trùng cảm nhiễm phát tán trong đất. V ì vậy nếu trong điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm) tốt và mật độ côn trùng vật chủ (bọ hung) vẫn duy trì trên đồng ruộng thì tuyến trùng có thể tồn tại thường xuyên trên đồng ruộng. Trường hợp sau 180 ngày hầu như không còn tuyến trùng trong đất cũng là vấn đề cần được xem xét lý giải tìm nguyên nhân cho vấn đề này. 8 300 250 7 6.4 250 6.8 6 5.2 4.8 200 5 4.6 4 150 3.2 112.5 113 3 2.6 85.4 2.2 100 2 64.8 Mật độ bọ hung (con/ m2) (con/ hung bọ độ Mật 2 2.4 2.4 2 m2) (IJs/ 1000 x EPN độ Mật 50 1 1.4 1.2 1 1.2 12.4 8 0 0.6 0 0 3 10 20 30 60 120 180 Ngày sau xử lý TT/ ĐC (con/ m2) TT/ TN (con/ m2) EPN (IJs/ m2) TT/ĐC Trưởng thành bọ hung/ô đối chứng TT/TN Trưởng thành bọ hung/ô thí nghiệm Hình 47. Biến động mật độ tuyến trùng và bọ hung trưởng thành ở ruộng thí nghiệm Nhìn chung, sau 6 tháng thử nghiệm, mật độ của cả ấu trùng và bọ hung trưởng thành giảm mạnh ở lô ruộng được xử lý tuyến trùng S-TX1 và chỉ còn 50% so với lô không xử lý. Còn mật độ tuyến trùng S-TX1 trong đất mặc dù cũng giảm rất nhiều nhưng vẫn tồn tại trong đất ruộng mía. Điều n ày khẳng định tác
  43. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 151 dụng lâu dài (ít nhất trong thời gian 6 tháng sau khi xử lý) của tuyến trùng, trong khi thuốc hóa học sau 30 ngày đã gần như không còn tác dụng. Sự duy trì lâu dài mật độ tuyến trùng trên đồng ruộng có ý nghĩa rất quan trọng vì khi đó tuyến trùng đóng một vai trò như một thiên địch tự nhiên của bọ hung trên đồng mía. Tuyến trùng tiếp tục tiêu diệt bọ hung, tiếp tục sinh sản trong điều kiện đồng ruộng và duy trì mật độ bọ hung hại mía d ưới ngưỡng gây hại. Đây là ích lợi quan trọng của tuyến tr ùng so với thuốc hóa học. Chính vì hiệu lực lâu dài của tuyến trùng mà số lần phun rải thuốc chỉ 1 hoặc 2 lần cho 1 năm, trong khi việc xử lý thuốc hóa học ít nhất là 3 tháng một lần. Tuy nhiên, việc duy trì tuyến trùng trên đồng ruộng, ngoài yếu tố vật chủ là bọ hung, còn phụ thuộc nhiều yếu tố môi trường như loại đất, thành phần cơ giới của đất, ẩm độ, cây chủ, v.v. . Vì vậy, để có thể kết luận về số lần và thời gian thích hợp cho một lần phun rải tuyến trùng cần tiếp tục theo dõi biến động mật độ bọ hung và tuyến trùng trong đất để xác định hiệu lực và thời gian duy trì hiệu lực của tuyến trùng trên đồng ruộng. 5. Hiệu lực phòng trừ bọ nhảy hại rau Bọ nhảy (Phyllotreta striolata Fabr.) là một trong những sâu hại phổ biến ở các loại rau họ hoa thập tự (Brassicaceae). Thử nghiệm phòng trừ bọ nhảy hại rau tại Hải Phòng với chế phẩm sinh học tuyến trùng do Chương trình phòng trừ tổng hợp sâu hại rau của FAO tiến hành với 2 chế phẩm sinh học tuyến trùng, trong đó 1 chế phẩm do Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp và chế phẩm khác do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp. Thử nghiệm được tiến hành theo 2 bước: trong chậu vại và ngoài đồng ruộng. Mục đích thí nghiệm là so sánh hiệu lực của thuốc sinh học tuyến trùng với thuốc hóa học và một số biện pháp khác. Thử nghiệm đã được tiến hành trong 2 vụ liên tiếp, thời gian tiến hành thử nghiệm từ tháng 4 đến tháng 7 năm 2004 tại 2 x ã là Tân Dân và An Thọ thuộc huyện An Lão, Hải Phòng.
  44. 152 Nguyễn Ngọc Châu 60 50 Mẫu của NCST 40 NIPP s1 NIPP s2 30 Đối chứng M ậ 20đ t ộ sát quan 10 0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Số ngày sau khi trứng đầu tiên nở Hình 48. Mật độ bọ nhảy trưởng thành trong các chậu trồng cải ngọt xử lý bằng EPN Kết quả thí nghiệm trong chậu vại cho thấy chế phẩm sinh học EPN của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp có tác dụng rất tốt, không để cho quần thể bọ nhảy tăng mạnh m à có tác dụng làm cho quần thể bọ nhảy giảm mạnh (Hình 48). Còn kết quả thử nghiệm ngoài đồng ruộng vụ thứ nhất được tiến hành ở Tân Dân cho thấy: Mức thiệt hại ở lô xử lý tuyến tr ùng là 0,1 (sau 1 tuần), 0,47 (sau 2 tuần) và 0,7 (sau 3 tuần) (theo thang độ 0-3) và là mức thiệt hại thấp nhất so với các lô thử nghiệm khác với Nicotin, thuốc hóa học hay phơi ải (Hình 49). Kết quả này thể hiện sau cả 3 tuần kiểm tra. Chỉ số năng suất trung b ình cũng cao gần bằng lô đối chứng và cao hơn so với các lô thử nghiệm khác (Hình 50). Tuy nhiên kết quả này không thể hiện ở vụ thứ 2 do điều kiện thí nghiệm thay đổi là giữa các lô thử nghiệm không có rào chắn bọ nhảy. Do bọ nhảy là đối tượng di chuyển nhanh trên mặt đất và trên giá thể là cây rau nên để đánh giá chính xác tác động v à hiệu lực của thuốc và các yếu tố thí nghiệm cần ngăn cách giữa các ô thí nghiệm không để bọ nhảy tự do di chuyển qua lại giữa
  45. Chương V. Hiệu lực phòng trừ sâu hại của một số chủng EPN 153 các ô thí nghiệm. Hình 49. Diện tích lá trung bình bị thiệt hại trên ruộng cải sau khi xử lý Mặc dù báo cáo của FAO nhận xét về tác dụng tích cực của tuyến trùng EPN trong phòng trừ bọ nhảy, chúng tôi cho rằng đây với kết quả thử nghiệm như trên thì đây chỉ là những nhận xét bước đầu. Để có được kết luận xác đáng hơn cần phải tiến hành thử nghiệm tiếp theo ở quy mô lớn hơn và theo một quy trình đánh giá chuẩn xác hơn. 12 10 8 6 Năngsu ấ t 4 2 0 Tuyến trùng Nicotin Phơi ải Thuốc BVTV Đối chứng Công thức thí nghiệm Hình 50. Năng suất rau cải sau khi xử lý
  46. 154 Nguyễn Ngọc Châu Mặt khác, để sử dụng tuyến trùng phòng trừ bọ nhảy thành công cần nghiên cứu về sinh học phát triển và tập tính của bọ nhảy để xác định cơ chế xâm nhập của tuyến trùng đối với bọ nhảy.
  47. Chương VI CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG EPN I. CƠ SỞ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG EPN 1. Các điều kiện cần xem xét trong việc nhân nuôi tuyến tr ùng Khi xác định cần và đủ để nhân nuôi các chủng tuyến trùng EPN cần phải quan tâm đến nhiều yếu tố, trong đó cần xem xét ba vấn đề quan trọng sau đây: i) điều kiện và nhân lực đã có cho việc nhân nuôi, sản xuất EPN và khả năng đáp ứng các yêu cầu của mô hình công nghệ lựa chọn. Cần xem xét, xác định mô h ình công nghệ nhân nuôi thích hợp với mục đích sản xuất EPM, trong đó n hân nuôi in vivo thích hợp cho việc duy trì và sản xuất IJs trong phòng thí nghiệm và các thử nghiệm ngoài đồng ở quy mô nhỏ, trong khi nhân nuôi in vitro là sự lựa chọn thích hợp đối với qui mô sản xuất lớn cho mục tiêu thương mại; ii) bao nhiêu loại tuyến trùng EPN được yêu cầu nhân nuôi? iii) loại tuyến trùng chuẩn bị sử dụng cho nhân nuôi đã được bảo quản trong thời gian bao lâu trước khi sử dụng. Cần biết rằng các chủng Steinernema thường có khả năng bảo quản lâu hơn các chủng Heterorhabditis. Vì vậy, trong việc sản xuất số lượng lớn Heterorhabditis cần tính toán giữa thời gian sản xuất và sử dụng để tránh kéo dài thời gian bảo quản làm tuyến trùng có thể chết hoặc suy giảm hiệu lực của tuyến tr ùng. 2. Tuyển chọn các chủng EPN để nhân nuôi sinh khối Thông thường tuyển chọn một chủng EPN để đưa vào sản xuất sinh khối lớn thì ngoài các tiêu chuẩn như có độc tố cao, tức hiệu lực diệt sâu tốt (LC50 thấp), có phổ diệt sâu tương đối rộng để có thể áp dụng phòng trừ cho một số đối tượng; có khả năng sinh sản tốt cũng là khả năng sản xuất sinh khối tốt th ì chủng tuyến trùng cũng phải
  48. 156 Nguyễn Ngọc Châu có khả năng bảo quản tốt, tức là có thể bảo quản được lâu trong những điều kiện nhất định mà không bị giảm hoạt tính. Từ các chủng tuyến trùng được phân lập ở Việt Nam, bước đầu đã tuyển chọn được 6 chủng EPN thuộc 4 loài, trong đó có 4 chủng Steinernema (thuộc 3 loài S. sangi, S. loci và S. robustispiculum) và 2 chủng Heterorhabditis thuộc loài H. indica (Bảng 41). Đây là những chủng đáp ứng tiêu chuẩn của tác nhân sinh học như: có phổ diệt sâu rộng, có hiệu lực diệt sâu tốt (LC 50 <100 IJs đối với hầu hết sâu hại – trừ đối tượng bọ hung), có khả năng sinh sản tốt v à có khả năng bảo quản khá lâu, thích hợp với môi tr ường và điều kiện ở Việt Nam. Ngoài 6 chủng này chúng tôi cũng đã sử dụng 1 chủng nhập nội thuôc loài S. carpocapsae (S-CTL) để đưa vào sản xuất. Bảng 41. Danh sách các chủng EPN được tuyển chọn cho PTSH Tên loài tuyến Tên Phổ diệt Sinh sản TT LC50* trùng chủng sâu In vivo In vitro 1 S. loci S-TK10 Rất rộng < 100 34,4 50.000 2 S. carpocapsae S-CTL Rất rộng < 100 32,6 50.000 3 S. sangi S-TX1 Rất rộng < 100 68,3 70.000 4 S. sangi S-XS4 Rất rộng < 100 36,6 60.000 5 H. indica H-MP11 Rộng < 100 180,8 195.000 6 H. indica H-NT3 Rộng < 100 233,5 195.000 7 S. robustispiculum S-TN10 Rộng < 100 32,0 50.000 * LC50 < 100 đối với tất cả sâu thử nghiệm, ngoạ i trừ bọ hung Đơn vị tính là IJs x 1000, nhân nuôi In vivo (IJs/BSL) và nhân nuôi In vitro (IJs/bình tam giác 500 ml) II. NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT TUYẾN TRÙNG EPN 1. Lựa chọn công nghệ thích hợp Hiện nay trên thế giới đã phát triển 2 hệ thống công nghệ nhân nuôi sản xuất tuyến trùng là nhân nuôi in vivo và nhân nuôi in vitro. Hai
  49. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 157 công nghệ này khác nhau chủ yếu bởi nguồn vật liệu nhân nuôi: vật liệu tự nhiên (côn trùng sống làm giá thể) và vật liệu nhân tạo. Nhân nuôi in vivo trên cơ sở sử dụng vật liệu nhân nuôi l à côn trùng sống. Một trong những nguồn vật liệ u cho công nghệ nhân nuôi in vivo là ấu trùng tuổi 4 của BSL (Galleria mellonella), một nguồn vật liệu khá sẵn, dễ sản xuất v à khá mẫn cảm với các chủng tuyến trùng EPN. Nhân nuôi in vitro trên cơ sở sử dụng nguồn vật liệu nhân nuôi nhân tạo. Trong công nghệ này có thể phân biệt 2 loại môi trường nhân nuôi là môi trường nhân nuôi đặc và môi trưởng lỏng được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau. Môi tr ường nhân nuôi đặc thường sử dụng nội tạng động vật làm vật liệu. Một số nội tạng như tim, thận có thể để nguyên gây nhiễm không cần xay nhỏ chế biến th ành dạng bột nhão. Ngoài ra, thường tận dụng cả bộ lòng gia cầm để chế biến thành dạng bột nhão gọi là chicken offal để nhân nuôi tuyến trùng. Đối với môi trường nhân nuôi lỏng thường ở dạng dung dịch được phối chế từ các vật liệu dạng lỏng chủ yếu l à dầu ăn, dịch men, cholesterol và một số muối khoáng như: NaCl, MgSO4, CaCl2 và KCl. Mỗi loại môi trường sử dụng các thiết bị nhân nuôi khác nhau: nhân nuôi in vivo chủ yếu sử dụng các đĩa petri loại lớn. Nhân nuôi in vitro được thực hiện trên nhiều thiết bị khác nhau như: bình tam giác miệng rộng, hộp nhựa, túi nylon chịu nhiệt (đối với môi tr ường chicken offal), bình tam giác miệng rộng, thiết bị bioreactor (đối với môi trường lỏng). Tùy theo điều kiện cụ thể và mục đích nhân nuôi mà quyết định lựa chọn công nghệ nhân nuôi thích hợp. Nhân nuôi in vivo với BSL và in vitro với tim, thận hoặc môi tr ường chicken offal thích hợp cho mục đích thí nghiệm hoặc nhu cầu sử dụng ít ở quy mô trang trại, không cần nhiều vốn. Nh ân nuôi in vitro với môi trường chicken offal và đặc biệt là môi trường lỏng sử dụng thiết bị bioreactor cần đầu tư lớn và thích hợp cho nhu cầu sản xuất lớn cho mục đích thương mại. Sơ đồ phát triển công nghệ Sản xuất chế phẩm sinh học EPN d ù theo công nghệ nhân nuôi in
  50. 158 Nguyễn Ngọc Châu vivo và in vitro cũng bao 5 công đoạn chủ yếu sau đây (theo s ơ đồ công nghệ dưới đây (Hình 51): ▪ Sản xuất vật liệu ban đầu là nguồn IJs ▪ Gây nhiễm tuyến trùng vào môi trường nhân nuôi VẬT LIỆU BAN ĐẦU IJS GÂY NHIỄM IN VIVO IN VITRO G. MELLONELLA MÔI TRƯỜNG NHÂN TẠO last instar larvae monoaxenic hoặc axenic NHÂN Ủ 12-14 NGÀY (IN VIVO) 24-28 NGÀY (IN VITRO) THU HOẠCH IJS XỬ LÝ SẠCH – PHỐI CHẾ ĐÓNG GÓI BẢO QUẢN Hình 51. Sơ đồ công nghệ sản xuất in vivo và in vitro chế phẩm EPN
  51. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 159 ▪ Nhân ủ để tuyến trùng sinh sôi phát triển ▪ Thu hoạch tuyến trùng ▪ Xử lý làm sạch tuyến trùng Ngoài ra, tùy mục đích kinh doanh, sử dụng hay cần bảo quản, vận chuyển đi xa mà có thể thêm 2 công đoạn sau: ▪ Phối chế tuyến trùng ▪ Đóng gói bảo quản tuyến trùng Về nguyên tắc 5 công đoạn chủ yếu trên khá giống nhau về quy trình công nghệ, nhưng hai công đoạn sau thì có thể khác nhau và có thể là bí quyết của các công ty sản xuất chế phẩm sinh học EPN. 2. Công nghệ nhân nuôi in vivo Do khả năng xâm nhiễm và sinh sản của các loài tuyến trùng Steinernema và Heterorhabdis trong vật chủ côn trùng và đặc biệt là do phổ ký sinh của chúng đối với côn tr ùng rất rộng, người ta đã sử dụng nhiều loại côn trùng để làm vật liệu nhân nuôi, sản xuất tuyến trùng. Trong số côn trùng vật chủ được sử dụng làm vật liệu sản xuất tuyến trùng EPN thì ấu trùng bướm sáp lớn - BSL (Galleria mellonella) được coi là côn trùng khá lý tưởng để làm vật liệu nhân nuôi đối với hầu hết các loài tuyến trùng EPN. BSL là côn trùng khá mẫn cảm với hầu hết các loài và chủng loài tuyến trùng EPN và là môi trường lý tưởng cho tuyến trùng sinh sản. Loài côn trùng này sẵn có và dễ nuôi bằng vật liệu tự nhiên là sáp ong hoặc vật liệu phối chế nhân tạo. Một ấu trùng bướm sáp lớn có thể cho thu hoạch tới 200.000 IJs của S. feltiae (Dutky et al. 1964) và 350.000 IJs của H. bacteriophora (Milstead và Poinar 1978). Tuy nhiên s ố lượng IJs được sản xuất trên một ấu trùng bướm sáp lớn phụ thuộc vào chủng loài tuyến trùng và mật độ gây nhiễm ban đầu. Các chủng lo ài tuyến trùng EPN có kích thước IJ nhỏ như ở hầu hết các loài Heterorhabditis thì sản lượng lớn và ngược lại kích thước IJ lớn như ở hầu hết các loài Steinernema thì sản lượng thường nhỏ. Thông thường đối với các chủng / loài tuyến trùng Steinernema số lượng IJs nhỏ hơn rất nhiều thường chỉ đạt từ 30.000 đến 50.000 IJs. Quy trình sản xuất in vivo chủ yếu tham khảo theo phương pháp Poinar (1979) với hàng loạt các thay đổi khác nhau.
  52. 160 Nguyễn Ngọc Châu Quy trình công nghệ sản xuất các chế phẩm sinh học EPN bằng in vivo trên cơ sở sử dụng ấu trùng tuổi 5 của BSL làm vật liệu nhân nuôi, gồm các bước chính sau đây: i) nhân nuôi sản xuất ấu tr ùng tuổi 5 BSL; ii) gây nhiễm IJs cho BSL v à nhân ủ trong 12-14 ngày; iii) thu hoạch IJs bằng kỹ thuật bẫy nước (white trap) và iv) phối chế và bảo quản IJs. Công nghệ nhân nuôi in vivo khá đơn giản, không cần đầu tư lớn, vì vậy có thể áp dụng cho quy mô hộ gia đ ình, các trang trại hoặc các đơn vị sản xuất nhỏ. Tuy nhiên, công nghệ này có nhược điểm là năng suất thấp, chất lượng không ổn định và đặc biệt tốn nhiều công lao động nên giá thành cao. Trước khi nhân nuôi sản xuất in vivo tuyến trùng, cần tạo nguồn vật liệu là ấu trùng BSL. Quy trình nhân nuôi và s ản xuất nguồn BSL được tiến hành theo quy trình được giới thiệu ở phần sau (Phụ lục). 2.1. Xâm nhiễm tuyến trùng vào ấu trùng BSL Tuyến trùng xâm nhiễm (IJs) thường được bảo quả lạnh 12-14oC, trước khi nhiễm nên để IJs ấm dần lên tới nhiệt độ phòng (20-24oC). Kiểm tra tuyến trùng dưới kính hiển vi soi nổi. Tuyến trùng còn sống tốt sẽ chuyển động. Lấy 1ml tuyến trùng và pha trong một lượng nước xác định sao cho có nồng độ tuyến trùng khoảng 200 IJs/ml. Đếm số lượng IJs bằng hộp đếm dưới kính hiển vi soi nổi để biết chính xác mật độ IJs và trên cơ sở đó điều chỉnh nồng độ tuyến trùng đạt 200 IJs/ml bằng thêm hoặc bớt một lượng nước hợp lý để đạt được nồng độ trên. Khi có được nồng độ mong muốn tiến hành hút từng ml dung dịch chứa tuyến trùng và cho vào trên giấy lọc Whatman No1, ф = 90mm đặt trong đĩa petri nhựa 100 14mm. Mỗi hộp cho vào 10 ấu trùng BSL đã qua xử lý nhiệt để không tạo kén. Nh ư vậy, nồng độ gây nhiễm là khoảng 20 IJs/BSL. Nếu nồng độ gây nhiễm cao th ì số lượng tuyến trùng sinh ra sẽ ít do bị cạnh tranh và bị ô nhiễm bởi vi khuẩn bên ngoài. Đậy nắp hộp (chứa tuyến trùng và vi khuẩn) bằng đáy đĩa petri. Dán nhãn và để trong túi nilon (để giữ ẩm), đặt trong phòng tối và ở nhiệt độ phòng (25-28oC). Sau khi gây nhiễm 5-7 ngày hầu hết BSL chết. Cẩn thận chuyển BSL đã nhiễm vào White
  53. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 161 trap (White 1927). Thông thường BSL bị nhiễm EPN và chết sẽ không có mùi thối và có màu sắc khá đặc trưng: BSL bị nhiễm bởi Steinernema sẽ có màu hơi vàng nâu và mềm khi gắp bằng kẹp còn BSL bị nhiễm bởi Heterorhabditid sẽ có màu đỏ gạch và cứng hơn một chút. Những con BSL bị ô nhiễm nặng hoặc chết bởi các nguy ên nhân khác thường màu hơi đen và có mùi thối. Tốt nhất là không thu tuyến trùng từ những con này vì số lượng ít và chúng có thể gây ô nhiễm cho cả đợt. 2.2. Thu hoạch tuyến trùng (IJs) Làm bẫy nước (white trap) theo White (1927): đặt giấy lọc Whatman No1 – 90mm trên mặt lõm của đĩa đồng hồ trong đĩa petri thuỷ tinh lớn (150 20mm). Đặt vào nồi hấp 20 phút ở 121 oC. Rót vào khoảng 70ml nước cất hoặc 0,1% formalin. Không được để nước nhỏ vào mặt lõm của đĩa đồng hồ. Đặt giấy lọc lên trên đĩa đồng hồ và gập mép giấy ngược lại sao cho khi đặt vào đĩa petri chứa nước mép giấy tiếp xúc với bề mặt n ước. Mỗi đĩa như vậy đặt khoảng 20-30 BSL sát nhau trên giấy lọc ở sát mép đĩa đồng hồ (Hình 52). Hình 52. Bẫy nước thu IJs thoát ra từ xác chết côn tr ùng
  54. 162 Nguyễn Ngọc Châu 10-12 ngày sau khi xâm nhiễm IJs sẽ bắt đầu phát tán ra khỏi BSL và di chuyển vào nước trong đĩa petri. Còn xác BSL còn lại trên đĩa đồng hồ. Khi tuyến trùng xuất hiện trong đĩa petri nên tiến hành thu chúng hàng ngày tới khi số lượng giảm (3-4 ngày). Để thu hoạch, nhấc đĩa đồng hồ có BSL ra, rót nước chứa IJs vào cốc (rửa đĩa petri để thu hết tuyến trùng) thêm 70ml nước cất hoặc 0,1% formalin và thay đĩa đồng hồ. Với hầu hết tuyến trùng EPN thì ấu trùng thoát ra khỏi vật chủ BSL cũng là IJs thành thục, nhưng với S. glaseri, khi ấu trùng mới thoát ra từ xác chết côn trùng thì chúng chỉ là dạng ấu trùng tiền xâm nhiễm (pre-IJs) và nếu ấu trùng này di chuyển ngay vào môi trường lỏng chúng sẽ không thể phát triển ho àn toàn thành dạng IJs được. Để cho chúng thành IJs cần thay đĩa đồng hồ và giấy lọc bằng đĩa petri được chuẩn bị đặc biệt. Đĩa petri này có chứa lớp mỏng (khoảng 2mm) plaster, để lớp plaster này khô và chỉ làm ẩm trở lại trước khi sử dụng. Lớp plaster n ày chỉ nên đủ ẩm không nên sũng ướt. Kiểm tra mức độ ẩm trong suốt thời gian thu hoạch, cộng thêm vài giọt nước nếu thấy cần thiết. Vật chủ đã nhiễm được đặt trên lớp plaster ẩm này. tuyến trùng tiền xâm nhiễm xuất hiện và kết thúc sự phát triển trên lớp plaster này, sau đó di chuyển trong 2-3 ngày vào trong môi trường nước hoặc 0,1% formalin trong đĩa petri thuỷ tinh lớn hơn. Chúng có thể được thu theo cách thông thường. 2.3. Chuẩn bị cho bảo quản Kiểm tra IJs còn hoạt động. Mô vật chủ hoặc tuyến trùng ở các giai đoạn không phải IJs phải được loại bỏ. Nếu có vấn đề phát sinh hoặc một số lớn tuyến trùng không hoạt động cần được xem xét xử lý lại hoặc loại bỏ, trước khi tiến hành quá trình rửa cuối cùng. Tách IJs sống ra khỏi xác chết vật chủ, môi trường nhân nuôi hoặc tạp chất khác bằng cách cho IJs di chuyển qua rây lọc có kích thước lỗ thích hợp (40-60µm) để giữ lại mô vật chủ và tuyến trùng ở các giai đoạn không xâm nhiễm. Các giai đoạn không xâm nhiễm có thể bị giết khi rửa tuyến trùng bằng dung dịch Hyamine 0,4% (Methylbenzethonium chloride) trong 15 phút. N ếu muốn, tất cả các giai đoạn không xâm nhiễm của cả hai loại Steinernema và Heterorhabditis đều có thể bị chết khi để ở nhiệt độ phòng trong
  55. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 163 một vài ngày. Để rửa tuyến trùng, cho chúng vào trong một cái cốc, để tuyến trùng lắng đọng, gạn phần nước phía trên và thêm nước sạch vào cho đến khi dung dịch sạch (2-4 lần). Nếu dung dịch bị ô nhiễm nặng chúng có thể được rửa một lần bằng 0,1% formalin. Có thể ly tâm ở tốc độ 300 vòng/phút trong 1 phút có thể làm đẩy nhanh quá trình này. Trong thời gian ngắn tuyến trùng có thể được cất giữ qua đêm trong tủ lạnh nhưng nên rửa ít nhất 1 lần trước khi cho vào tủ lạnh. Cuối cùng chuyển tuyến trùng vào lọ bảo quản. 3. Công nghệ nhân nuôi in vitro Công nghệ sản xuất in vitro trên cơ sở sử dụng môi trường nhân tao (chicken offal) để sản xuất sinh khối lớn EPN. Quy tr ình sản xuất chế phẩm sinh học tuyến trùng gồm 5 giai đoạn chủ yếu sau đây: i) phân lập VKCS (VKCS) từ xoang máu của ấu trùng bướm sáp lớn đã được gây nhiễm EPN chuyển sang môi tr ường Laura Broth cho nhân nuôi sơ cấp để tuyển chọn khuẩn lạc chuẩn (pha I); ii) nhân nuôi thứ cấp VKCS trong môi trường chicken offal để tạo sinh khối lớn; iii) gây nhiễm EPN vào môi trường chicken offal đã được tạo sinh khối VKCS; iv) nhân ủ tổ hợp EPN-VKCS trong vòng 24-28 ngày; v) thu hoạch EPN, phối chế và bảo quản. Công nghệ này khắc phục được những hạn chế của công nghệ in vivo và có khả năng thương mại hoá chế phẩm sinh học EPN với giá thành thấp hơn. 3.1. Phân lập VKCS Nhân nuôi Xenorhabdus pha sơ cấp VKCS của EPN rất mẫn cảm với nồng độ oxygen thấp, thay đổi độ thẩm thấu, thiếu các nguồn dinh d ưỡng và nhân nuôi nhỏ hơn là các chủng thông thường khác (E. coli). Pha sơ cấp của Xenorhabdus có thể được tách và nhận dạng theo hướng dẫn ở Bảng 43 dưới đây. Các vi khuẩn sơ cấp có thể được bảo quản trong 17% môi tr ường dinh dưỡng Glycerol trong chai Martney và giữ ở -18oC (Akhurst 1980). Thể treo này được làm tan nhanh ở nước nóng 60oC (Bedding 1984). Cách khác vi
  56. 164 Nguyễn Ngọc Châu khuẩn có thể được bảo quản tại 12-25oC và cấy chuyền thường xuyên (hàng tháng ở 12oC hoặc hàng tuần ở 25oC). Tốt nhất là sử dụng NBTA hoặc MacConkey agar để bảo quản VKCS vì trong môi trường này nếu vi khuẩn phát triển thành dạng thứ cấp sẽ dễ bị nhận ra và loại bỏ. Phân lập VKCS . Chuyển 10 ấu trùng BSL từ cát ẩm (10%) vào một đĩa petri. Cho nhiễm khoảng 100 IJs trên mỗi BSL. Không nên cho quá nhiều nước để tránh BSL bị chết do ngập n ước trước khi nhiễm tuyến trùng. . Sau 24-48 giờ khi ấu trùng BSL chết chúng được chuyển vào một cốc nhuộm thủy tinh và rửa bằng cồn 70% trong 5-10 phút. . Mổ xác chết bằng một kéo hoặc kim nhọn sắc đ ã được khử trùng và lấy 1 giọt huyết tương (haemolymph) lên NBTA (ho ặc McConkey) sử dụng que cấy platin dạng vòng. Chú ý: Khi thao tác mổ và lấy mẫu huyết tương không làm vỡ ruột ấu trùng BSL để tránh nhiễm bẩn. . Ủ đĩa môi trường nhân nuôi ở 25oC trong buồng tối. . Chọn lấy một khuẩn lạc đơn sơ cấp và nhiễm trở lại vào môi trường NBTA agar. . Nếu đĩa nhân nuôi đạt chất lượng và không bị nhiễm bẩn (có thể phân loại trong nhân nuôi thứ cấp n ày), có thể sử dụng làm nguồn giống cho các nhân nuôi tiếp theo. Chuẩn bị nhân nuôi vi khuẩn . Cấy chuyển một khuẩn lạc sơ cấp vào dịch YS-broth và ủ trong 1-2 ngày ở nhiệt độ 25oC trong máy lắc 200 vòng phút trong tối. . Bổ sung thêm 15% Glyxerol vào dịch nhân nuôi, trộn lắc đều và lấy 2 ml vào các ống týp đã khử trùng. . Sau khi san dịch vào các ống týp, chuyển ngay chúng vào bảo quản ở -80oC. Lưu ý: Các ống týp cần được ghi nhãn tên chủng, ngày chuẩn bị mẫu (VD. HB1-3, 2/9/99). Để chắc chắn cần thêm mô tả ngắn nguồn giống nhân nuôi trong hồ sơ đông lạnh -80oC (lab shelf), nghĩa là số
  57. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 165 thứ tự của khay và hộp chứa mẫu, số chính xác của các typ mẫu, số chủng nuôi và đặc tính của chủng (sơ cấp, thứ cấp, v.v.). 3.2. Chuẩn bị môi trường nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng - vi khuẩn Từ nghiên cứu thành công quy trình công nghệ in vitro trên môi trường đặc (chicken offal) trong bình tam giác, đề tài đã nghiên cứu, thay thế vật liệu sản xuất môi trường chicken offal từ nguyên liệu lòng gia cầm, một loại vật liệu khá đắt, không sẵn có tr ên thị trường với khối lượng lớn bằng nguyên liệu mới là lòng gia súc (lòng lợn) một loại vật liệu khá rẻ, luôn sẵn có tr ên thị trường với khối lượng lớn. Môi trường mới không những rẻ hơn, sản xuất dễ dàng hơn mà năng suất nhân nuôi không thua kém môi trường được sản xuất từ lòng gia cầm. Chuẩn bị môi trường nhân nuôi offal (Bedding 1981, 1984) Các nội quan như tim, gan, ruột, v.v. của gia cầm và gia súc đều có thể sử dụng để sản xuất môi trường nhân nuôi EPN. a. Bỏ túi mật (các muối mật có hại cho sự phát triển của tuyến trùng). Không được làm vỡ túi mật khi lấy nó ra. b. Cho vật liệu lòng vào nối áp suất để hấp ở 121oC trong 20-25 phút. c. Xay nghiền cho nhuyễn vật liệu, trước xay nên dùng kéo cắt ruột thành các đoạn ngắn khoảng 15cm. d. Bảo quản lạnh nếu chưa trộn môi trường ngay. Tốt nhất là trộn xong (như ở bước e) sau đó nếu cần mới bảo quản để giữ an toàn cho không gian trong tủ bảo quản. e. Trộn trong nước và mỡ bò theo các tỷ lệ sau: ▪ Môi trường nhân nuôi các loài Steinernema: 8 Dung dịch offal + 2 phần nước (không có mỡ bò). ▪ Môi trường nhân nuôi các loài Heterorhabditis: 7 phần dịch offal + 2 phần nước + 1 phần mỡ bò. 3.3. Chuẩn bị bình nhân nuôi Cần mang găng tay cao su trong suốt quá trình thao tác là một yêu cầu quan trọng. Tiến hành cắt xốp thành những miếng nhỏ (kích
  58. 166 Nguyễn Ngọc Châu thước 1cm) sau đó trộn với môi trường offal đã chuẩn bị sẵn với tỷ lệ môi trường/xốp (tính theo trọng lượng) là 12,5/1. Mỗi bình tam giác cho một lượng 250-300ml (khoảng 100g) môi trường đã trộn với xốp. Lau sạch miệng bình và bịt kín bằng nút bông bọc vải thưa và hấp ở 121oC trong 20 phút. Bình nhân nuôi được làm lạnh một thời gian trước khi sử dụng. Trường hợp môi trường có mùi hôi thối do nguyên liệu đã để lâu trước khi chế biến thì có thể sử dụng chất khử mùi. Dùng túi nylon chịu nhiệt thay cho bình tam giác và hộp nhựa để nhân nuôi EPN có thể tiết kiệm chi phí nhân nuôi (Hình 55). Ngoài ra, có thể chuyển trực tiếp các túi nhân nuôi ra đồng ruộng để phun rải mà không cần qua khâu tách lọc vừa mất nhiều thời gian vừa bị hao hụt. 3.4. Gây nhiễm vi khuẩn Dịch nhân nuôi vi khuẩn sơ cấp nên được ủ trước một ngày trước khi bình nuôi được chuẩn bị. Vi khuẩn được cấy chuyển vào các ống nghiệm (tốt nhất nhân nuôi vi khuẩn trong một ống týp cho một b ình nhân nuôi) có chứa 5ml nutrient broth. Tốt nhất để các ống týp qua đêm trên máy lắc hoặc ít nhất là xoáy nước trong ống trước khi ủ. Khi nhiễm rót một ống dịch vi khuẩn v ào mỗi bình nhân nuôi. Lắc đều để trộn lẫn dịch vi khuẩn với môi tr ường trong chất xốp nền. Ủ 2-3 ngày ở 25oC để vi khuẩn phát triển nhanh. 3.5. Gây nhiễm tuyến trùng và nhân nuôi tổ hợp (monoxenic) Sau khi nhân nuôi vi khuẩn xong, tiến hành nhiễm tuyến trùng vào các bình đã chuẩn bị sẵn vi khuẩn. Một bình tam giác ban đầu có thể chia thành 7 bình mới. Dùng pipet hút một lượng nước chứa tuyến trùng khoảng 3-4ml và phun vào từng bình tại 3-5 điểm. Sau khi nhiễm tuyến trùng, tốt nhất là tránh rung lắc mạnh bình đang nhân nuôi tuyến trùng. Để các bình nhân ủ trong phòng tối ở nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ 75-80% trong thời gian 10-14 ngày cho đến khi thấy tuyến trùng sinh sôi nhiều và bám đầy trên thành bình có thể thu hoạch.
  59. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 167 Hình 53. Nhân nuôi EPN trong bình tam giác Hình 54. Nhân nuôi EPN trong hộp nhựa
  60. 168 Nguyễn Ngọc Châu Khi bình nhân nuôi có dấu hiệu không tốt hoặc bị nghi ngờ, IJs đã vô trùng bề mặt có thể phục vụ như chất gây nhiễm ban đầu. Khi chủng IJs không nên cho quá nhiều nước cùng với tuyến trùng (tốt nhất là < 5ml) Sau 2-3 ngày kiểm tra xem các bình nhân nuôi có thành công không bằng cách lấy mẫu từ bình nuôi cấy trên MacConkey agar hoặc NBTA (Nutrient agar, bromthy mol blue và tetrazolium chloride) và sau đó kiểm tra màu sắc vi khuẩn phù hợp và hình thái để biết độ thuần khiết (Xem phần phụ lục). Hình 55. Dụng cụ cải tiến nhân nuôi EPN trong túi nylon (B) so với dụng cụ nhân nuôi EPN trong bình tam giác (A) 3.6. Thu hoạch tuyến trùng (IJs) Để tách lọc lấy IJs từ bọt xốp cho xốp vào một rây lọc kích thước lỗ 1-2mm. Đặt rây vào một chậu và cho nước vừa ngập xốp, để yên tĩnh trong thời gian từ 2-6 giờ hoặc nếu cần có thể để lâu đến 12 giờ, nhưng không nên để lâu quá 24 giờ vì thời gian lâu hơn sẽ không có lợi cho tuyến trùng. Không được rót nước lên trên xốp vì
  61. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 169 sẽ rửa mất một phần chất dinh d ưỡng (để nuôi tuyến trùng). Thông thường trong vòng 2 giờ đầu sẽ có khoảng 95% IJs di chuyển qua đáy rây lọc xuống chậu nước. Làm lắng tuyến trùng và rửa tuyến trùng để loại bỏ các phần khác và IJs không hoạt động. Có thể dùng rây lọc kích thước lỗ 0,5mm để lọc và loại bỏ các phần không cần thiết. Đối với các chủng Steinernema có thể sử dụng dung dịch Hyamine để giết các dạng không phải IJs trước khi lọc qua rây. Cần phải rửa tuyến tr ùng nhiều lần tới khi nước sạch. Trong trường hợp cần thiết có thể dùng sục khí để phá vỡ những phần nhỏ của dung dịch sau khi rửa IJs. 3.7. Xử lý sự cố Để tránh ô nhiễm các bình hoặc hộp nhân nuôi cần hết sức chú ý bất kỳ thao tác nào trong quá trình thao tác. Chỉ cần 1 giọt nước nhỏ trong khi sản xuất cũng có thể gây ra ô nhiễm, hoặc một sự thay đổi đột ngột cũng có thể tạo ra pha thứ cấp của VKCS. Thậm chí khi nhiệt độ nhân ủ không thích hợp, ẩm độ không phù hợp vì nhiều nguyên nhân hoặc yếu tố khác. Sự ô nhiễm có thể được nhận biết dễ dàng khi xuất hiện các màu sắc hoặc mùi vị không bình thường hoặc chất rò rỉ khác lạ từ sinh khối do vi khuẩn v à nấm gây ra. Trong bất kỳ trường hợp nào cũng nên được kiểm tra bằng cách gây nhiễm trên NBTA hoặc MacConkey agar. Ở thời điểm trước 2 tuần, bình tam giác nuôi cấy chứa tỷ lệ cao vi khuẩn thứ cấp l à bình thường, tuy nhiên một điều rất quan trong là các bình này phải được chủng vi khuẩn sơ cấp lúc ban đầu. Mặc dù nhiệt độ nhân nuôi tối ưu khác nhau ở các loài tuyến trùng, nhưng nhiệt độ 25-28oC là tốt cho việc sản xuất hầu hết các chủng tuyến trùng. Độ ẩm có thể được điều chỉnh bằng cách thêm vào hay bớt đi một lượng chất lỏng nhất định trong các bước khác nhau của quy trình sản xuất. Nếu môi trường là quá lỏng hoặc quá nhiều chất lỏng cho vào khi nhiễm, tuyến trùng sẽ bị giữ lại ở chỗ nhiễm và chết. Nếu môi trường là quá khô, sự nhân nuôi sẽ mất độ ẩm dần dần trước khi một số lớn tuyến trùng được sản xuất ra. Duy trì ẩm độ cao ở nơi đặt các bình tam giác để nhân ủ là rất tốt. Việc sản xuất và bảo quản IJs cần tính toán thời gian ph ù hợp để không làm giảm khả năng xâm nhiễm của IJs. Sản xuất in vitro
  62. 170 Nguyễn Ngọc Châu chỉ nên được tiến hành 4-6 tháng trước khi sử dụng để tránh làm giảm độc tố và khả năng gây bệnh của tuyến trùng đối với vật chủ của nó. Mặt khác cũng cần quan tâm thích đáng để duy trì các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và bảo quản để làm giảm nguy cơ về vấn đề chất lượng tuyến trùng. Nhìn chung, người sản xuất tuyến trùng cần phải lường trước được các vấn đề có thể xảy ra. Để làm được như vậy người nhân nuôi cần được trang bị kiến thức về hệ thống nhân nuôi để chủ động theo dõi và phản ứng hợp lý đối với các thay đổi mang tính thủ tục. Cùng với một vài hiểu biết về sinh học tuyến trùng, các nguyên nhân và giải pháp cho các vấn đề xảy ra không quá khó để xác định nguyên nhân và giải pháp khắc phục. Thậm chí như vậy sản xuất in vitro cũng không phải là dễ dàng, vì vậy, các thử thách và các sự cố sẽ rất cần thiết cho người tập sự để làm hoàn thiện hệ thống sản xuất. 3.8. Bảo quản tuyến trùng Sau khi thu hoạch và làm sạch, tuyến trùng có thể được chứa trong nước cất với 1 giọt Triton X-100 (tác nhân làm ẩm và ngăn chặn tuyến trùng dính vào bên trong cốc) hoặc 0,1% formalin (chỉ sử dụng khi sự ô nhiễm trở thành một vấn đề quan trọng). Nếu bảo quản trong điều kiện không có sục khí khí th ì nồng độ IJs không nên quá 10-20.000 IJs/ml và độ sâu của nước nên duy trì ở mức 1cm hoặc ít hơn. Các bình tam giác hoặc bình nuôi cấy tế bào là dụng cụ lý tưởng bảo quản tuyến trùng. Trong điều kiện được thông khí (dùng bơm sủi hoặc bất kỳ thiết bị cung cấp khí nào) có thể bảo quản tuyến trùng ở nồng độ 100.000 IJs/ml. Các chủng Steinernema có thể được bảo quản tốt nhất ở nhiệt độ 4-10oC trong 6-12 tháng mà không mất hoạt tính. Các chủng Heterorhabditis thường không để lâu được như vậy, chỉ từ 2- 4 tháng ở 4-10oC. Nếu thấy có hiện tượng tạo búi ở Heterorhabditis cần bổ sung dung dịch sodium bicacbonate (NaH 2CO3) với nồng độ 1gr/50ml nước (hoặc nhiều hơn) để làm tan các búi này mà không ảnh hưởng gì đến tuyến trùng. Nhìn chung, các chủng tuyến trùng của Việt Nam có khả năng bảo quản lâu hơn và có thể bảo quản ở nhiệt độ cao h ơn. Kết quả thí nghiệm bảo quản IJs trong n ước ở nhiệt độ 12oC với
  63. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 171 mật độ 20.000 IJs/ml, thì 2 chủng S-TX1 và S-XS4 của loài Steinernema sangi có thể giữ được từ 6-12 tháng và độc lực diệt sâu vẫn còn. Trong khi đó, với điều kiện bảo quản t ương tự, 2 chủng H-MF11 và H-NT3 của loài Heterorhabditis indica có thể sống và giữ được độc lực trong thời gian 4 -8 tháng. Có thể bảo quản IJs bằng xốp polyether polyurethane. D ùng xốp ẩm đã hấp sạch để chứa IJs của Steinernema với số lượng tuyến trùng bằng 10 lần khối lượng của xốp. Đặt cốc vào trong bình vô trùng và sục khí qua một màng lọc vi khuẩn (0,45m). Khi sử dụng, tuyến trùng được tách khỏi xốp bằng rây lọc hoặc vắt xốp trong nước cho đến khi tất cả tuyến trùng đã rời khỏi xốp. Việc tách lọc này thường tốn nhiều thời gian v à không thích hợp cho mục đích thương mại nhưng rất thích hợp cho mục đích nghiên cứu. Bảo quản IJs trong than hoạt tính và đặc biệt nghiên cứu bảo quản IJs ở trạng thái khô để IJs không hoạt động là một trong những hướng mới khả thi đang được nhiều người quan tâm nghiên cứu (Yukawa & Pitt 1985). III. CHẾ PHẨM SINH HỌC TUYẾN TR ÙNG BIOSTAR VÀ NEMASTAR 1. Cơ sở sản xuất chế phẩm sinh học BIOSTAR và NEMASTAR Các chế phẩm sinh học tuyến trùng được phát triển trên cơ sở 7 chủng tuyến trùng EPN được đánh giá và tuyển chọn, đáp ứng các tiêu chuẩn của thuốc sinh học tuyến trùng. Trong số này có 6 chủng tuyến trùng bản địa Việt Nam và 1 chủng nhập nội (S-CTL). Các chủng này đã được đưa vào sản xuất thử nghiệm qui mô pilot. Trong số các chế phẩm sinh học tuyến trùng, có 5 chế phẩm được sản xuất từ 5 chủng tuyến trùng của giống Steinernema được đặt tên là BIOSTAR, từ BIOSTAR-1 đến BIOSTAR-5 và 2 chế phẩm sinh học tuyến trùng còn lại được sản xuất từ 2 chủng tuyến trùng giống Heterorhabditis (cùng loài H. indica), được mang tên NEMASTAR là N EMASTAR-1 và NEMASTAR-2 (Bảng 42).
  64. 172 Nguyễn Ngọc Châu Bảng 42. Kết quả sản xuất các chế phẩm sinh học EPN Khối Chủng Nồng độ TT Loài tuyến trùng Tên chế phẩm lượng chế EPN (IJs) phẩm (lit) 1 S-TK10 S. loci BIOSTAR-1 300 15 x 106 2 S-CTL S. carpocapsae BIOSTAR-2 1400 10 x 106 3 S-TX1 S. sangi BIOSTAR-3 6500 10 x 106 4 S-XS4 S. sangi BIOSTAR-4 1300 10 x 106 5 S-TN10 S. robustispiculum BIOSTAR-5 1050 10 x 106 6 H-MP11 H. indica NEMASTAR-1 1500 15 x 106 7 H-NT3 H. indica NEMASTAR-2 2500 15 x 106 Các chế phẩm BIOSTAR và NEMASTAR đáp ứng tiêu chuẩn của thuốc sinh học tuyến trùng như: có phổ diệt sâu rộng có khả năng sinh sản tốt và cho sinh khối cao; có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ in vivo và in vitro; có khả năng bảo quản lâu (từ 2-6 tháng) trong điều kiện bình thường, không cần bảo quản lạnh. Đây là ưu thế quan trọng của các chủng EPN bản địa của Việt Nam. Hình 56. Chế phẩm sinh học tuyến trùng BIOSTAR
  65. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 173 Hình 57. Chế phẩm sinh học tuyến trùng NEMASTAR Cơ sở để tính giá thành sản xuất và đánh giá hiệu quả kinh tế của chế phẩm sinh học EPN là các chi phí đầu vào như: chi phí vật tư, năng lượng, công lao động, khấu hao nhà xưởng và trang thiết bị. Trên cơ sở đó có thể tính toán năng lực sản xuất và giá thành sản phẩm ở qui mô pilot (diện tích 24-30m2) như Bảng 43 dưới đây. Năng lực sản xuất chế phẩm EPN của pilot và giá thành phòng trừ bọ hung ở Thạch Thành, Thanh Hóa (Bảng 44) với giá chế phẩm EPN là 1.080.000 đồng (thời điểm 2003), nếu tính cả chi phí vận chuyển (khoảng 700.000 đồng) và công xử lý thuốc (khoảng 250.000 đồng) thì tổng chi phí sẽ vào khoảng 1.930.000 đồng. Như vậy, nếu tổ chức sản xuất tại chỗ có thể giảm giá th ành vật liệu và công vận chuyển. Ngoài ra, tại địa phương khi dịch hại bọ hung hại mía xảy ra có thể sử dụng chính nguồn bọ hung bắt đ ược bằng các phương tiện thủ công để cho gây nhiễm IJs tại chỗ v à có thể sử dụng nguồn sâu này phun rải trực tiếp trở lại đồng ruộng. Phương pháp
  66. 174 Nguyễn Ngọc Châu sử dụng nguồn vật liệu gây nhiễm tại chỗ n ày có thể vừa phục vụ kịp thời việc phòng trừ sâu hại vừa cho phép hạ giá th ành phòng trừ hơn nữa. Bảng 43. Quy mô sản xuất và giá thành chế phẩm EPN (tính cho 01 đợt sản xuất pilot, thời gian là 28-30 ngày). Đầu ra (chế Giá thành/kg Đầu vào Đơn giá (đ.) phẩm) (đ.) Nguyên liệu (15 kg 300.000 ▪ 180 túi nhân lòng gia cầm) nuôi x 30 triệu Hoá chất 150.000 IJs 54.000 Vật liệu phối chế 100.000 ▪ Thu 45 kg chế Năng lượng, thiết bị, phẩm EPN 900.000 dụng cụ (dạng thô, nồng độ tiêu chuẩn Công lao động 1,5 12 x106 IJs. 900.000 người/tháng ▪ Sử dụng cho Chi khác 75.000 diện tích qui đổi Cộng 2.425.000 2,4 ha * Chưa tính chi phí xây dựng nhà xưởng pilot vào giá thành sản xuất Bảng 44. Chi phí sản xuất chế phẩm sinh học EPN và giá thành phòng trừ (đơn giá năm 2003) ▪ Năng lực sản xuất chế - Tổng số sản phẩm là: 45 kg x 12 đợt = phẩm EPN của pilot (tính 540 kg chế phẩm cho cả năm, 12 đợt) - Sử dụng phòng trừ cho 27 ha tiêu chuẩn ▪ Kinh phí đầu tư cho sản - Một đợt: 2,425.000 đ. xuất qui mô pilot (tính 12 - Cả năm: x 12 đợt: 29.100.000 đ. đợt / năm) ▪ Giá thành sử dụng chế - Chế phẩm EPN: 20 kg x 54.000 đ. = phẩm EPN cho 1 ha qui 1.080.000 đ. đổi - Vận chuyển (300 km đi, về): 600.000 đ. - Công xử lý thuốc ngoài đồng: 10 công x 25.000 đ = 250.000 đ.
  67. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 175 So với giá thành sản xuất EPN ở Mỹ và Châu Âu (khoảng 250 USD cho1ha) thì giá thành sản phẩm EPN ở ta rẻ hơn khá nhiều. Tuy nhiên, trong điều kiện Việt Nam thì giá thành này vẫn chưa đủ khả năng cạnh tranh với thuốc hóa học. Mặc d ù hiện tại chi phí thuốc hóa học Diaphos 10H phòng trừ bọ hung hại mía là khá cao, khoảng 750.000 đ / 1ha / năm (ở Thạch Thành, Thanh Hóa). 2. Luận chứng kinh tế kỹ thuật cho sản xuất chế phẩm EPN ở qui mô pilot Thực tế cho thấy giá thành chế phẩm sinh học EPN còn cao là một trong những rào cản chính trong việc thương mại hóa chế phẩm sinh học tuyến trùng. Vì vậy, việc sử dụng công nghệ thính hợp, giảm chi phí đầu vào và tăng sản phẩm đầu ra sẽ có ý nghĩa quyết định về mặt công nghệ sản xuất EPN. Bảng 45 dưới đây liệt kê thiết bị đầu tư cho một pilot sản xuất ở quy mô nhỏ với năng lực sản xuất và chi phí đầu vào, giá thành sản phẩm đầu ra như tính toán ở Bảng 43 và 44 ở trên. Bảng 45. Trang thiết bị cho 01 pilot sản xuất chế phẩm EPN Đơn giá TT Tên trang thiết bị (x1000 Đ) 1 01 máy điều hoà nhiệt độ 2 chiều (air-conditioner) 16.000 2 01 tủ định ôn (incubator) 30.000 3 01 tủ cấy vô trùng (laminar flow) 35.000 4 01 máy hấp vô trùng (sterilizer) 20.000 5 01 máy lắc (electronic shaker) 7.500 6 01 tủ lạnh (refrigerator) 6.000 7 01 tủ lạnh nông (pharmaceutical cabinet 4 -14 oC) 25.000 8 01 kính hiển vi soi nổi (stereomicroscope) 45.000 9 100 hộp đĩa petri ( = 5cm) 1.500 10 100 ống nghiệm ( = 1,8cm x H=18cm) 2.000 11 và một số vật tư, dụng cụ nhỏ khác 4.500 Tổng kinh phí thiết bị cho 01 pilot sản xuất EPN 192,5 triệu Đ
  68. 176 Nguyễn Ngọc Châu Thực ra với giá thành khoảng trên dưới 1.500.000 Đồng chi phí để xử lý cho 1ha (như bọ hung hại mía) mặc dù so với thuốc hóa học (thông thường chi phí để phun thuốc Diaphos 10H mỗi năm 3 lần chi hết 750.000 Đ/ha) thì xử lý bằng tuyến trùng có giá thành gấp đôi. Tuy nhiên, nếu so với giá thành xử lý bằng tuyến trùng, trung bình ở Mỹ là 250 USD trên 1ha thì giá thành ở ta như vậy cũng đã khá rẻ. 3. Những hạn chế công nghệ và giải pháp Từ thực tế sản xuất thử nghiệm có thể thấy một số hạn chế v à giải pháp khắc phục như sau: ▪ Hiệu lực phòng trừ một số sâu hại như bọ hung hại mía, bọ nhảy hại rau còn khá thấp. Do chưa tuyển chọn được chủng EPN tối ưu nhất (có độc lực cao và thích hợp với điều kiện sinh thái) để phòng trừ các đối tượng này. Để nâng cao hiệu quả phòng trừ cần tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn thay thế các chủng Steinernema hiện đang được sử dụng sản xuất EPN bằng các chủng Heterorhabditis. Theo các nghiên cứu nước ngoài thì đây là các chủng có độc tính cao và mẫn cảm hơn với bọ hung và bọ nhảy. ▪ Hạn chế lớn thứ 2 là giá thành chế phẩm sinh học tuyến trùng còn cao chưa cạnh tranh về mặt kinh tế so với thuốc hóa học. Sở dĩ như vậy do công nghệ được áp dụng để sản xuất các chế phẩm sinh học tuyến trùng vẫn là công nghệ thông thường mang tính thủ công, chưa cho phép sản xuất ở qui mô thương mại thuốc sinh học tuyến trùng. Để giải quyết vấn đề này có thể đề xuất 2 giải pháp trước mắt và lâu dài sau đây: − Trước mắt: cần tiếp tục nghiên cứu cải tiến môi trường nhân nuôi EPN thích hợp để tăng năng suất và giảm giá thành sản phẩm. Cải tiến dụng cụ nhân nuôi bằng hộp nhựa hoặc túi polyeth ylen. Cần phải có dự báo sâu bệnh phát sinh tốt để chủ động sản xuất v à có thể đưa sản phẩm từ pilot ra ngoài đồng để sử dụng trực tiếp mà không cần qua khâu xử lý làm sạch bảo quản trước khi phun rải. Như vậy, sẽ giảm được chi phí đáng kể. − Tương lai: cần nghiên cứu công nghệ hiện đại và tự động hóa để sản xuất chế phẩm sinh học EPN trên cơ sở sử dụng môi trường nhân nuôi lỏng để sản xuất in vitro trong các thiết bị Bioreactor
  69. Chương VI. Công nghệ sản xuất tuyến trùng EPN 177 có dung tích lớn (đến 80.000 lít). Hiện nay, việc áp dụng công nghệ này là rất khả thi trong điều kiện Việt Nam. Tuy nhiên để đạt được các mục tiêu như trên, cần đầu tư kinh phí để mua thiết bị và cần nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất in vitro. IV. TRIỂN VỌNG ÁP DỤNG CÔNG NGHỆ MỚI ĐỂ SẢN XUẤT THUỐC SINH HỌC TUYẾN TRÙNG Công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học EPN bằng môi trường nhân nuôi dạng dung dịch và quá trình nhân nuôi được điều khiển tự động trong thiết bị lên men có dung tích lớn (Bioreactors) được coi là sự lựa chọn tối ưu để sản xuất EPN ở qui mô thương mại. Công nghệ này cho phép sản xuất các chế phẩm sinh học EPN ở qui mô lớn, giảm giá thành sản phẩm. Mặc dù quy trình công nghệ chung đã được nghiên cứu và áp dụng tại nhiều hãng sản xuất EPN, nhưng các thông số tối ưu được xác định cho mỗi chủng EPN cần được nghiên cứu và thử nghiệm. Để sản xuất EPN với môi trường lỏng và thiết bị Bioreactor, nguồn tuyến trùng gây nhiễm và VKCS phải được chuẩn bị sẵn ở dạng đơn giá thể (axenic cultures) trước khi chủng nhân nuôi phối chế trong thiết bị Bioreactor. VKCS có thể được phân lập từ tuyến trùng xâm nhiễm hoặc từ xoang máu của BSL sau khi nhiễm tuyến trùng. Nguồn VKCS được bảo quản trong Glyxerin 15% ở nhiệt độ -80oC. 1. Chuẩn bị nguồn tuyến trùng đơn giá thể (axenic) Để thành công đối với nhân nuôi sản xuất t uyến trùng trong môi trưởng lỏng và bằng thiết bị Bioreactor thì yếu tố vô trùng là quan trọng nhất. Để đảm bảo vô tr ùng không thể sử dụng nguồn tuyến trùng bình thường đã có sẵn VKCS mà phải tiến hành phân lập, sản xuất tuyến trùng đơn giá thể (axenic) – không có VKCS bằng cách phân lập và nhân nguồn tuyến trùng từ trứng mới đảm bảo vô trùng tuyệt đối. Ngoài ra, có sự sai khác quan trọng nhất giữa các lo ài Steinernema và Heterorhabditis là các cá thể phân tính trưởng thành