Luận văn Nghiên cứu quá trình lên men Axit lactic từ tinh bột hạt mít - Hồ Thị Hảo

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu quá trình lên men Axit lactic từ tinh bột hạt mít - Hồ Thị Hảo

1. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO ĐI HC ĐÀ NNG H TH HO NGHIÊN CU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC T TINH BT HT MÍT LUN VĂN THC SĨ K THUT Đà Nng – Năm 2011
2. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO ĐI HC ĐÀ NNG H TH HO NGHIÊN CU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC T TINH BT HT MÍT Chuyên ngành: CƠNG NGH THC PHM VÀ Đ UNG Mã s: 60 54 02 LUN VĂN THC SĨ K THUT Ngưi hưng dn khoa hc: PGS.TS.TRƯƠNG TH MINH HNH Đà Nng Năm 2011
3. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO ĐI HC ĐÀ NNG H TH HO NGHIÊN CU QUÁ TRÌNH LÊN MEN AXIT LACTIC T TINH BT HT MÍT Chuyên ngành: Cơng ngh thc phm và đ ung Mã s: 60 54 02 TĨM TT LUN VĂN THC SĨ K THUT Đà Nng Năm 2011
4. Cơng trình đưc hồn thành ti ĐI HC ĐÀ NNG Ngưi hưng dn khoa hc: PGS.TS. TRƯƠNG TH MINH HNH Phn bin 1: PSG.TS. TRN TH XƠ Phn bin 2: PGS.TS. PHM NGC ANH Lun văn đưc bo v trưc hi đng chm Lun văn tt nghip thc sĩ K thut hp ti Đi Hc Đà Nng vào ngày 23 tháng 4 năm 2011. * Cĩ th tìm hiu lun văn ti: Trung tâm Thơng tin Hc liu, Đi hc Đà Nng Trung tâm Hc liu, Đi hc Đà Nng.
5. DANH MC CÁC BNG S hiu Tên bng Trang bng 1.1 Hình thái và kiu lên men lactic ca mt s vi khun lactic 11 1.2 Thành phn hĩa hc ca ht mít 21 2.1 Thành phn mơi trưng lên men axit lactic 28 2.2 Thành phn mơi trưng MRS Agar 29 3.1 nh hưng ca nng đ xút đn quá trình tách lp v nâu 31 ht mít 3.2 Hàm lưng tinh bt ca ht mít 33 3.3 Kt qu đo OD ca dch kim chng và mu thí nghim 34 3.4 Hàm lưng đưng kh to thành sau quá trình thy phân 38 3.5 Hiu sut lên men theo nng đ dch đưng 48 3.6 Các điu kin thí nghim TYT 2 2 51 3.7 Kt qu thí nghim theo thc nghim TYT 2 2 52 3.8 Bng giá tr tính phương sai dư 55 δ 3.9 Kt qu tính bưc chuyn đng j ca các yu t 56 3.10 Kt qu thc nghim ti ưu hĩa theo đưng lên dc 57
6. DANH MC CÁC HÌNH S hiu Tên hình Trang hình 1.1 Hai dng đng phân ca axit lactic 5 1.2 Lên men axit lactic đng hình nh các phn ng theo con đưng 8 EMP 1.3 Lên men axit lactic d hình theo các phn ng ca con đưng 9 PP 1.4 Lactobacillus casei 12 1.5 Lactobacillus bulgaricus 13 1.6 Lactobacillus acidophilus 13 1.7 Streptococcus lactic 13 1.8 Thuc Biolactyl 15 1.9 Cây mít 20 1.10 Ht mít 20 1.11 Hình chp phân t tinh bt ht mít 22 2.1 Máy so màu hiu JENWAY 6305 23 2.2 T sy nguyên liu 23 3.1 Bt ht mít thu nhn 33 3.2 Khun lc L.casei sau khi hot hĩa 36 3.3 Đưng chun glucoza 37 3.4 Dch đưng sau thy phân 39 3.5 Dch đưng đã kho sát nng đ trưc lúc lên men 40 3.6 Các khun lc Lactobacillus casei các mc pha lỗng 10 3 42 3.7 Đưng cong biu din mt đ t bào các mc pha lỗng 42 khác nhau
7. 3.8 Dch đưng đã chun b trưc lúc lên men 43 3.9 Quá trình lên men lactic 44 3.10 nh hưng ca nhit đ đn hàm lưng axit lactic to thành 45 3.11 nh hưng ca t l ging đn lưng axit lactic to thành 46 3.12 nh hưng ca nng đ dch đưng đn hàm lưng axit lactic to 47 thành 3.13 nh hưng ca thi gian lên men đn hàm lưng axit lactic to 49 thành 3.14 Các mu dch sau khi kt thúc quá trình lên men 50
8. DANH MC CÁC CH VIT TT EMP : Embden-Mayerhoff-Parnas ATP : Adenosine Triphosphate ADP : Adenosine Diphosphate PP : Pentoza Phosphat L.bulgaricus : Lactobacillus bulgaricus: L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus Opt : Optimum
9. LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi. S liu, kt qu báo cáo trong lun văn là trung thc và chưa tng đưc cơng b bt c cơng trình nào khác. Tác gi H Th Ho
10. 1 M ĐU 1. TÍNH CP THIT CA Đ TÀI Axit lactic là axit hu cơ khơng màu, cĩ hương v nh. Axit lactic đưc hình thành do quá trình lên men t nhiên trong các sn phm như phomai, sa chua, nưc tương, bt chua, sn phm t tht, rau mui chua Axit lactic đưc dùng sn xut trong mt s thc phm như các sn phm bánh, đ ung, các sn phm t sa, tht, xà lách Trong các sn phm thc phm đ ung, axit lactic đưc s dng đ điu chnh đ pH hoc như mt cht bo qun [27], [30]. Trong cơng nghip nh, axit lactic là dung mơi cho cơng nghip sn xut sơn, vecni, nhum và thuc da. Trong cơng nghip rưu, axit lactic đưc dùng dưi dng mui ca canxi. Đc bit là gn đây, các nhà khoa hc trên th gii đã nghiên cu tng hp nha axit polylactic (PLA) – mt loi nha sinh hc t axit lactic. PLA là s la chn thích hp thay cho nha cĩ ngun gc t du m, vì nĩ va cĩ th phân hu đưc, va ít đc tính đi vi con ngưi. PLA đưc s dng làm nguyên liu sn xut bao bì phân bĩn, thc phm và các loi bát, đĩa dùng mt ln. Đc bit trong y hc và dưc hc, kt hp vi s phát trin ca cơng ngh sinh hc và di truyn, axit lactic đưc nghiên cu nhm sn xut phc v nhng nhu cu thit yu v sc khe ca con ngưi. Trong phu thut chnh hình, các hp cht cao phân t tng hp t axit lactic và nhng dn xut ca nĩ là nhng cht liu cy ghép sinh hc thích hp và hiu qu cao. Canxi lactat là loi dưc phm nhm b sung canxi dưi dng d hp thu cho cơ th. St lactat đưc s dng đ cha bnh thiu máu [16], [28], [37]. Axit lactic đưc sn xut t nhiu ngun nguyên liu khác nhau như r đưng, c ci đưng, nưc mía, tinh bt Nhm đ h chi phí sn xut axit lactic, ngày nay đang cĩ rt nhiu nghiên cu thay th ngun cacbon và nitơ đt tin trong mơi trưng lên men bng các nguyên vt liu r tin hơn. Trong đĩ, tp trung ch yu
11. 2 vào vic tn dng các ph phm nơng nghip như bã mía, bã ngơ, lõi ngơ, cám mỳ, rơm r, r đưng [16],[23],[28],[36]. Mít là loi trái cây nhit đi cĩ giá tr. Qu mít đã đưc s dng đ ăn tươi t lâu đi. Trong nhng năm gn đây mít đưc s dng rt nhiu trong các ngành ch bin thc phm đ to ra các sn phm khác nhau như: mt mít, mít sy, sn xut bánh ko, Ht mít trong qu mít chim trung bình t 10 – 15% trng lưng trái, ngồi ra trong ht mít cha mt hàm lưng khá ln tinh bt và protein. Mc dù khi lưng nhiu nhưng nĩ ch đưc coi là ph ph phm và thưng b loi b trong quá trình s dng, sn xut và gây khĩ khăn cho vic x lý rác thi ơ nhim mơi trưng . Chúng ta đã bit s dng ht mít đ ch bin mt s mĩn ăn nh tuy nhiên s hiu bit v các thành phn dinh dưng cịn hn ch [35]. Quá trình nghiên cu xác đnh thành phn dinh dưng ca ht mít đã đưc kho sát trong thi gian gn đây, trong ht mít cĩ cha ti 77,76% tinh bt và là mt ngun nguyên liu r tin, sn cĩ [38], [43]. Thy phân tinh bt t ht mít đ lên men sn xut cn và axit lactic là mt hưng mi nhưng chưa đưc nghiên cu nhiu. Vic tn dng đưc ngun ph phm r tin, d kim, cũng như nhm hn ch lưng cht thi trong quá trình ch bin, chng ơ nhim mơi trưng là mt thiên hưng ln đi vi các nhà nghiên cu. Trong cơng ngh sn xut axit lactic, vic s dng các ngun nguyên liu như đưng, r đưng, nưc mía ép, c ci đưng, tinh bt đã đưc nghiên cu nhiu nhưng hin nay vic s dng tinh bt ht mít đ sn xut axit lactic thì chưa thy cơng b. nưc ta, vic s dng axit lactic trong cơng ngh thc phm và phi thc phm khá nhiu nhưng ch yu là thu mua t nưc ngồi vi giá thành cao. Nghiên cu quá trình thy phân tinh bt ht mít (mt ngun ph phm cơng nghip khng l và r tin) đ làm nguyên liu trong cơng ngh lên men lactic nhm h giá thành cho sn phm axit lactic là tht s cĩ ý nghĩa khơng ch v mt kinh t mà cịn cĩ ý nghĩa rt ln v bo v mơi trưng sng ca chúng ta. Chính vì nhng thc t trên, chúng tơi mnh dn chn đ tài “Nghiên cu quá trình lên men axit lactic t tinh bt ht mít” là mt vic làm cp thit hin nay.
12. 3 2. MC ĐÍCH NGHIÊN CU S dng ht mít làm nguyên liu chính đ tin hành thy phân thu nhn dch lên men. Xác đnh các thơng s cơng ngh tt nht như nng đ dch đưng, nhit đ lên men, thi gian lên men, pH lên men cho quá trình lên men axit lactic bng cách s dng phương pháp quy hoch thc nghim và ti ưu hĩa nhm thu đưc hàm lưng axit lactic sau lên men là cao nht. Đ xut đưc quy trình lên men axit lactic t tinh bt ht mít. 3. ĐI TƯNG NGHIÊN CU S dng ht mít làm ngun nguyên liu chính đ tin hành thy phân thu nhn dch đưng. S dng ch phm enzyme αamylaza do hãng Novozymes – Đan Mch sn xut và ch phm γamylaza ca Genencor Bioproducts Co.Ltd, China sn xut. S dng chng vi khun Lactobacillus casei đ lên men dch sau thy phân. 4. PHM VI NGHIÊN CU S dng ht mít đưc thu mua ti các đu mi nguyên liu ca Cơng ty c phn Vinamit trên Daklak. Lên men axit lactic t dch thy phân t tinh bt ht mít. 5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU Phương pháp ly mu, chun b mu và bo qun mu. Phương pháp hĩa lý Phương pháp hĩa hc Phương pháp hĩa sinh Phương pháp vi sinh vt Phương pháp tốn hc 6. Ý NGHĨA KHOA HC CA Đ TÀI Phân tích và xác đnh hàm lưng tinh bt ca ht mít, thành phn dch lên men và xác đnh hàm lưng axit lactic bng các phương pháp hĩa hc. Thc hin lên men axit lactic trên mơi trưng lng.
13. 4 Ti ưu hĩa các điu kin lên men bng phương pháp quy hoch thc nghim và phương pháp ti ưu nhm thu đưc hàm lưng axit lactic là cao nht. 7. Ý NGHĨA THC TIN CA Đ TÀI Tn dng lưng ph ph phm trong quá trình ch bin các sn phm t qu mít đ to ra ngun nguyên liu chính đ sn xut axit lactic. Gii quyt đưc vn đ ơ nhim mơi trưng, bo v sc khe cng đng, nâng cao hiu qu kinh t trong sn xut. Tăng ngun thu nhp cho ngưi trng mít Gim lưng axit lactic ngoi nhp, ch đng sn xut, tit kim ngoi t. 8. CU TRÚC CA LUN VĂN Ngồi phn m đu, kt lun và kin ngh, tài liu tham kho, ph lc, trong lun văn gm cĩ các chương sau: + Chương 1: Tng quan. + Chương 2: Đi tưng và phương pháp nghiên cu. + Chương 3: Kt qu và tho lun.
14. 5 CHƯƠNG 1. TNG QUAN 1.1. Tng quan v axit lactic 1.1.1. Lch s lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyn hĩa k khí đưng to thành axit lactic đã đưc bit và s dng t lâu đi trong dân gian như: lên men chua rau qu, làm sa chua Năm 1780 nhà bác hc Thy Đin Shale ln đu tiên đã tách đưc axit lactic t sa bị lên men chua. Năm 1857 Pasteur đã chng minh đưc s lên men chua sa là do nhĩm vi khun lactic. Năm 1878 Lister phân lp thành cơng vi khun lactic đu tiên và đt tên là Bacterium lactis, nay gi là Streptococus lactic . V sau các nhà khoa hc liên tip phân lp đưc nhiu loi vi khun lactic khác nhau. T đĩ cơng nghip lên men sn xut axit lactic đưc hình thành t năm 1881 [1], [3]. Ngày nay, vic sn xut và tiêu th axit lactic trên th gii khá nhiu. Vì axit lactic đưc lên men t nhiu nguyên liu khác nhau, ch yu là nhng nguyên liu cĩ cha tinh bt, đưng và nguyên liu cĩ kh năng chuyn hĩa thành đưng. Hơn na, đa s các loi nguyên liu này thưng là ph phm trong nhiu ngành cơng nghip như r đưng, rơm r [16], [25], [28], [36]. 1.1.2. Cu to ca axit lactic Cơng thc phân t: C3H6O3, khi lưng phân t là 90,08; t trng 1,21; nhit đ sơi 122 oC; đim tan 18 oC [1]. Axit lactic là hn hp ca 2 dng đng phân Daxit lactic và Laxit lactic: Daxit lactic Laxit lactic Hình 1.1. Hai dng đng phân ca axit lactic [52].
15. 6 Axit lactic là axit hu cơ khơng màu, cĩ mùi nh, tan trong nưc và trong cn. Trong cu to phân t ca chúng cĩ mt cacbon bt đi xng nên chúng cĩ hai đng phân quang hc: Daxit lactic và Laxit lactic. Hai đng phân quang hc này cĩ tính cht hĩa lý ging nhau, ch khác nhau kh năng làm quay mt phng phân cc ánh sáng, mt quay sang phi và mt quay sang trái. Do đĩ tính cht sinh hc ca chúng hồn tồn khác nhau. Loi Laxit lactic dng tinh th khơng màu. Chúng cĩ kh năng tan trong nưc, tan trong cn etylic, tan trong eter, khơng tan trong CHCl 3. Nhit đ nĩng chy là 28 oC, gĩc quay cc 15 oC là 2,67 o. Loi Daxit lactic là dng tinh th, tan trong nưc, tan trong cn. Nhit đ nĩng chy là 28 oC, nhit đ sơi 103 oC, gĩc quay 15 o là 2,26 o. Nu Daxit lactic và Laxit lactic cĩ trong hn hp theo t l 50:50, ngưi ta gi là hn hp raxemic. Hn hp này đưc kí hiu là DLaxit lactic. Trong quá trình lên men khơng cĩ mt hn hp lý tưng này mà ch cĩ đưc hn hp này khi tin hành tng hp hu cơ. DLaxit lactic là dch lng dng sino, cĩ kh năng tan trong nưc, trong cn, khơng tan trong CHCl 3, nhit đ nĩng chy ca chúng là 16,8 oC, nhit đ sơi là 122 oC [1], [3]. 1.1.3. Cơ s ca qúa trình lên men axit lactic Các phn ng sinh hĩa xy ra trong quá trình lên men lactic là nhng phn ng chuyn hydro và đin t. Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên t hydro khi cơ cht là các enzyme oxy hĩa – kh (dehydrogenase, oxydase ) ch yu t vi sinh vt. Như vy, lên men là quá trình oxy hĩa kh sinh hc đ thu năng lưng và các hp cht trung gian. Tùy thuc vào các sn phm to thành mà quá trình lên men lactic đưc chia thành 2 loi: lên men lactic đng hình và lên men lactic d hình [8], [11]. Lên men lactic đng hình, thc t ch xut hin axit lactic, cịn trong lên men d hình các sn phm cui cùng khá đa dng: axit lactic, etanol, axit axetic và CO 2. Ch cĩ lên men lactic đng hình là cĩ ý nghĩa v mt cơng nghip.
16. 7 Các vi khun lactic đng hình phân gii glucose theo con đưng EMP [3]. Tùy thuc vào tính chuyn hĩa khơng gian ca men xúc tác cho phn ng to axit lactic, lactac dehdrogenase, và tùy vào s tn ti ca men lactateracemase mà cĩ th xut hin các dng decacboxyl hĩa và chuyn thành axit axetic, etanol và CO 2 cũng như to thành axeton. Mc đ to thành sn phm này ph thuc vào s cĩ mt ca oxi. S hình thành nên axit lactic tri qua hàng lot giai đon trung gian vi s tham gia ca các enzyme tương ng. Các phn ng chuyn hĩa glucose theo con đưng EMP đưc chia làm 2 giai đon: Giai đon đu đưc gi là giai đon đu tư năng lưng, gm 5 phn ng đu tiên. giai đon này, đưng đưc hot hĩa bi s photphoril hĩa. Phn ng này to ra 1 mol đưng 6 cacbon đã đưc photphoril hĩa, fructozo – 1,6 – diphotphat. Đưng này sau đĩ đưc ct thành 2 mol trizophotphat. Hai mol trizophotphat đưc hình thành t 1 mol glucose sau 2 ln photphoril hĩa mc đ cơ cht to thành 4 mol ATP. Giai đon th hai, là giai đon phát sinh năng lưng. Giai đon này gm nhng phn ng cịn li. giai đon này, các trizophotphat s đưc hot hĩa tip đ to thành hai hp cht cha các liên kt photphat cao năng 1,3 diphotphoglycerat và photpho enolpiruvat. C hai hp cht này đưc coi như hp cht siêu cao năng lưng. Hai cht này s chuyn photpho cao năng cho ADP đ to thành ATP. Quá trình này đưc gi là photphoril hĩa mc cơ cht. Lưng axit lactic to thành chim hơn 90%. Ch mt lưng nh pyruvat b kh cacbon đ chuyn thành axit lactic, etanol, CO 2 và axeton [1], [3]. Phương trình phn ng to axit lactic: C 6H12 O6 = 2CH 3CHOHCOOH +225cal. S lên men lactic đng hình đưc biu din theo sơ đ sau:
17. 8 Glucose Gluco6 photphat Fructo1,6diphotphat Glyceraldehyt3photphat Dihydroaxeton photphat NAD NADH 2 1,3Diphotphoglyxerat 3Photphoglyxerat 2Photphoglyxerat Photphoenol pyruvat Pyruvat NADH 2 NAD Lactat Hình 1.2. Lên men axit lactic đng hình nh các phn ng theo con đưng EMP [3]. Các vi khun lactic d hình thiu các enzyme ch yu ca con đưng EMP, do b đt bin mt hoc nhiu hơn mt enzyme ca con đưng này, đĩ là aldolase và trizophotphatizomerase.
18. 9 Hình 1.3. Lên men axit lactic d hình theo các phn ng ca con đưng PP [4]. Trong s lên men lactic d hình, nhiu sn phm khác nhau đưc to thành. Các tác nhân gây lên men lactic d hình là Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides.
19. 10 S lên men lactic d hình xy ra khi vi khun gây lên men thiu enzyme cơ bn ca s đưng phân là aldolase và trioso isomerase. Khi đĩ, glucose đưc chuyn hố theo con đưng pentosophosphat t glucoso 6 phosphat đn xiluloso 5 phosphat. Sau đĩ, dưi tác dng ca enzyme pentosophosphat cetolase mà xiluloso 5 phosphat b phân ly to thành glyceraldehyd 3 phosphat và acetyl phosphat. Acetyl phosphat cĩ th đưc chuyn hố tip tc thành ethanol hoc axit axetic tuỳ theo h enzyme ca tng vi sinh vt. Cịn glyceraldehyd 3 phosphat thì b kh H2 đ chuyn thành axit lactic ging như trưng hp lên men lactic đng hình. S lên men lactic d hình đưc ng dng trong lên men thc ăn gia súc và mui chua rau qu. Các vi khun cĩ kh năng gây lên men các đưng mono và disaccharid (sau khi đã thu phân thành monosaccharid nh enzyme tƣơng ng ca vi khun). 1.2. Tác nhân tng hp axit lactic Vi sinh vt là tác nhân ch yu gây nên s lên men. Trong t bào vi sinh vt cĩ mt h enzyme rt phc tp. Tuy nhiên, khơng phi tt c vi sinh vt đu cĩ kh năng tng hp mt phc h enzyme như nhau. Nhiu thí nghim nghiên cu các enzyme riêng bit cĩ ngun gc t vi sinh vt chng t rng ngay c cùng mt lồi, khác nhau v lưng enzyme tng hp đưc. Vì vy, vic tuyn chn chng cĩ h enzyme đc trưng cho mt sn xut nào đĩ luơn luơn liên quan ti vic kho nghim hàng chc, hàng trăm lồi vi sinh vt khác nhau. Đ cĩ đưc chng ng dng cho tng sn xut riêng là vn đ khĩ khăn, phc tp và lâu dài [1]. 1.2.1. Phân loi vi khun lactic Theo khĩa phân loi Bergey, nhĩm vi khun lactic thuc: Gii: Bateria Ngành: Firmicutes Lp: Bacilli B: Lactobacillates H: Lactobacillaceae & Streptococcaceae Vi khun lactac cĩ chung các đim như: bt màu gram (+), khơng di đng, khơng to bào t (dù vy, ngày nay ngưi ta tìm thy mt s vi khun sinh axit
20. 11 lactic cĩ kh năng to bào t), nhu cu dinh dưng phc tp, k khí tùy ý, t bào khơng cha cytochobrom và enzyme catalase , lên men tng hp axit lactic [1], [5]. Bng 1.1. Hình thái và kiu lên men lactic ca mt s vi khun lactic [1], [3]. Ging vi sinh vt Kiu Sn phm chính Cu hình lên men (t l phân t) axit lactic Trc khun Lactobacillus lactic đng hình lactat D() L. helveticu s đng hình lactat DL L. acidophilus đng hình lactat D() L. bulgaricus đng hình lactat D() L. delbrueckii đng hình latcat D() L.casei đng hình latcat L() L. plantarum đng hình lactat DL L. brevis d hình DL L. fermentum d hình DL L. viridescens d hình DL Bifidobacterium bifidum d hình lactat: acetat(2:3) L(+) Cu khun Stretoccus đng hình lactat L(+) S. faeclis đng hình lactat L(+) S. salivarius đng hình lactat L(+) S. pyogenes đng hình lactat L(+) S. cremoris đng hình lactat L(+) S. thermophilus đng hình lactat L(+) S. diacetilactics đng hình lactat L(+) Pediococcus cerevisiae đng hình lactat DL Leuconostoc cremoris d hình lactat : acetat : CO 2 (1:1:1) D() Leuconostoc mesenteroides d hình lactat : acetat : CO 2 (1:1:1) D()
21. 12 Nhĩm vi khun lactic bao gm nhiu lồi khác nhau v hình dng, song v mt sinh lý và kh năng lên men chúng tương đi đng nht. Mơi trưng sinh trưng ca chúng ngồi gluxit, khống, mui amon, photphat cịn cn vitamin nhĩm B, vitamin H, axit folic, axit nicotinic và axit amin khác [1], [11]. 1.2.2. Mt s vi khun lactic đin hình Lactobacillus casei : Thuc loi trc khun nh, cĩ kích thưc rt ngn. Chúng cĩ th to chui, khơng di đng, gram (+). Cĩ kh năng lên men mt s loi đưng như glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose. Trong quá trình lên men chúng to ra Laxit lactic Hình 1.4. Lactobacillus casei [52] Lactobacillus casei thuc nhĩm các vi khun lên men lactic đng hình. Cu trúc t bào ca lactobacillus casei thưng thng, hình que và sp xp theo dây chuyn. Kích thưc t bào khong 0,71,1 x 2,04,0 micrometer. Nĩ thuc dng ym khí tùy tin. Điu này cĩ nghĩa nĩ là mt sinh vt cĩ kh năng phát trin trong c hai mơi trưng hiu khí và k khí, nhưng phát trin tt hơn và nhanh hơn trong s hin din ca oxygen. Điu đc bit ca vi khun này là cĩ kh năng hot đng trong mt khong nhit đ và pH tương đi rng, nhit đ hot đng nm trong khong: 3040 oC, pH ti thích vào khong 5.5. Các nhà khoa hc đã tìm thy lactobacillus casei cĩ nhiu đc tính cĩ li h tr sc khe con ngưi. Nĩ cĩ th ci thin và tăng cưng tiêu hĩa. Mt s chng vi khun giúp kim sốt tiêu chy, cĩ tác dng chng viêm rut, gim dung np đưng lactose, gim táo bĩn, Ngồi ra, nĩ cịn là vi sinh vt s dng đ sn xut axit lactic, mt sn phm ng dng rng rãi trong cơng ngh sinh hc và trong ngành cơng nghip thc phm. Lactobacillus casei đưc s dng rng rãi trong cơng nghip, nht là trong sn xut sa.
22. 13 Lactobacillus bulgaricus: Thuc loi trc khun cĩ kích thưc rt dài, liên kt vi nhau to thành chui, gram (+). Chúng khơng cĩ kh năng di đng Chúng cĩ kh năng lên men đưc các loi đưng như glucose, lactose, galactose, fructose Chúng khơng cĩ kh năng to ra nitrit t nitrate. Hình 1.5. L.bulgaricus [52] Lactobaciilus acidophilus: Thuc loi trc khun gram (+) di đng Kích thưc: rng 0,6 – 0,9 Trong thiên nhiên chúng tn ti riêng l. Đơi khi cũng to thành chui ngn. Cĩ kh năng lên men mt s loi đưng như glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose, saccharose đ to thành axit lactic. Hình 1.6. L.acidophilus [52] Chúng khơng cĩ kh năng lên men mt s loi đưng như xylose, arabinose, rhamnose, glycerol, mantitol, sorbitol, dulcitol, inositol. Nhit đ phát trin ti ưu là 45 – 50 oC. Streptococcus lactic: Cĩ dng hình cu, dng chui Nhit đ thích hp phát trin: 30 oC Chúng lên men đưc các loi đưng như: glucose, maltose, rhamnose, lactose. Hình 1.7. Streptococcus lactic [52] 1.3. ng dng ca axit lactic 1.3.1. Trong cơng ngh thc phm Vi khun lactic cĩ nhiu trong thiên nhiên, do đĩ chúng rt gn gũi vi nhng hot đng sng ca con ngưi, trong đĩ phn ln là trong ngành ch bin thc phm.
23. 14 ng dng vi khun lactic đ len men sa chua: nhiu loi vi khun lactic đưc đưa vào quá trình sn xut sa chua. S lên men lactic trong quá trình sn xut va tăng giá tr dinh dưng va cĩ tính cht cha bnh đưng rut giúp ăn ngon ming, d tiêu hĩa va cĩ tác dng bo qun lâu hơn sn phm sa khi b hư hng. ng dng đ sn xut dưa chua: mui chua rau qu là mt quá trình hot đng ca vi khun lactic và vi khun axetic. Trong rau qu, vi khun s phát trin to axit lactic và axit axetic cùng vi mt s cht hu cơ khác. Các axit hu cơ này làm gim pH ca dch, chng li s phát trin ca các vi sinh vt gây thi làm hư thi rau qu. Bên cnh đĩ, nh cĩ lưng axit hu cơ to thành s làm tăng hương v ca khi chua rau qu, đng thi gi đưc màu t nhiên và bo đm đưc cht lưng ca sn phm chua. Vì vy, cũng như sn xut sa chua, mui chua rau qu là quá trình va mang ý nghĩa ch bin va mang ý nghĩa bo qun. ng dng trong sn xut tương: sn xut tương theo phương pháp ca ngưi min Bc (Vit Nam) cĩ giai đon ng nưc đu sau khi rang. Quá trình ng nưc đu này cĩ nhiu phn ng sinh hĩa khác nhau xy ra, trong đĩ cĩ quá trình lên men lactic to pH thích hp cho sn phm và làm tăng hương v cho sn phm. ng dng sn xut đu ph: giai đon kt ta protein ca đu trong quá trình sn xut đu ph theo phương pháp truyn thng thưng dùng nưc dưa chua (cĩ vi khun lactic) đ to kt ta nh pH gim đn đim đng đin ca protein đu nành. ng dng đ sn xut các sn phm lên men t sa: các sn phm sa cĩ s dng lên men lactic thơng thưng là: sa chua ung, sa chua ăn, phomat, bơ Các qúa trình bin đi và chuyn hĩa trong sn xut đu làm cho sn phm thêm giàu dinh dưng và to cho sn phm cĩ hương v đc trưng. ng dng đ thc ăn cho gia súc: v nguyên tc trên các loi c, lá cây cĩ cha các cht dinh dưng phù hp vi vi khun lactic nên khi tin hành các loi c, lá cây thì khi này tr nên chua và gi đưc màu sc hương v ca cây, lá. Quá trình chua này cũng gĩp phn bo qun thc ăn cho gia súc [5], [8], [15].
24. 15 1.3.2. Trong y hc ng dng vi khun lactic đ cha bnh đưng rut: nưc Pháp đã sn xut và đưa ra th trưng hàng chc năm nay mt sn phm mang tên biolactyl . Sn phm này chuyên tr tiêu chy bng mt nhĩm nhiu vi khun lactic. Hình 1.8. Thuc Biolactyl [50] ng dng axit lactic theo phương pháp vi lưng đng cân (homeopathy): trong quá trình vn đng ca cơ th, mơ cơ hot đng mnh và trong mt thi gian dài s gây ra hin tưng mt mi. Hin tưng mt mi này do các phn ng sinh hĩa xy ra trong mơ cơ, to axit lactic. Các thy thuc đã to ra mt v thuc bao gm axit lactic kt hp vi cây kim sa cĩ kh năng giúp cơ th khơng cịn mt mi và cĩ kh năng làm vic trong thi gian dài. ng dng axit lactic trong phu thut chnh hình, ngưi ta thưng s dng loi vt liu cĩ tên là purasorb. Purasorb là mt hp cht cao phân t đưc sn xut t axit lactic. Purasorb đưc s dng như nhng đinh gim, gn phn xương li vi nhau; khi xương đnh hình, purasorb s t tiêu hy. ng dng axit lactic trong nha khoa: Trong nha khoa cĩ hai ch phm đưc s dng nhiu đĩ là puramex và puracal. Puramex gm các thành phn như amulinium lactac, Felactac, Mglactac, Mnlactac, Znlactac; puracal ch cĩ canxi lactac. Các ch phm này thưng làm răng khe hơn. ng dng trong sn xut vt liu sinh hc (biomaterials): các nhà khoa hc đang nghiên cu to ra nhng vt liu sinh hc dùng trong y hc bng các copolymer ca axit lactic. Các copolymer này cĩ tính năng rt ging nhng b khung xương đng vt. Hưng này đang đưc nghiên cu và trong tương lai nĩ s đưc ng dng nhiu.
25. 16 ng dng trong sn xut các loi sa bt giàu canxi: B sung lactac canxi vào thành phn sa bt dinh dưng, bánh ngt, bánh nưng đ tăng lưng canxi cho cơ th. [8], [15]. 1.3.3. ng dng trong cơng ngh vt liu Cht do trong tương lai: ngưi ta đã nghiên cu nhng cht do mi thay th cho cht do cũ khĩ b phân hy. Cht do mi này là mt loi polymer cĩ tên gi là axit polylactic (PLA). Đĩ là sn phm đưc to ra nhiu loi vt liu ng dng trong nhiu ngành cơng nghip khác nhau như: cơng nghip dt, cơng nghip thuc da, cơng nghip bao bì Nhng vt liu này sau khi vt b chúng s b phân hy bi vi sinh vt, khơng gây ơ nhim mơi trưng [13], [16], [17]. 1.3.4. ng dng trong m phm Các loi lactate kim loi đưc s dng trong thành phn ca mt s m phm chăm sĩc da như punosal ca hãng m phm Punac. M phm này cĩ tác dng chng li các vi sinh vt cĩ trên b mt da, làm m và sang da [8], [18]. 1.4. Tình hình nghiên cu axit lactic trên th gii Axit lactic đưc các nhà nghiên cu nưc ngồi quan tâm khá nhiu, nhưng ch yu tp trung ng dng ca axit này trong cơng nghip thc phm, trong nơng nghip và lâm nghip, trong y t và y hc. Năm 1780 nhà bác hc Thy Đin Scheele ln đu tiên đã tách đưc axit lactic t sa bị lên men chua. Năm 1857 Pasteur đã chng minh đưc lên men sa là do nhĩm vi khun lactic [1]. Năm 1878 , Joseph Lister (1827 – 1912) đã phân lp thành cơng vi khun lactic đt tên là Bacterium lactic nay gi là Streptococcus lactic [13]. Sau đĩ cĩ nhiu nhà nghiên cu trên th gii đã nghiên cu và kho sát lên men sn xut axit lactic t nhiu ngun nguyên liu khác nhau. Vi khun lên men ch yu t ngun cacbon chính là dch đưng, t mt s nguyên liu cĩ kh năng chuyn bin thành đưng. Năm 2001, Hassan K. Sreenath, AnaB.Moldes, RichardG. Koegel & Richard J. Straub, Sn xut axit lactic t cht thi nơng nghip [36]. Năm 2003, Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi & Toshinori Kimura, Sn xut axit lactic t cht thi thc phm như bã da (t da
26. 17 đĩng hp) và bã nho (t sn xut vang nho) [39]. Năm 2006, Walaiporn Timbuntam Klanarong Sriroth, Yutaka T okiwa, nghiên cu sn xut axit lactic t nưc mía bi lactobacillus sp . Năm 2007, Buenaventurada P. Calabia Yutaka Tokiwa, Sn xut D axit lactic t r đưng, nưc mía và nưc ép c ci đưng ca Lactobacillus delbrueckii [16]. Năm 2007, Sarote Sirisansaneeyakul Tiyaporn Luangpipat Wirat Vanichsriratana Thongchai Srinophakun Henry HoHsien Chen Yusuf Chisti, Ti ưu hĩa sn xut axit lactic bng cách c đnh lacbacillus lactic IO1 [33]. Năm 2007, Se´ bastien Givry Vincent Prevot Francis Duchiron, sn xut axit lactic t thy phân hemicenllulo bi các t bào ca Lactobacillus bifermentans c đnh trong Alginat Ca bng cách s dng phương pháp phn ng b mt [22]. Hu ht các đ tài nghiên cu đu tp trung sn xut axit lactic t nhiu ngun nguyên liu khác nhau. Nhưng chưa cĩ đ tài nào dùng tinh bt t ht mít đ lên men lactic. 1.5. Tình hình nghiên cu axit lactic trong nưc Ti Vit Nam, vic s dng axit lactic vào nhiu ngành cơng nghip khác nhau và ngun axit lactic ch yu thu nhp t nưc ngồi vi giá thành khá cao. S quan tâm ca các nhà khoa hc trong nưc v lên men sn xut axit lactic ch yu t ngun nguyên liu chính là r đưng. Tháng 1 năm 2010, PGS.TS. Lê Thanh Mai, nghim thu đ tài cp b “sn xut axit lactic t r đưng”, trưng Đi Hc Bách Khoa Hà Ni [49]. Tuy nhiên, vic s dng ht mít làm nguyên liu cho quá trình lên men lactic thì chưa đưc nghiên cu. Tuy vy, ht mít đưc quan tâm và nghiên cu mt s Trưng Đi Hc tuy khơng nhiu. Năm 2009, ti trưng Đi Hc Bách Khoa Thành Ph H Chí Minh, Nguyn Minh Hin, Nguyn Thúy Hương, Nghiên cu quá trình thy phân tinh bt ht mít bng enzyme Termamyl 120L và AMG 300L đ lên men rưu chưng ct [42]. Như vy, vic s dng axit lactic hin nay nưc ta rt nhiu, trong khi đĩ quá trình lên men sn xut axit lactic thì cịn hn ch. Hơn na, các ngun nguyên
27. 18 liu khác nhau đ cĩ th lên men axit lactic thì khá phong phú như r đưng, đưng c ci, nưc mía, các ph phm cơng nghip khác Nhưng nghiên cu lên men thu nhn axit lactic t tinh bt ht mít thì chưa đưc các nhà khoa hc quan tâm, ht mít li là mt ngun ph phm trong cơng ngh sn xut các sn phm thc phm t qu mít, chính vì vy mà chúng tơi đã mnh dn đ cp đn vic nghiên cu lên men axit lactic t tinh bt ht mít. 1.6. Các yu t nh hưng đn tng hp axit lactic t vi sinh vt 1.6.1. nh hưng ca ngun dinh dưng 1.6.1.1. Ngun cacbon Ngun cacbon cĩ ý nghĩa hàng đu trong s sng sinh vt, thc ăn ch yu cùa vi sinh vt hyđrocacbon. Trao đi, chuyn hĩa hyđrocacbon đáp ng ba nhu cu ca t bào: sn sinh ra năng lưng, to ra nhng tin cht, to ra các quá trình oxy hĩakh đ bin đi nhng tin cht thành các sn phm trung gian hoc sn phm cui cùng dùng đ xây dng t bào, đng thi tích t trong mơi trưng mt hoc mt vài sn phm sinh tng hp tha [1], [3]. 1.6.1.2. nh hưng ca ngun nitơ Nitơ là nguyên t quan trng trong t bào. Vi sinh vt cũng như các cơ th sng khác đu cn nitơ trong quá trình sng đ xây dng t bào. Chúng gĩp phn to nên nhĩm amin (_NH 2) và nhĩm imin (_NH_) trong các phân t axit amin cu to nên protein, các vịng purine và pyrimidine, trong nhiu vitamin và trong mt s hp cht khác cĩ trong nguyên sinh cht ca t bào. Vic chn ngun nitơ là rt cn thit đ đm bo đưc hiu sut sinh tng hp cao và cĩ li v mt kinh t [1], [3]. 1.6.1.3. nh hưng ca photphat vơ cơ Tt c các hot đng ca t bào đu cn năng lưng, ngun năng lưng đưc tích tr ch yu các liên kt cao năng vi gc phosphat. Vì th các gc này cĩ vai trị quan trng trong quá trình chuyn hĩa năng lưng ca h thng sinh hc t bào [1], [3].
28. 19 1.6.1.4. nh hưng ca ngun mui khống Mơi trưng tng hp địi hi phi b sung các nguyên t khống cn thit. Nhu cu ca các nhĩm vi sinh vt khác nhau thì khác nhau v nguyên t khống hoc nguyên t vi lưng. Nguyên t vi lưng đĩng vai trị rt quan trng vì chúng cĩ chc năng giúp cho mt s enzyme hot đng trong quá trình trao đi cht ca t bào. Nu trong mơi trưng thiu mt s nguyên t vi lưng vi sinh vt s khơng phát trin bình thưng, d dn đn cht t bào hoc cĩ s phát trin bt thưng [1], [3], [4]. 1.6.2. nh hưng ca điu kin nuơi cy Sinh trưng và trao đi cht ca chúng nghiên cu liên quan cht ch đn hàng lot các yu t khác nhau, tác đng qua li vi nhau và vi mơi trưng bên ngồi. nh hưng ca các yu t bên ngồi thưng th hin dưi dng thích hp hay khơng thích hp cho hot đng ca t bào và các enzyme trong chui trao đi cht [1], [3]. 1.6.2.1. nh hưng ca nhit đ Hot đng trao đi cht ca vi sinh vt cĩ th coi là kt qu ca các phn ng hĩa hc. Vì các phn ng này ph thuc cht ch vào nhit đ nên yu t nhit đ rõ ràng nh hưng sâu sc đn các quá trình sng ca t bào. T bào thu đưc nhit ch yu t mơi trưng bên ngồi, mt phn cũng do cơ th thi ra, do kt qu ca hot đng trao đi cht. Vn đ đáng lưu ý là cùng mt lồi vi sinh vt, tùy theo quá trình sinh lý khác nhau mà địi hi nhng nhit ti thích khác nhau. Hu ht t bào sinh dưng b c ch nhit đ cao do protein b bin tính, mt hoc hàng lot enzyme b mt bt hot, ngưc li nhit đ thp cĩ th làm bt hot quá trình vn chuyn các cht qua màng t bào do nh hưng đn cu hình ca enzyme [1], [3]. 1.6.2.2. nh hưng ca pH Vi sinh vt sng và phát trin trong các mơi trưng lng chu nh hưng trc tip hoc gián tip ca các ion H + và OH do các phân t nưc phân ly ra. Trong
29. 20 các dung dch thưng xuyên cĩ ion H + t do. Nng đ H+ trong mơi trưng dinh dưng cĩ nh hưng ln đn s trao đi cht và phát trin ca vi sinh vt. pH ca mơi trưng cĩ nh hưng rt ln đn s phát trin và kh năng sinh tng hp ca vi sinh vt. S nh hưng ca pH đn vi sinh vt mt cách khơng ging nhau. Cĩ nhng pH mà đĩ vi sinh vt vn phát trin bình thưng, nhưng các sn phm to thành ít hoc hồn tồn khơng to thành [1], [3], [4]. 1.7. Ht mít 1.7.1. Đc đim và thành phn ca ht mít Cây mít cĩ tên khoa hc là: Artocarpus heterophyllus Lam . H khoa hc: Moraceae . Đây là mt loi cây ăn qu đưc trng vùng nhit đi hoc cn nhit đi. Cây mít khơng th phát trin vùng cĩ khí hu lnh Mt s điu kin v khí hu th nhưng ca cây mít: Đ cao: t mc nưc bin – 1600m Hình 1.9. Cây mít [51] . Lưng mưa: 1000 – 2400mm Nhit đ: 24 – 28 oC Đt đai: đ sâu ca tng canh tác 25cm, bán kính 2.25m, đ pH 5÷7.5. Mt cây mít trưng thành mi v cĩ th cho t 200 – 300 qu, khi lưng mi qu trung bình khong 2–5 kg (các giá tr trên khác nhau tùy theo ging lồi và tng khu vc). Ht mít đưc coi là ph ph phm trong qu mít, ht mít chim khong 10 – 15% tng khi lưng ca trái mít. Hình 1.10. Ht mít [45] .
30. 21 Ht mít đưc cha bên trong múi mít và đưc bao bc trong mt lp v mng màu trng. Ht mít tươi thưng cĩ màu nâu sáng cho đn nâu, cĩ hình bu dc hoc hình trịn. Chiu dài ht khong 2 – 3 cm (0.8 – 1.2 inch), đưng kính khong 1.0 – 1.5cm (0.4 – 0.6 inch). Trung bình trong mt qu mít cĩ 100 – 500 ht. Ht mít cĩ th bo qun trong thi gian mt tháng nu đưc bo qun trong điu kin lnh và m [19]. Bng 1.2. Thành phn hĩa hc ca ht mít [38]. % (tính theo vt cht khơ) Ch tiêu Chưa loi lp v nâu Đã loi lp v nâu Singh et al (1991) Đ m 7.70 ± 0.20 8.57 ± 0.25 5.1 Protein thơ (%N*5.7) 11.02 ± 0.46 11.17 ± 0.21 17.2 Lipid thơ 1.01 ± 0.12 0.99 ± 0.08 2.2 Xơ thơ 2.36 ± 0.04 1.67 ± 0.11 3.06 Tro 3.97 ± 0.04 3.92 ± 0.03 3.6 Carbonhydrat tng s (a) 81.64 82.25 74 Hàm lưng tinh bt 77.76 ± 0.96 Amylose ca tinh bt 32.05 ± 1.20 Protein ca tinh bt 1.84 pH 5.68 Kh năng hp th nưc 205 141 Kh năng hp th du 92.6 90.2
31. 22 1.7.2. Tinh bt ht mít T bng 1.2, tơi thy hàm lưng tinh bt trong ht mít đt ti 77.76 ±0.96% so vi tng s hàm lưng cht khơ cĩ trong ht. Dưi kính hin vi đin t quét (SEM), và kính hin vi quang dưi ánh sáng bình thưng cho thy các ht tinh bt cĩ hình trịn và hình vuơng là chim ưu th (hình 1.11). [19]. Hình 1.11. Hình chp cu hình phân t tinh bt ht mít [19]
32. 23 Chương 2. ĐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Đi tưng nghiên cu 2.1.1. Ht mít Ht mít đưc thu mua ti mt s cơ s bĩc múi mít cung cp cho Cơng ty Vianamit ti th xã Buơn H, huyn Krơngbuk, tnh Daklak. 2.1.2. Enzyme thy phân Tinh bt ht mít đưc thy phân bi 2 loi ch phm enzyme: αamylaza và γamylaza .Ch phm enzyme αamylaza do hãng Novozymes Đan Mch sn xut. Cịn ch phm γamylaza do Genencor Bioproducts Co.Ltd, China sn xut. Ch phm αamylaza cĩ dng lng màu nâu đm, khơng cĩ mùi, nhit đ ti thích t 90 ÷105 oC, pH ti thích t 4,5÷5. Ch phm enzyme γamylaza cũng cĩ dng lng, màu o nâu đen, cĩ mùi ht khĩ chu, pH opt=3,5 – 5, t opt= 50 – 60 C. 2.1.3. Vi khun lactic Vi khun lactobacillus casei đưc ly t cơng ty Nanogen Biopharma, thành ph H Chí Minh. Chng dng đơng khơ nên cn phi hot hố li trưc khi s dng. Chúng tơi bo qun chng vi khun này điu kin 05oC trong sut thi gian nghiên cu. 2.1.4. Thit b, dng c và hĩa cht trong quá trình nghiên cu Thit b: T sy: dùng đ sy nguyên liu và dng c Máy so màu Hình 2.1. Máy so màu hiu JENWAY 6305 Hình 2.2. T sy nguyên liu
33. 24 Mt s thit b thơng dng khác như: T cy Laminar; Ni hp thanh trùng Hirayama HVE50; Cân đin t Excell; T m Memmert; Máy lc Edmund Buhler Gmbtt (ph lc 2.1) Dng c, vt liu dùng trong thc nghim (ph lc 2.2) Hĩa cht: S dng các hĩa cht trong phịng thí nghim Trưng Đi hc Bách Khoa Đà Nng và mt s hĩa cht liên quan mua ti Đà Nng và TP. H Chí Minh (ph luc 1.1 và 1.2) 2.2. Phương pháp nghiên cu 2.2.1. Phương pháp hĩa hc 2.2.1.1. Xác đnh hàm lưng tinh bt theo phương pháp thy phân nh axit [6] Nguyên tc: Thy phân tinh bt thành đưng bi dung dch HCl 2% điu kin đun sơi trong bình cách thy vi thi gian là 2 gi. Dch đã thy phân đưc làm ngui và trung hịa bng NaOH vi ch th metyl da cam. Hàm lưng đưng trong dung dch đưc xác đnh theo các phương pháp Graxianop (đưc trình bày mc 2.2.1.2 bên dưi). T hàm lưng đưng đnh lưng đưc, áp dng cơng thc đ xác đnh hàm lưng tinh bt ca ht mít, xem ph lc 3.1 và 3.2 2.2.1.2. Xác đnh hàm lưng đưng kh bng phương pháp Graxianop [6] Nguyên tc: Da vào phn ng 2K 3Fe(CN) 6 + 2KOH 2K 4Fe(CN) 6 +H 2O + O Tip theo oxi hĩa đưng đ to thành axit đưng CH 2CH(CHOH) 4 + O COOH(CHOH) 4COOH Phn ng tng quát là: 4K 3Fe(CN) 6 + 4KOH + CH 2CH(CHOH) 6CHO 4K 4Fe(CN) 6+ COOH(CHOH) 4COOH + 2H 2O 2.2.1.3. Xác đnh hàm lưng axit lactic bng phương pháp hĩa hc [12] Nguyên lý Oxy hĩa axit lactic bng đng sunfat, mơi trung axit sunfuric thành acetaldehyd. Acetaldehyd kt hp vi paraoxydiphenyl vi s cĩ mt ca ion Cu 2+ , cho màu tím cĩ th đnh lưng bng phương pháp so màu trên máy so màu.
34. 25 Dng c, vt liu và thuc th: Máy so màu Dung dch CuSO 4 4% Axit sunfuric đm đc Axit sunfuric 10% Dung dch chì axetat basic: + Chì axetat Pb(CH3COO) 2 300gam + Chì oxyt (bt) 100gam + Nưc ct 700gam Nghin nát chì axetat, cho vào chu s vi chì oxyt và nưc ct, khuy cho đn khi tan hồn tồn. Lc và bo qun trong chai nút kín. Dung dch para oxydiphenyl 0,75% + Para oxydiphenyl 0,75gam + NaOH 2% va đ 100ml Cách tin hành và tính tốn theo ph lc 3.5. 2.2.1.4. Xác đnh hàm lưng đưng kh bng phương pháp so màu s dng acid dinitro salicylic (DNS) [6]. Mc đích: Nhm kim tra và điu chnh nng đ dch đưng sau thy phân đ thun li cho quá trình lên men. Nguyên tc: Da trên phn ng to màu gia đưng kh vi thuc th axit dinitrosalicylic DNS. Cưng đ màu ca hn hp phn ng t l thun vi nng đ dch đưng kh trong phm vi nht đnh. Da trên đ th đưng chun đi vi glucoza tinh khit tính đưc hàm lưng đưng kh trong mu phân tích. Phương pháp tin hành đưc th hin ph lc 3.6 2.2.1.5. Xác đnh hot lc ca α amilaza theo Rukhliadeva [6] Nguyên tc: Phương pháp da trên cơ s thy phân tinh bt bi enzyme cĩ trong dch ch phm nghiên cu ti các dextrin cĩ phân t lưng khác nhau. Đo cưng đ màu to thành gia tinh bt và các sn phm thy phân ca nĩ vi iot bng máy so màu quang đin s tính đưc hot đ enzyme.
35. 26 Đơn v hot đ enzyme α amilaza là lưng enzyme chuyn hĩa đưc mt gam tinh bt tan thành các dextrin cĩ phân t lưng khác nhau 30 oC trong thi gian mt gi (pH cho amilaza ca malt là 4.8 – 4.9, ca nm mc là 4.7, ca vi khun là 6.0 ). Cách tin hành xem ph lc 3.3 2.2.1.6. Xác đnh hot lc ca γamilaza theo phương pháp vi lưng ca V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6] Nguyên tc: Phương pháp da trên cơ s thy phân tinh bt bi enzyme γ amilaza cĩ trong ch phm nghiên cu. Xác đnh lưng glucoza to thành s tính đưc hot đ enzyme. Đơn v hot đ γamilaza là lưng enzyme tác dng lên dung dch tinh bt tan pH= 4,7 nhit đ 30 oC trong thi gian mt gi gii phĩng đưc 1mg glucoza. Cách tin hành xem ph lc 3.4 2.2.2. Phương pháp cơng ngh 2.2.2.1. X lí ht mít và sn xut bt ht mít Ht mít đưc thu nhn t nhiu cơ s sn xut nh l. Quá trình x lý và thu nhn bt ht mít đưc trình bày như quy trình bên dưi. Ht mít thu nhn v đưc tách các hp cht hu cơ như xơ, v, ci mít và ra sch, phơi ráo đ thun li cho quá trình tách lp v cng bên ngồi. Dùng dao đ tách sch lp v cng. Sau đĩ bĩc lp v màu nâu mng bao quanh ht, vì chính lp v này nh hưng đn màu sc ca bt ht mít. Trong quá trình nghiên cu, chúng tơi s dng NaOH vi các nng đ nghiên cu khác nhau đ tách lp v màu nâu đng thi khơng lưu li mùi xút (mùi đc trưng ca NaOH) trong bt ht mít thành phm. Tip đn là thái mng ht mít đ rút ngn thi gian sy khơ. Nhng ming hat mít tươi này sy liên tc nhit đ 55 60 oC t 60 đn 72gi. Cui cùng là xay bt đáp ng cho quá trình nghiên cu sau này.
36. 27 Ht mít Làm sch và làm ráo Tách lp v cng bên ngồi Tách v nâu Ra sch và làm nh Sy khơ Xay bt 2.2.2.2. Phương pháp thy phân tinh bt ht mít bng ch phm enzyme αamylaza và γamylaza Quá trình thy phân tinh bt ht mít đưc thc hin nh hai loi ch phm enzyme αamylaza và γ – amylaza [42]. Bt ht mít trưc lúc dch hĩa đưc h hĩa pH = 5 5.5, nhit đ 95 oC trong b n nhit. Trong quá trình dch hĩa bng ch phm enzyme αamylaza, tinh bt ht mít đưc chuyn hĩa thành maltoza, mt ít đưng glucoza và ch yu là các dextrin. Sau đĩ chúng tơi tin hành đưng hĩa bi ch phm enzyme γ – amylaza đ cui cùng thu nhn sn phm là dch đưng đáp ng cho quá trình lên men lactic. Trên cơ s nghiên cu lý thuyt và tha k kt qu nghiên cu ca Nguyn Minh Hin, Nguyn Thúy Hương (Trưng ĐH Bách khoa TP.HCM) [42], tác gi đã s dng ch phm enzyme αamylaza ca hãng Novozymes Đan Mch sn xut vi t l 0,1% đ dch hĩa tinh bt và 0,12% ch phm enzyme γ – amylaza cũng do hãng này sn xut cho quá trình đưng hĩa. Trong nghiên cu này, chúng tơi s dng ch phm γamylaza do Genencor Bioproducts Co.Ltd, China sn xut nên t l ch phm enzyme s dng cn phi đưc nghiên cu thêm. Chính vì th mà chúng tơi đã đ xut quy trình thy phân như sau:
37. 28 Bt ht mít đem hịa nưc H hĩa to = 95 oC, T = 45 phút, điu chnh v pH=5,56 B sung ch phm αamylaza, t l 0,1% Nâng nhit đ lên 95 oC và gi 120 phút H to = 60 oC và điu chnh pH = 4,25 B sung ch phm γ – amylaza, t l t 0,12 0,2 % Gi 60 oC, T = 175180 phút đây chúng tơi s c đnh các điu kin dch hĩa bi ch phm αamylaza và ch kho sát hàm lưng ch phm γ – amylaza b sung trong quá trình đưng hĩa sao cho hiu sut thy phân là cao nht. 2.2.2.3. Mơi trưng lên men lactic [34] Bng 2.1. Thành phn mơi trưng lên men axit lactic (Fer) [34]. Thành phn Gam/lít Ngun cung cp Cao nm men 8,0 Merck, Đc K2HPO 4 0,5 Merck, Đc KH 2PO 4 0,5 Merck, Đc CH 3COONa.3H 2O 1,0 Merck, Đc MgSO 4.7H 2O 0,6 Merck, Đc MnSO 4.4H 2O 0,03 Merck, Đc Dch đưng va đ 1000ml Mơi trưng lên men lactic trong nghiên cu này là dch đưng ca quá trình thy phân t tinh bt ht mít vi nng đ kho sát phi trn vi mơi trưng riêng l thích hp vi nhau.
38. 29 Sau khi phi trn tt c các thành phn, tin hành hiu chnh pH mơi trưng bng H 2SO 4 20% và NaOH 5N [34] đ đưa pH v giá tr cn cho quá trình lên men. Hp tit trùng dch lên men nhit đ 121 oC trong thi gian 20 phút. 2.2.2.4. Phương pháp lên men lactic Ging vi khun sau khi nuơi cy đt yêu cu, kim tra và kho sát theo các điu kin thích hp. Dch đưng sau khi xác đnh nng đ và b sung mt s thành phn khác. Tin hành hp thanh trùng nhit đ 121 oC trong 20 phút. Chuyn ging t mơi trưng nuơi cy sang mơi trưng lên men theo t l xác đnh trong quá trình kho sát. 2.2.3. Phương pháp vi sinh vt 2.2.3.1. Phương pháp hot hĩa vi khun Mơi trưng đ nuơi cy vi khun lactobacillus casei là mơi trưng MRS agar ca Merck, Đc. Đây là mơi trưng cĩ pha ch sn và cĩ thành phn như sau: [14], [29]. Bng 2.2. Thành phn mơi trưng MRS Agar Thành phn Gam/lít Peptone 10,0 Cao tht 8,0 Cao nm men 4,0 Glucose 20,0 K2HPO 4 2,0 CH 3COONa.3H2O 5,0 Triamonium citrate 2,0 MgSO 4.7H2O 0,2 MnSO 4.4H2O 0,05 Agar 10,0 Sorbitan monooleate (C 24 H44 O6) 1ml pH = 6,2 ±0,2
39. 30 Chng vi khun lactobacillus casei dng đơng khơ, hot hĩa mơi trưng trên theo các bưc sau: Dùng que cy ly mt lưng va phi chng đơng khơ cho vào l đng 10ml nưc mui sinh lý đã qua hp tit trùng, khuy tan đu. Chun b mơi trưng MRS đã hp tit trùng, đ đu trên 5 đĩa petri, làm ngui. Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dch khun trên cho vào đĩa petri, sau đĩ dùng que trang trang đu trên b mt thch. Nuơi cy trong thi gian 48h, n đnh nhit đ 30 oC trong t bo ơn. 2.2.3.2. Phương pháp xác đnh gián tip s lưng t bào bng cách đm các khun lc phát trin trên mơi trưng thch [5] Nguyên tc: Mt t bào cĩ th phân chia theo cp s nhân cho đn khi hình thành mt khun lc cĩ th trơng thy đưc. Đây là cơ s ca vic đnh lưng t bào trên đĩa thch, bi s lưng khun lc sinh ra t mt th tích ging vi sinh vt nht đnh ch s lưng t bào sng cĩ trong th tích ging đĩ. Thơng thưng, tt c các t bào phase tăng trưng hay phase n đnh đu cĩ kh năng hình thành khun lc. Vì vy, s lưng khun lc đm đưc gn như tương đương vi s lưng t bào sng. Đ đnh lưng chính xác, cn phi thc hin sao cho mi mt khun lc ch đưc hình thành t mt t bào. Do dch t bào s dng trong phịng thí nghim thưng cĩ nng đ cao, thưng nhiu hơn 10 6 t bào/ml, nên cn thit phi đưc pha lỗng trưc khi cy. Phương pháp chun là thc hin các bưc pha lỗng đ gim nng đ t bào t 10 đn 100 ln cho đn khi đt vài nghìn t bào/ml. Cách tin hành đưc th hin ph lc 3.8. 2.2.3.3. Phương pháp chuyn ging sang mơi trưng lên men Ging phi đưc hot hĩa trưc khi lên men đ n đnh trng thái sinh lý, tin hành nhân ging theo các cp, th tích cp sau ln hơn cp trưc khong 10 ln [1], [10]. Trong lên men cơng nghip vic rút ngn thi gian lên men là cn thit, do đĩ mơi trưng nhân ging đưc thit k cĩ thành phn ging mơi trưng lên men nhm to điu kin thích nghi cho chng nghiên cu và gim thi gian lên men.
40. 31 Mt đ ging cy phi đưc xác đnh trưc khi thc hin vic lên men thơng qua phương pháp xác đnh gián tip mt đ t tào bng cách đo OD 620nm [39]. Trong qúa trình nhân ging và lên men phi theo dõi tính thun khit ca ging cy, tránh tình trng b tp nhim vi sinh vt l gây nh hưng đn hiu sut lên men và làm sai lch kt qu kho sát. 2.2.4. Phương pháp tốn hc Áp dng quy hoch thc nghim đ kho sát nh hưng ca các yu t nh hưng đn quá trình lên men và ti ưu hĩa hàm mt mc tiêu hai yu t [2].
41. 32 CHƯƠNG 3. KT QU VÀ THO LUN 3.1. Kho sát đc đim ca các nguyên liu trong nghiên cu 3.1.1. Bt ht mít 3.1.1.1. X lí và thu nhn bt ht mít Theo quy trình đã trình bày mc 2.2.2.1 , chúng tơi đã tin hành x lý và thu nhn bt ht mít. Theo quy trình này, v cng đưc tách bng phương pháp cơ hc, cịn v nâu thì s dng NaOH. Đ tìm ra nng đ xút thích hp cho vic tách v nâu, chúng tơi đã tin hành ngâm ht mít trong dung dch NaOH cĩ nng đ: 1%, 2%, 3% và 4% trong khong thi gian t 3 5 phút. Kt qu kho sát đưc trình bày bng 3.1. Bng 3.1. nh hưng ca nng đ xút đn quá trình tách lp v nâu ht mít STT NaOH, % Kt qu 1 1 Lp v nâu tách khơng ht, màu ca ht đm ti 2 2 Lp v nâu chưa tách ht trit đ, màu ca ht khơng đp, hơi vàng nâu 3 3 Đã tách sch lp v nâu ca ht, màu ca ht đp, trng 4 4 Đã tách sch lp v nâu ca ht, màu ca ht đp, trng Như vy, bt đu nng đ NaOH 3% là đã tách ht lp v nâu, ngâm li bng nưc lnh và ra sch đ khơng cịn lưu li mùi ca xút. nng đ xút càng cao thì lp v nâu cũng đưc tách sch, tuy nhiên v mt kinh t s khơng đt yêu cu và mùi ca xút cịn lưu li trên ht mít nh hưng đn cht lưng ca bt ht mít. Vì vy chúng tơi chn nng đ NaOH 3% đ tách sch lp v nâu ca ht mít. Sau khi tách xong v nâu, ht mít đưc thái nh, đ ráo, sy khơ, xay thành bt đ thun li cho quá trình nghiên cu. Nguyên liu sau khi sy khơ, đ kim tra dư lưng ca NaOH cịn trong ht mít vì mùi ca NaOH nh hưng đn cht lưng ca bt ht mít, chúng tơi tin hành kim nghim bng cách ngâm nưc ct tr li đn khi lát ht mít trương n,
42. 33 sau đĩ dùng quỳ tím và áp sát vào lát ht mít đng thi nhúng vào nưc ngâm. Kt qu cho thy, giy quỳ tím khơng đi màu. Như vy, qua thi gian ngâm ra và sy, NaOH khơng cịn lưu li trong mu ht mít. Hình 3.1. Bt ht mít thu nhn Bt ht mít thu nhn đưc cĩ màu trng đc, gn ging như màu ca bt ng cc, cĩ hương thơm đc trưng. 3.1.1.2. Xác đnh hàm lưng tinh bt ca ht mít Chúng tơi tin hành xác đnh hàm lưng tinh bt ca ht mít theo phương pháp thy phân bng axit như đã trình bày 2.2.1.1 . T đĩ tơi đnh lưng hàm lưng đưng kh to thành theo phương pháp Graxianop như đã trình bày mc 2.2.1.2, ph lc 3.1 và 3.2. Vi ht mít thu mua t các ngun nh l khác nhau thì kt qu tinh bt xác đnh đưc trình bày bng 3.2 Bng 3.2. Hàm lưng tinh bt ca ht mít S ln đo Ln 1 Ln 2 Ln 3 Ln 4 Trung bình KQ đo (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) Glucoza 0,5% 2,7 2,8 2,8 2,9 2,8 Dch đưng 2,5 2,4 2,3 2,4 2,4 a (gam) 0,014 Mbt, % 65,62
43. 34 Da vào kt qu thu đưc t thc nghim chúng tơi thy rng, hàm lưng tinh bt ca ht mít trung bình đt 65,62%. Trong khi đĩ, theo tài liu [13] thì hàm lưng tinh bt trong ht mít 77.76 ± 0.96%. Như vy nguyên liu kho sát cĩ hàm lưng tinh bt thp hơn so vi tài liu nghiên cu. Theo chúng tơi do nguyên liu thu mua ti mt s nơi x lí mít, thơng thưng do mít thu mua v đang giai đon già chín và cĩ th cịn non hoc mít ch đt đn đ chín thu hái, đây cũng chính là nguyên nhân làm cho hàm lưng tinh bt trong ht mít hình thành chưa nhiu. 3.1.2. Ch phm enzyme Trong quá trình thy phân tinh bt ht mít, chúng tơi s dng 2 loi ch phm enzyme như đã trình bày mc 2.2.2.2. Đ kho sát hiu qu ca quá trình thy phân cũng như đnh lưng đưc hàm lưng enzyme b sung, trưc khi thy phân tinh bt, chúng tơi xác đnh li hot lc ca ch phm enzyme ti thi đim nghiên cu. 3.1.2.1. Xác đnh hot lc ca ch phm enzyme αamylaza Chúng tơi tin hành thc nghim vi ch phm enzyme đưa v bng cách pha lỗng 10 ln. Da vào nguyên tc đã trình bày mc 2.2.1.5 và ph lc 3.3. Chúng tơi tin hành thc nghim và nhn thy: ng cha dung dch kim chng cĩ màu xanh, ng cha dung dch thí nghim cĩ màu tím. Đo cưng đ màu ca các dng dch bưc sĩng λ = 656nm so vi nưc ct, kt qu đưc trình bày bng 3.3. Bng 3.3. Kt qu đo OD ca dch kim chng và mu thí nghim Kt qu đo OD Mt đ quang Ln 1 Ln 2 Ln 3 Trung bình D1 0,145 0,145 0,145 0,145 D2 0,071 0,072 0,071 0,071 D − D T cơng thc tính: C = 1 2 *0,1 D1 Suy ra: C = 0,051
44. 35 Trong đĩ: D1 là mt đ quang đo đưc ca dung dch kim chng D2 là mt đ quang đo đưc ca dung dch thí nghim 0,1 là lưng tinh bt đem phân tích, gam. C: là lưng tinh bt đưc thy phân Vy hot lc ca ch phm enzyme αamylaza đưc tính như sau: C 5ml enzyme thy phân đưc 0,051g bt trong 10phút X1 ml enzyme 1g bt X1 = (5 x 1)/0,051 = 98,039 (ml enzyme) Trong 60 phút thì: X 2 = 98,039 x 6 = 588,235 ml enzyme Dch enzyme đưa v đưc pha lỗng 10 ln đ xác đnh hot lc, do đĩ: HdA = 588,235 x 10 = 5882,35 đơn v/ml Kt lun: T kt qu trên, trong sut quá trình nghiên cu, c theo đnh kỳ chúng tơi kim tra li hot lc ca ch phm enzyme này đ thun li cho vic kho sát hàm lưng enzyme b sung khi thy phân. 3.1.2.2. Xác đnh hot lc ca ch phm enzyme γ – amylaza Hot lc ca ch phm enzyme γ – amylaza đưc xác đnh theo phương pháp đã trình bày mc 2.2.1.6 và ph lc 3.4. Chúng tơi tin hành thc nghim và sau thc nghim, chúng tơi cĩ đưc kt qu như sau: Hot lc ca enzyme tính bng “đơn v/ml” đưc xác đnh như sau: a × K × 3,3 × 60 HdG = m ×10 a = a 2 – a1 * mc pha lỗng 10 ln: 3,4( − )6,0 ×1× 3,3 × 60 HdG = = 146,52 (đơn v/ml) 5,0 ×10 Vy, hot lc ca ch phm enzyme γ – amylaza đưc tính là: HđG = 146,52 *10 = 1465 đơn v/ml. Kt lun: Cũng tương t như ch phm enzyme αamylaza, chúng tơi xác đnh đưc hot lc ca ch phm γ – amylaza vi mc đích thun li cho sut quá trình nghiên cu. Vì trong thi gian nghiên cu, hot lc ca ch phm enzyme cĩ
45. 36 th b gim, nu vy chúng tơi thay ch phm mi sn xut khác hoc tăng hàm lưng ch phm enzyme b sung khi thy phân. 3.1.3. Vi khun lên men lactic Trong nghiên cu này chúng tơi s dng vi khun lactobacillus casei. Chng này đang dng đơng khơ nên chúng tơi tin hành hot hĩa chng. Sau khi hot hĩa, vi khun cĩ dng như hình 3.2, sau đĩ chúng tơi chn nhng đm khun cĩ màu trng sa, trịn đu và nhân ging các cp theo thi gian, bo qun nhit đ thp đ phc v cho nghiên cu. Hình 3.2. Vi khun L.casei sau khi hot hĩa 3.2. Nghiên cu quá trình thy phân tinh bt Theo quy trình đ xut mc 2.2.2.2, chúng tơi cân 30 gam bt ht mít hịa trong 100ml nưc, khuy đu và đun cách thy nhit đ sơi, thi gian 45 phút nhm h hĩa hồn tồn lưng bt cĩ trong dch bt. Đ dch hĩa, chúng tơi điu chnh pH v 5,5 – 6, đng thi b sung ch phm αamylaza vi t l 0,1% so vi lưng bt cĩ trong dch bt, h nhit đ xung đn 95 oC và gi trong b n nhit 120 phút. Sau khi kt thúc quá trình dch hĩa, đưa nhit đ xung 60 oC và điu chnh pH = 4,25, b sung ch phm γ – amylaza vi các t l khác nhau: 0,12%; 0,14%; 0,16%; 0,18% và 0,20%. Gi b n nhit trong thi gian 175 180 phút. Sau quá trình thy phân thì lc ly dch đưng và đnh lưng hàm lưng đưng kh to thành. Trong nghiên cu này chúng tơi s dng hai loi ch phm enzyme α amylaza và γ – amylaza đ thy phân tinh bt ht mít. Nhưng ch phm enzyme αamylaza ti thi đim nghiên cu cĩ ngun gc sn xut t hãng Novozyme, hồn tồn ging vi ch phm enzyme ca tác gi Nguyn Minh Hin, Nguyn
46. 37 Thúy Hương (Trưng ĐH Bách khoa TP.HCM) [42] mà chúng tơi tham kho và tha hưng nên chúng tơi khơng kho sát t l ch phm enzyme này b sung vào đ dch hĩa là bao nhiêu. Hơn na, ch phm γ – amylaza chúng tơi s dng do Genencor Bioproducts Co.Ltd, China sn xut, khơng cùng ngun gc xut x ca ch phm enzyme γ – amylaza như trong tài liu [42] nên chúng tơi tin hành kho sát lưng ch phm enzyme γ – amylaza b sung đ đưng hĩa tinh bt ht mít. Sn phm ca quá trình thy phân tinh bt ht mít là dch đưng kh. Đ đnh lưng hàm lưng đưng kh to thành chúng tơi s dng phương pháp DNS như đã trình bày mc 2.2.1.4 và ph lc 3.6. Trong phương pháp này, chúng tơi tin hành xây dng đưng chun đưng glucose. 3.2.1. Xây dng đưng chun đưng glucose Vi nguyên tc cơ bn đã trình bày mc 2.2.1.4 , chúng tơi tin hành đo OD các mc nng đ dch đưng chun (đưng glucose chun) khác nhau nhm xây dng đưc đưng chun và th hin hình 3.3. Hình 3.3. Đưng chun glucoza T đ th đưng chun, chúng tơi xác đnh hàm lưng đưng kh to thành các mc b sung ch phm enzyme γ – amylaza khác nhau như trình bày trên. Mc đích là đ tìm ra hàm lưng ch phm γ – amylaza thích hp cho quá trình đưng hố sao cho sau khi kt thúc quá trình thy phân thì lưng đưng kh to thành là cao nht.
47. 38 Tương t như vy, trong các ln lên men sau này, chúng tơi thc hin xây dng đưng chun và t đĩ điu chnh nng đ dch đưng sau thy phân đ thích hp cho tng m lên men khác nhau. 3.2.2. Kho sát hàm lưng ch phm γ – amylaza cn dùng Dch đưng sau thy phân, chúng tơi tin hành pha lỗng 100 ln và đo OD. Da vào đ th đưng chun mc 3.3, kt qu đưc th hin bng 3.4. Bng 3.4. Hàm lưng đưng kh to thành sau quá trình thy phân STT Lưng enzyme γ – Lưng đưng kh to Hiu sut amylaza b sung, % thành, gam/100ml thy phân,% 1 0,12 10,769 49,233 2 0,14 11,667 53,339 3 0, 16 14,000 64,005 4 0,18 20,000 91,436 5 0,20 15,556 71,119 Chú ý: cách tính hiu sut thy phân xem ph lc 5.2 Qua bng kt qu trên ta thy, ti thi đim kho sát, lưng ch phm enzyme γ – amylaza b sung càng tăng thì lưng dch đưng to thành càng cao. Khi hàm lưng enzyme là 0,18% dch bt thì lưng đưng to thành là cao nht, đng thi hiu sut thy phân đt đưc cũng cao nht (đ th ph lc 5.1). Nu tip tc tăng hàm lưng enzyme b sung, vì cĩ s cnh tranh gia enzyme và cơ cht nên lúc này hàm lưng đưng to thành gim dn. Chính vì vy, nhng nghiên cu tip theo tơi thy phân tinh bt bi 0,1% ch phm enzyme αamylaza và 0,18% ch phm enzyme γ – amylaza đ to dch đưng cho quá trình lên men lactic. Nhn xét: T kt qu thc nghim thu đưc, chúng tơi thy dưi s xúc tác ca hai loi ch phm enzyme trên, tinh bt ca ht mít đưc thy phân khá trit đ.
48. 39 Hình 3.4. Dch đưng sau thy phân Dch sau thy phân tin hành lc trên giy lc nhiu ln. Hàm lưng đưng thu đưc sau thy phân đ điu kin cho quá trình lên men lactic. T kt qu thu đưc, chúng tơi điu chnh nng đ dch đưng theo các mc khác nhau đ lên men. 3.3. Nghiên cu các yu t nh hưng đn qúa trình lên men lactic Trong quá trình lên men lactic, dưi s hot đng ca vi khun lactobacillus casei, chu s nh hưng ca nhiu yu t như nhit đ, nng đ dch đưng, hàm lưng vi khun b sung, thi gian lên men dch đưng b chuyn hĩa và sn phm to thành cui cùng ch yu là axit lactic, ngồi ra cĩ mt s sn phm ph khác như ethanol, axit acetic, CO 2, aceton. Chúng tơi tin hành thc hin quá trình lên men vi các điu kin và yu t kho sát khác nhau. Trưc khi kho sát quá trình lên men, chúng tơi chn phương pháp so màu s dng axit dinitrosalycilic (DNS), đưc trình bày mc 2.2.1.4 và mc 3.2 đ xác đnh và điu chnh nng đ ca dch đưng chun b lên men. Đng thi vi quá trình trên, chúng tơi chun b trưc dch vi khun đ kho sát đng thái sinh trưng và phát trin ca loi vi khun này nhm thun li cho quá trình lên men và rút ngn thi gian lên men. Dch đưng sau khi đã điu chnh v nng đ kho sát, chúng tơi tín hành b sung thành phn dinh dưng như đã trình bày mc 2.2.2.3. Tip đn là hp thanh trùng mơi trưng và lên men.
49. 40 Hình 3.5. Dch đưng đã kho sát nng đ trưc lúc lên men 3.3.1. Kho sát kh năng sinh trưng và phát trin ca vi khun lactobacillus casei Da vào nguyên tc đã trình bày mc 2.2.3.2. và ph lc 3.8, chúng tơi tin hành thc nghim như sau: Cho 100ml dch đưng cĩ nng đ 5% vào bình tam giác cĩ dung tích 250ml B sung thành phn mơi trưng lên men vào dch đưng trên như đã trình bày mc 2.2.2.3. Hp thanh trùng mơi trưng nhit đ 121 oC trong thi gian 20 phút. Làm ngui mơi trưng và tin hành cy vi khun lactibacillus casei trong điu kin vơ trùng. Nuơi nhit đ 37 oC trong 24 gi. Pha lỗng mơi trưng trên trong nưc ct đã hp vơ trùng bng cách s dng 7 ng nghim, mi ng cha 9ml nưc ct vơ khun và mt s ng hút 1ml đã hp tit khun. Mc đ pha lỗng khác nhau như sau: + Hút 1ml mu dch vi khun trên cho vào ng nghim th nht cha 9ml nưc ct, khuy đu. Ta cĩ mc đ pha lỗng lúc này là 10 1 ln + Tip tc hút 1ml ng nghim th nht cho vào ng nghim th hai cha 9ml nưc ct vơ khun. Trn đu và ta đưc đ pha lỗng là 10 2 + Tip tc chúng tơi làm tương t và cĩ các mc đ pha lỗng khác nhau như sau: 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, 10 7 mi đ pha lỗng phi khuy đu và lc k. Tương ng vi mi đ pha lỗng, tin hành gieo cy vào hp petri theo trình t như sau:
50. 41 + Dùng hp petri đã vơ khun chưa cĩ mơi trưng. Chun b mơi trưng MRS như đã trình bày mc 2.2.3.1 , hp thanh trùng nhit đ 121 oC trong thi gian 20 phút, đ ngui đn 50 55 oC. + Dùng pipet vơ khun hút 1 ml canh trưng trên, hé m hp petri ri cho vào, đy np li đng thi xoay nh hp trên bàn phng đ chúng dàn tri đu đáy hp. + Hé m np hp, nhanh tay đ thch vào, đy np và xoay nh hp trên bàn cho thch và vt gieo cy đưc trn đu, dàn thành mt lp trên đáy hp. + Đ thch đc li, lt ngưc hp petri, dán nhãn lên các hp tương ng vi tng đ pha lỗng, gĩi giy báo và đt vào t m cĩ nhit đ 30 oC, c mi đ pha lỗng chun b 3 hp petri. Thao tác phi tht nhanh và đưc thc hin trong mơi trưng vơ trùng. Sau 2 ngày, ly các hp ra quan sát nu thy trên b mt thch xut hin các khun lc, b mt khơ, nhn bĩng, cĩ màu trng sa thì đĩ là du hiu ca nhng khun lc vi khun. Mi khun lc là tp hp t bào đưc phát trin t mt t bào đơn. Đm và xác đnh s lưng khun lc mi mc đ pha lỗng khác nhau. Kt qu đưc tính theo ph lc 3.8. mc đ pha lỗng10 3 ln trên 3 đĩa petri theo th t tng đĩa là: 48, 53 và 52, khi đĩ: N = (48 + 53+ 52)/3 = 51 D = 1/10 3 = 10 3 51 Suy ra s t bào/ ml mu = ×103 = 51.10 3 t bào/ml 1 Các khun lc Lactobacillus casei các mc pha lỗng 10 3 đưc th hin hình 3.6.
51. 42 3 Pha lỗng 10 Hình 3.6. Các khun lc Lactobacillus casei các mc pha lỗng 10 3 Đng thi vi vic hút và cy canh trưng vào mơi trưng MRS. Chúng tơi tin hành đo OD bưc sĩng 620nm ca tng mt đ pha lỗng khác nhau. Kt qu ca vic đo OD tương ng vi s lưng khun lc đm đưc mi mc đ pha lỗng khác nhau, chúng tơi xác đnh đưc s lưng khun lc mi OD đ thun li cho các ln lên men sau này. Hình 3.7. Đưng cong biu din mt đ t bào các mc pha lỗng khác nhau T đưng cong trên, chúng tơi suy lun đưc lưng khun lc cĩ trong dch khun chun b đ cân đi lưng vi khun cho tng m lên men trong nghiên cu. đây chúng tơi thy bưc sĩng 620nm thì OD = 0,173, tương ng vi mc đ pha lỗng 103 ln, s lưng vi khun đm đưc là 51.10 3 t bào/ml.
52. 43 3.3.2. Quá trình lên men và x lí sau lên men Dch đưng sau khi lc và xác đnh nng đ dch đưng theo mc 3.2.1. Dch vi khun chun b như trình bày phn 3.3. Trưc khi lên men, dch vi khun này đã đưc nuơi trong 24 gi, tin hành đo OD bưc sĩng 620nm và da vào kt qu OD đo đưc, t đưng cong biu din mt đ t bào hình 3.7, chúng tơi ưc lưng hàm lưng vi khun cĩ trong dch khun đ điu chnh cho quá tình lên men. Hình 3.8. Dch đưng đã chun b trưc lúc lên men nghiên cu này, chúng tơi s dng các bình tam giác nh đ lên men. mi bình tam giác, chúng tơi ly chính xác mt lưng dch đưng đã điu chnh nng đ, b sung thành phn dinh dưng cn thit cho mơi trưng như mc 2.2.2.3 đã trình bày. Sau đĩ hp thanh trùng 121 oC trong 20 phút và tin hành lên men theo như quy trình sau: Dch đưng Dch đưng B sung thành phn dinh dưng B sung thành phn dinh dưng và cy vi khun CaCO 3 Lên men Nuơi trong 24 gi Dch sau lên men X lý Axit lactic dng thơ Đnh lưng
53. 44 Trong sut thi gian lên men, nhm tăng s tip xúc gia mơi trưng và vi khun, chúng tơi b trí lên men bng cách đt các bình tam giác trên máy lc IKA VIBRAXVXR (hình 3.9), mu đưc đt trong t bo ơn nhm điu chnh d dàng nhit đ lên men. Dch sau lên men theo các điu kin kho sát khác nhau. Axit lactic to thành làm cho pH ca dch lên men chuyn dn v axit mnh. Trong quá trình lên men, đ trung hịa lưng axit to thành, c 3 ÷ 4 ln/ngày đêm chúng tơi b sung CaCO 3 dng bt. Lúc này lưng axit lactic to thành s kt hp vi CaCO 3 như sau: 2CH 3CHOHCOOH + CaCO 3 = Ca(CH 3CHOHCOO) 2 + CO 2 + H 2O Kt thúc quá trình lên men, nâng nhit đ ca dch sau lên men đn nhit đ o 80 – 90 C, b sung CaCO 3 và đưa pH ca dch lên bng 10 – 11, gi yên nhit đ này t 3 5 gi (cĩ th lâu hơn) [7]. Trong khong thi gian này các cht lng và sinh khi vi sinh vt s lng xung đáy. Lc dch nhiu ln và thu ly dch trong, đng thi loi b các t bào cht và lưng CaCO 3 tha. Sau đĩ tin hành đun o nĩng dch đn nhit đ 60 70 C, b sung H 2SO 4 nhm to kt ta CaSO 4. Loi b kt ta thu đưc lưng axit lactic dng thơ. Đnh lưng đưc lưng axit lactic to thành. Hình 3.9. Quá trình lên men lactic Như vy trong quá trình lên men, chúng tơi nhn thy cĩ nhiu yu t nh hưng đn kh năng lên men cũng như hàm lưng axit lactic to thành. Chính vì th chúng tơi tin hành nghiên cu và kho sát mt s yu t sau nhm các điu kin nht đnh, chúng tơi thu đưc hàm lưng axit lactic là cao nht.
54. 45 3.3.2.1. Nghiên cu nh hưng ca nhit đ lên men Kim sốt mt đ t bào trưc khi thc hin cy ging cho quá trình lên men. Dch nuơi cy t bình nhân ging cp sang bình lên men phi đt giá tr 3 OD 620nm ≈ 0,173 (sau khi pha lỗng 10 ln). Tin hành lên men trong cùng mt ch đ lc như nhau. Nng đ dch đưng ban đu là 4%, pH = 6, hàm lưng ging là 5% [1], [10], trong thi gian là 72 gi. Lên men đưc tin hành các nhit đ khác nhau t 35 – 40 oC. nh hưng ca nhit đ lên men thơng qua hàm lưng axit lactic to thành. Lưng axit lactic to thành đưc tính như cách tính đưc trình bày ph lc 3.6. Kt qu đưc biu din hình 3.10 và ph lc 4.1. T đ th cho ta thy lưng axit lactic to thành nhit đ 37 oC là cao nht. Điu này cho ta thy vi khun lactobacillus casei hot đng tt nht nhit đ là 37 0C trong trưng hp ta xét, các hot đng trao đi cht ca chng kho sát cĩ th coi là các phn ng hĩa hc. Hình 3.10. nh hưng ca nhit đ đn hàm lưng axit lactic to thành Vì các phn ng này ph thuc cht ch vào nhit đ nên yu t nhit đ rõ ràng nh hưng sâu sc đn quá trình sinh trưng và tng hp axit lactic ca t bào. Vn đ này th hin rt rõ đ th trên, nhit đ thích hp thì sinh khi tăng kéo theo lưng axit lactic tăng.
55. 46 Khi nhit đ thp hoc cao đu nh hưng đn các hot đng ca vi khun dn đn hiu qu thu hi kém, ngưc li khi nhit đ đt đim thích hp thì s sinh trưng và phát trin ca vi khun là cao nht, do đĩ kt qu là hàm lưng axit lactic to thành là nhiu nht. T đây chúng tơi kt lun rng: vi điu kin nhit đ thích hp trong nuơi cy và lên men to axit lactic là 37 oC. 3.3.2.2. Nghiên cu nh hưng ca t l ging vi khun lên men Kim sốt mt đ t bào trưc khi thc hin cy ging cho quá trình lên men. Dch nuơi cy t bình nhân ging cp sang bình lên men phi đt giá tr 3 OD 620nm ≈ 0,173 (sau khi pha lỗng 10 ln). C đnh nng đ dch đưng 4%, nhit đ là 37 0C, pH = 6, ch đ lc như kho sát trên. Tin hành b trí nhiu thí nghim vi các t l ging ban đu khác nhau theo t l th tích nuơi cy. Kt qu đưc th hin ph lc 4.2 và hình 3.11. 18.5 18 17.5 17 16.5 16 15.5 Lưngg/l lactic, axit 15 14.5 14 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T l vi khun, % Hình 3.11. nh hưng ca t l ging đn lưng axit lactic to thành Nhn xét: Kt qa th hin đ th cho thy lưng ging ban đu thích hp nht cho vic lên men to axit lactic là 5% v/v. Sinh trưng và phát trin là thuc tính cơ s ca sinh vt. S sinh tng hp axit lactic ca lactobacillus casei cao hay thp ph thuc vào quá trình sinh trưng và s dng ngun dinh dưng nhiu hay
56. 47 ít. T l ging ban đu thích hp s giúp cho quá trình lên men và sinh tng hp axit lactic tt. Điu này cho thy lưng ging ban đu cho quá trình lên men là rt quan trng, nĩ gĩp phn quyt đnh hiu sut lên men. Nu lưng ging ban đu mơi trưng khá cao, qun th t bào s sm rơi vào pha n đnh, lúc này qun th vi khun trng thái cân bng đng hc và như vy tc đ sinh trưng cũng như sinh tng hp axit lactic s gim. Cịn nu lưng ging ban đu quá thp so vi lưng cơ cht cĩ trong mơi trưng lên men thì quá trình sinh trưng, phát trin và sinh tng hp axit lactic s kéo dài thi gian lên men hoc to ra mt s sn phm ph khơng mong mun như rưu etylic, axit bay hơi và khơng kinh t cho vic lên men quy mơ cơng nghip. 3.3.2.3. Nghiên cu nh hưng ca nng đ dch đưng Kim sốt mt đ t bào trưc khi thc hin cy ging cho quá trình lên men. Dch nuơi cy t bình nhân ging cp sang bình lên men phi đt giá tr 3 OD 620nm ≈ 0,173 (sau khi pha lỗng 10 ln). Mơi trưng lên men là Fer, trong đĩ ngun cacbon chính là dch đưng sau khi thy phân tinh bt ht mít và đưc b trí thành nhiu phn vi nng đ dch đưng là khác nhau như bng 4.3, ph lc 4.3. Nuơi cy nhit đ là 37 oC, pH như kho sát ban đu, hàm lưng ging là 5%, trong điu kin lc như đã kho sát trên. Sau 72 gi lên men, xác đnh hàm lưng axit lactic to thành như biu din đ th hình 3.12 bên dưi. Hình 3.12. nh hưng ca nng đ dch đưng đn hàm lưng axit lactic to thành
57. 48 Ngun cacbon cn cho s sinh trưng và lên men ca chng nghiên cu là khơng th thiu, nghiên cu này dch thy phân đưc xem là ngun cacbon chính cho quá trình lên men thu nhn axit lactic. Thơng qua đ th trên cho thy hàm lưng đưng trong dch đưng thích hp cho vic to axit lactic cao nht nng đ đưng là 5% (g/100ml). Thc t cho thy mt trong nhng thành phn ch cht ca mơi trưng trong quá trình lên men là gluxit. Gluxit khơng nhng là ngun cung cp năng lưng mà cịn là ngun cung cp vt liu xây dng cn thit đ sinh tng hp các cu t ca t bào. Trong điu kin thí nghim, ngun gluxit đưc cho vào dưi dng ch yu đưng đơn kh. Hàm lưng đưng này nu đưc đưa vào mơi trưng nuơi cy vi mt lưng thích hp thì s giúp chng nghiên cu sinh trưng và sinh tng hp tt. Ngưc li, lưng đưng thp thì khơng đ ngun cacbon cung cp cho vi sinh vt phát trin hoc lưng đưng quá cao s to mt áp lc thm thu ra mơi trưng và làm nh hưng đn trng thái sinh lý ca t bào dn đn hiu sut ca quá trình khơng cao. Nu xét v hiu sut lên men ta thy, ng vi mi nng đ dch đưng khác nhau thì cĩ mt khi lưng riêng nht đnh. Chúng tơi tính hiu sut lên men và kt qu đưc th hin bng 3.5. Bng 3.5. Hiu sut lên men theo nng đ dch đưng Nng đ dch Khi lưng Lưng axit lactic to Hiu sut STT đưng, % riêng ρ, kg/m 3 thành, gam/lít lên men, % 1 2 1007,79 9,14 45,36 2 3 1011,72 15,29 50,37 3 4 1015,67 17,57 43,24 4 5 1019,65 18,26 35,82 5 6 1023,66 17,35 28,24 6 7 1027,70 16,72 23,22 Vi cách tính hiu sut lên men đưc trình bày ph lc 5.3. T kt qu trên chúng tơi nhn thy, nng đ dch đưng 3% thì hiu sut lên men là cao nht, các nng đ dch đưng 2%, 4% thì hiu sut lên men cũng
58. 49 khá cao nhưng hàm lưng axit lactic to thành khơng nhiu bng nng đ dch đưng là 5%. Hơn na, vi hiu sut lên men ch đt 35,82% tuy thp hơn so vi nng đ dch đưng 2%, 3% và 4% nhưng s chênh lch v các nng đ này khơng ln lm. Chính vì th mà chúng tơi chn lên men nng đ dch đưng 5% đ thu đưc hàm lưng axit lactic là cao nht. 3.3.2.4. Nghiên cu nh hưng ca thi gian lên men Kim sốt mt đ t bào trưc khi thc hin cy ging cho quá trình lên men. Dch nuơi cy t bình nhân ging cp sang bình lên men phi đt giá tr 3 OD 620nm ≈ 0,173 (sau khi pha lỗng 10 ln). Quá trình lên men đưc thc hin nhit đ, pH, nng đ dch đưng và t l ging thích hp như đã kho sát các thí nghim trên. Ly mu theo nhng khong thi gian nht đnh là 8 gi, xác đnh kh năng sinh tng hp axit lactic ca chng kho sát ti nhng thi đim thi gian xác đnh đĩ. Kt qa thu đưc th hin bng 4.4 ph lc 4.4 và đ th hình 3.13. Hình 3.13. nh hưng ca thi gian lên men đn hàm lưng axit lactic to thành Chúng tơi đã xác đnh vi khong thi gian 72 gi thì lưng axit lactic sinh ra là cao nht. Vi khun lactobacillus casei khi đưc đưa vào mơi trưng, chúng s dng ngay nhng dưng cht đ sinh trưng và din ra qua 4 giai đon thích nghi, phát trin, cân bng và suy vong. Giai đon đu khơng cĩ vì chng này đưc nhân
59. 50 ging trên mơi trưng cĩ thành phn ging thành phn mơi trưng lên men. Quá trình phát trin to sinh khi nhiu đng thi cũng to ra lưng axit lactic tăng tương ng. Như vy theo thi gian thì axit lactic to ra nhiu hơn đưc biu th qua hàm lưng axit lactic tăng dn theo thi gian. Tuy nhiên, khơng phi thi gian càng dài thì axit lactic càng tăng mà khi qun th đt bão hịa thì axit lactic s gim đi đáng k do cơ cht trong mơi trưng gim, và nu mơi trưng khơng đưc điu chnh pH thì yu t này theo thi gian cũng s kìm hãm s phát trin và tng hp lactic ca chúng ta nghiên cu. Hình 3.14. Các mu dch sau khi kt thúc quá trình lên men 3.4. Nghiên cu nh hưng đng thi ca hai yu t đn quá trình lên men lactic Theo thc nghim chúng tơi thy cĩ nhiu yu t nh hưng đn quá trình lên men lactic đ thu nhn axit lactic. Nhưng đây chúng tơi xét 2 yu t theo điu kin ti ưu đ lưng axit lactic to thành là cao nht: nng đ dch đưng và thi gian lên men. Do đĩ, đ cĩ th nâng cao hiu sut ca quá trình lên men chúng tơi phi tìm mc thích hp nht thơng qua ti ưu hĩa hai yu t này. 3.4.1. Lp ma trn quy hoch thc nghim và xác đnh các h s ca phương trình Căn c vào các giá tr thích hp như đã kho sát mc 3.3.2.3 và 3.3.2.4 , chúng tơi chn mc trên, mc dưi cho 2 yu t như sau: Các yu t nh hưng z1 là nng đ dch đưng ban đu (%) z2 là thi gian lên men (gi)
60. 51 Hàm mc tiêu y: hàm lưng axit lactic to thành sau lên men ( y → max) Phương trình biu din cĩ dng: y = f (Z 1, Z 2) Chn min kho sát: Nng đ dch đưng thy phân, % (gam/100ml): 4 < Z1 < 6 Thi gian lên men, gi : 64< Z2 < 80 T nhng yu t trên, chúng tơi xây dng điu kin thí nghim theo bng sau: Bng 3.6. Các điu kin thí nghim TYT 2 2 Ch s z1 z2 y o Mc cơ bn (Z j ) 5 72 Khong bin thiên 1 8 max Mc trên (Z j ) 6 80 min Mc dưi (Z j ) 4 64 * Chn phương án quy hoch trc giao cp I (TYT 2 k) Lp thí nghim ti ưu hĩa theo thc nghim yu t tồn phn 2 k da trên các điu kin đã kho sát trên (k là s yu t nh hưng, trong thí nghim này k = 2). Các thí nghim đưc thc hin trong điu kin pH ban đu, ch đ lc và nhit đ ti ưu. Phương trình hi qui cĩ dng: y = b 0 + b 1x1 + b 2x2 + b 12 x1x2 (3.1) Trong đĩ: x1: Bin s mã hố ca bin thc Z 1 Nng đ dch đưng x2: Bin s mã hố ca bin thc Z 2 Thi gian lên men y: Hàm mc tiêu – Hàm lưng axit lactic to thành, g/l. b0, b 1, b 2, b 12 : Các h s ca phương trình hi quy. * B trí thí nghim trc giao cp I: S thí nghim thc hin theo quy hoch thc nghim yu t tồn phn hai 2 o mc, hai yu t (2 ) là 04, trong đĩ thí nghim tâm (Z j ) đưc thc hin cùng 03 thí nghim. Kt qu thí nghim đưc th hin bng 3.7
61. 52 Theo phương pháp bình phương nh nht, các h s hi quy trong phương trình hi quy đưc xác đnh như sau: N N 1 1 b j = ∑ xi j yi và b12 = ∑()x1 x 2 i yi N i=1 N i=1 Bng 3.7. Kt qu thí nghim theo thc nghim TYT 22 Hàm mc STT Bin mã tiêu x1 x2 x1.x 2 y S thí nghim trong phương án 1 + 17,68 2k 2 + 17,97 3 + 18,15 4 + + + 18,82 5 0 0 0 18.18 S thí nghim 6 0 0 0 ti tâm 18,48 7 0 0 0 18.20 Tương ng vi s liu t thí nghim trên bng kt qu, chúng tơi tin hành tính các h s b như sau: 17,68116 +17,97101 +18,15384 +18,82353 b = = 18,1574 0 4 −17,68116 −17,97101+ 18,15384 +18,82353 b = = 0,3313 1 4 −17,68116 +17,97101−18,15384 +18,82353 b = = 0,2398 2 4
62. 53 17,68116 −17,97101−18,15384 +18,82353 b = = 0,0949 12 4 Vy, các h s trong phương trình hi quy: b 0 = 18,1574, b 1 = 0,3313 , b 2 =0,2398, b 12 =0,0949 T kt qu trên, thay các h s b vào phương trình (3.1), ta cĩ dng phương trình hi quy như sau: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 + 0.0949x 1x2 3.4.2. Kim đnh s cĩ nghĩa ca các h s theo tiêu chun Student Đ chính xác ca các h s phương trình đưc xác đnh như sau: m 2 0 ∑ ()yu − y0 Phương sai tái hin: S 2 = u=1 (3.2) th m −1 Sth Sai s tính cho b i : Sb = (3.3) i N − 0 0 Trong đĩ y u : giá tr y thu đưc ti tâm thc nghim; y : giá tr trung bình 0 ca các ln đo giá tr y u; m: s thí nghim làm ti tâm thc nghim, đây m = 3 Các giá tr tính tốn theo s liu thc nghim ca phân b Student đưc tính theo cơng thc: b t = j (3.4) j S b j 1 Ta cĩ: y 0 = 18,1818 2 y0 = 18,4848 3 y0 = 18,2089 3 y 0 − ∑ u Suy ra: y 0 = u=1 = 18,2918 3
63. 54 m 2 0 ∑ ()yu − y0 S 2 = u=1 = 0,0281 → S = 0,1677 th 3−1 th ,0 1651 S = = 0,0838 bi 2 Các giá tr tính tốn theo s liu thc nghim ca phân b Student đưc tính theo cơng thc (3.4) trên. Kt qu như sau: Suy ra: t 0 = 216,5838 t1 = 3,9517 t2 = 2,8613 t12 = 1,1326 Tra bng t p(f) vi p = 0.05, f = 2 thì t 0.05 (2) = 1.18 Đi chiu vi các tr s Student đã tính ta thy t 12 < t p(f) nên h s b12 khơng cĩ ý nghĩa. Vy phương trình hi quy cĩ dng: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 (3.5) 3.4.3. Kim tra s tương thích ca phương trình hi quy Chúng tơi kim tra s tương thích ca phương trình hi quy vi thc nghim đưc đnh theo tiêu chun Fisher vi cơng thc: N 2 2 ∑ ()yl − y S u 2 l=1 F = 2 (3.6) vi phương sai tương thích: Su = (3.7) S th N − N' Trong đĩ: N: s thí nghim N’: s h s cĩ nghĩa trong phương trình yi: giá tr đo đưc trong thc nghim _ yi : giá tr tính tốn theo phương trình hi quy. Các giá tr thu đưc trên bng 3.8.
64. 55 Bng 3.8. Bng giá tr tính phương sai dư STN 1 2 3 4 17,5862 18,0659 18,2488 18,7285 yi 2 0,009 0,009 0,009 0,009 (yi − yi ) Kim tra tính tương thích ca phương trình hi quy y 1 : N 2 ∑ ()yl − y Phương sai tính theo cơng thc trên cĩ giá tr: S 2 = l=1 = 0,0361 u N − N' 2 S u Tiêu chun Fisher: F = 2 = 0,2151 S th So sánh giá tr F vi F = F , trong đĩ p là mc ý nghĩa; f : bc t do b (1− p )( f2 , f 1 ) 1 ca phương sai dư f 1 = N – N’ = 4 3 = 1; f 2: bc t do ca phương tái hin f 2 = m1 = 2 Tra bng ta cĩ F b = 5.3, suy ra F b > F, phương trình phù hp vi các s liu thc nghim. Vy phương trình hi quy là: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 (3.8) T phương trình 3.8 ta nhn thy x 2 và x 1 cĩ h s hi quy tương đương nhau. Tuy nhiên x 1 ln hơn x 2, điu đĩ chng t rng x 1 cĩ nh hưng đn quá trình sinh tng hp axit lactic hơn x 2. Hơn na, chúng tơi thy h s hi quy b 12 = 0,09495, cho thy rng hai yu t x1 và x 2 cĩ tương tác vi nhau, chúng cĩ nh hưng ln nhau trong quá trình lên men lactic. Cũng t mơ hình tốn hc cho chúng tơi thy rng mun tăng giá tr ca các thơng s ti ưu hĩa cn tăng giá tr ca các yu t x2 và tăng giá tr ca yu t x1. 3.4.4. Ti ưu hĩa thc nghim T các s liu thu đưc cho thy phương trình hi quy 3.8 trên hồn tồn tương thích vi thc nghim. Như vy đ thu nhn đưc nhiu axit lactic chúng tơi
65. 56 thc hin ti ưu hĩa bng phương pháp leo dc (phương pháp BoxWilson), bt đu t đim khơng, là mc cơ s: z 1 = 5, z2= 72. 0 Tính các bưc chuyn đng δ j : T mc cơ s Z j và phương trình hi quy tuyn tính chúng tơi tính bưc chuyn đng cho mi yu t. Kt qu đưc trình bày bng 3.9. Bng 3.9. Kt qu tính bưc chuyn đng δ j ca các yu t Các ch tiêu Z1, % ,(gam/100ml) Z2, gi Mc cơ s 5 72 Khong bin thiên ( j ) 1 8 H s bj 0,3313 0,2398 bj j 0,3313 1,9184 bj j 0,3313 1,9184 Bưc chuyn đng ( δ j ) 1,0362 6 1 6 Làm trịn bưc chuyn đng ( δ j ) Ta thy: b2 2 là ln nht (1,9184) nên tơi chn bưc chuyn đng δ j = δ 2 Và chn bưc chuyn đng δ 2 = 0,7* 2 = 0,7*8 = 5,6. Chúng tơi làm trịn s và chn δ 2 = 6 Các bưc chuyn đng ca yu t x1 đưc tính theo cơng thc sau: b1 1 δ1 = δ 2 = 1,0362, làm trịn bưc chuyn đng δ 1 = 1 b2 2
66. 57 T chc các thí nghim leo dc: T kt qu các bưc chuyn đng δ j bng (3.9), chúng tơi t chc thí nghim leo dc, xut phát t tâm thc nghim theo hưng đã chn. Kt qu đưc biu din bng 3.10. Z j − Z0 Chuyn sang bin mã vi cơng thc: x j = . λ j Bng 3.10. Kt qu thí nghim leo dc theo phương pháp BoxWilson Hàm mc Bin thc Bin mã Thí nghim tiêu Z1 (%) Z2 (gi) x1 x2 y TN ti tâm 5 72 0 0 18,29 2 6 78 1 0,75 18,33 3 7 84 2 1,50 18,70 4 8 90 3 2,25 19,94 5 9 96 4 3,00 17,67 Vy kt qu nhn đưc thí nghim 4 là cao nht, vi hàm lưng axit lactic to thành là 19,9415 (mg/10ml), ng vi nng đ dch đưng lên men là 8% và thi gian lên men là 90 gi.
67. 58 KT LUN VÀ KIN NGH 1. KT LUN Hàm lưng tinh bt cĩ trong bt ht mít nghiên cu là 65,62%. Trong quá trình dch hĩa tinh bt ht mít, vi hàm lưng enzyme α amylaza b sung là 0,1% và trong đưng hĩa tinh bt ht mít thì lưng enzyme γ – amylaza b sung là 0,18%. Sau quá trình thy phân, dch đưng to thành đt 20gam/100ml, hiu sut thy phân đt 91,43%. Sau khi kim đnh s cĩ nghĩa ca các h s theo tiêu chun Student và kim tra s tương thích ca phương trình hi quy, chúng tơi xây dng đưc phương trình phù hp vi các s liu thc nghim như sau: y = 18,1574 + 0,3313x1 + 0,2398x2 Trong đĩ: x 1 là bin s mã hĩa ca bin thc z 1 (nng đ dch đưng). x2 là bin s mã hĩa ca bin thc z 2 (thi gian lên men). y là hàm lưng axit lactic to thành (g/l). Xác đnh đưc các điu kin ti ưu trong lên men + Nng đ dch đưng lên men là 8% + Nhit đ lên men là 37 oC + pH =6 + Thi gian lên men là 90 gi + Hàm lưng axit lactic to thành đt đn 19,9415 g/l. 2. KIN NGH Nu tip tc nghiên cu lên men axit lactic t tinh bt ht mít, chúng tơi đ ngh đưc lên men trong điu kin ti ưu hơn, tc là cĩ thit b lên men vi năng sut nh. T đĩ cĩ th t kt qa thc nghim, chúng tơi mnh dn đưa ra quy mơ sn xut axit lactic theo pilot. T axit lactic to thành, tinh ch và cĩ th ng dng vào nhiu ngành cơng nghip khác nhau.
68. 59 DANH MC TÀI LIU THAM KHO Tài liu Ting Vit [1] Kiu Hu nh (1999), Vi sinh vt cơng nghip, Nhà xut bn Khoa hc K thut. [2] Nguyn Cnh, X.L.Akhnadarơva, V.V.Kapharp (1994), Ti ưu hĩa thc nghim trong hĩa hc và k thut hĩa hc, Đi hc K thutTP. H Chí Minh. [3] Nguyn Lân Dũng, Nguyn Đình Quyn, Phm Văn Ty (1997), Vi sinh vt hc, Nhà xut bn Giáo Dc [4] Nguyn Đc Lưng (1996), Cơng ngh vi sinh vt tp 1 , Trưng Đi hc K thut [5] Nguyn Đc Lưng (1996), Cơng ngh vi sinh vt tp 2 , Trưng Đi hc K thut [6] PGS.TS. Lê Thanh Mai (2005), Các phương pháp phân tích ngành cơng ngh lên men , Nhà xut bn Khoa hc và K thut Hà Ni. [7] Phan Bích Ngc (1991) , Cơng ngh lên men , Nhà XB Đà Nng. [8] Đng Th Thanh Thu (1998), Sinh hc ng dng , T sách Đi hc Khoa hc t nhiên TP.HCM. [9] Bùi Th Như Thun (1991), Nguyn Phùng Tin, Bùi Minh Đc, Kim tra cht lưng và thanh tra v sinh an tồn thc phm, Nhà Xut bn Y hc. [10] Nguyn Đình Thưng, Nguyn Thanh Hng (2000), Cơng ngh sn xut và kim tra cn Etylic , NXB Khoa hc và K thut, Hà Ni. [11] Lê Ngc Tú (1997), Hĩa sinh cơng nghip, NXB Khoa hc và K thut. [12] Hà Duyên Tư (1996), Kim tra và qun lý cht lưng thc phm, Đi hc Bách Khoa Hà Ni.
69. 60 Tài liu Ting Anh [13] Kharas, G. B., SanchezRiera, F., and Severson, D. K (1994), "Polymers of lactic acid. In: Plasticsfrom Microbes: Microbial Synthesis of Polymers and Polymer Precursors (Mobley, D. P., Ed.)", Hanser Publishers , Munic , p 93137 [14] J. Boudrrant, N.V.Menshutin, A.V.Skorohodov, E.V.Gusev, M.Fick (2005), "Mathematical modeling of cell suspension in high cell density conditions Application to Llactic acid fermentation using Lactobacillus casei in membrane bioreactor", Process Biochemistry . [15] Bogaert J C (1997), "Production and novel application of nature L(+) lactic acid: food, pharmaceutic and biodegradable polymer", Cerevisa. [16] Buenaventurada P. Calabia (2007), "Production of Dlactic acid from sugarcane molasses, sugarcanejuice and sugar beet juice by Lactobacillus delbrueckii", Yutaka Tokiwa. [17] M.L. Cazetta, M.A.P.C. Celligoi, J.B. Buzato, I.S. Scarmino, R.S.F. da Silva (2005), "Optimization study for sorbitol production by Zymomonas mobilis in sugar cane molasses", Process Biochemistry . [18] Buchanan R E, Gibbons N E (1974), Bergey’s manual of determinative bacteriology , Eight edition. [19] Craig R. Elevitch and Harley I. Manner (2006), Artocarpus heterophyllus, Jackfruit. [20] Mozzi F, de Giori G S, Oliver G and de Valdez G F (1994), "Effect of culture pH on the growth characteristics and polysaccharide production by Lactobacillus casei", Milchwissenschaft [21] JeanPierre Furet, Pascal Que ´ne ´e, Patrick Tailliez (2004), "Molecular quantification of lactic acid bacteria in fermented milk products using real time quantitative PCR, Institut National de la Recherche Agronomique, Unite ´ de Recherches Laitie `res et Ge ´ne ´tique Applique ´e", Domaine de Vilvert , 78352 JouyenJosas Cedex, France.
70. 61 [22] Se ´bastien Givry , Vincent Prevot, Francis Duchiron (2007), Lactic acid production from hemicellulosic hydrolyzate by cells of Lactobacillus bifermentans immobilized in Caalginate using response surface methodology , Universite ´de Reims ChampagneArdenne, France [23] Li Ping Huang, Tao Dong, Jing Wen Chen , Ning Li (2007), "Biotechnological production of lactic acid integrated with fishmeal wastewater treatment by Rhizopus oryzae, School of Environmental and Biological Science and Technology", Dalian University of Technology , Dalian 116024, China [24] Nam Sun Wang (2005), "Starch Hydrolysis by amylase, Department of Chemical & Biomolecular Engineering", University of Marland , College Park, MD 207422111, ENCH485 [25] SangMok Lee, YoonMo Koo, Jianqiang Lin (2004), "Production of Lactic Acid from Paper Sludge by Simultaneous Saccharification and Fermentation", Inha University , Incheon 402751,Korea; Shandong University, Jinan 250100, China [26] Joseph W.Lengeler Gerhart Drews Hans G.Schlegel (2002), Biology of the ProKaryotes [27] Mai Huong LyChatain a,b,c, Mai Linh Le a, Mai Le Thanh b, JeanMarc Belin a, Yves Waché (2010), "Cell surface properties affect colonisation of raw milk by lactic acid bacteriaat the microstructure level, a.Université de Bourgogne & AgroSup Dijon, France. b.Institute of Biotechnology and Food Technology", Hanoi University of Technology , Viet Nam. c.Laboratoire de Microbiologie, France,. [28] P.Singh.nee’Nigam (2009), "Production of Organic acids from Agro_Industrial Residues, Faculty of life and Health Sciences, School of Biomedical Sciences", University of Ulster , Coleraine BT52 1SA, Northern Ireland, UK.
71. 62 [29] Hanson T P and Tsao G T (1972), "Kinetic studies of the lactic acid fermentation in batch and continuous cultures", Biotechnol , Bioeng. [30] Micaela Pescuma , Elvira María Héberta, Fernanda Mozzia, Graciela Font de Valdez (2010), "Functional fermented wheybased beverage using lactic acid bacteria". [31] AsadurRehman, Sikander Ali and IkramulHaq (2002), Temperature Optima for Citric Acid Accumulation by Aspergillus niger , Biotechnology, Volume 1 Number 24: p180 – 110. [32] Lipinsky, E. S. and Sinclair (1986), R. G. Is lactic acid a commodity chemical , Chem. Eng. Prog 82,2632 [33] Sarote Sirisansaneeyakul, Tiyaporn Luangpipat, Wirat Vanichsriratana Thongchai Srinophakun, Henry HoHsien Chen , Yusuf Chisti (2007), "Optimization of lactic acid production by immobilized Lactococcus lactis IO1", Kasetsart University , Bangkok 10900, Thailand [34] Sakhamuri Sivakesava, Joseph Irudayaraj Demivci Ali (2001), "Sumultaneous determination of multiple components in lactic acid fermentation using FT_MiR, NiR and FT_Raman spectroscopic techniques", Process Biochemistry . [35] Technoguide Series (1996), "Jackfruit DARFU", Eastern Visayas Integrated Agricultural Research Center (EVIARC) [36] Hassan K. Sreenath, AnaB.Moldes, RichardG.Koege & Richard J. Straub (2001), "Lactic acid production from agriculture residues", University of Wisconsin , Madison, WI 53706, USA [37] Youichi Tamai, Noriko Yoshimitsu, Yasuo Watanabe, Yuji Kuwabara and Seiichiro Nagai (1995), Effects of Milk Fermented by Culturing with Various Lactic Acid Bacteria and a Yeast on Serum Cholesterol Level in Rats , Department of Bioresources, Faculty of Agriculture, Ehime University, Matsuyama, Ehime 790’ and Shikoku Milk Product Co. Ltd., Kawauchi, Ehime 79103, Japan.
72. 63 [38] Vanna Tulyathana, Kanitha Tananuwonga, Prapa Songjinda and Nongnuj Jaiboon (2001), "Some Physicochemical Properties of Jackfruit (Artocarpus heterophyllus Lam) Seed Flour and Starch, Department of Food Technology", Faculty of Science, Chulalongkorn University , Thailand 10330. [39] Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi& Toshinori Kimura (2003), "Lactic acid production using two food processing wastes, canned pineapple syrup and grape invertase, as substrate and enzyme", Tokyo University of Agriculture , Tokyo 1568502, Japan. [40] Nam Sun Wang (2002), "Starch Hydrolysis by amylase", Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Marland , College Park, MD 207422111, ENCH485. Tài liu t internet [41] ngày 12/3/1010 [42] cntrongnc/nghincuquatrinhthyphantinh bthtmitbngenzymetermamyl120lvaamg300ldlnmenruchngc t.html, ngày 13/3/2010 [43] dungtutraimit, ngày 25/4/1010 [44] ngày 20/4/1010 [45] manufacturers_id, ngày 17/5/2010 [46] ngày 13/3/2010 [47] ngày 17/5/2010 [48] ngày 20/4/1010 [49] ngày 19/9/2010
73. 64 [50] pham13630.aspx, ngày 25/10/2010 [51] la/caymit350quaokien giang/a52577.html, ngày 6/8/1010 [52] , ngày 14/10/2010
74. MC LC TRANG PH BÌA LI CAM ĐOAN MC LC DANH MC CÁC CH VIT TT DANH MC CÁC BNG DANH MC CÁC HÌNH M ĐU 1 1.Tính cp thit ca đ tài 1 2. Mc đích nghiên cu 3 3. Đi tưng nghiên cu 3 4. Phm vi nghiên cu 3 5. Phương pháp nghiên cu 3 6. Ý nghĩa khoa hc ca đ tài 3 7. Ý nghĩa thc tin ca đ tài 4 8. Cu trúc ca lun văn 4 CHƯƠNG 1. TNG QUAN 5 1.1. Tng quan v axit lactic 5 1.2. Tác nhân tng hp axit lactic 10 1.3. ng dng ca axit lactic 13 1.4. Tình hình nghiên cu axit lactic trên th gii 16 1.5. Tình hình nghiên cu axit lactic trong nưc 17 1.6. Các yu t nh hưng đn tng hp axit lactic t vi sinh vt 18 1.7. Ht mít . 20 CHƯƠNG 2. ĐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 23 2.1. Đi tưng nghiên cu 23 2.1.1. Ht mít 23 2.1.2. Enzyme thy phân 23 2.1.3. Vi khun lactic 23
75. 2.1.4. Thit b, dng c và hĩa cht trong quá trình nghiên cu 23 2.2. Phương pháp nghiên cu 24 2.2.1. Phương pháp hĩa hc 24 2.2.2. Phương pháp cơng ngh 26 2.2.3. Phương pháp vi sinh vt 29 2.2.4. Phương pháp tốn hc 31 CHƯƠNG 3. KT QU VÀ THO LUN 32 3.1. Kho sát đc đim ca các nguyên liu trong nghiên cu 32 3.1.1. Bt ht mít 32 3.1.2. Ch phm enzyme 34 3.1.3. Vi khun lên men lactic 36 3.2. Nghiên cu quá trình thy phân tinh bt 37 3.2.1. Xây dng đưng chun đưng glucose 37 3.2.2. Kho sát hàm lưng ch phm γ – amylaza cn dùng 38 3.3. Nghiên cu các yu t nh hưng đn qúa trình lên men lactic 39 3.3.1. Kho sát đng thái sinh trưng và phát trin ca vi khun lactobacillus casei 40 3.3.2. Quá trình lên men và x lí sau lên men 43 3.4. Nghiên cu nh hưng đng thi ca hai yu t đn quá trình lên men lactic 50 3.4.1. Lp ma trn quy hoch thc nghim và xác đnh các h s ca phương trình 50 3.4.2. Kim đnh s cĩ nghĩa ca các h s theo tiêu chun Student 53 3.4.3. Kim tra s tương thích ca phương trình hi quy 54 3.4.4. Ti ưu hĩa thc nghim 55 KT LUN VÀ KIN NGH 58 1. Kt lun 58 2. Kin ngh 58 DANH MC TÀI LIU THAM KHO 59 QUYT ĐNH GIAO Đ TÀI LUN VĂN (BN SAO) PH LC.
76. PHN PH LC PH LC 1 CÁC HĨA CHT S DNG TRONG THÍ NGHIM 1.1. Các hĩa cht thơng thưng s dng trong thí nghim Hĩa cht Đ tinh khit Nưc sn xut NaOH 95% Trung Quc HCl 96% Trung Quc NaClO 95% Trung Quc H2SO 4 96% Trung Quc CaCO 3 96% Trung Quc CH 3COOH 95% Trung Quc CuSO 4 96% Trung Quc Acid lactic 99% Trung Quc 1.2. Dung dch thuc th DNS (acid dinitro salicylic) * Hĩa cht: Axit dinitrosalicylic DNS Mui tartrat kép KNaC 4H4O6.4H 2O NaOH dung dch 4N
77. * Cách pha: Cho 5 gam DNS và 300ml nưc ct vào cc, hịa tan hồn tồn 50 oC. Sau đĩ cho thêm 50ml dung dch NaOH 4N. Cui cùng thêm 150gam mui tartrat kép, hịa tan hồn tồn ri cho vào trong bình đnh mc 500ml. Thêm nưc ct ti vch đnh mc. Đng trong l thy tinh màu sm. Nu 12 ngày sau thy xut hin cn lng thì đem lc cn. Chun 3ml thuc th DNS bng HCl 0,1N vi ch th phenolphthalein, nu ht 56ml HCl là đưc (Nu cn thêm NaOH đ đt mơi trưng mnh cho thuc th).
78. PH LC 2 CÁC PHƯƠNG TIN S DNG TRONG THÍ NGHIM Bng 2.1. Máy và thit b s dng trong thí nghim Ký hiu, đc tính k Nưc sn STT Tên máy, thit b thut xut 1 B điu nhit Julabo Anh 2 Bung cy vơ trùng SWCJ1F Trung Quc 3 Cân phân tích đin t M 4 Máy lc IKAVIBRAXVXR Đc 5 Máy so màu Jenway 6305 Anh 6 Ni hp thanh trùng Hirayama M 7 T sy Memmert Đc 8 T bo ơn Memmert Đc 9 T lnh Hitachi Nht
79. Bng 2.2. Các dng c, vt liu dùng trong nghiên cu thc nghim STT Dng c, vt liu Nưc sn xut 1 Bình tam giác (100, 250, 500) Trung Quc 2 Bình đnh mc (100, 500, 1000ml) Trung Quc 3 Bình cu 500ml Trung Quc 4 Bơng khơng thm nưc Vit Nam 5 Cc thy tinh (200, 500ml) Trung Quc 6 Cuvet Trung Quc 7 Đèn cn Vit Nam 8 Đũa thy tinh Trung Quc 9 Đĩa Petri Trung Quc 10 Giy lc Trung Quc 11 Kéo Vit Nam 12 ng đong (50, 100ml) Trung Quc 13 ng nghim 50ml Trung Quc 14 ng sinh hàn Trung Quc 15 Phu thy tinh Trung Quc
80. 16 Qu bĩp cao su Trung Quc 17 Que cy vịng Trung Quc 18 Que gt Trung Quc
81. PH LC 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP S DNG TRONG THÍ NGHIM 3.1. Xác đnh hàm lưng tinh bt bng phương pháp thy phân bng axit [6] a, Nguyên tc b, Dng c và hĩa cht: Ni cách thy ng sinh hàn Bình đnh mc 100ml, 250ml Bình tam giác 250ml Cc thy tinh 100ml, 250ml Phu lc, giy lc Nhit k Cân phân tích HCl đđ NaOH 10% Dung dch metyl da cam 1% c, Cách tin hành Cân 2g bt, chuyn vào bình tam giác hoc bình cu cĩ dung tích 250ml. Tip theo cho thêm 100ml HCl 2%, đy nút cao su và ni vi ng sinh hàn khí. Lc nh ri đt ni vào đun cách thy, đun ti sơi và sơi ti 2h. Mc nưc ni cách thy phi luơn cao hơn mc nưc trong bình thy phân, phi chun b nưc sơi đ b sung vào. Sau 2h thy phân, tồn b lưng tinh bt đã chuyn thành glucoza, làm ngui đn nhit đ phịng ri thêm 45 git metyl da cam, dùng NaOH 10% đ trung hịa axit đn đi màu. Chú ý ch trung hịa khi đã làm ngui đn 30 oC, vì nhit đ cao và kim cc b thì glucoza s b phân hy làm kt qu kém chính xác. Trung hịa xong ta chuyn tồn b dung dch vào bình đnh mc 250ml, tráng bình ri thêm nưc ct ti ngn bình và đem lc. Dch đưng thu đưc cĩ th xác đnh theo các phương pháp Graxianop
82. d, Kt qu Hàm lưng tinh bt trong nguyên liu TB(%) đưc tính theo cơng thc như sau: a × 250 ×100 TB = × 9,0 ,% b × m Trong đĩ: a: s gam glucoza tương ng vi 20ml fericyanua kali b: S mililit dch đưng lỗng tiêu hao khi đnh phân m: s gam bt mu thí nghim 0,9: h s chuyn glucoza thành tinh bt. 3.2. Xác đnh hàm lưng đưng kh bng phương pháp Graxianop [6]. Hĩa cht: Dung dch fericyanua kali 1% KOH 2,5N Metyl xanh 0,5% Dng c: Bình tam giác, bình đnh mc, buret, pipet, cc đng, bp Tin hành: Dùng pipet ly 20ml dung dch fericyanua cho vào bình tam giác 250l ml, thêm 5ml dung dch KOH và 34 git metyl xanh (nu dung dch đưng cĩ nng đ <0,25% thì ly 10ml Fericyanua và 2,5ml KOH) Lc đu, đt trên bp đin ri đun sao cho sau 12 phút thì sơi. Chun đ bng dung dch mu thí nghim đã pha lỗng đn mt màu ca metyl xanh: màu ca dung dch s thay đi t xanh sang tím hng và cui cùng đn vàng rơm thì kt thúc. Nu đ ngui màu dung dch s tr li tím hng. Làm dung dch chun tin hành như sau: cân 0,5g đưng glucoza hoc fructoza tinh khit, sau đĩ pha trong bình đnh mc 100ml (dung dch cĩ nng đ 0,5%). Dùng dung dch đ chun đ fericyanua như phn trên. Tính kt qu Hàm lưng đưng kh trong dung dch pha lỗng: RS(g/100ml) = a/m x 100 Trong đĩ: a là s gam đưng glucoza cĩ trong dung dch đưng glucoza 0,5% chun đ ht 20ml Fericyanua
83. m là s ml dung dch mu thí nghim chun đ ht 20 ml Fericyanua 3.3. Xác đnh hot lc ca α amilaza theo Rukhliadeva [6] Hĩa cht và dch chit enzyme Dung dch HCl 0,1N Dung dch đm iot gc: Hịa tan 0.5 gam iot và 5 gam KI vi mt lưng nh nưc ct trong chén cân cĩ nút mài. Lc nh hn hp đ hịa tan hồn tồn, sau đĩ chuyn dung dch sang bình đnh mc 200ml, b sung nưc ct đn vch mc. Bo qun dung dch trong bình màu nâu ch ti trong thi gian mt tháng. Dung dch iot phân tích: Pha lỗng 2ml dung dch iot gc vi dung dch HCl 0,1N trong bình đnh mc dung tích 100ml. Trưc khi s dng cn kim tra mt đ quang ca nĩ trên máy so màu quang đin bưc sĩng λ = 453nm vi chiu dày cuvet 1cm. Mt đ quang ca dung dch phi cĩ giá tr 0,160 ± 0,01. Nu cĩ s sai lch mt đ quang phi hiu chnh bng cách thêm vài git acid clohydric hoc dung dch iot gc. Dung dch tinh bt 1%: Hịa tan 1gam tinh bt (theo cht khơ tuyt đi) vi 50 ml nưc ct trong bình đnh mc 100ml, lc đu. Đt vào bp cách thy đang sơi, lc liên tc cho ti khi tinh bt tan hồn tồn. Sau đĩ làm ngui bình và b sung 10ml dung dch đm axetat pH = 4,7 (hoc 10 ml dung dch đm phosphate pH = 4,9) b sung nưc ct ti vch mc, lc đu. Dung dch đưc chun b trong ngày s dng. Dch chit enzyme phân tích: Chun b dch chit enzyme phân tícht dch chit enzyme gc bng cách pha lỗng sao cho trong 3 ml dch ch phm enzyme phân tích cĩ cha mt lưng enzyme đ đ thy phân tinh bt t 20% ti 70% trong điu kin xác đnh. Do đĩ tùy thuc vào hot đ ca ch phm enzyme gc mà tin hành pha lỗng theo t l thích hp. Tin hành: