Luận văn Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA đến sự nảy mầm và sinh trưởng phát triển của đậu côve tại Buôn Ma Thuột - Lê Thị Hường

pdf

113 trang huongle 1780

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA đến sự nảy mầm và sinh trưởng phát triển của đậu côve tại Buôn Ma Thuột - Lê Thị Hường", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_nghien_cuu_anh_huong_cua_vi_khuan_sinh_iaa_den_su_n.pdf

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA đến sự nảy mầm và sinh trưởng phát triển của đậu côve tại Buôn Ma Thuột - Lê Thị Hường

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN LÊ TH HƯNG NGHIÊN CU NH HƯNG CA VI KHUN SINH IAA ĐN S NY MM VÀ SINH TRƯNG PHÁT TRIN CA ĐU CƠVE TI BUƠN MA THUT LUN VĂN THC SĨ SINH HC BUƠN MA THUT, NĂM 2011
B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN LÊ TH HƯNG NGHIÊN CU NH HƯNG CA VI KHUN SINH IAA ĐN S NY MM VÀ SINH TRƯNG PHÁT TRIN CA ĐU CƠVE TI BUƠN MA THUT CHUYÊN NGÀNH SINH HC THC NGHIM Mã s: 60.42.30 LUN VĂN THC SĨ SINH HC Ngưi HDKH: TS. Võ Th Phương Khanh BUƠN MA THUT, NĂM 2011
i LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi. Các s liu, kt qu nêu trong lun văn là trung thc và chưa đưc ai cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. Ngưi cam đoan Lê Th Hưng
ii LI CM ƠN Đ hồn thành lun văn tt nghip, tơi xin bày t lịng bit ơn chân thành và sâu sc đn: TS. Võ Th Phương Khanh, ngưi đã dy d, gn gũi, tn tình hưng dn, to mi điu kin thun li, giúp đ tơi trong sut thi gian hc tp ti trưng cũng như thi gian thc hin đ tài. Ban giám hiu cùng tồn th quý thy cơ trưng THPT Tơn Đc Thng đã to điu kin thun li cho tơi trong hc tp và hồn thành lun văn tt nghip. Quý thy cơ trong trưng, các thy cơ trong khoa Khoa hc t nhiên và cơng ngh, đc bit là các thy cơ trong b mơn Sinh đã nhit tình truyn đt cho tơi nhng kin thc quý báu sut ba năm hc tp và rèn luyn dưi mái trưng Đi hc Tây Nguyên. Các thy cơ giáo, cán b, nhân viên qun lý phịng thí nghim đã to điu kin tt nht cho tơi thc hin đ tài. Cui cùng, cho phép tơi gi li cm ơn sâu sc đn gia đình, bn bè, các bn hc viên lp Sinh hc thc nghim K03, đã đng viên, giúp đ tơi trong sut thi gian hc tp và thc hin đ tài. Xin chân thành cm ơn! BMT, ngày 06 /10 / 2011 Hc viên Lê Th Hưng
iii MC LC Trang M ĐU 1 CHƯƠNG I TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1 Vi khun sinh IAA 3 1.1.1. Đi cương v vi khun sinh IAA 3 1.1.2. Mt s yu t nh hưng đn sinh trưng, phát trin ca vi khun 7 1.1.2.1. nh hưng ca nhit đ 7 1.1.2.2. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy 7 1.1.2.3. Nưc và đ m mơi trưng 8 1.2. Auxin – cht kích thích sinh trưng thc vt 8 1.2.1. Ngun gc 8 1.2.2. Cu trúc hố hc và s sinh tng hp 9 1.2.3. Tính cht sinh lý ca auxin 10 1.2.3.1. Hot đng trong s kéo dài t bào 10 1.2.3.2. Hot đng trong s phân chia t bào 11 1.2.3.3. Hot đng trong s phát sinh hình thái (r, chi, qu) 11 1.3 Tng quan tài liu v cây đu Cơve 13 1.3.1. Phân loi 13 1.3.2. Ngun gc và phân b 13 1.3.3. Mt s đc đim sinh vt hc ca đu Cơve 13 1.3.4.Yêu cu sinh thái ca cây đu Cơve 14 1.4. Tình hình nghiên cu 15 1.4.1. Nghiên cu trong nưc 15 1.4.2. Nghiên cu trên th gii 16 1.5. Điu kin t nhiên ca Buơn Ma Thut 18 CHƯƠNG II NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 19
iv 2.1 Ni dung 19 2.2 Vt liu và đa đim nghiên cu 19 2.2.1 Vt liu nghiên cu 19 2.2.2 Đa đim nghiên cu 19 2.3 Phương pháp nghiên cu 19 2.3.1. Phương pháp tuyn chn chng vi khun sinh IAA nh hưng đn sinh trưng ca cây mm đu Cơve 19 2.3.1.1. To dung dch thí nghim 19 2.3.1.2. Xác đnh nng đ vi khun trong dung dch 20 2.3.1.3. Xác đnh phương trình tương quan gia ch s OD 530nm và nng đ IAA (mg/l) 20 2.3.1.4. Nghiên cu nh hưng ca các chng vi khun sinh IAA lên s sinh trưng cây mm đu Cơve 21 3.3.2. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca chng vi khun sinh IAA đưc tuyn chn lên s ny mm ca ht và sinh trưng, phát trin ca đu Cơve 21 3.3.2.1. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun sinh IAA đưc tuyn chn đn s ny mm và sinh trưng cây mm đu Cơve 21 3.3.2.2. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca nng đ và s ln tưi ca vi khun sinh IAA đưc chn đn sinh trưng phát trin cây đu Cơve 22 3.3.2.3. Phương pháp đánh giá vi sinh vt đt sau nuơi trng đu Cơve 24 3.3.3. Phương pháp nghiên cu mt s đc đim sinh hc ca chng vi khun đưc tuyn chn đ đnh danh và nhân nuơi sinh khi 25 3.3.3.1. Mơ t hình thái, màu sc và đc đim khun lc 25 3.3.3.2. Phương pháp nhum Gram 25 3.3.3.3. Phương pháp xác đnh hot tính catalaza 26 3.3.3.4. Phương pháp xác đnh kh năng c đnh nitơ phân t 26 3.3.3.5. Phương pháp xác đnh đưng cong sinh trưng 26 3.3.3.6. Phương pháp xác đnh nhit đ thích hp ca chng vi khun sinh IAA 27
v 3.3.3.7. Phương pháp xác đnh pH thích hp ca chng vi khun sinh IAA 27 CHƯƠNG III KT QU VÀ THO LUN 28 3.1. Nghiên cu tuyn chn các chng vi khun sinh IAA nh hưng đn s sinh trưng cây mm đu Cơve 28 3.1.1. nh hưng ca các chng vi khun đn t l ny mm ca ht 28 3.1.2. nh hưng ca các chng vi khun đn sinh trưng ca cây mm 30 3.2. Nghiên cu nh hưng ca chng vi khun sinh IAA đưc tuyn chn (chng T5) lên sinh trưng, phát trin ca đu Cơve 34 3.2.1. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn s ny mm 34 3.2.2. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn s sinh trưng cây mm đu Cơve 36 3.2.3. Nghiên cu nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn sinh trưng phát trin cây đu Cơve 42 3.2.3.1. nh hưng đn s lưng lá và din tích lá 42 3.2.3.2. nh hưng đn kh năng ra hoa và đu qu 43 3.2.3.3. nh hưng đn chiu dài, đưng kính qu, năng sut, 47 3.2.3.4. nh hưng đn s lưng nt sn r đu Cơve 51 3.2.4. Đánh giá lưng vi sinh vt đt sau nuơi trng đu Cơve 53 3.3. Nghiên cu mt s đc đim sinh hc ca chng vi khun T5 đ đnh danh và nhân nuơi sinh khi 55 3.3.1. Đnh danh vi khun chng T5 55 3.3.2. Xác đnh vi khun Gram 55 3.3.3. Hot tính catalaza ca vi khun chng T5 56 3.3.4. Nghiên cu kh năng c đnh nitơ phân t ca vi khun chng T5 57 3.3.5. Xác đnh đưng cong sinh trưng ca vi khun chng T5 57 3.3.6. nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng, phát trin ca vi khun chng T5 59 3.3.7. nh hưng ca pH đn sinh trưng, phát trin ca vi khun T5 61
vi KT LUN VÀ KIN NGH 64 Kt lun 64 Kin ngh 64 Tài liu tham kho Ph lc
vii DANH MC CÁC CH VIT TT STT Ch vit tt Ch vit đy đ 1 DT Din tích 2 D Dài lá 3 IAA Acid indol acetic 4 KHKT Khoa hc k thut 5 KL Khi lưng 6 NĐ Nng đ Parts Per Milion 7 ppm (1 phn triu) 8 R Rng lá 9 TB Trung bình 10 VK Vi khun
viii DANH MC BNG Trang Bng 2.1. Kí hiu các nghim thc theo nng đ và s ln tưi dch thí nghim 23 Bng 3.1. Tương quan gia nng đ vi khun và IAA trong dung dch nuơi cy 28 Bng 3.2. nh hưng ca các chng vi khun đn t l ny mm ca ht Cơve 29 Bng 3.3. nh hưng ca các chng vi khun đn chiu dài r, s r con và chiu dài thân mm ca cây đu Cơve 31 Bng 3.4. nh hưng ca các chng vi khun đn khi lưng khơ r và thân mm 33 Bng 3.5. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn t l ny mm ca ht đu 34 Bng 3.6. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun đn chiu dài r, s r con và chiu dài thân mm ca cây đu Cơve 40 Bng 3.7. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn trng lưng khơ ca r và thân mm 41 Bng 3.8. nh hưng ca mt đ vi khun chng T5 và s ln tưi đn s lưng lá và din tích lá ca cây đu Cơve 43 Bng 3.9. nh hưng ca nng đ vi khun và s ln tưi đn thi gian bt đu ra hoa, s hoa/ chùm, t l đu qu 45 Bng 3.10. nh hưng ca nng đ vi khun và s ln tưi đn chiu dài, đưng kính qu và năng sut, khi lưng khơ ca cây 49 Bng 3.11. nh hưng ca nng đ vi khun và s ln tưi đn s lưng nt sn r đu Cơve 52 Bng 3.12. Tng s vi sinh vt trưc và sau khi tưi dch vi khun 54 Bng 3.13. Đc đim khun lc và t bào ca vi khun chng T5 55
ix Bng 3.14. S bin đng OD 610nm ca dung dch nuơi cy vi khun T5 theo thi gian 59 Bng 3.15. nh hưng ca nhit đ đn s sinh trưng ca vi khun T5 60 Bng 3.16. nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng vi khun T5 61 Bng 3.17. Kh năng sinh IAA ca chng vi khun đưc tuyn chn trên các mơi trưng nuơi cy 63
x DANH MC HÌNH Trang Hình 1.1. Các nhĩm vi khun cĩ kh năng sinh IAA 6 Hình 1.2. Cơng thc hĩa hc ca IAA 9 Hình 1.3. Hot đng ca IAA trong s kéo dài t bào 10 Hình 3.1. nh hưng ca các chng vi khun sinh IAA đn t l ny mm ca ht đu Cơve 30 Hình 3.2. Chiu dài r mm, thân mm và s lưng r con sau 3 ngày .38 Hình 3.3. Chiu cao thân mm sau 5 ngày 39 Hình 3.4. Thí nghim s dng dung dch vi khun T5 nng đ 10 10 CFU/ml vi s ln tưi khác nhau lên đt trng đu Cơve 46 Hình 3.5. Thí nghim tưi 3 ln các dung dch khác nhau lên đt trng đu Cơve 46 Hình 3.6. Kích thưc qu đu 50 Hình 3.7. B r đu Cơve sau khi trng 52 Hình 3.8. Vi sinh vt tng s nghim thc tưi dch vi khun T5 1, 2, 3 ln nng đ vi khun 10 10 CFU/ml 53 Hình 3.9. Hình khun lc và t bào ca vi khun chng T5 55 Hình 3.10. T bào vi khun T5 nhum Gram âm 56 DANH MC BIU Đ Trang Biu đ 3.1. Đưng cong sinh trưng ca vi khun chng T5 59 Biu đ 3.2. nh hưng ca nhit đ đn s sinh trưng vi khun T5 60 Biu đ 3.3. nh hưng ca pH đn s sinh trưng vi khun T5 62
1 M ĐU S sinh trưng và phát trin ca thc vt chu nhiu tác đng ca các yu t bên trong cũng như bên ngồi mơi trưng sng bao gm ngun dinh dưng, nưc, nhit đ, m đ, ánh sáng, các cht điu hịa sinh trưng, [26]. Mi yu t cĩ mt vai trị đi vi đi sng ca thc vt. Cht điu hịa sinh trưng cĩ vai trị quan trng trong vic điu hịa quá trình sinh trưng, phát trin, các hot đng sinh lý ca thc vt ngay t lúc nỗn bào đưc th tinh phát trin thành phơi cho đn cây ra hoa, kt qu và kt thúc chu kỳ sng ca mình. Hin nay, bng con đưng hĩa hc, con ngưi cũng đã tng hp nên hàng lot các cht cĩ hot tính sinh lý tương t cht điu hịa sinh trưng ca thc vt. Các cht này rt phong phú và đã cĩ nhng ng dng rng rãi trong nơng nghip [26]. Tuy nhiên vic s dng các cht điu hịa sinh trưng nhân to khơng đúng nguyên tc s nh hưng đn mơi trưng, gim cht lưng nơng sn, gây hi đn sc khe ngưi tiêu dùng. Trong t nhiên, ngồi thc vt, mt nhĩm vi sinh vt cũng cĩ kh năng to ra cht kích thích sinh trưng cho thc vt vào mơi trưng đt và cĩ tác dng trc tip lên cây trng, gĩp phn tăng năng sut, cht lưng nơng sn, đm bo an tồn cho ngưi tiêu dùng [58], [59]. Đĩ là nhĩm vi khun cĩ kh năng tng hp IAA (indol acetic acid) hoc GA (gibberellin) thuc chi Rhizobium, Azotobacter, Azospirrillum, Bradyrhizobium, [7], [27], [29], [30], [37]. Đăk Lăk là mt trong các tnh Tây Nguyên cĩ tim năng phát trin nơng nghip cĩ tng din tích t nhiên 1.312.537 ha, trong đĩ đt nơng nghip chim 533.404 ha thích hp cho nhiu loi cây trng khác nhau k c các cây h đu. Đ to điu kin cho vic thâm canh các cây h đu hiu qu nhưng vn đm bo tính bn vng mơi trưng sinh thái, đ tài: “ Nghiên cu nh hưng ca vi khun sinh IAA đn s ny mm và sinh trưng phát trin ca đu Cơve ti Buơn Ma Thut ” đưc thc hin.
2 Mc tiêu đ tài 1. Tuyn chn và đánh giá chng vi khun sinh IAA phân lp trong đt nh hưng đn s ny mm và sinh trưng phát trin ca cây đu Cơve. 2. Xác đnh mt s đc đim sinh hc ca chng vi khun sinh IAA đưc tuyn chn đ đnh danh và nhân nuơi sinh khi. Ý nghĩa khoa hc Xác đnh các chng vi khun cĩ kh năng sinh IAA đưc phân lp ti Buơn Ma Thut, gĩp phn đánh giá s đa dng ca vi sinh vt đt Tây Nguyên. Đánh giá vai trị ca mt s vi khun trong t nhiên đi vi s ny mm ca ht cũng như đi vi s sinh trưng, phát trin đu Cơve. Ý nghĩa thc tin Kt qu đ tài gĩp phn vào vic s dng các vi khun cĩ kh năng sinh IAA và giúp s phát trin nn nơng nghip theo hưng bn vng, cĩ th gim s dng cht kích thích sinh trưng nhân to cho cây trng, t đĩ đm bo an tồn cho ngưi s dng.
3 CHƯƠNG I TNG QUAN TÀI LIU 1.1. Vi khun sinh IAA 1.1.1. Đi cương v vi khun sinh IAA Vi sinh vt là sinh vt cĩ cu to đơn gin, kích thưc rt nh bé nhưng s lưng ca chúng trong mơi trưng vơ cùng ln. Vi khun trong đt là mt nhĩm vi sinh vt s dng ngun dinh dưng nitơ ly t mơi trưng cĩ t xác đng thc vt. Đc bit mt s lồi cĩ kh năng s dng nitơ t khơng khí. Nhng vi khun này cĩ vai trị quan trng đi vi cây trng gĩp phn phát trin nn nơng nghip bn vng. Ngồi ra, mt s vi khun c đnh đm cịn cĩ kh năng sinh tng hp IAA (indol acetic acid) là cht kích thích sinh trưng thc vt. Đĩ là vi khun thuc chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Azospirrillum, [8], [20], [23], [25], [39], [43], [47], [48], [51], [58], [60]. Rhizobium sp . là vi khun c đnh nitơ cng sinh vi r cây b đu (cịn gi là vi khun nt sn), dng hình que cĩ kh năng di đng hoc hình que phân nhánh mt kh năng di đng. Vi khun nt sn thuc loi hiu khí, ưa pH trung tính hoc hơi kim, nhit đ thích hp t 28 30 0C, theo khĩa phân loi Bergey thì cĩ phm vi nhit đ rng hơn, đ m t 60 80%, cĩ kh năng s dng nitơ khơng khí, đc bit là kh năng sinh IAA kích thích s sinh trưng, phát trin ca cây trng qua s hình thành lơng r và kéo dài r. Vi khun nt sn khi cịn non cĩ t bào hình que, kích thưc vào khong 0,5 0,9 x 1,2 3,0 m, bt màu đng đu và cĩ kh năng di đng nh tiên mao, khi già vi khun nt sn tr nên bt đng. Lúc đĩ, t bào tr nên bt màu tng đon, chúng thưng cĩ dng hình cu di đng hoc khơng di đng. Trên mơi trưng dinh dưng nhân to, chi Rhizobium là nhĩm mc nhanh. Trên mơi trưng đc, Rhizobium thưng cĩ khun lc trơn bĩng, nhy, vơ màu. Cht nhy do vi khun nt sn sinh ra là polysaccharit cu to bi các hexose, pentose và acid uronic.
4 Mi loi vi khun nt sn ch nhim lên mt nhĩm cây nht đnh trong b Đu. Vit Nam, vi khun nt sn Đin thanh hoa vàng ( S.cannabana ) cĩ th to nt sn trên cây Đin thanh hoa trịn ( S.paludosa ) và ngưc li. Đơi khi vi khun nt sn xâm nhp vào loi đu khơng đc hiu vi chúng, khi đĩ ít nt sn đưc to ra và kh năng c đnh nitơ yu [8], [30]. Bradyrhizobium: cũng là vi khun nt sn, hiu khí, cĩ th phát trin đưc trong trưng hp ch cĩ áp lc oxy rt thp khong 0,001atm, pH thích hp t 6,5 7,5. S sinh trưng ca chúng b hn ch khi pH h thp đn 4,5 5,0 hoc nâng lên 8,0. Nhit đ thích hp t 25 30 0C, 37 0C s phát trin ca chúng b cn tr mt cách rõ rt [8], [9], [32], [45]. Trên mơi trưng đc, khun lc vi khun cĩ dng trơn, bĩng, nhy, khơng màu, đưng kính khơng quá 1mm. Vi khun Bradyrhizobium hình que, cĩ kích thưc là 0,5 0,9 * 1,2 3,0 m. Azotobacter sp . là vi khun Gram âm, hiu khí sng t do trong đt, khơng sinh bào t, cĩ kh năng c đnh nitơ phân t. T bào Azotobacter sp . cĩ hình cu hoc hình que. Khi cịn non, t bào hình que, sinh sn theo kiu trc phân, di đng nh tiên mao mc quanh cơ th. Bên cnh các tiên mao khá dài cịn cĩ nhng khun mao nh bé. V già, t bào Azotobacter sp . mt kh năng di đng, kích thưc thu nh thành hình cu đưc bao bc bi lp v nhy dày và to thành nang xác. Khi gp điu kin thun li, nang xác nt ra, to thành các t bào mi. Khun lc cĩ dng hình cu li, nhy, nhn, cĩ khi nhăn nheo. Khi già khun lc màu vàng lc, hng, nâu đen; đây là mt tiêu chun phân loi ca lồi Azotobacter sp Azotobacter sp . Thích hp vi pH 7,0 8,2 và chúng ít tn ti trong mơi trưng đt chua cĩ pH < 5,6 5,8 [8], [36], [37]. Azotobacter sp . địi hi mt đ m khá cao ca đt tương t như nhu cu ca cây trng. Tuy vy bào xác ca Azotobacter sp . chu đưc rt lâu s khơ hn ca đt. Nhit đ thích hp nht đi vi s phát trin ca Azotobacter sp . khong 26 30 0C. vùng nhit đi, Azotobacter sp . thích hp vi nhng nhit đ cao hơn.
5 70C, Azotobacter sp . c đnh nitơ thp hơn 5 ln so vi nhit đ 45 0C. T bào dinh dưng ca Azotobacter sp . khơng tn ti khi x lý nhit đ 50 0C trong 30 phút, 80 0C vi khun s cht rt nhanh. Trong đt, Azotobacter sp . tp trung vùng gn r cây, cĩ tác dng tăng cưng thc ăn nitơ cho cây trng. Tác dng ca Azotobacter sp . đi vi cây trng cịn đưc chng minh kh năng kích thích sinh trưng ca chúng đn s ny mm và sinh trưng ca mm ht. Azotobacter sp . cĩ kh năng tit vào mơi trưng các vitamin, acid amin cũng như các cht kích thích sinh trưng thc vt (IAA, gibberelin) [6], [8], [13], [35], [36], [37], [44]. Azospirillum : vi khun gram âm, dng xon, sng t do, c đnh nitơ phân t, đưc phát hin t năm 1974. Nhng vi khun thuc ging Azospirillum sng t do hoc kt hp vi r ca cây ngũ cc và mt s loi c. Vi khun chuyn đng trong mơi trưng lng nh mt tiên mao đu. Trong mơi trưng đc 30 0C, nhiu tiên mao bên ngn hơn đưc thành lp. Nhng ht Poly β hydroxybutyrate (PHB) cĩ màu hng lp đy hu ht nhng t bào vi khun và khun lc. S tăng sinh Azospirillum xy ra dưi c 2 điu kin hiu khí và k khí vi s hin din hoc khơng ca hp cht nitơ trong mơi trưng. Nhit đ ti thích ca vi khun là 35 37 0C. Nhng khun lc Azospirillum trên mơi trưng khoai tây agar cĩ màu hng nht hoc đm, thưng cĩ np gp và khơng cĩ cht nhy. Mt s dịng Azospirillum là vi sinh vt t dưng khơng bt buc. Vi khun Azospirillum phát trin tt trên mui ca nhng acid hu cơ như malate, succinate hoc pyruvate. Fructose và nhng đưng đơi khác cũng cĩ th đưc vi khun s dng làm ngun carbon, vi khun khơng s dng đưng đơn khác. Mt s dịng Azospirillum cn biotin cho s phát trin ca chúng [8]. Azospirillum sng thành tp đồn vùng r ca nhiu lồi thc vt vùng nhit đi và cn nhit đi. Ngồi kh năng c đnh nitơ, chúng cịn cĩ kh năng kh nitrat, chng li vi khun gây bnh thi lá cây dâu tm.
6 Azospirillum cĩ kh năng sinh tng hp các hormone tương t hormone sinh trưng ca thc vt như IAA, gibberelin, cytokinin. Azospirillum cĩ th kích thích thc vt sinh trưng bi s kích thích hình thành r, tăng đ dài r [12], [27], [28], [40], [61]. A B C D Hình 1.1. Các nhĩm vi khun cĩ kh năng sinh IAA A: Vi khun Rhizobium sp . B: Vi khun Bradyrhizobium C: Vi khun Azotobacter sp . D: Vi khun Azospirillum
7 1.1.2. Mt s yu t nh hưng đn sinh trưng, phát trin ca vi khun 1.1.2.1. nh hưng ca nhit đ Nhit đ nh hưng sâu sc đn s sinh trưng ca vi sinh vt. Mi lồi vi sinh vt cĩ kh năng phát trin trong mt gii hn nhit đ nht đnh. Phn ln các vi sinh vt là ưu m, nhit đ thích hp vào khong 20 400C, ti ưu: 30 37 0C. Nhit đ thp thưng khơng gây cht vi sinh vt ngay mà tác đng lên kh năng chuyn hố các hp cht, làm c ch hot đng ca các h enzyme, thay đi kh năng trao đi cht ca chúng. Vì th, vi sinh vt mt kh năng phát trin và sinh sn, nhiu trưng hp s b cht. Kh năng gây cht ca nhit đ thp chm và t t, khơng đt ngt như nhit đ cao. Da vào đc tính này, ngưi ta tin hành ct gi thc phm, bo qun ging vi sinh vt nhit đ thp. Nhit đ cao thưng gây cht vi sinh vt mt cách nhanh chĩng. Đa s vi sinh vt b cht 60 80 0C. Mt s khác cht nhit đ cao hơn. Đc bit bào t cĩ kh năng tn ti nhit đ trên 100 0C. Nhit đ cao thưng gây bin tính protein, làm h enzyme lp tc khơng hot đng đưc, vi sinh vt d dàng b tiêu dit. Li dng đc đim này, ngưi ta tin hành nhng phương pháp sy khơ thc phm, phương pháp tit trùng, [8], [17]. 1.1.2.2. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy Vi sinh vt sng và phát trin trong mơi trưng lng chu nh hưng trc tip và gián tip ca các ion H + và OH . Đ pH đưc đo bng nng đ các ion H + và OH trong dung dch [17]. Mi vi sinh vt đu cĩ mt phm vi pH sinh trưng nht đnh. Vi sinh vt ưa acid (acidophile) cĩ pH cho sinh trưng tt t 0 5,5 ; đi vi vi sinh vt ưa trung tính: pH = 5,5 8,0 ; đi vi vi sinh vt ưa kim: pH = 8,5 11,5. Vi sinh vt ưa kim cc đoan cĩ mc sinh trưng ti ưu pH = 10 hay cao hơn na. Nhìn chung, các nhĩm vi sinh vt khác nhau đu cĩ phm vi pH sinh trưng riêng ca mình. Phn ln vi khun và đng vt nguyên sinh ưa pH trung tính. Mc du vi sinh vt thưng cĩ th sinh trưng trong mt phm vi pH khá rng, nhưng tính chu đng ca chúng cũng cĩ gii hn nht đnh. Khi pH trong
8 t bào cht cĩ s thay đi đt ngt s phá v màng sinh cht hoc làm c ch hot tính ca enzyme hay protein vn chuyn màng, do đĩ làm tn thương đn vi sinh vt [8], [17]. 1.1.2.3. Nưc và đ m mơi trưng Cơ th vi sinh vt cha 80 98% nưc nên hu ht quá trình sng ca vi sinh vt đu cĩ liên quan đn nưc. Nưc và đ m ca mơi trưng là yu t quan trng. Đa s vi sinh vt thuc loi ưa nưc, chúng cn nưc t do đ hp thu. Khi mơi trưng thiu nưc s xy ra hin tưng loi nưc ra khi t bào, vi sinh vt trao đi cht b gim và t bào b cht. Vì th trong cơng ngh vi sinh cn coi nưc là ngun nguyên liu quan trng, các mơi trưng lên men hoc mơi trưng nuơi cy cn mt lưng nưc rt ln. Đi vi đ m mơi trưng, t 55 60% là thích hp cho s sinh trưng và phát trin ca vi sinh vt [8]. 1.2. Auxin – cht kích thích sinh trưng thc vt 1.2.1. Ngun gc Năm 1880, Darwin đã phát hin bao lá mm ca cây h hịa tho rt nhy cm vi ánh sáng. Nu chiu sáng mt chiu thì gây quang hưng đng, nhưng nu che ti hoc b đnh ngn thì hin tưng trên khơng xy ra. Darwin cho rng ngn bao lá mm là nơi tip nhn kích thích ca ánh sáng. Năm 1926, mt sinh viên tt nghip đi hc ti Hà Lan tên Fritz Went đã cơng b phương pháp phân lp cht kích thích tăng trưng bng cách đt nhng khi thch trng bên dưi đnh ca lá bao mm trong mt thi gian nht đnh sau đĩ ly ra và đt vào thân cây khác đã b bm ngn. Sau khi đt các khi thch đĩ, các thân cây b bm ngn bt đu tăng trưng tr li. Năm 1928, Went đã trin khai mt phương pháp đnh lưng cht kích thích tăng trưng này. Went thưng đưc bit đn như ngưi tiên phong s dng thut ng “auxin”, nhưng tht s phi k đn Kogl và Haagen Smit. H là nhng ngưi đã tinh ch đưc hn hp axít auxentriolic (auxin A) t nưc tiu ca ngưi vào năm 1931. Sau đĩ, Kogl đã phân lp đưc nhng hn hp khác t nưc tiu cĩ cu trúc và chc năng tương t auxin A, trong đĩ cĩ IAA.
9 Indole acetic acid (IAA) thưng đưc hình thành gn đnh tăng trưng và sau đĩ đi xung phn dưi ca cây. Quá trình đĩ khin cho các lá non mc dài hơn. IAA đã kích thích cây ci phát trin hưng theo ánh sáng và phát trin b r. Vào năm 1954, hi đng các nhà sinh lý hc thc vt đưc thành lp đ đnh danh cho các nhĩm auxin. Thut ng này xut phát t ting Hy Lp, cĩ nghĩa là “tăng trưng”. Các hp cht đưc gi chung là auxin nu chúng đưc tng hp trong các loi thc vt và là nhng cht chia s nhng hot đng tương t vi IAA [11], [26]. 1.2.2. Cu trúc hố hc và s sinh tng hp Hình 1.2. Cơng thc hĩa hc ca IAA Auxin là mt hp cht hu cơ tương đi đơn gin, cĩ nhân indole, cơng thc là: C 10 H9O2N, đưc gi là acid βindolacetic. Auxin đưc tng hp tt c các thc vt bc cao, to, nm và c vi khun. thc vt bc cao, IAA đưc tng hp ch yu đnh chi ngn và t đĩ đưc vn chuyn xung dưi vi vn tc 0,5 1,5cm/gi. S vn chuyn ca auxin trong cây cĩ tính cht phân cc rt nghiêm ngc, tc là ch vn chuyn theo hưng gc. Chính vì vy càng xa đnh ngn, hàm lưng auxin càng gim, to nên mt gradien nng đ gim dn ca auxin t đnh ngn xung gc ca cây. Ngồi đnh ngn ra auxin cịn đưc tng hp các cơ quan cịn non khác như lá non, qu non, phơi ht đang sinh trưng, mơ phân sinh tng phát sinh. Quá trình tng hp auxin xy ra thưng xuyên và mnh m trong cây dưi xúc tác ca các enzyme đc hiu. Acid βIndol Acetic là loi
10 auxin ph bin trong cây, đưc tng hp t tryptophan bng con đưng kh amin, carboxyl và oxy hĩa [11], [26]. 1.2.3. Tính cht sinh lý ca auxin Auxin can thip vào nhiu quá trình sinh hc ca cây. Hot đng ca nĩ tuỳ thuc vào nng đ và các s tương h qua li ca auxin vi các cht điu hồ khác. Mt s hot đng chính ca auxin bao gm: 1.2.3.1. Hot đng trong s kéo dài t bào Auxin kích thích mnh s kéo dài t bào ngn chi. S kéo dài t bào là mt quá trình phc tp, kt hp nhiu hin tưng: hp thu nưc; dãn dài vách vi sc trương; đt các hp cht mi ca vách gia các mng vi si cellulose; sinh tng hp protein và các cht khác. Hình 1.3. Hot đng ca IAA trong s kéo dài t bào Vai trị ca auxin là gây nên s gim pH ca thành t bào bng cách hot hĩa bơm proton ( H +) nm trên màng ngoi cht. Khi cĩ mt ca auxin thì bơm proton hot đng và bơm H + vào thành t bào làm gim pH và hot hĩa enzyme xúc tác ct đt các cu ni ngang ca các polysaccarit. Enzyme tham gia vào quá trình này là pectinmetylesterase, khi hot đng s metyl hĩa các nhĩm carboxyl và ngăn chn cu ni ion gia nhĩm carboxyl vi calxi đ to nên pectat calxi, do đĩ mà các si cellulose tách ri nhau.
11 Ngồi ra, auxin cũng kích thích s tng hp các mRNA các cht ribosome tham gia vào s tng hp các cht protein. 1.2.3.2. Hot đng trong s phân chia t bào Kích thích s phân chia t bào tưng tng Auxin kích thích rt mnh s phân chia t bào tưng tng (tng phát sinh libe mc), nhưng hu như khơng tác đng trên mơ phân sinh sơ cp. Như vy, auxin tác đng trên s tăng trưng theo đưng kính. nng đ cao, auxin kích thích s to mơ so t các t bào sng nh vào cht “histogene” (là cht to ra nhiu t bào ging nhau hồn tồn). Đây là đc tính tt đưc áp dng trong nuơi cy t bào. Phân hố mơ dn Auxin kích thích phân chia ca tưng tng, đng thi giúp s phân hố ca các mơ dn (libe và mch mc). Auxin cĩ kh năng cm ng trc tip s phân hố t bào nhu mơ thành các t chc mơ dn. 1.2.3.3. Hot đng trong s phát sinh hình thái (r, chi, qu) Kích thích phát trin chi Auxin phi hp vi cytokinin giúp s tăng trưng chi non và khi phát s to mơ phân sinh ngn chi t nhu mơ. Tuy nhiên, nng đ cao, auxin ngăn cn s phát trin ca phát th chi va thành lp hay chi nách, các chi bây gi vào trng thái tim sinh. Auxin gây hin tưng ưu th ngn. Hin tưng ưu th ngn là hin tưng ph bin trong cây. Khi chi ngn hoc r chính sinh trưng s c ch sinh trưng ca chi bên và r bên. Ðây là mt s c ch tương quan vì khi loi tr ưu th ngn bng cách ct b chi ngn hoc r chính thì cành bên hoc r bên đưc thốt khi c ch và lp tc sinh trưng. Nguyên nhân: auxin đưc tng hp ch yu ngn chính và vn chuyn xung dưi làm cho các chi bên tích lu nhiu auxin nên b c ch sinh trưng. Khi ct ngn chính, lưng auxin tích lu trong chi bên gim s kích thích chi bên sinh trưng.
12 Kích thích phát trin r Auxin nng đ cao kích thích s to sơ khi r (phát th non ca r), nhưng cn s tăng trưng ca các sơ khi này. Đc tính này đưc ng dng ph bin trong giâm cành. S hình thành r ph trong giâm cành cĩ th chia làm 3 giai đon: giai đon đu phn phân hố t bào trưc tng phát sinh, tip theo xut hin mm r và cui cùng mm r sinh trưng thành r ph chc thng v ra ngồi. Giai đon đu cn hàm lưng auxin cao, giai đon r sinh trưng cn ít auxin và cĩ khi khơng cn cĩ auxin. Kích thích s hình thành, s sinh trưng ca qu và to qu khơng ht T bào trng sau khi th tinh to nên hp t và phát trin thành phơi. Phơi ht là nơi tng hp auxin ni sinh quan trng s khuych tán vào bu, kích thích s sinh trưng ca bu đ hình thành qu. Vic x lý auxin ngoi sinh cho hoa s thay th đưc ngun auxin ni sinh vn đưc hình thành trong phơi và do đĩ khơng cn quá trình th phn th tinh nhưng bu vn ln lên thành qu. Trong trưng hp này qu khơng qua th tinh và do đĩ khơng cĩ ht. Kìm hãm s rng lá, hoa, qu ca cây. Auxin c ch s hình thành tng ri cung lá, hoa, qu vn đưc cm ng bi các cht c ch sinh trưng. Vì vy cung cp auxin ngoi sinh cĩ th gim s rng lá, tăng s đu qu và hn ch rng n, qu non làm tăng năng sut [11], [18], [26].
13 1.3. Tng quan v cây đu Cơve 1.3.1. Phân loi Gii : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lp : Magnoliopsida B : Fabales H : Fabaceae Chi : Phaseolus Lồi : Phaseolus vulgaris. L 1.3.2. Ngun gc và phân b Cây đu Cơve cĩ ngun gc t Châu M, vùng Mêhicơ, Pêru và Cơlơmbia, cách đây 8000 năm v trưc. Đây là cây rt c xưa ca th gii nhưng v sau li là cây trng chính Châu Âu và Châu Phi. Ngày nay đu này đưc trng rng rãi các vùng nhit đi và cn nhit đi. Đu Cơve đã tr thành thc phm ch yu Châu M và Châu Phi và cũng là cây đu quý him n Đ và hu ht các nưc Châu Á nhit đi. 1.3.3. Mt s đc đim sinh vt hc ca đu Cơve Cây đu Cơve thân tho hàng năm, hoc thân leo, thân bi. dng thân bi, cây thp, ch cao 50 60cm, ít đt, sinh trưng hu hn. H r gm r chính ăn sâu khong 25 40 cm và nhiu r ph phân b ch yu tng mt 20 30 cm, trong phm vi bán kính 50 70 cm. Trên r đu Cơve cĩ vi khun nt sn c đnh đm ( Rhizobium bacteria ), gĩp phn cung cp thêm cht đm cho cây và tăng đ màu m cho đt. Lá tht thuc loi lá kép gm 3 lá chét. Chiu dài cun lá bng đ dài phin lá, gân lá phân b đu trên các thùy lá, lá mc cách trên thân, màu xanh hoc xanh vàng, phin lá phng và hơi nhám.
14 Hoa đu Cơve thuc hoa cánh bưm, mc thành chùm, hoa lưng tính gm 10 nh đc, trong đĩ cĩ 9 nh bao quanh nhy cái, 1 nh riêng r v trí cao hơn. Khi hoa n là quá trình th tinh đã kt thúc. Màu sc hoa cĩ th là trng, hng, đ hoc tím tùy ging. Hoa ch yu t th phn. Qu dài t 8 20 cm màu xanh hoc vàng tùy theo ging, qu thng, qu bĩng (qu non cĩ th cĩ lơng), mi qu cĩ 4 8 ht, ht hình trng, hơi trịn, chiu dài 5 8 mm, rng 4 5 mm, nng 0,3 0,5g. V ht màu trng ngà hoc màu vàng nht, mt s ging ht cĩ hn hp nhiu màu trng, đen, nâu, cà phê sa, . Ht đu Cơve cha lưng protein khá cao, khong trên 20%. Thi gian sinh trưng ca các ging đu lùn t 80 100 ngày, đu leo t 100 120 ngày, năng sut qu tươi trung bình 15 20 tn/ha [3]. Đu Cơve ch yu đưc dùng làm rau ăn, cĩ giá tr dinh dưng cao. Trong qu non cha 2,5% đm, 0,5% cht béo, 7% cht đưng bt, nhiu cht khống (Ca, Fe, P, ), nhiu loi vitamin ( đc bit là vitamin A, B 1, B 2, C) [3]. 1.3.4. Yêu cu sinh thái ca cây đu Cơve Khí hu : đu Cơve thích hp khí hu m áp, ơn hịa, khơng thích hp nhit đ cao; kh năng chu rét kém. Nhit đ : ht đu cĩ th ny mm nhit đ khong 10 0C, thích hp nht t 25 30 0C. Cây sinh trưng, phát trin trong phm vi 15 25 0C. Khi nhit đ cao trên 30 0C thưng gây rng n, rng hoa. giai đon qu hình thành và phát trin, nhit đ thích hp khong 20 27 0C. Ánh sáng : thiu ánh sáng năng sut đu thưng b gim. Đu Cơve dng cây bi cĩ kh năng chu bĩng hơn dng leo. Lá đu Cơve cĩ đc tính xoay chuyn đ tăng kh năng s dng ánh sáng hoc tránh sánh sáng cĩ cưng đ cao. Lưng nưc : đu Cơve cĩ kh năng chu hn và chu úng kém, tr mt s ging đu lùn cĩ kh năng chu hn khá. Khi thiu nưc cây sinh trưng kém, hoa rng nhiu, qu nh và nhiu xơ.
15 Đ m đt : thích hp cho cây đu Cơve t 70 80%. Giai đon cây cĩ 2 3 lá tht và khi ra hoa kt qu rt cn đ đ m. Đt đai : cây đu Cơve cĩ th trng trên nhiu loi đt nhưng tt nht là trng trên loi đt tht nh, đt tht pha cát, tơi xp và thốt nưc tt. Đ pH thích hp ca đt trng là 6,0 6,5. Dinh dưng : nhu cu ca cây đu Cơve khá ln, ngồi các đa lưng như đm, lân, kali , cịn cn các nguyên t trung vi lưng như : Calxi, Mangan, Km, St, [3]. 1.4. Tình hình nghiên cu 1.4.1. Nghiên cu trong nưc Năm 2003, Phm Vit Cưng và cng s (Vin Cơng ngh Sinh hc) đã nghiên cu v kh năng to IAA ca mt s chng vi khun chi Bacillus . Kt qu cho thy kh năng tng hp IAA ca các chng nghiên cu thay đi tùy theo chng ging, mơi trưng nuơi cy và mt s nhân t khác [4]. Vũ Thúy Nga và cng s ti Vin KHKT Nơng nghip Vit Nam (2003), nghiên cu nh hưng ca mt đ vi khun và mơi trưng nuơi cy đn kh năng tng hp IAA ca vi khun Bradyrhizobium . Nhĩm tác gi kt lun: “ Kh năng tng hp IAA ca vi khun Bradyrhizobium khơng ph thuc vào mt đ vi khun mà ph thuc vào chng ging vi khun, mơi trưng nuơi cy, hàm lưng tryptophan. Mc đ phân gii phosphat vơ cơ ca Bradyrhizobium ph thuc vào thi gian nuơi cy” [16]. Năm 2003, Phm Bích Hiên và Phm Văn Ton (Vin KHKT Nơng nghip Vit Nam) đã nghiên cu và tuyn chn đưc mt s chng Azotobacter đa hot tính, cĩ kh năng sinh IAA s dng làm phân vi sinh chc năng. Hu ht các chng Azotobacter chroococcum th nghim đu cĩ kh năng sinh trưng, phát trin tt nhit đ 25 30 0C, pH: 5,5 8,0 và trong mơi trưng cĩ ngun đưng thay th là r đưng [10].
16 Ti Trung tâm Ging Nơng nghip cây trng, Thành ph Cn Thơ, Lăng Ngc Du (2003) nghiên cu kh năng tng hp IAA ca vi khun Azospirillum lipoferum . Trong điu kin cĩ tryptophan, sau 2 ngày nuơi, mt s chng tng hp đưc nhiu IAA ( > 10ppm) [5]. Năm 2003, Phm Văn Ton (Vin KHKT Nơng nghip Vit Nam), nghiên cu hiu qu s dng phân bĩn cha hn hp vi sinh vt cĩ kh năng sinh cht kích thích sinh trưng đi vi cà chua, khoai tây, đu phng [22]. Năm 2008, Nguyn Kim Anh và Phm Th Ngc Anh (Trưng Đi hc Sư phm Đà Nng), đã phân lp và tuyn chn đưc 08 chng vi khun thuc chi Azotobacter cĩ kh năng c đnh đm và sinh tng hp IAA t 30 mu đt ca thơn Bình Kỳ Hịa Quý Ngũ Hành Sơn thành ph Đà Nng [1]. Năm 2010, Cao Bình đã phân lp 23 chng vi khun cĩ kh năng sinh IAA t đt trng và r cây đu phng, đu tương, đu Cơve và ngơ. Sau khi đánh giá kh năng sinh IAA ca các chng đã chn đưc 11 chng vi khun. Thi gian nuơi cy thích hp đ các chng vi khun sinh IAA mnh nht trong mơi trưng Nfb vi nng đ tryptophan phù hp là khác nhau gia các chng khác nhau [2]. 1.4.2. Nghiên cu trên th gii Trên th gii cĩ rt nhiu nghiên cu v các chng vi khun cĩ kh năng sinh IAA, t vi khun sng cng sinh nt sn ca r cây đn vi khun sng t do trong đt như: Rhizobium, Azotobacter, Azospirrillum, Bradyrhizobium, [41], [42], [46], [48], [49], [52], [55], [57], [62]. Năm 1986, Paola Barbieri và Tiziano Zanelli (Ytalia), nghiên cu nh hưng ca vi khun Azospirillum brasilense Sp6 lên lúa mì. Khi lúa mì đưc nhim chng vi khun Azospirillum brasilense Sp6, s lưng và chiu dài r bên tăng lên đáng k: 15,67 r bên và 18,80 cm so vi đi chng khơng nhim vi khun: 8,25 r bên và 5,78 cm [56]. Năm 1996, Elazar Fallik’ và Yaacove Okon (Iran), nghiên cu nh hưng ca vi khun sinh IAA Azospirillum brasilense lên s tăng trưng ca ngơ. Thí nghim đưc tin hành trong điu kin nhà kính, ngơ đưc x lý vi vi khun
17 Azospirillum brusilense cho kt qu tăng chiu cao thân, trng lưng khơ cây và tăng trng lưng ht [38]. Năm 2000, Maria Guineth Torres Rubio (Colombia) cùng cng s đã phân lp đưc mt s chng Azotobacter và Pseudomonas cĩ kh năng sinh IAA t vùng r cây lúa. Lưng IAA do vi khun Azotobacter và Pseudomonas sinh ra bin đng: 3,5 32,2 mg/l sau 3 ngày nuơi cy [54]. Năm 2001, Vivek Kumar và cng s (n Đ), nghiên cu nh hưng ca vi khun sinh IAA Azotobacter chroococcum lên sinh trưng và phát trin cây lúa mì. Kt qu nghiên cu cho thy nhng nghim thc đưc x lý vi vi khun sinh IAA Azotobacter chroococcum cĩ trng lưng ht (1000 ht) tăng 11,4%; trng lưng rơm tăng 11,3% so vi đi chng khơng dùng vi khun [63]. Năm 2007, Gh. Abbas Akbari và cng s (Iran) đã phân lp và tuyn chn đưc mt s chng Azosopirrillum sp . cĩ kh năng sinh tng hp IAA kích thích sinh trưng cây lúa mì. IAA đưc sinh ra bi mt s chng vi khun Azosopirrillum sp . là đng lc giúp cây sinh trưng, hình thành r tt [27]. Năm 2009, Fabricio Cassan và cng s (Argentina), nghiên cu nh hưng ca 2 chng vi khun Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 đn s ny mm, sinh trưng thân mm ca đu tương và bp. Các nghim thc đưc x lý đc lp hay kt hp 2 chng vi khun trên đu cho chiu dài r và trng lưng khơ thân cao hơn so vi đi chng khơng s dng vi khun [40]. Năm 2009, Mandira Malhotra và Sheela Srivastava (n Đ), nghiên cu nh hưng ca vi khun sinh IAA Azospirillum brasilense SM lên s sinh trưng, phát trin ca lúa min. Khi lúa min đưc nhim vi khun Azospirillum brasilense SM sau 2 tun gieo trng cho chiu dài r mm: 7,8 cm, thân mm: 19,2 cm, s lưng r con: 24,5 r con so vi đi chng khơng s dng vi khun cĩ chiu dài r mm: 6,12 cm, chiu dài thân mm 19,0 cm, và 17 r con [53]. Năm 2011, B.S. Saharan và V. Nehra (n Đ), nghiên cu nh hưng ca các vi khun vùng r đn s sinh trưng, phát trin ca cây. Kt qu nghiên cu
18 cho thy vi khun Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm, thúc đy cây sinh trưng, tăng năng sut thu hoch [59]. 1.5. Điu kin t nhiên ca Buơn Ma Thut Mang nét đc trưng ca khí hu Tây Nguyên, Thành ph Buơn Ma Thut cĩ hai mùa mưa và khơ rõ rt. Trong đĩ, mùa mưa kéo dài t tháng 5 đn ht tháng 10, cĩ đc đim mưa nhiu, lưng mưa ln, tp trung, trung bình 69,9 mm/tháng, 1.830 2.200 mm/năm. Mùa khơ kéo dài t tháng 11 đn tháng 4 năm sau. Vào mùa khơ do tri qua giai đon nng nĩng 6 tháng liên tc vi s gi nng qua các năm bin đng t 1.966 2.487,5 gi. Điu này thun li cho quá trình quang hp và hn ch s phát trin ca sâu bnh trên các loi cây trng như rau, nhưng mùa khơ thưng gây hn hán. Do đĩ thiu nưc tưi cho trng trt do lưng mưa quá ít, mch nưc ngm gim thp và quá trình thốt hơi nưc quá nhanh. Nhit đ trung bình các tháng trong năm giao đng t 23,6 0C 26 0C, tc đ giĩ t 1,3 4,7 m/s.
19 CHƯƠNG II NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Ni dung 1. Nghiên cu tuyn chn chng vi khun sinh IAA nh hưng đn sinh trưng cây mm đu Cơve. 2. Nghiên cu nh hưng ca chng vi khun sinh IAA đưc tuyn chn lên s ny mm ca ht và sinh trưng, phát trin ca cây đu Cơve. 3. Nghiên cu mt s đc đim sinh hc ca chng vi khun đưc tuyn chn đ đnh danh và nhân nuơi sinh khi. 2.2. Vt liu và đa đim nghiên cu 2.2.1. Vt liu nghiên cu Các chng vi khun cĩ kh năng sinh IAA cao T5, P5, V1 phân lp trong đt trng và r cây đu tương, đu phng, đu Cơve ca Easup, Đk lk. Ht ging đu Cơve đưc bán ti th trưng (ging TLP 68). 2.2.2. Đa đim nghiên cu Phịng thí nghim B mơn Sinh hc thc nghim Khoa Khoa hc T Nhiên và Cơng ngh, trưng Đi hc Tây Nguyên. Vưn thc nghim ca Khoa Nơng Lâm nghip, trưng Đi hc Tây Nguyên. Thi gian nghiên cu: tháng 09/ 2010 đn tháng 09/2011. 2.3. Phương pháp nghiên cu 2.3.1. Phương pháp tuyn chn chng vi khun sinh IAA nh hưng đn sinh trưng ca cây mm đu Cơve. Thc hin trên 3 chng vi khun sinh IAA : T5, P5, V1. 2.3.1.1. To dung dch thí nghim Mơi trưng nhân nuơi Nfb (g/l): KH 2PO 4 0,5g, MgSO 4.7H 2O 5g, NaCl 0,2g, CaCl 2.2H 2O 0,02g, KOH 4,5g, Biotin 0,01g, acid malic 5g, Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N: 3ml, FeEDTA 1,64%: 10ml. Vi lưng: 2ml (MgS0 4.7H2O 0,2g/l, H3BO 3 1,4g/l, ZnSO 4 0,12g/l, CuSO 4 0,04g/l, Na 2MoO 4.2H 2O 1g/l), nưc ct khơng đm 1000ml, pH = 6,8.
20 Chun b mơi trưng lng trong các bình tam giác, 200ml/bình. Kh trùng áp sut 1atm, trong 30 phút. Đ ngui, cy chng vi khun vào các bình, lc 200 vịng/phút, nhit đ phịng. Sau 5 ngày nuơi cy, thu dung dch, xác đnh nng đ t bào vi khun (CFU/ml), nng đ IAA (mg/lít). 2.3.1.2. Xác đnh nng đ vi khun trong dung dch Dùng phương pháp đo OD 610nm và đm khun lc trên đĩa petri đ xây dng phương trình đưng chun v mi tương quan gia ch s OD 610nm và nng đ t bào trong dung dch nuơi cy vi khun. Da vào phương trình đưng chun, xác đnh nng đ vi khun qua ch s OD tương ng. 2.3.1.3. Xác đnh phương trình tương quan gia ch s OD 530nm và nng đ IAA (mg/l) Chun b dung dch đm Phosphat(200ml) A: KH 2PO 4 0,136 g/100ml nưc ct B: K 2HPO 4 0,174 g/100 ml nưc ct 39ml A + 61 ml B và cho thêm nưc ct va đ 200ml, điu chnh pH =7. Chun b thuc th Salkowski 553ml H 2SO 4 (98%) và nưc ct đ 1 lít, đ ngui sau 12 gi đưc dung dch H 2SO 4 đm đc 10,8 M. Cân 4,5g FeCl 3 cho vào 1 lít H 2SO 4 10,8 M đã pha trên đ đưc thuc th Salkowski. Xây dng phương trình đưng chun IAA Phương trình xác đnh mi tương quan gia ch s OD530nm và nng đ IAA (mg/l) trong dung dch nuơi cy vi khun. Cân 16 mg IAA tng hp hịa tan vi 100ml dung dch đm Phosphat đưc nng đ 160mg/l, sau đĩ tin hành pha lỗng ra các nng đ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 (mg/l). 4ml thuc th đưc cho vào các ng nghim cĩ nng đ IAA khác nhau cĩ th tích 2ml, mi nng đ lp li 3 ln.
21 10 phút nhit đ phịng đ phn ng xy ra hồn tồn. Đo OD 530nm . T kt các qu trên, xác đnh đưc phương trình đưng chun ca dung dch IAA thơng qua ch s OD 530nm . 2.3.1.4. nh hưng ca các chng vi khun sinh IAA lên s sinh trưng cây mm đu Cơve Ht đu Cơve cĩ trng lưng: 400ht/100g. Chn các ht đng đu, chc. Ra ht bng nưc sch nhiu ln. Ngâm ht trong dung dch thí nghim 12 gi. Gieo ht trong các chu nha cha cát đã ra sch. Chu nha cĩ đưng kính 8cm, cao 10cm. Lưng cát cho vào mi chu 300g. B trí thí nghim: ht đưc ngâm trong các dung dch sau: + Chng T5: vi các nng đ t bào 10 11 , 10 10 , 10 9, 10 8 CFU/ ml. + Chng P5: vi các nng đ t bào 10 11 , 10 10 , 10 9, 10 8 CFU/ ml. + Chng V1: vi các nng đ t bào 10 11 , 10 10 , 10 9, 10 8 CFU/ ml. + Dung dch IAA ( 1,5 ppm ). + Nưc. Các ch tiêu theo dõi: + T l ny mm (%) = (S ht ny mm/ tng s ht gieo) x 100. + Chiu dài r, thân mm (mm). + S lưng r con. + Trng lưng tươi, khơ ca r, thân mm sau 5 ngày gieo trng (mg). 2.3.2. nh hưng ca chng vi khun sinh IAA đưc tuyn chn lên s ny mm ca ht và sinh trưng, phát trin ca đu Cơve 2.3.2.1. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun sinh IAA đưc tuyn chn đn s ny mm và sinh trưng cây mm đu Cơve. Chn chng tt nht trong 3 chng vi khun T5, P5, V1 qua kt qu thí nghim trên đ tin hành thí nghim. Mơi trưng nuơi cy vi khun sinh IAA: Nfb. Các khong thi gian ngâm ht trong dung dch nuơi cy vi khun sinh IAA: 8, 12, 16, 20 gi.
22 Các nng đ vi khun trong dung dch nuơi cy: 1010 , 10 9, 10 8, 10 7 CFU/ml. Các nghim thc đi chng: dung dch IAA 1,5 ppm, dung dch Nfb, nưc. Mi chu thí nghim gieo 5 ht. Mi nghim thc thc hin 15 chu. Phun nưc 2 ln/ngày. Mi ln phun 2ml/chu. Theo dõi và ly s liu t 1 5 ngày sau gieo trng. Các ch tiêu theo dõi + T l ny mm (%) = (S ht ny mm/ tng s ht gieo) x 100. + Chiu dài r, thân mm (mm). + S lưng r con. + Trng lưng tươi, khơ ca r, thân mm sau 5 ngày gieo trng (mg). 2.3.2.2. nh hưng ca nng đ và s ln tưi ca vi khun sinh IAA đưc chn đn sinh trưng phát trin cây đu Cơve + Chu nha cĩ đưng kính 25cm, sâu 30cm, cĩ đc l nh. + Lưng đt trong các chu trng đu đng nht và 10 kg/chu. + S ln tưi dch trong giai đon sinh trưng ca cây đu: 1 ln, 2 ln, 3 ln. + Dung dch ca tng nghim thc đưc dùng đ ngâm ht 16 gi trưc khi gieo và tưi vào đt trng đu. Gieo 2 ht/chu, tưi 5 ml/chu/ln. Ch đ tưi nưc: Tùy vào điu kin thi tit, mi ngày tưi 12 ln, lưng nưc va đ đ m cho đt 70 80%. Ch đ phân bĩn: phân tng hp NPK cĩ hàm lưng 16168 vào thi kỳ 15, 30, 45 ngày sau gieo trng. S dng: 40g NPK/lít nưc, phun 5ml/chu. B trí thí nghim: v nng đ và s ln tưi theo các nghim thc sau:
23 Bng 2.1. Ký hiu các nghim thc theo nng đ và s ln tưi dch thí nghim. Dung d ch v à n ng đ S ln Ký hi u x lý tưi dch nghim thc 1 C1T1 10 10 2 C1T2 3 C1T3 Vi khun T5 1 C2T1 (CFU/ml) 10 9 2 C2T2 3 C2T3 1 C3T1 10 8 2 C3T2 3 C3T3 1 C4T1 IAA (1,5 ppm) 2 C4T2 3 C4T3 1 C5T1 Nfb 2 C5T2 3 C5T3 1 C6T1 Nưc 2 C6T2 3 C6T3 Ch tiêu theo dõi: + Tng s lá hình thành. + Din tích lá (cm 2/lá). +Thi gian ra hoa: khi cĩ 50% s cây n hoa. + S hoa trên chùm: xác đnh trên 9 chùm. Tính 2 đt. + T l đu qu (%) = ( S qu đm đưc/S hoa đm đưc) * 100. + Đưng kính qu (mm), chiu dài qu (cm).
24 + Năng sut qu tươi thu hoch: các ln thu hoch (g) + Trng lưng khơ ca cây (mg): mu đưc sy nhit đ 70 0C cho đn khi trng lưng mu khơng đi. + S nt sn/cây 2.3.2.3. Phương pháp đánh giá vi sinh vt đt sau nuơi trng đu Cơve * Mơi trưng nuơi cy Mơi trưng đnh lưng vi khun (nưc tht pepton): pepton 10g, nưc mm 20ml, agar 20g, nưc 1.000ml. Mơi trưng đnh lưng x khun (Gause): tinh bt tan 20g, K 2HPO 4 3g, MgSO 4 3g, KNO 3 1g, FeSO 4 0,01g, NaCl 0,5g, agar 20g, nưc 1000ml, pH = 7,2. Mơi trưng đnh lưng nm mc (PGA): khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nưc 1000ml, pH = 6,5. * Thu mu đt Đt cách b mt 5 10cm đưc ly bng dng c và túi polyetylen (PE) vơ trùng. Mi nghim thc gm 10 chu trng đu, lưng đt thu 100g/nghim thc. Đng nht mu, phân tích vi sinh vt tng s. Thi đim thu mu đt: trưc khi gieo ht và sau khi thu hoch. * Pha lỗng mu theo h s thp phân. Cân 10g mu cho vào bình tam giác cĩ cha 90 ml dung dch nưc mui 0,1% vơ trùng, lc đu hn hp trong 10 phút. Dùng micropipet cĩ đu típ vơ trùng hút 1ml dung dch mu trên vào mt ng nghim cĩ cha 9 ml dung dch nưc mui 0,1% vơ trùng ta đưc đ pha lỗng 10 1. Tip tc tin hành tưng t ta đưc các đ pha lỗng t 10 1 đn 10 5. Mi thao tác đu phi thc hin trong điu kin vơ trùng. * Cy trãi trên đĩa Chn 3 đ pha lỗng liên tip: 10 3, 10 4, 10 5. Hút 0,05 ml dung dch đưc pha lỗng mi nng đ vào các đĩa petri cha mơi trưng nuơi cy. Dùng que gt thy tinh vơ trùng dàn đu dung dch lên mt thch ca đĩa petri, và 35 ngày nhit đ phịng. Thc hin 3 đĩa petri cho mt đ pha lỗng.
25 * Xác đnh s lưng vi sinh vt tng s S dng phương pháp đm khun lc mc trên đĩa petri, đm tt c s khun lc xut hin trên các đĩa sau khi . Chn các đĩa cĩ s khun lc t 20 đn 200 đ tính kt qu. S lưng vi sinh vt trong 1g mu đưc tính như sau: A (CFU/g) = N/(n 1vf 1 + n 2vf 2 + + n ivf i) Trong đĩ: A: S t bào hình thành khun lc vi sinh vt trong 1g mu. N: Tng s khun lc đm đưc trên các đĩa đưc chn. ni: S lưng đĩa cĩ s khun lc đưc chn ti mi đ pha lỗng. v: Dung tích mu (ml) cy vào mi đĩa. fi: Đ pha lỗng ca đĩa đưc đm [15], [21]. 2.3.3. Phương pháp nghiên cu mt s đc đim sinh hc ca chng vi khun đưc tuyn chn đ đnh danh và nhân nuơi sinh khi 2.3.3.1. Mơ t hình thái, màu sc và đc đim khun lc Tin hành quan sát khun lc đơn dưi kính hin vi soi ni. Thc hin tiêu bn ưt quan sát hình thái t bào dưi kính hin vi vt kính 40, 100. Các ch tiêu mơ t hình thái vi khun: Khun lc: dng, cu trúc, b mt, đ ni, bìa và màu sc. Hình dng và kích thưc ca t bào. 2.3.3.2. Phương pháp nhum Gram 1. Làm tiêu bn mu cn nhum. 2. C đnh mu bng ngn la đèn cn. 3. Dùng tím Violet nhum mu trong 1 phút. 4. Ra nưc ti đa 5 giây. 5. Thêm dung dch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút. 6. Ra bng rưu trong 10 giây. 7. Ph lên mu vi ethanol 95% vài ln cho đn khi khơng xut hin thêm màu trong mu (1 phút). 8. Ra nưc.
26 9. Nhum tip vi Fuchsin. 10. Ra qua nưc, đ khơ. 2.3.3.3. Phương pháp xác đnh hot tính catalase Đây là mt đc đim ca mt s vi sinh vt hiu khí. Vi sinh vt k khí bt buc và nhiu loi vi khun hiu khí khơng sinh catalase. Catalase phân hy H2O2 và to thành oxy theo phn ng sau: H2O2 H2O + O 2 Cho 1 git dung dch H 2O2 30% lên trên khun lc vi khun hoc trên b mt vi khun trong ng nghim. Vi khun si bt khí khng đnh là catalase dương tính, vi khun khơng si bt là catalase âm tính. 2.3.3.4. Phương pháp xác đnh kh năng c đnh nitơ phân t Chun b mơi trưng Ashby vi agar khơng dinh dưng đã đưc loi b hồn tồn ngun nitơ. Kh trùng 1atm, 45 phút. Phân b mơi trưng đã kh trùng vào 12 đĩa petri vơ trùng. Cy vi khun kho sát vào các đĩa peptri mơi trưng. Bc kín các đĩa petri bng polyethylen. 5 7 ngày, quan sát, phát hin các khun lc mc trên mơi trưng Ashby. Đi chiu đc đim khun lc và t bào ca các khun lc xut hin vi chng kho sát đưc cy vào. Thí nghim đưc lp li 3 ln đ đánh giá chính xác kh năng c đnh nitơ t do ca chng vi khun. Đng thi căn c vào mc đ phát trin đ kt lun vi khun thuc nhĩm vi đm hay c đnh đm. Vi sinh vt vi đm là nhĩm vi sinh vt cĩ th s dng đưc mt lưng nh nitrogen liên kt cha trong các hĩa cht, nưc máy, trong khơng khí. 2.3.3.5. Phương pháp xác đnh đưng cong sinh trưng Nuơi cy vi khun tuyn chn vào mơi trưng Nfb khơng agar ca 39 ng nghim đng thi chun b 13 ng mơi trưng khơng cy vi khun đ làm ng khơng
27 cho k thut đo OD. Tin hành đo OD 610nm dch nuơi vi khun mi ngày. Mi ngày đo OD ca 3 ng nuơi cy vi khun. Đo liên tip 12 ngày và ghi li kt qu. 2.3.3.6. Phương pháp xác đnh nhit đ thích hp ca chng vi khun sinh IAA Chun b dung dch ging: cy chng vi khun kho sát trong ng ging vào bình cha 100 ml mơi trưng Nfb khơng agar. Lc dung dch vi khun trên máy trong 24 gi. Mi ng nghim cha 9ml mơi trưng Nfb và 1ml ging. Nng đ t bào vi khun trong 1ml ging cho vào tng ng nghim ca các lơ thí nghim kho sát là như nhau. Kho sát nh hưng ca nhit đ đn s sinh trưng ca vi khun vi bin đng t 25, 32, 39, 46 0C. Thí nghim gm 4 lơ theo 4 nhit đ kho sát. S ng nghim mơi trưng Nfb cho mi lơ: 24. Đo OD 610nm vào thi đim sau khi cy và sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày. Mi thi đim lp li 3 ln. 2.3.3.7. Phương pháp xác đnh pH thích hp ca chng vi khun sinh IAA Thí nghim đưc tin hành tương t thí nghim xác đnh nhit đ thích hp nhưng kho sát 4 mc pH: 5, 6, 7, 8.
28 CHƯƠNG III KT QU VÀ THO LUN 3.1. Nghiên cu tuyn chn các chng vi khun sinh IAA nh hưng đn s sinh trưng cây mm đu Cơve. Thí nghim tin hành nuơi cy các chng vi khun T5, P5, V1 trong mơi trưng Nfb. Sau 5 ngày, xác đnh nng đ IAA (ppm) đưc to ra trong dung dch vi khun cĩ nng đ t bào 10 8, 10 9, 10 10 , 10 11 CFU/ml. Bng 3.1. Tương quan gia nng đ vi khun và IAA trong dung dch nuơi cy Chng vi khun Nng đVK (CFU/ml) Nng đ IAA (ppm) 10 11 28,74 10 10 2,87 T5 10 9 0,29 10 8 0,03 10 11 27,23 10 10 2,72 P5 10 9 0,26 10 8 0,03 10 11 21,04 10 10 2,10 V1 10 9 0,21 10 8 0,02 3.1.1. nh hưng ca các chng vi khun đn t l ny mm ca ht nh hưng ca các dung dch x lý đn s ny mm ca ht đu đưc ghi nhn qua bng 3.2. Sau 1 ngày gieo trng, t l ny mm ca ht cĩ s chênh lch gia các nghim thc. T l ny mm ca ht ngâm trong dung dch cha vi khun sinh IAA và dung dch IAA 1,5 ppm tương đương hoc cao hơn so vi t l ny mm
29 ca ht ngâm trong nưc. Dung dch ngâm ht là IAA 1,5 ppm cho t l ny mm tương đương vi dung dch nuơi cy vi khun sinh IAA ca 3 chng cĩ nng đ IAA bin đng t 0,21 2,87ppm (nng đ t bào vi khun: 10 9 10 10 CFU/ml). Ngồi ra, sau 2 ngày, chng T5 cho t l ny mm ca ht đt 100% các nng đ vi khun t 10 8 10 10 CFU/ml; chng P5 cho t l 100% nng đ 10 9 CFU/ml, chng V1 cho t l 100% các nng đ 10 9, 10 10 CFU/ml. Riêng nng 10 11 CFU/ml đi vi c 3 chng vi khun, t l ny mm đu đt 96,7% tương đương vi t l ny mm ca nưc. Như vy, nng đ này ca các dung dch vi khun, lưng IAA sinh ra cao (21,04 28,74 ppm) nên nh hưng khơng tt đn s ny mm ca ht. Bng 3.2. nh hưng ca các chng vi khun đn t l ny mm ca ht Cơve Các dung dch Nng đ vi khun T l ny mm (%) ngâm ht (CFU/ml) 1 ngày 2 ngày 10 11 73,3 96.7 10 10 76,7 100 Vi khun T5 10 9 76,7 100 10 8 76,7 100 10 11 73,3 96,7 10 10 73,3 96,7 Vi khun P5 10 9 70,0 100 10 8 70,0 96,7 10 11 73,3 96,7 10 10 73,3 100 Vi khun V1 10 9 76,7 100 10 8 73,3 93,3 Nưc 0 70,0 96,7 IAA(1,5ppm) 0 73,3 100
30 Nhìn chung t l ny mm ca ht đu đưc ngâm trong dch cha vi khun T5 cĩ hiu qu hơn so vi chng P5, V1. Hình 3.1. nh hưng ca các chng vi khun sinh IAA đn t l ny mm ca ht đu Cơve . 3.1.2. nh hưng ca các chng vi khun đn sinh trưng ca cây mm nh hưng ca các chng vi khun đn chiu dài r mm Kt qu ca ngày th 5 đưc th hin qua bng 3.3.
31 Bng 3.3. nh hưng ca các chng vi khun đn chiu dài r, s r con và chiu dài thân mm ca cây đu Cơve Các dung Nng đ Các ch tiêu theo dõi sau 5 ngày gieo trng dch ngâm vi khun Chiu dài S lưng Chiu dài ht (CFU/ml) r mm (mm) r con thân mm (mm) 10 11 183,89 ± 3,04 abc 12,44 ± 1,29 b 81,56 ± 1,11 ab Vi khun T5 10 10 193,56 ± 4,15 c 14,11 ± 0,65 ab 84,44 ± 1,78 b 10 9 192,22 ± 3,29 c 12,00 ± 0,99 ab 84,67 ± 2,12 b 10 8 178,44 ± 4,03 ab 10,78 ± 0,62 a 79,33 ± 1,3 a 10 11 179,44 ± 3,50 b 11,56 ± 0,96 a 78,22 ± 1,78 ab 10 10 190,00 ± 2,81 c 12,44 ± 1,18 a 81,22 ± 1,97 b Vi khun P5 10 9 188,67 ± 2,28 c 11,56 ± 0,84 a 80,67 ± 1,89 b 10 8 171,11 ± 2,31 a 11,56 ± 1,03 a 74,44 ± 2,43 a 10 11 173,00 ± 3,34 a 12,78 ± 1,05 a 78,78 ± 1,66 ab 10 10 186,44 ± 4,10 b 11,33 ± 0,85 a 81,33 ± 1,62 b Vi khun V1 10 9 186,44 ± 2,59 b 11,44 ± 0,37 a 81,11 ± 0,96 b 10 8 168,33 ± 3,33 a 11,22 ± 0,97 a 75,89 ± 1,18 a Nưc 0 176,11 ± 3,07 a 10,44 ± 0,69 a 77,67 ± 2,0 a IAA(1,5ppm) 0 187,33 ± 2,02 bc 12,11 ± 0,99 ab 81,11 ± 1,20 ab Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan. Thí nghim cho thy vào ngày th 5, cùng nng đ 10 10 CFU/ml, chiu dài r mm ca nghim thc s dng vi khun T5 đt 193,56 mm, P5: 190,00 mm, V1: 186,44 mm, so vi nghim thc s dng dung dch IAA 1,5 ppm: 187,33 mm và nưc: 176,11 mm. S sai khác này cĩ ý nghĩa thng kê. Các nghim thc đưc x lý vi dung dch vi khun T5 cho chiu dài r mm t 178,44 193,56 mm, so vi các nghim thc đưc x lý dung dch vi khun P5 cĩ chiu dài r: 171,11 190,00 mm, vi khun V1: 168,33 186,44 mm. Như vy, vi khun T5 nh hưng tt hơn vi khun P5 và V1 đn sinh trưng ca r mm.
32 nh hưng ca các chng vi khun đn s lưng r con Ngồi r chính, cây đu các r con cũng gĩp phn khơng nh đn kh năng hút nưc ca cây. Vì th thí nghim đã tin hành kho sát ch tiêu s lưng r con đưc hình thành trong quá trình phát trin ca cây mm. R con bt đu xut hin vào ngày th 3 sau khi gieo ht và th hin s khác bit rõ vào ngày th 5. Kt qu cũng đưc ghi nhn qua bng 3.3. Cùng nng đ vi khun 10 10 CFU/ml, s lưng r con ca cây mm nghim thc s dng dch vi khun T5 là cao nht (14,11 r con) so vi dung dch vi khun P5: 12,44; V1: 11,33; IAA 1,5 ppm: 12,11 và nưc: 10,44. Kt qu trên cho thy cĩ s khác bit rõ v s lưng r con đưc hình thành khi s dng dung dch vi khun sinh IAA chng T5. Vi khun P5 cĩ nh hưng đn s lưng r con tương đương khi s dng dch IAA 1,5 ppm. Khi ngâm ht vi nưc, kt qu s r con ca cây mm thp nht. Tương t như nh hưng ca vi khun sinh IAA đn chiu dài r mm, nng đ vi khun 10 11 CFU/ml đi vi c 3 chng T5, P5, V1 đu cĩ s lưng r con đt 11,56 12,78 khơng hiu qu bng nng đ 10 10 CFU/ml cĩ t 11,33 14,11 r con. nh hưng ca các chng vi khun đn chiu dài thân mm Chiu dài thân mm bin đng theo đi tưng vi khun trong dung dch x lý ht. Sau 5 ngày, ht đưc x lý bi dung dch vi khun T5 vi nng đ 10 10 CFU/ml cho chiu dài thân mm 84,44 mm so vi P5: 81,22 mm, V1: 81,33 mm, IAA 1,5 ppm: 81,11 mm và nưc: 77,67 mm. Như vy, hàm lưng IAA trong dung dch nuơi cy vi khun cũng đã tác đng đn s phát trin thân mm đu Cơve và chng T5 cĩ nh hưng tt hơn c. nh hưng ca các chng vi khun đn trng lưng khơ ca r và thân mm Trng lưng khơ ca r và thân mm th hin bng 3.4.
33 Bng 3.4. nh hưng ca các chng vi khun đn khi lưng khơ r và thân mm Nng đ Khi lưng khơ Các dung dch vi khun sau 5 ngày gieo trng (mg) ngâm ht (CFU/ml) R Thân 10 11 12,22 ± 0,44 b 20,57 ± 1,17 abc 10 10 13,82 ± 0,53 c 22,67 ± 0,89 c Vi khun T5 10 9 13,57 ± 0,42 c 22,43 ± 0,73 bc 10 8 11,35 ± 0,28 ab 19,47 ± 0,69 b 10 11 11,48 ± 0,48 a 20,0 ± 0,76 b 10 10 11,53 ± 0,36 a 21,09 ± 1,78 b Vi khun P5 10 9 11,22 ± 0,46 a 19,92 ± 1,48 b 10 8 11,11 ± 0,28 a 16,96 ± 1,80 a 10 11 11,37 ± 0,57 a 19,73 ± 0,82 c Vi khun V1 10 10 11,43 ± 0,69 a 19,16 ± 0,51 bc 10 9 11,13 ± 0,61 a 17,34 ± 1,19 ab 10 8 11,24 ± 0,36 a 16,53 ± 0,63 a Nưc 0 10,37 ± 0,39 a 16,38 ± 0,61 a IAA (1,5ppm) 0 11,18 ± 0,25 ab 20,12 ± 0,64 bc Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan. Theo kt qu thí nghim, trng lưng khơ ca r và thân các nghim thc đưc x lý vi nng đ vi khun 10 11 CFU/ml đu thp hơn khi đưc x lý vi nng đ 10 10 CFU/ml. Nghim thc đưc x lý trong dung dch vi khun T5 nng đ 10 10 CFU/ml cho trng lưng khơ ca r và thân cao nht đt 13,82 và 22,67 mg. Trng lưng khơ ca r và thân đu gim dn theo s gim dn nng đ vi khun ca các nghim thc. Theo Cao Bình (2010), dung dch nuơi cy vi khun sinh IAA (T5, P5, T6) cĩ nh hưng tt đn s ny mm và sinh trưng cây mm đu tương so vi đi chng đưc x lý bng nưc. C th: nghim
34 thc đưc x lý vi dung dch nuơi cy vi khun T5 cĩ trng lưng khơ r mm đu tương đt 10,30 12,40 mg so vi nghim thc x lý nưc đt 8,51 mg [2]. Như vy, nng đ IAA phù hp trong dung dch ngâm ht đã khích thích đn s phân chia t bào r và thân mm, đng thi tăng sinh tng hp các thành phn nên tăng trng lưng cht khơ ca r và thân. Đc bit, nu cùng nng đ t bào vi khun, chng T5 vn cho kt qu v trng lưng khơ ca r và thân mm cao hơn so vi chng P5 và V1. Da vào kt qu thí nghim đánh giá nh hưng ca các chng vi khun lên kh năng ny mm, s sinh trưng ca cây mm, chng vi khun T5 đưc chn đ tin hành các thí nghim tip theo trên cây đu Cơve. 3.2. nh hưng ca chng vi khun sinh IAA đưc tuyn chn (chng T5) lên sinh trưng, phát trin ca đu Cơve 3.2.1. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn s ny mm Bng 3.5. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn t l ny mm Thi T l ny mm (%) Thi gian gian Nng đ vi khun T5 IAA ngâm ht theo dõi (CFU/ml) 1,5 Nfb Nưc (gi) (ngày) 10 10 10 9 10 8 10 7 (ppm) 8 76,7 76,7 76,7 80,0 76,7 73,3 70,0 12 80,0 76,7 76,7 76,7 80,0 76,7 70,0 1 16 86,7 83,3 80,0 80,0 83,3 80,0 76,7 20 73,3 70,0 70,0 66,7 70,0 63,3 63,3 8 96,7 96,7 96,7 93,3 96,7 93,3 96,7 12 100,0 96,7 100,0 96,7 100,0 96,7 100,0 2 16 100,0 100,0 100,0 96,7 100,0 96,6 100,0 20 76,7 80,0 73,3 73,3 73,3 70,0 70,0
35 Theo dõi s ny mm ca ht vào ngày th 2, khi ht đưc ngâm trong dch Nfb, t l ny mm bin đng t 70,0 93,3%. T l này thp hơn so vi ht đưc x lý trong dch Nfb cĩ cha vi khun T5, bin đng t 73,3 100%. Điu này chng t nng đ IAA đưc to ra do vi khun T5 trong mơi trưng nuơi cy đã tác đng lên s ny mm ca ht. Như vy, kt qu này khơng phi do cht dinh dưng cĩ trong dung dch Nfb, là mơi trưng nuơi cy vi khun c đnh đm quy đnh. Khi s dng dung dch cha IAA 1,5ppm và dung dch nuơi vi khun T5 các nghim thc khác nhau đu cho kt qu ny mm ca ht t 73,3 100%, cao hơn so vi s dng nưc, đt 70,0 100%. Ngồi ra, sau 1 ngày cũng như 2 ngày, t l ht ny mm tăng dn theo thi gian ngâm ht t 8, 12, 16 gi, nhưng gim 20 gi. S ny mm ca ht bt đu bng s hp th nưc nh cơ ch hút trương ca ht. Ngay sau khi ht hút nưc, hàm lưng nưc tăng trung bình t 10 14% đn 50 70%, lp tc hot tính ca các enzyme hơ hp tăng mnh m giúp cho phơi ht cĩ đ năng lưng và nguyên liu cn thit cho quá trình sinh tng hp ca t bào, chun b ny mm [26]. Như vy nưc là điu kin cn thit cho s ny mm. Tuy nhiên, nu ht đưc ngâm nưc vi thi gian dài s gây úng ht làm t l ny mm gim. Sau 1 ngày, t l ny mm cĩ s chênh lch đáng k gia các thi gian ngâm ht. Thi gian ngâm 8 gi, 12 gi đu cĩ t l ny mm t 70 80%, ngâm 16 gi ny mm: 76,7 86,7%, ngâm 20 gi ny mm: 63,3 73,3%. Nhưng sau 2 ngày, t l ny mm cĩ s chênh lch khơng nhiu gia thi gian ngâm ht 12 gi và 16 gi. Ngâm ht 16 gi vn hiu qu hơn so vi 12 gi do t l 100% ny mm các nghim thc cao hơn. Như vy, thi gian ngâm ht 16 gi giúp t l ny mm cao. Xét v nh hưng nng đ vi khun T5, khi s dng nng đ vi khun 10 7 10 9 CFU/ml vi thi gian ngâm ht 16 gi, t l ny mm ca đu bin đng t 80,0 83,3 %, trong khi đĩ, nng đ 10 10 CFU/ml t l ny mm đt 86,7%. Do đĩ, nh hưng rõ rt nht v nng đ vi khun đn t l ny mm ca ht đu Cơve đưc chn là 10 10 CFU/ml.
36 3.2.2. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn s sinh trưng cây mm đu Cơve Da vào kt qu nghiên cu nh hưng ca thi gian ngâm ht đn t l ny mm ca ht, thi gian ngâm ht 8, 12, 16 gi đưc chn đ tip tc kho sát các nh hưng đn sinh trưng ca cây mm. Kt qu th hin bng 3.6, 3.7. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn chiu dài r mm Sau 5 ngày gieo trng, các nghim thc ngâm ht 8 gi đu cho chiu dài r mm: 159,44 182,33 mm, thp hơn so vi ngâm ht 12 gi: 169,22 184,00 mm và 16 gi: 171,11 192,56 mm. Ngồi ra, trong cùng thi gian ngâm ht 16 10 gi, nghim thc đưc x lý vi dung dch vi khun chng T5 nng đ 10 CFU/ml cho chiu dài r mm 192,56 mm cao hơn so vi dung dch IAA 1,5 ppm, đt 185,89 mm, Nfb: 168,44 mm, nưc: 171,11 mm. Vy dung dch vi khun T5 nh hưng đn chiu dài r mm cĩ s khác bit so vi nghim thc ht đưc ngâm trong nưc và mơi trưng Nfb khơng vi khun. Khi s dng dung dch vi khun các nng đ khác nhau cũng cĩ nh hưng khác nhau đn chiu dài r mm. nng đ 10 7 10 9 CFU/lm bin đng t 177,44 183,78 mm, nng đ 10 10 là 192,56 mm. S khác bit cĩ ý nghĩa v mt thng kê. Kt qu này trùng hp vi thí nghim ca Mandira Malhotra và Sheela Srivastava (2007) khi dùng vi khun Azospirillum brasilense SM cĩ kh năng sinh IAA đ tác đng lên sinh trưng phát trin ca lúa min cho chiu dài r 7,80 cm và s lưng r con 24,5 r con, tăng đáng k so vi đi chng khơng s dng vi khun: 6,12 cm và 17 r con [53]. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn s lưng r con Hiu qu ca IAA rt đc trưng trong s hình thành r đc bit là r ph [26]. S hình thành r ph cĩ th chia làm 3 giai đon: giai đon đu là phn phân hĩa t bào trưc tng phát sinh, giai đon này cn lưng IAA khá cao, tip
37 đn là xut hin mm r và cui cùng mm r sinh trưng thành r ph chc thng v đ ra ngồi [26]. S lưng r con ca các nghiêm thc ht đưc ngâm 8 gi đt 18,11 19,33; so vi ht đưc ngâm 12 gi: 18,11 19,78 và 16 gi: 18,89 23,22 r con. Cùng thi gian ngâm ht 16 gi, nghim thc đưc x lý dung dch vi khun T5 vi nng đ 10 10 CFU/ml đt 23,22 r con so vi nghim thc đưc x lý dch IAA 1,5 ppm: 21,44, Nfb: 18,89, nưc: 19,67. Mt ln na, kt qu thí nghim khng đnh thành phn mơi trưng Nfb khơng nh hưng đn sinh trưng ca cây mm đu Cơve. Khi ngâm ht 16 gi nng đ vi khun t 10 7 10 9 CFU/ml, cĩ s lưng r con bin đng: 19,67 20,44, nng đ vi khun 10 10 CFU/ml đt 23,22 r con. Như vy, nng đ vi khun cĩ nh hưng rõ rt đn s hình thành r con đu. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn chiu dài thân mm Tương t như trên, chiu dài thân mm ca nghim thc đưc x lý vi thi gian 8 gi đt 70,89 87,22 mm, 12 gi: 73,78 88,11 mm, 16 gi: 75,89 93,33 mm. Như vy chiu dài thân mm tăng dn theo thi gian x lý ht t 8, 12, 16 gi. Khi ngâm ht 16 gi, nng đ vi khun t 10 7 10 9 CFU/ml cĩ chiu dài thân mm bin đng 79,33 89,89 mm, so vi nng đ 10 10 CFU/ml đt 93,33 mm, IAA 1,5 ppm: 84,44 mm, Nfb: 76,78 mm, và nưc: 75,89 mm. Điu này chng t thi gian ngâm ht 16 gi kt hp nng đ IAA thích hp giúp ht nhanh chng ny mm và r mm hot đng mnh, hút nhiu nưc, tác đng đn s sinh trưng ca thân mm. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn trng lưng khơ ca r và thân mm Kt qu nghiên cu cho thy, trng lưng khơ ca r và thân mm tăng dn theo thi gian x lý ht t 8 16 gi tt c các nghim thc. Cùng thi gian ngâm ht 16 gi, nghim thc đưc x lý vi dch vi khun T5 cĩ nng đ 10 10 CFU/ml
38 cho kt qu trng lưng khơ ca r, thân mm cao (12,16 ; 28,68 mg) so vi nghim thc đưc x lý IAA 1,5 ppm (11,90 ; 25,63 mg), Nfb (10,91 ;17,16), nưc (10,77 ; 17,90 mg). Theo Mandira Malhotra và Sheela Srivastava (2007), các nghim thc đưc x lý vi vi khun Azospirillum brasilense SM cho trng lưng khơ lúa mì đt 1,223 g so vi đi chng khơng x lý vi khun: 0,827 g. Qua các thí nghim trên, khi x lý ht trong dung dch vi khun T5 cĩ nng đ 10 10 CFU/ml trong 16 gi là tt nht. Thành phn mơi trưng Nfb khơng cĩ tính quyt đnh đn tăng chiu dài thân mm, r mm, s lưng r con, và trng lưng khơ ca cây mm. Hình 3.2. Chiu dài r mm, thân mm và s lưng r con sau 3 ngày
39 Hình 3.3. Chiu cao thân mm sau 5 ngày
40 Bng 3.6. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun đn chiu dài r, s r con và chiu dài thân mm ca cây đu Cơve Thi gian Ch tiêu theo dõi sau 5 ngày gieo trng Dung dch và ngâm ht Chiu dài S lưng Chiu dài thân nng đ x lý (gi) r mm (mm) r con mm (mm) 8 182,33 ± 4,03 c 20,33 ± 0,88 a 87,44 ± 4,01 c 10 10 12 184,00 ± 4,50 b 19,78 ± 1,16 a 87,78 ± 2,15 c 16 192,56 ± 3,28 c 23,22 ± 1,11 b 93,33 ± 2,13 d 8 181,67 ± 3,43 c 19,56 ± 0,78 a 88,22 ± 2,38 c 10 9 12 180,44 ± 5,03 ab 19,67 ± 0,58 a 88,11 ± 2,32 c Vi khun 16 183,78 ± 3,59 bc 20,44 ± 0,77 ab 89,89 ± 2,87 cd T5 8 18067 ± 4,08 c 19,44 ± 0,82 a 83,89 ± 1,61 bc (CFU/ml) 10 8 12 181,78 ± 2,13 ab 19,78 ± 1,11 a 84,89 ± 2,34 bc 16 182,44 ± 3,06 bc 19,89 ± 1,33 ab 84,56 ± 1,86 bc 8 174,11 ± 2,22 bc 18,44 ± 0,75 a 78,78 ± 2,2 ab 10 7 12 173,89 ± 3,14 ab 18,11 ± 1,27 a 79,55 ± 1,89 ab 16 177,44 ± 2,89 ab 19,67 ± 1,30 ab 79,33 ± 2,51 ab 8 181,11 ± 3,30 c 18,67 ± 1,20 a 84,22 ± 1,37 bc IAA (1,5ppm) 12 179,89 ± 1,45 ab 19,22 ± 1,0 a 84,11 ± 2,58 bc 16 185,89 ± 2,34 bc 21,44 ± 1,13 ab 84,44 ± 1,67 bc 8 159,44 ± 3,30 c 18,56 ± 0,82 a 70,89 ± 1,25 a Nfb 12 169,67 ± 6,06 a 18,56 ± 0,87 a 73,78 ± 3,0 a 16 168,44 ± 5,20 a 18,89 ± 1,0 a 76,78 ± 1,99 a 8 168,67 ± 5,49 ab 18,11 ± 0,72 a 73,44 ± 3,0 a Nưc 12 169,22 ± 4,62 a 18,11 ± 1,27 a 75,78 ± 2,05 a 16 171,11 ± 4,56 a 19,67 ± 1,3 ab 75,89 ± 2,42 a Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan.
41 Bng 3.7. nh hưng ca thi gian ngâm ht và nng đ vi khun T5 đn trng lưng khơ ca r và thân mm Khi lưng khơ Các dung dch Thi gian sau 5 ngày gieo trng (mg) và nng đ x lý ngâm ht (gi) R mm Thân mm 8 11,74 ± 0,32 b 27,72 ± 0,58 c a d 10 10 12 11,81 ± 0,56 28,01 ± 0,61 16 12,16 ± 0,40 b 28,68 ± 0,62 d 8 11,59 ± 0,47 b 24,12 ± 0,29 b 10 9 12 11,63 ± 0,29 a 25,94 ± 0,46 cd Vi khun 16 11,78 ± 0,50 ab 26,22 ± 1,06 cd T5 8 11,20 ± 0,31 ab 23,30 ± 1,24 b (CFU/ml) 10 8 12 11,26 ± 0,31 a 23,37 ± 1,24 bc 16 11,60 ± 0,37 ab 23,36 ± 1,03 bc 8 10,70 ± 0,39 ab 21,40 ± 1,13 b 10 7 12 10,42 ± 0,55 a 21,29 ± 1,01 b 16 10,53 ± 0,47 a 21,29 ± 1,14 b 8 11,36 ± 0,41 ab 22,60 ± 1,01 b IAA (1,5ppm) 12 11,58 ± 0,41 a 22,57 ± 0,96 b 16 11,90 ± 0,44 ab 25,63 ± 1,56 cd 8 10,62 ± 0,15 ab 17,97 ± 0,45 a Nfb 12 10,42 ± 0,47a 17,09 ± 1,10 a 16 10,91 ± 0,42 ab 17,16 ± 0,30 a 8 10,28 ± 0,36 a 17,14 ± 0,95 a Nưc 12 10,39 ± 0,43a 17,47 ± 0,87 a 16 10,77 ± 0,39 a 17,90 ± 0,95 a Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan.
42 3.2.3. nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn sinh trưng phát trin cây đu Cơve. Da vào kt qu ca các thí nghim trên, thi gian ngâm ht là 16 gi vi các nng đ vi khun trong dung dch t 10 8 10 10 CFU/ml đưc chn đ x lý ht ging trưc khi gieo trng và theo dõi s sinh trưng phát trin ca cây đu. Sau 12 ngày gieo ht, khi cây đu cĩ 1 cp lá tht, tip tc tưi dch nuơi cy vi khun T5 vi 5ml/chu. Ch đ tưi khác nhau gia các nghim thc đưc thc hin và theo dõi kt qu cho đn khi thu hoch. Vic đánh giá nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn sinh trưng phát trin cây đu Cơve theo các ch tiêu sau: S lưng lá và din tích lá. Kh năng ra hoa và đu qu. Chiu dài, đưng kính qu, năng sut, khi lưng khơ ca cây. S lưng nt sn. 3.2.3.1. nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn s lưng lá và din tích lá Da vào kt qu bng 3.8, s lưng lá và din tích các lơ đưc tưi dch vi khun 1 ln đt: 7,11 7,22 lá; 20,11 21,00 cm 2, 2 ln: 7,22 7,33 lá; 21,00 21,78 cm 2, thp hơn so vi 3 ln tưi: 7,44 7,56 lá; 22,78 23,56 cm 2. Như vy s lưng lá và din tích lá ca các nghim thc đưc x lý vi dch vi khun các nng đ khác nhau cĩ s sai khác khơng đáng k nhưng s sai khác này đưc th hin rõ qua s ln tưi dch khác nhau. Khi vi khun đưc b sung vào đt qua các ln tưi dch, chúng s thu nhn dinh dưng t đt đ tăng s lưng, t đĩ tng hp nên lưng IAA đ đ kích thích đu Cơve sinh trưng mnh, tăng s lưng lá và din tích lá. Cĩ cùng 3 ln tưi dung dch nhưng nghim thc đưc x lý dch vi khun T5 nng đ 10 10 CFU/ml cho s lưng lá và din tích lá đt 7,56 lá; 23,56 cm 2, cao hơn so vi IAA 1,5 ppm: 7,22; 20,55 cm 2, Nfb: 6,89; 17,78 cm 2, nưc: 6,78 lá; 17,67 cm 2. Mơi trưng Nfb tác đng tương đương vi nưc. Điu này chng
43 t IAA đưc tng hp do vi khun T5 nng đ 10 10 CFU/ml vi 3 ln tưi cĩ tác đng rõ rt đn s lưng lá, din tích lá. Bng 3.8. nh hưng ca mt đ vi khun chng T5 và s ln tưi đn s lưng lá và din tích lá ca cây đu Cơve S lưng lá Din tích lá S lưng lá Din tích lá N.thc N.Thc (Lá/cây) (cm 2/lá) (Lá/cây) (cm 2/lá) a a bc C1T1 7,11 ± 0,26 20,33 ± 0,29 bc C4T1 7,00 ± 0,28 20,11 ± 0,24 a a C1T2 7,22 ± 0,22 21,22 ± 0,15 c C4T2 7,22 ± 0,22 20,44 ± 0,18 bc b c ab C1T3 7,56 ± 0,12 23,56 ± 0,24 C4T3 7,22 ± 0,27 20,55 ± 0,34 b C2T1 7,22 ± 0,16 a 20,11 ± 0,26 b C5T1 6,78 ± 0,22 a 17,78 ± 0,15 a C2T2 7,33 ± 0,23 a 21,00 ± 0,19 c C5T2 6,89 ± 0,26 a 17,77 ± 0,36 a C2T3 7,44 ± 0,24 ab 22,98 ± 0,24 c C5T3 6,89 ± 0,26 ab 17,78 ± 0,32 a C3T1 7,22 ± 0,22 a 21,00 ± 0,29 c C6T1 6,78 ± 0,22 a 17,78 ± 0,28 a C3T2 7,33 ± 0,36 a 21,78 ± 0,22 c C6T2 6,89 ± 0,26 a 17,33 ± 0,24 a C3T3 7,56 ± 0,18 b 22,78 ± 0,43 c C6T3 6,78 ± 0,22 a 17,67 ± 0,29 a Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan. 3.2.3.2. nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn kh năng ra hoa và đu qu S sinh trưng, phát trin tt, s hoa và t l đu qu cao s gĩp phn tăng năng sut cây trng. Thí nghim nghiên cu nh hưng các dch x lý đn thi gian ra hoa ca đu Cơve, s liu theo dõi th hin qua bng 3.9. Nhng nghim thc đưc x lý vi nng đ vi khun 10 9 10 10 CFU/ml và IAA 1,5 ppm sau 3 ln tưi đu cĩ thi gian t gieo đn ra hoa là 37 ngày, sm hơn 1 ngày so vi lơ x lý cùng nng đ nhưng ch tưi dch 1, 2 ln, và sm hơn 2, 3 ngày so vi các lơ x lý nưc hoc Nfb khơng vi khun. Điu đĩ chng t vi khun sinh IAA đã tác đng đn s sinh trưng, giúp cây tng hp đ dinh dưng to điu kin cho đu ra hoa sm hơn.
44 Kh năng ra hoa kt qu ca cây trng nĩi chung và đu Cơve nĩi riêng là mt tiêu chí quan trng đ quyt đnh đn năng sut ca cây trng. S lưng hoa và t l đu qu khơng ch ph thuc vào tng ging cây mà cịn ph thuc vào mùa v, đt đai, khí hu Da vào bng s liu 3.9, s lưng hoa ca các nghim thc đt 2,89 4,22 hoa/chùm, ít hơn so vi lý thuyt: 2 8 hoa/chùm. S lưng hoa/chùm thp vì thi gian tin hành thí nghim t 25/10/2010 25/1/2011, thi tit khơng đưc thun li, mưa bão nhiu, lưng mưa lên đn 260,4 ml, đ m 91% vào tháng 11/2011 (Niên giám thng kê 2010 – Đaklak). Kt qu tương đương vi s hoa /chùm ca đu Cơve vào mùa mưa [3]. Khi s dng dung dch cha vi khun sinh IAA tưi cho đu, kh năng ra hoa và đu qu đt: 3,11 4,22 hoa/chùm; 72,41 81,58 % tăng hơn so vi các nghim thc tưi IAA 1,5ppm: 3,11 3,65; 71,88 78,67 % , mơi trưng Nfb và nưc: 2,89 3 hoa/chùm; 73,08 74,07 %. Ngồi ra, tưi dch vi khun 1 ln cho s hoa và t l đu qu bin đng t 3,11 3,56 hoa/chùm; 72,41 76,13 %, tưi 2 ln: 3,56 3,78; 78,13 79,41 %, tưi 3 ln: 4,00 4,22 hoa/chùm; 80,56 81,58 %. Kt qu thí nghim cho thy: S sai khác khơng đáng k gia các nghim thc đưc x lý dch vi khun nng đ 10 10 , 10 9, 10 8 CFU/ml. S ln tưi dch càng nhiu (3 ln) cho s hoa và t l đu qu càng cao. Các nghim thc đưc x lý vi dung dch vi khun cho kt qu tt hơn so vi nghim thc x lý IAA 1,5 ppm, Nfb và nưc. S hoa và t l đu qu ca nghim thc đưc x lý dung dch vi khun nng đ 10 10 CFU/ml vi 3 ln tưi đt cao nht. Dch IAA 1,5ppm đưc tưi vào đt, hàm lưng IAA khơng tăng lên mà gim đi do b phân hy bi ánh sáng hoc b tác đng ca nhng yu t mơi trưng, nên s khác bit gia các ln tưi khơng đáng k. Khi tưi dch vi khun vào đt nhiu ln, s lưng vi khun đưc b sung nhiu hơn, đng thi vi khun sinh sn nhanh nên khơng cĩ s chênh lch gia các nng đ x lý mà cĩ s khác
45 bit rõ gia s ln x lý dch vi khun. Qua kt qu thí nghim, chng t lưng IAA do vi khun T5 tng hp khơng ch tăng kh năng ra hoa mà cịn c ch s hình thành tng ri ca cung hoa, qu non dn đn tăng t l đu qu [26]. Bng 3.9. nh hưng ca nng đ vi khun và s ln tưi đn thi gian bt đu ra hoa, s hoa/ chùm, t l đu qu Nghim Thi gian bt đu ra hoa T l đu qu S hoa/chùm thc (S ngày sau gieo) (%) C1T1 38 3,22 ± 0,32 a 72,41 C1T2 38 3,67 ± 0,41 a 78,79 C1T3 37 4,22 ± 0,40 b 81,58 C2T1 38 3,11 ± 0,35 a 75,00 C2T2 38 3,56 ± 0,44 a 78,13 C2T3 37 4,00 ± 0,47 ab 80,56 C3T1 38 3,56 ± 0,44 a 76,13 C3T2 38 3,78 ± 0,27 a 79,41 C3T3 38 4,00 ± 0,47 ab 80,56 C4T1 38 3,16 ± 0,44 a 71,88 C4T2 38 3,11 ± 0,35 a 77,57 C4T3 37 3,33 ± 0,33 ab 78,67 C5T1 39 2,89 ± 0,35 a 73,08 C5T2 40 3,00 ± 0,33 a 74,04 C5T3 40 2,89 ± 0,35 a 73,18 C6T1 40 2,89 ± 0,35 a 73,06 C6T2 40 3,00 ± 0,35 a 74,07 C6T3 40 2,89 ± 0,35 a 73,08 Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan.
46 Hình 3.4. Thí nghim s dng dung dch vi khun T5 nng đ 10 10 CFU/ml vi s ln tưi khác nhau lên đt trng đu Cơve Hình 3.5. Thí nghim tưi 3 ln các dung dch khác nhau lên đt trng đu Cơve
47 3.2.3.3. nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn chiu dài, đưng kính qu, năng sut, khi lưng khơ ca cây Kt qu thí nghim th hin qua bng 3.10. Chiu dài qu: Các nghim thc đưc x lý dch cha vi khun cĩ chiu dài qu đt: 13,27 15,56 cm so vi x lý IAA 1,5 ppm: 13,78 14,33 cm, Nfb và nưc: 13,13 13,70 cm. Chiu dài qu cĩ s khác nhau gia s ln x lý dch cha vi khun, c th: tưi 1 ln đt 13,27 13,71 cm, 2 ln: 13,52 13,93 cm, 3 ln: 15,01 15,60 cm. Đưng kính qu: Tương t chiu dài qu, đưng kính qu các nghim thc đưc x lý dch vi khun đt: 8,21 8,79 mm so vi x lý IAA 1,5 ppm: 8,37 8,48 mm, Nfb và nưc: 7,88 8,06 mm. Gia các nghim thc, đưng kính qu bin đng khơng ln, tuy nhiên s khác bit này cĩ ý nghĩa v thng kê. Năng sut qu thu hoch: Mi quan tâm cui cùng ca ngưi nơng dân trong trng trt là cây trng đt năng sut cao, thc t cho thy nhiu khi cây trng cĩ kh năng sinh trưng tt, cho hoa nhiu nhưng năng sut khơng cao, do chu nh hưng ca nhiu yu t: thi tit (khơ hn, ngp úng, tc đ giĩ ln), dinh dưng thit yu (vi lưng, đa lưng) hoc các nng đ ca phytohormone Khi x lý dch vi khun sinh IAA các nng đ và s ln tưi khác nhau cho năng sut qu thu đưc gia các nghim thc như sau: Khi lưng qu ca tt c các ln thu nghim thc đưc x lý dch vi khun đt: 696 1.192 g, so vi x lý IAA 1,5 ppm: 807 851 g, Nfb và nưc: 601 620 g. Các nghim thc đưc tưi dch vi khun 1 ln đt: 696 788 g, tưi 2 ln: 778 794 g, tưi 3 ln: 1.021 1.192 g. Như vy nghim thc đưc tưi 3 ln dch vi khun cho kt qu tt nht. Trng lưng khơ ca cây: Trng lưng khơ ca cây các nghim thc đưc x lý vi dch vi khun đt: 674,9 762,3 mg, so vi x lý IAA 1,5 ppm: 673,3 724,3 mg, Nfb và nưc: 629,1 671,9 mg. Tưi dch vi khun 1 ln: 670 683 mg, 2 ln: 669,0 716,3 mg, 3 ln: 756,7 762,3 mg. Như vy, tt c các ch tiêu kho sát đu cĩ s khác bit gia các nghim thc. nghim thc cĩ
48 nng đ vi khun t 10 8, 10 9, 10 10 CFU/ml đưc tưi dch vi khun 3 ln đu cho kt qu cao hơn so vi các nghim thc khác. C th nghim thc C1T3 cho chiu dài qu 15,60 cm, đưng kính qu 8,76 mm, trng lưng qu đưc thu 1192g, trng lưng khơ ca cây 762,3 mg là cao nht. Điu này chng t lưng IAA do vi khun sinh ra đ đ tác đng đn sinh trưng, phát trin ca đu Cơve nh s tăng cưng hp thu các cht khống nên các cht hu cơ đưc tích lũy nhiu hơn, cho kt qu tt hơn (Fallkiik và cng s, 1994). Kt qu ca các ch tiêu kho sát cĩ mi quan h t l thun. Qua đây th hin mi tương quan sinh trưng gia các b phn trong cây. Mi tương quan sinh trưng th hin qua mi quan h, s tương tác ln nhau gia các cơ quan, b phn, gia các mơ và t bào đang sinh trưng. Mi tương quan đĩ đưc đm bo bng các tác nhân kích thích và c tác nhân c ch. Bi cơ th thc vt là mt chnh th thng nht, hài hịa to ra tính tồn vn [26]. Theo kt qu thí nghim, tưi 3 ln dch vi khun nng đ 10 8 10 10 CFU/ml, mi ln cách nhau 10 ngày là cho kt qu tt nht. Chng vi khun sinh IAA (T5) đã nh hưng rõ đn s ny mm, sinh trưng, phát trin ca đu Cơve so vi đi chng. Theo các d liu tng hp, khi nghiên cu nh hưng ca vi khun sinh IAA đn sinh trưng, phát trin ca mt s cây trng đu cho cho kt qu tt [29], [58], [60]. C th khi cho nhim chng Azospirillum vào trong đt, các vùng khí hu khác nhau, đu cĩ kh năng tăng năng sut các loi cây trng nơng nghip. Năng sut tăng khong 30% so vi đi chng (Yaacov Okon và cng s, 1996) [38]. Hoc Vivek Kumar (2001) nghiên cu nh hưng ca Azotobacter chroococcum lên lúa mì, trng lưng ht tăng 12,6% và rơm tăng 11,4% [63]
49 Bng 3.10. nh hưng ca nng đ vi khun và s ln tưi đn chiu dài, đưng kính qu và năng sut, khi lưng khơ ca cây Nghim Chiu dài qu Đưng kính Năng sut Khi lưng khơ thc (cm) qu (mm) (g/lơ thí nghim) ca cây (mg) C1T1 13,63 ± 0,18 a 8,31 ± 0,06 bc 696 674,9 ± 23,46 a C1T2 13,68 ± 0,18 ab 8,40 ± 0,1 bc 794 704,6 ± 14,50 bc C1T3 15,60 ± 0,19 c 8,76 ± 0,07 bc 1192 762,3 ± 29,92 c C2T1 13,27 ± 0,19 a 8,27 ± 0,05 bc 690 670,0 ± 11,93 a C2T2 13,93 ± 0,23 ab 8,49 ± 0,04 c 736 716,3 ± 14,36 c C2T3 15,54 ± 0,19 c 8,79 ± 0,01 c 1114 756,7 ± 20,95 c C3T1 13,71 ± 0,23 a 8,21 ± 0,15 abc 788 683 ± 12,21 a C3T2 13,52 ± 0,31 ab 8,37 ± 0,11 bc 778 699,4 ± 13,65 abc C3T3 15,01 ± 0,25 bc 8,58 ± 0,17 bc 1021 751,7 ± 17,82 c C4 T1 13,78 ± 0,47 a 8,37 ± 0,08 c 818 673,3 ± 19,70 a C4T2 14,24 ± 0,40 b 8,37 ± 0,07 bc 807 705,2 ± 14,75 bc C4T3 14,34 ± 0,39 b 8,48 ± 0,06 c 851 724,3 ± 22,30 c C5T1 13,70 ± 0,38 a 7,91 ± 0,09 a 603 671,9 ± 17,83 a C5T2 13,52 ± 0,45 a 8,06 ± 0,13 ab 619 664,0 ± 7,87 a C5T3 13,34 ± 0,23 a 7,98 ± 0,09 a 620 662,0 ± 8,83 a C6T1 13,50 ± 0,23 a 7,97 ± 0,12 ab 611 664,8 ± 8,20 a C6T2 13,13 ± 0,19 a 7,88 ± 0,18 a 620 662,7 ± 9,46 a C6T3 13,17 ± 0,34 a 7,96 ± 0,06 a 601 629,1 ± 5,49 a Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan.
50 A B C D E Hình 3.6. Kích thưc qu đu A: Tưi 3 ln dch VK T5 (10 10 , 10 9, 10 8 CFU/ml), dch IAA, Nfb, nưc B: Tưi dch vi khun T5 1, 2, 3 ln nng đ vi khun 10 10 CFU/ml C: Tưi dch vi khun T5 1, 2, 3 ln nng đ vi khun 10 9 CFU/ml D: Tưi dch vi khun T5 1, 2, 3 ln nng đ vi khun 10 8 CFU/ml E: Tưi dch 1, 2, 3 ln nng đ IAA 1,5 ppm
51 3.2.3.4. nh hưng ca nng đ và s ln tưi vi khun T5 đn s lưng nt sn r đu Cơve Mt đc trưng ni bt ca các lồi cây thuc h Đu nĩi chung và đu Cơve nĩi riêng là cĩ kh năng c đnh đm. Chc năng này nh vào nhiu lồi vi khun ti các nt sn trên r ca chúng. Các lồi vi khun đĩ đã chuyn hĩa khí nitơ (N 2) trong khơng khí khĩ s dng thành các cht cây cĩ th hp th đưc (NO 3 hay NH 3) [8], [34]. Đ tìm hiu nh hưng ca vi khun sinh IAA chng T5 đn s hình thành nt sn ca đu Cơve, thí nghim kim tra s lưng nt sn trên r đu Cơve sau thu hoch đưc thc hin. Qua bng s liu 3.11, s lưng nt sn cĩ s sai khác các nghim thc. S lưng nt sn tăng theo s ln tưi dch vi khun và nng đ vi khun trong dch tưi. C th tưi dch vi khun 3 ln các nng đ vi khun t 10 8, 10 9, 10 10 đt 45,11 48,11 nt sn/b r. Các nghim thc đưc x lý IAA tng hp 1,5ppm và dch khơng vi khun, nưc, cĩ s nt sn đt 29,33 37,44 nt sn/b r. Điu này chng t vi khun sinh IAA chng T5 đã tác đng đn b r đu Cơve, giúp r đu tit ra men poligalacturonase. Enzyme phân hy thành lơng hút và giúp vi khun cĩ điu kin xâm nhp vào r. Sau nhng hot đng din ra bên trong lp nhu mơ r, nt sn đưc hình thành [8]. Theo Phm Văn Ton (2003), khi s dng vi khun cĩ kh tng hp cht kích thích sinh trưng vào đt trng đu phng, s nt sn đu phng tăng lên 31,12 32,54 nt sn so vi đi chng khơng s dng vi khun [22].
52 Bng 3.11. nh hưng ca nng đ vi khun và s ln tưi đn s lưng nt sn r đu Cơve Nghim S lưng Nghim S lưng thc nt sn thc nt sn C1T1 37,33 ± 1,98 a C4T1 37,44 ± 2,39 a C1T2 40,44 ± 3,99 b C4T2 37,33 ± 2,54 ab C1T3 48,11 ± 2,98 b C4T3 33,56 ± 2,46 a C2T1 36,44 ± 2,95 a C5T1 34,11 ± 1,75 a C2T2 38,78 ± 2,64 b C5T2 29,33 ± 2,02 a C2T3 46,78 ± 2,78 b C5T3 33,22 ± 2,31 a C3T1 36,89 ± 3,45 a C6T1 32,67 ± 2,34 a C3T2 43,33 ± 3,70 b C6T2 29,67 ± 1,76 a C3T3 45,11 ± 3,50 b C6T3 33,67 ± 2,24 a Ghi chú: Các tr trung bình theo sau cĩ các mu t ging nhau trong cùng 1 ct thì khác bit khơng cĩ ý nghĩa 5% theo phép th Ducan. A B Hình 3.7. B r đu Cơve sau khi trng A: Nt sn trên r đu Cơve B: Các r đu nghim thc tưi dch 3 ln vi vi khun T5 (nng đ 10 10 , 10 9, 10 8 CFU/ml), IAA 1,5ppm, Nfb, nưc
53 3.2.4. Đánh giá lưng vi sinh vt đt sau nuơi trng đu Cơve Đ đánh giá đưc vi sinh vt tng s trong đt trưc và sau khi thí nghim, các mu đt đưc thu thp, phân tích cho kt qu qua bng 3.12. Qua bng 3.12 cho thy, trưc khi tưi dch nuơi cy vi khun vào đt, tng s vi sinh vt đt đt 2,77 x 10 8 CFU/g. Trong đĩ vi khun 2,46 x 10 8 CFU/g, nm mc 0,25 x 10 8 CFU/g và x khun 0,06 x 10 8 CFU/g. S vi khun ca nghim thc C1T3 sau khi tưi dch đt 4,48 x 10 8 CFU/g, cao gp 1,8 ln so vi s vi khun trưc khi tưi dch 2,46 x 10 8 CFU/g. Theo lý thuyt, sau 3 ln tưi dch vi khun nng đ 10 10 CFU/ml, 5ml/ ln, s cung cp lưng vi khun là 0,15 x 10 8 CFU/g và s vi khun s đt 2,61 x 10 8 CFU/g. Nhưng s lưng thc t đt 4,48 x 10 8 CFU/g cao hơn nhiu so vi lý thuyt. Điu này chng t khi đưc tưi vào trong đt, vi khun s dng ngun dinh dưng t đt và sinh trưng mnh. S nm mc và s x khun ca tt c các nghim thc chênh lch khơng đáng k. Do đĩ, s bin đng ca vi sinh vt tng s là do s bin đng ca vi khun qua các ln tưi. Tưi dch càng nhiu ln, s lưng vi khun trong đt càng tăng. Nm mc và x khun khơng nh hưng đn s bin đng ca vi sinh vt tng s. Các nghim thc đưc x lý vi nưc, IAA 1,5ppm và mơi trưng Nfb, tng s vi sinh vt chênh lch khơng đáng k so vi đt chưa đưc x lý dch. Như vy khi tưi dch vi khun vào đt thích hp s gĩp phn làm tăng thêm h vi sinh vt đt. Hình 3.8. Vi sinh vt tng s nghim thc tưi dch vi khun T5 1, 2, 3 ln nng đ vi khun 10 10 CFU/ml
54 Bng 3.12. Tng s vi sinh vt trưc và sau khi tưi dch vi khun Mu đt Vi khu n tng X khun tng Nm si tng s VSV t ng s phân tích s (CFU/g) s (CFU/g) (CFU/g) (CFU/g) 1. Tng s vi sinh vt trưc khi tưi dch vi khun N.Thc 2,46 x 10 8 0,06 x 10 8 0,25 x 10 8 2,77 x 10 8 2. Tng s vi sinh vt sau khi tưi dch vi khun C1T1 3,54 x 10 8 0,03 x 10 8 0,27 x 10 8 3,84 x 10 8 C1T2 3,95 x 10 8 0,07 x 10 8 0,15 x 10 8 4,17 x 10 8 C1T3 4,48 x 10 8 0,05 x 10 8 0,34 x 10 8 4,87 x 10 8 C2T1 3,16 x 10 8 0,06 x 10 8 0,25 x 10 8 3,47 x 10 8 C2T2 3,46 x 10 8 0,08 x 10 8 0,37 x 10 8 3,91 x 10 8 C2T3 3,96 x 10 8 0,05 x 10 8 0,26 x 10 8 4,27 x 10 8 C3T1 2,86 x 10 8 0,07 x 10 8 0,22 x 10 8 3,15 x 10 8 C3T2 3,06 x 10 8 0,06 x 10 8 0,35 x 10 8 3,47 x 10 8 C3T3 3,34 x 10 8 0,07 x 10 8 0,38 x 10 8 3,79 x 10 8 C4T1 2,26 x 10 8 0,06 x 10 8 0,34 x 10 8 2,66 x 10 8 C4T2 2,75 x 10 8 0,08 x 10 8 0,25 x 10 8 3,08x 10 8 C4T3 2,05 x 10 8 0,04 x 10 8 0,39 x 10 8 2,48 x 10 8 C5T1 3,02 x 10 8 0,05 x 10 8 0,15 x 10 8 3,22 x 108 C5T2 2,56 x 10 8 0,04 x 10 8 0,31 x 10 8 2,91 x 10 8 C5T3 2,38 x 10 8 0,03 x 10 8 0,32 x 10 8 2,73 x 10 8 C6T1 2,82 x 10 8 0,04 x 10 8 0,25 x 10 8 3,11 x 10 8 C6T2 2,48 x 10 8 0,06 x 10 8 0,35 x 10 8 2,89 x 10 8 C6T3 3,05 x 10 8 0,08 x 10 8 0,17 x 10 8 3,30 x 10 8
55 3.3. Mt s đc đim sinh hc ca chng vi khun đưc tuyn chn đ đnh danh và nhân nuơi sinh khi 3.3.1. Đc đim hình thái ca vi khun chng T5 Vi sinh vt khi phát trin trên b mt các mơi trưng thch s hình thành các khun lc đc trưng cho lồi. Khun lc đơn là qun th vi sinh vt đưc hình thành t mt bào t hay mt t bào ban đu. Khun lc đơn đưc to ra đ thu nhn dịng thun ca vi sinh vt đng thi đưc s dng đ mơ t khun lc, mt trong các tiêu chí dùng trong phân loi. Bng 3.13. Đc đim khun lc và t bào ca vi khun T5 Đc đim khun lc Đc đim t bào Hình Màu Cu Hình Chiu dài B mt Đ ni Bìa dng sc trúc dng (m) Bĩng Li Bng Đng Que – Trịn Ngà 2,9 – 3,0 nhn cong phng nht trịn Hình 3.9. Hình khun lc và t bào ca vi khun chng T5 3.3.2. Xác đnh vi khun Gram Nhum Gram là mt phương pháp nhm phân bit 2 nhĩm vi khun: Gram dương và Gram âm da trên các đc tính hố lý và cu to ca thành t bào vi khun. vi khun Gram dương, thành t bào cĩ mt lp peptidoglycan dày, cht này cĩ kh năng gi phc hp tím tinh th ca thuc nhum tím violet. T đĩ
56 làm gim khong trng gia các phân t và khin thành t bào bt gi phc hp tím tinh thviolet bên trong t bào và t bào cĩ màu tím xanh. Trong khi đĩ, vi khun gram âm, lp thành t bào peptidoglycan mng hơn và đc bit cĩ thêm lp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngồi. Sau khi nhum vi dung dch tím violet, mu đưc x lý tip vi ethanol 95%. Dung mơi này s phá v lp đơi phospholipid ca thành ngồi và các tinh th ca dung dch tím violet cũng b ra trơi. Do đĩ khi nhum thuc nhum th hai, thành t bào vi khun Gram âm s bt màu và cĩ màu đ hng ca Fuchsin. Da vào nguyên tc nhum trên, tin hành nhum Gram chng vi khun nghiên cu xác đnh tính Gram, mt trong nhng tiêu chí phân loi vi khun. Sau khi nhum, chng vi khun T5 bt màu đ hng. Như vy: chng vi khun sinh IAA (T5) đưc kho sát là vi khun Gram âm. Hình 3.10. T bào vi khun T5 nhum Gram âm 3.3.3. Hot tính catalase ca vi khun chng T5 Đây là đc đim ca vi sinh vt hiu khí. Vi sinh vt k khí bt buc và nhiu loi vi sinh vt ưa khí khơng sinh ra catalase. Catalase phân hy H 2O2 to thành O 2 theo phn ng sau đây: H2O2 H2O + O 2 Hot tính catalase đưc phát hin bng cách cho mt git dung dch H 2O2 30% lên vi khun, da vào hin tưng si bt (+) hay khơng () và kt lun hot tính catalase ca chng. Kt qu thí nghim cho thy chng kho sát cĩ catalase dương tính.
57 3.3.4. Kh năng c đnh nitơ phân t ca vi khun chng T5 Kh năng c đnh đm là mt trong nhng đc đim ca mt nhĩm vi khun sinh IAA và đưc dùng làm ch tiêu đ kho sát. Các vi sinh vt c đnh nitơ phân t phát trin tt trên mơi trưng Ashby là mơi trưng vơ đm. Thí nghim tin hành cy chng vi khun T5 lên mơi trưng Ashby trong 7 ngày. Nhng khun lc đơn mc đưc trên mơi trưng đưc hình thành t nhng t bào vi khun cĩ kh năng s dng nitơ phân t ca khơng khí. Tuy nhiên, mt s vi sinh vt vi đm, tc cĩ nhu cu nitơ cc thp, cĩ th s dng đưc mt lưng nh nitrogen liên kt cha trong các hĩa cht, nưc máy, trong khơng khí. Đ loi tr kh năng vi đm ca chng T5, thí nghim tip tc cy trãi liên tip vi khun T5 sau khi thu khun lc đơn lên mơi trưng Ashby. Kt qu qua các ln cy trãi, vi khun T5 đu phát trin tt trên mơi trưng vơ đm. Đng thi căn c vào mc đ phát trin cĩ th kt lun vi khun T5 cĩ kh năng c đnh nitơ phân t. 3.3.5. Xác đnh đưng cong sinh trưng ca vi khun T5 Vi khun T5 đưc nuơi cy trong mơi trưng Nfb s sinh trưng, phát trin làm tăng s lưng t bào trong dung dch. S dng máy quang ph đ đo đ đc dung dch nuơi cy vi khun bưc sĩng 610nm. Đ đc càng cao chng t nng đ vi khun trong dung dch càng ln, vi khun sinh trưng mnh. Da vào ch s OD 610nm , đánh giá kh năng sinh trưng, phát trin ca vi khun T5. Kt qu đưc ghi nhn theo bng 3.14. Kt qu đưc s dng đ xây dng đưng cong sinh trưng ca đi tưng nghiên cu là vi khun sinh IAA chng T5. Nhìn chung, s sinh trưng, phát trin ca vi khun đưc xác đnh gm 4 pha: Pha tim phát: s lưng t bào vi khun tăng khơng đáng k, ch yu xy ra mnh m quá trình sinh tng hp protein, enzyme, ADN. Pha log: s lưng t bào vi khun trong dung dch tăng theo h s mũ ( N= N0 2vt).
58 Pha n đnh: s t bào sinh ra bng s t bào cht đi do đĩ tng s t bào ca dung dch nuơi cy khơng tăng. Pha suy vong: s t bào sinh ra thp hơn s t bào cht do mơi trưng cn cht dinh dưng, to ra nhng yu t bt li cho vi sinh vt. Nên s t bào trong mơi trưng nuơi cy gim. Đưng cong sinh trưng ca vi khun s biu th các giai đon trên ca vi khun trong quá trình nuơi cy. Mi vi khun cĩ mt đưng cong sinh trưng riêng, ph thuc ch yu vào đc đim ca chng ging. Da vào đưng cong sinh trưng s xác đnh thi gian nuơi cy vi khun đ thu sinh khi hiu qu nht. biu đ 3.1, giai đon tim phát din ra rt ngn trong 1 ngày vì vi khun T5 đã đưc nuơi cy trong mơi trưng Nfb, mơi trưng ch yu s dng trong quá trình nghiên cu. Pha log ca vi khun T5 kéo dài t 1 đn 6 ngày, vi khun sinh sn rt nhanh th hin qua ch s đo OD 610nm bin đng t 0,103 0,797. Pha cân bng bt đu t ngày th 6 đn ngày th 9 sau nuơi cy, ch s đo OD bin đng rt nh: 0,627 0,797. Cĩ nhiu nguyên nhân làm cho qun th vi khun chuyn sang giai đon n đnh. Trong đĩ nguyên nhân ch yu là do sn phm ca quá trình trao đi cht to ra nhng yu t bt li trong mơi trưng làm hn ch s sinh trưng ca vi khun [8]. Theo kt qu trên, thi gian nuơi cy vi khun T5 thích hp trong mơi trưng lng Nfb đ tăng sinh khi mnh t 6 8 ngày.
59 Bng 3.14. S bin đng OD 610nm ca dung dch nuơi cy vi khun T5 theo thi gian Thi gian Thi gian Ch s OD 610nm Ch s OD 610nm theo dõi (ngày) theo dõi (ngày) 0 0,054 7 0,776 1 0,103 8 0,770 2 0,171 9 0,627 3 0,266 10 0,496 4 0,318 11 0,324 5 0,707 12 0,252 6 0,797 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 OD 0,3 0,2 Ch Ch s OD (610nm) 0,1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112 Thi gian theo dõi (ngày) Biu đ 3.1. Đưng cong sinh trưng ca vi khun chng T5 3.3.6. nh hưng ca nhit đ đn sinh trưng, phát trin ca vi khun chng T5 Sinh trưng và trao đi cht ca vi khun liên quan chc ch vi các điu kin ca mơi trưng bên ngồi, bao gm hàng lot các yu t khác nhau, tác đng qua li vi nhau. Các yu t bên ngồi nh hưng đn vi khun như nhit đ pH, liu lưng tia chiu UV, thành phn hĩa hc ca mơi trưng, đ nht, .
60 Hot đng trao đi cht ca vi khun cĩ th coi là kt qu ca các phn ng hĩa hc. Các phn ng ph thuc chc ch vào nhit đ. Vì vy yu t nhit đ nh hưng sâu sc đn các quá trình sng ca t bào. T bào thu đưc nhit ch yu t mơi trưng bên ngồi, mt phn do cơ th thi ra qua hot đng trao đi cht. Do đĩ thí nghim kho sát nh hưng ca các mc nhit đ: 25, 32, 39, 46 0C đn sinh trưng ca vi khun nhm chn ra nhit đ thích hp đ nhân nuơi sinh khi. Tin hành đo OD 610nm ca dung dch nuơi cy sau 0, 2, 4, 6, 8, 10 ngày đ đánh giá kh năng sinh trưng ca vi khun. Kt qu đưc ghi nhn qua bng 3.15. Bng 3.15. nh hưng ca nhit đ đn s sinh trưng ca vi khun sinh IAA Thi gian Kt qu đo OD 610 ca chng vi khun sinh IAA theo dõi (ngày) 25 0C 32 0C 39 0C 46 0C 0 0,054 0,053 0,054 0,055 2 0,072 0,186 0,110 0,085 4 0,204 0,315 0,301 0,201 6 0,515 0,788 0,590 0,317 8 0,506 0,685 0,548 0,306 10 0,346 0,481 0,395 0,214 0,9 0,8 0,7 0,6 25 đ C 0,5 32 đ C 0,4 39 đ C 0,3 0,2 46 đ C 0,1 Ch Ch s đo OD (610nm) 0 0 2 4 6 8 10 Thi gian theo dõi (ngày) Biu đ 3.2. nh hưng ca nhit đ đn s sinh trưng ca vi khun sinh IAA
61 nhit đ 32 0C, chng vi khun T5 sinh trưng mnh nht. Nhit đ 25 0C và 39 0C vi khun sinh trưng kém. Nhit đ 46 0C vi khun sinh trưng rt kém do làm bin tính enzyme, protein [8]. Nhit đ thp quá hoc cao quá đu làm nh hưng đn s sinh trưng hoc làm cht vi khun. Kt qu cho thy, chng T5 sinh trưng tt nhit đ 32 0C. 3.3.7. nh hưng ca pH đn sinh trưng, phát trin ca vi khun T5 Đ chn pH thích hp cho chng vi khun T5, thí nghim tin hành kho sát dãy pH: 5, 6, 7, 8. Kt qu đưc ghi nhn qua bng 3.16. Bng 3.16. nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng vi khun T5 Thi gian Ch s OD 610nm ca vi khun T5 theo dõi (ngày) pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 0 0,083 0,084 0,083 0,083 2 0,117 0,144 0,183 0,180 4 0,165 0,246 0,401 0,374 6 0,228 0,333 0,766 0,717 8 0,134 0,293 0,665 0,675 10 0,076 0,197 0,486 0,447 các nghim thc v pH đu cho kt qu ch s OD cao nht tc nng đ t bào trong dung dch nuơi cy cao nht đu vào ngày th 6 nuơi cy. Kt qu này mt ln na khng đnh thi gian nuơi cy đ thu sinh khi là 6 ngày trên mơi trưng Nfb. Ngồi ra, kt qu cịn cho thy vi khun T5 sinh trưng tt mơi trưng Nfb cĩ đ pH = 7 8. Chúng sinh trưng kém mơi trưng cĩ pH = 6 và rt kém pH = 5. Theo kt qu nghiên cu ca B. Joseph và cng s (2007), Azotobacter và Rhizobium sinh trưng mnh pH: 6,8 – 7,7 [46]. Qua đĩ chng t pH càng thp, mơi trưng càng chua thì vi khun T5 b c ch sinh trưng càng mnh. Khi pH mơi trưng cĩ s thay đi, màng sinh cht
62 s b phá v hoc hot tính enzyme b c ch, do đĩ nh hưng đn sinh trưng ca vi khun [8]. 0,9 0,8 0,7 0,6 pH = 5 0,5 pH = 6 0,4 pH = 7 0,3 pH = 8 0,2 0,1 Ch Ch s đo OD (610nm) 0 0 2 4 6 8 10 Thi gian theo dõi (ngày) Biu đ 3.3. nh hưng ca pH đn sinh trưng ca các chng vi khun sinh IAA Theo khĩa phân loi Bergey, căn c đc đim hình thái, mt s đc đim sinh hc và kh năng sinh IAA đã kho sát, vi khun T5 đưc mơ t như sau: T5 là vi khun Gram âm. T bào sau 1 ngày nuơi cy dng que, khi già cĩ dng trịn. Đưng kính t bào 2,9 – 3,0m. Khun lc trịn, b mt bĩng, nhn, mép bng phng, cu trúc đng nht, màu ngà. Khơng to màu khi nuơi cy trong mơi trưng lng. Catalase dương tính; pH ti thích: 7 8, nhit đ ti thích: 32 0C. Phát trin đưc trên mơi trưng cĩ ngun cacbon là Manitol. Cĩ kh năng c đnh nitơ phân t, kh năng sinh IAA. Da vào nhng đc đim trên, vi khun T5 thuc lồi Azotobacter chroococcum, chi Azotobacter, h Pseudomonadaceae , b Pseudomonadales [35]. Theo tài liu tham kho, vào năm 1978, Harper, S.H.T và Lynch, J.M đã nghiên cu nh hưng ca Azotobacter chroococcum đn s ny mm và sinh trưng thân mm ca lúa mch [44]. Điu này phn nào phù hp vi nghiên cu khác. Như vy vi khun T5 là: Azotobacter chroococcum .
63 Da trên nghiên cu ca Cao Bình, trưng Đi hc Tây Nguyên v kh năng sinh IAA ca chng vi khun đưc tuyn chn trên các mơi trưng nuơi cy, trong đĩ cĩ vi khun T5, kt qu th hin bng 3.17. Bng 3.17. Kh năng sinh IAA ca chng vi khun đưc tuyn chn trên các mơi trưng nuơi cy Nng đ IAA (mg/l) Mơi trưng Nfb Mơi trưng YEM Mơi trưng YMA 34,794 ± 0,090 j 5,789 ± 0,090 b 8,276 ± 0,114 f Như vy theo tác gi này, vi khun chng T5 đưc nuơi cy trong mơi trưng Nfb, lưng IAA đưc to ra rt cao so vi nuơi cy trong mơi trưng YEM và YMA. Vì vy mơi trưng Nfb đã đưc la chn đ nhân nuơi thu sinh khi. T các kt qu nghiên cu trên, đ nhân nuơi sinh khi vi khun T5, Azotobacter chroococcum cn mơi trưng lng Nfb, nhit đ thích hp 32 0C, pH: 7 8, thi gian thu sinh khi: 6 8 ngày sau khi nuơi cy.
64 KT LUN VÀ KIN NGH 1. Kt lun Đ tài đã xác đnh đưc chng T5 cĩ kh năng tăng t l ny mm và sinh trưng ca cây mm, tăng din tích lá, s lưng nt sn, rút ngn thi gian ra hoa, tăng t l đu qu và năng sut cây đu Cơve. Ngồi ra khi tưi dch vi khun T5, mt đ vi khun trong đt tăng 1,14 đn 1,76 ln so vi đt trưc khi trng đu. Căn c vào khĩa phân loi vi khun ca Bergey, đ tài xác đnh đưc vi khun sinh IAA T5 là vi khun Azotobacter chroococcum . Khi s dng mơi trưng Nfb, pH 7,0 và nuơi cy vi khun này 32 0C thi gian thu sinh khi là 6 8 ngày 2. Kin ngh Đnh danh vi khun T5 bng k thut sinh hc phân t. Nghiên cu nh hưng ca vi khun sinh IAA chng T5 đn mt s đi tưng cây trng khác, đc bit là các cây rau nhm tìm bin pháp gim ti vic s dng các cht kích thích sinh trưng tng hp, đng thi vn đáp ng và nâng cao năng sut cây trng. Phân lp và tuyn chn t các vùng đt khác Đk Lk cũng như Tây Nguyên các chng vi khun sinh IAA cao đ nghiên cu ng dng đáp ng cho s phát trin nơng nghip bn vng đng thi bo tn đa dng sinh hc ca đa phương.