Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm đối kháng trên tuyến trùng meloidogyne spp. gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông - Hoàng Ngọc Duyên

pdf

113 trang huongle 3000

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm đối kháng trên tuyến trùng meloidogyne spp. gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông - Hoàng Ngọc Duyên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_nghien_cuu_tuyen_chon_mot_so_vi_nam_doi_khang_tren.pdf

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm đối kháng trên tuyến trùng meloidogyne spp. gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông - Hoàng Ngọc Duyên

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN HỒNG NGC DUYÊN “NGHIÊN CU TUYN CHN MT S VI NM ĐI KHÁNG TRÊN TUYN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HI CÂY H TIÊU TI ĐĂK NƠNG” MÃ S: 60.42.30 LUN VĂN THC SĨ CHUYÊN NGÀNH SINH HC THC NGHIM Buơn Ma Thut, năm 2010
B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN HỒNG NGC DUYÊN “NGHIÊN CU TUYN CHN MT S VI NM ĐI KHÁNG TRÊN TUYN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HI CÂY H TIÊU TI ĐĂK NƠNG” LUN VĂN THC SĨ CHUYÊN NGÀNH SINH HC THC NGHIM NGƯI HƯNG DN KHOA HC: TS. NGUYN VĂN NAM Buơn Ma Thut, năm 2010
i LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi. Các s liu, kt qu nêu trong lun văn là trung thc và chưa đưc ai cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. Ngưi cam đoan Hồng Ngc Duyên
ii LI CM ƠN Vi lịng kính trng sâu sc, tơi xin bày t s bit ơn vi Tin sĩ Nguyn Văn Nam, ngưi Thy đã tn tình truyn đt kin thc, theo dõi, dìu dt, hưng dn, giúp đ tơi trong sut quá trình thc hin và hồn thành đ tài này. Tơi vơ cùng bit ơn ThS. Nguyn Quang Tun, Chi cc trưng chi cc BVTV tnh Đăk Nơng đã to mi điu kin giúp đ và đng viên tơi trong thi gian thc hin đ tài. Tơi xin dành s kính trng và tình cm sâu sc ca mình đn các thy cơ b mơn sinh hc, b mơn Bo v thc vt, các thy cơ khoa khoa hc t nhiên, khoa Nơng lâm nghip, trưng Đi hc Tây Nguyên đã ht lịng truyn đt kin thc, kinh nghim, to điu kin giúp đ tơi trong sut thi gian hc tp và thc hin đ tài. Xin đưc cm ơn Ban lãnh đo Chi cc Bo v thc vt tnh Đăk Nơng, các đng chí đng nghip trong cơ quan đã to mi điu kin thun li, h tr cho tơi đưc hc tp và hồn thành lun văn này. Chân thành cm ơn các anh ch, các bn lp Cao hc SHTN K2 khĩa II, các em sinh viên đang thc tp ti phịng thí nghim b mơn BVTV đã luơn đng viên, to mi điu kin giúp đ tơi trong sut quá trình làm lun văn. Li cm ơn sâu sc nht tơi xin dành cho ngưi cha kính yêu, đã luơn đng viên, giúp đ tơi vưt qua mi khĩ khăn. Xin dành tng gia đình, nhng ngưi bn, đng nghip và nhng ngưi thân yêu ca tơi nhng tình cm chân thành nht. Buơn Ma Thut, ngày 18 tháng 09 năm 2010 Hc viên Hồng Ngc Duyên
iii MC LC Ni dung Trang Trang ph bìa Li cam đoan i Li cm ơn ii Mc lc iii Danh mc các ký hiu, các ch vit tt v Danh mc các bng vi Danh mc các hình v, đ th vii M ĐU 1 1. Đ t vn đ 1 2. M c ti êu nghiên c u 2 3. Ý nghĩa khoa hc và ý nghĩa thc tin 2 3.1. Ý nghĩa khoa hc 2 3.2. Ý nghĩa thc tin và hiu qu ng dng 3 4. Gii hn ca đ tài 3 Chương I: TNG QUAN TÀI LIU 4 1.1. Gi i thiu c hung v cây h ti êu 4 1.1.1. Ngu n gc cây ti êu 4 1.1.2. Cơng dng ca cây tiêu 4 1.1.3. Đc đim hình thái ca cây tiêu 5 1.2. Gii thiu chung v tuyn trùng thc vt. 7 1.3. Đc đim ca tuyn trùng Meloidogyne spp. 9 1.3.1. Đc đim sinh hc 10 1.3 .2. Các y u t sinh thái, mơi tr ưng nh h ưng đn mt đ tuy n tr ùng 11 1.3 .3. Tp quán sinh sng v à gây h i 12 1.3.4. Quá trình phát trin ca bnh 13 1.3.5. Các yu t lan truyn tuyn trùng h tiêu 14 1.3.6. Các lồi Meloidogyne spp. gây hi quan trng 15 1.4. Các nghiên cu trong và ngồi nưc v tuyn trùng Meloidogyne spp. 15 1.4.1. Các nghiên cu v tuyn trùng Meloidogyne spp. trên th gii 15 1.4 .2. Các nghiên c u v tuyn tr ùng Meloidogyne spp. t i Vit Nam 19 1.5 . M t s bin pháp p hịng tr tuyn tr ùng Meloidogyne spp. 21 1.5.1. Bin pháp chn ging 22 1.5.2. Bin pháp canh tác 22 1.5.3. Bin pháp hĩa hc 24 1.5.4. Bin pháp phịng tr tng hp 25 1.5 .5. Bi n pháp sinh hc 26 1.6 . Vi sinh v t đi kháng v à ký sinh tuy n tr ùng gây hi cây trng 26 Chương II: ĐI TƯNG, NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 31 2.1. Đi tưng nghiên cu 31 2.2. Ni dung nghiên cu 31 2.3. Thi gian và đa đim thc hin 31 2.4. Vt liu, hĩa cht và dng c thí nghim 32 2.4.1. V t li u 32 2.4.2. Hĩa ch t, d ng c và thi t b 32
iv 2.4.3. Các cơng thc mơi trưng 33 2.5. Phương pháp nghiên cu 35 2.5.1. Phương pháp thu mu 35 2.5.2. Phương pháp x lý mu 36 2.5.3. Phương pháp ly trích tuy n tr ùng 36 2.5.4. Nhân nuơi tuy n tr ùng M eloidogyne spp. trong phịng thí nghi m 37 2.5.5. Phân lp nm và gi mu nm 37 2.5.6. Xác đnh kh năng đi kháng ca các lồi nm phân lp đưc lên tuy n trùng Meloidogyne spp. trong điu kin invitro 38 2.5.7. Phương pháp nhân nuơi các chng nm đưc tuyn chn 39 2.5.8. Nghiên cu các yu t nh hưng đn kh năng ký sinh ca nm 40 2.6. Th nghim tính đi kháng ca mt s chng nm cĩ tính đi kháng cao trong điu kin nhà lưi 41 2.7. Phương pháp xác đ nh s l ưng b ào t 43 2.8. Phương pháp x lý s liu 44 Chương III: KT QU NGHIÊN CU 45 3.1. Phân lp, làm thun và lưu gi các chng nm bn đa các đa đim nghiên cu 45 3.2. Sàng lc và tuyn chn các chng nm cĩ kh năng KS tuyn trùng 47 3.2.1. Sàng lc kh năng ký sinh tuyn trùng ca các chng nm 47 3.2.2. Hình thc ký sinh trng tuyn trùng ca các chng nm trong điu kin nghiên cu 50 3.2.3. Kh năng ký sinh ca các chng nm tuyn chn 50 3.3. Nghiên c u các y u t nh hư ng đ n kh năng KS ca n m lên tuy n trùng Meloidogyne spp. 52 3.3.1. nh hư ng c a mơi trư ng nuơi c y đ n kh năng KS ca n m 52 3.3.2. nh hư ng c a nhi t đ đn kh năng ký sinh c a n m 55 3.3.3. nh hưng ca pH đn kh năng ký sinh ca nm 56 3.3.4. nh hưng ca thi gian chiu sáng đn kh năng KS ca nm 57 3.3.5. Mt s yu t sinh hc ca nm liên quan đn kh năng ký sinh ca nm 57 3.4. Đc đim hình thái và phân loi ca các chng nm tuyn chn 59 3.4.1. Đc đim hình thái 59 3.4.2. V trí phân lo i c a các ch ng n m C07, C22, DY16 và T7 61 3.5. Nhân nuơi các dịng n m tuy n ch n 64 3.5.1. Mơi trưng nhân nuơi cp 1 64 3.5.2. Mơi trưng nhân nuơi cp 2 65 3.6. Kho sát kh năng ký sinh ca các chng nm lên tuyn trùng Meloidogyne spp. trên cây tiêu trong điu kin nhà lưi 67 3.6.1. Din bin ch tiêu sinh trưng ca cây tiêu các CT thí nghim 67 3.6.2. S bin đng mt đ tuyn trùng Meloidogyne spp. trong đt và trong r tiêu thí nghim theo thi gian 71 KT LUN VÀ KIN NGH 75 Kt lun 75 Ki n ngh 76 DANH MC TÀI LIU THAM KHO 78 PH LC MT S HÌNH NH CA Đ TÀI
v DANH MC CÁC KÝ HIU, CÁC CH VIT TT BVTV: Bo v thc vt CBM: Chitin Broth Medium CT: Cơng thc IJ1: Infective Juvenile 1 (u trùng tui 1) IJ2: Infective Juvenile 2 (u trùng tui 2 dng cm nhim) M. : Meloidogyne MA: Maize Agar MM: Minimum Mineral MT: Mơi trưng KDTV: Kim dch thc vt KHVQH: Kính hin vi quang hc KD: Kinh doanh KS: Ký sinh KT: Kích thưc KTCB: Kin thit cơ bn SXL: Sau x lý PGA: Potato Glucose Agar PL: Ph lc PTSH: Phịng tr sinh hc PRBA: Peptone Rose Bengal Agar T. : Trichoderma TCA: Trichloroacetic WA: Water Agar
vi DANH MC CÁC BNG Bng Ni dung Trang Bng 3.1. S lưng các chng vi nm phân lp đưc ti các đa đim nghiên cu 45 Bng 3.2. Mt đ vi nm phân lp t đt ti các đa đim nghiên cu 45 Bng 3.3. Thành phn vi nm phân lp đưc t các mu đt, mu r ca bn đa đim nghiên cu . 47 Bng 3.4. Kh năng ký sinh trng tuyn trùng ca các chng nm . 48 Bng 3.5: T l ký sinh ca 04 chng nm cĩ hot tính ký sinh cao trên tuyn trùng Meloidogyne spp . 51 Bng 3.6. Đc đim khun lc sau 5 ngày nuơi cy và t l ký sinh ca nm trên các mơi trưng khác nhau . 54 Bng 3.7. T l ký sinh ca các chng nm các nhit đ khác nhau 55 Bng 3.8. T l ký sinh trng tuyn trùng Meloidogyne spp. các mc pH khác nhau . 56 Bng 3.9. T l ký sinh ca các chng nm C07, C22, DY16 và T7 các thi gian chiu sáng khác nhau 57 Bng 3.10. Hot tính enzyme Chitinase ca 04 chng nm C07, C22, DY16, T7 sau 12 ngày 58 Bng 3.11. Hot tính protease, chitinase và t l ký sinh ca các chng nm C07, C22, DY16, T7 59 Bng 3.12. Đc đim hình thái ca các chng nm C07, C22, DY16 và T7 trên mơi trưng PGA sau 5 ngày nuơi cy 59 Bng 3.13. Kh năng sinh bào t ca 04 chng C07, C22, DY16 và T7 trên mơi trưng PGA 65 Bng 3.14. S lưng bào t thu đưc ca 04 chng C07, C22, DY16 và T7 02 t l cơ cht khác nhau trên mơi trưng nhân nuơi . 66 Bng 3.15. S lưng tuyn trùng/100g đt, trng/5g r và t l nt sn trên b r tiêu sau khi chng nm và x lý tuyn trùng kỳ điu tra tun 8 72
vii DANH MC CÁC HÌNH V, Đ TH Hình Ni dung Trang Hình 3.1. T l (%) mt đ vi nm phân lp đưc ti các đa đim nghiên cu 46 Hình 3.2. T l các ging nm chính xut hin ti mu đt và mu r ti các đa đim nghiên cu 46 Hình 3.3. T l ký sinh ca các chng nm sàng lc 49 Hình 3.4. T l ký sinh sau 3 ngày ca các chng nm 49 Hình 3.5. Kh năng ký sinh ca các chng nm lên trng tuyn trùng Meloidogyne spp 50 Hình 3.6. T l ký sinh ca 04 chng nm cĩ hot tính ký sinh cao trên trng tuyn trùng Meloidogyne spp . 51 Hình 3.7. Kh năng ký sinh ca các chng nm đưc tuyn chn lên trng tuyn trùng Meloidogyne spp . 52 Hình 3.8. T l ký sinh ca các chng nm C07, C22, DY16 và T7 các mơi trưng nuơi cy khác nhau . 53 Hình 3.9. T l ký sinh ca các chng nm C07, C22, DY16 và T7 các mc nhit đ khác nhau . 55 Hình 3.10. T l ký sinh ca các chng nm các mc pH khác nhau 56 Hình 3.11. Hot tính enzyme chitinase ca các chng nm C07, C22, DY16, T7 sau 12 ngày 58 Hình 3.12. Khun lc chng C07 (A); C22 (B); DY16 (C) và T7 (D) 60 Hình 3.13. Đc đim hình thái ca chng nm C07 62 Hình 3.14. Đc đim hình thái ca chng nm C22 62 Hình 3.15. Đc đim hình thái ca chng nm DY16 . 63 Hình 3.16. Đc đim hình thái ca chng nm T7 64 Hình 3.17. Kh năng sinh bào t ca chng C07, C22, DY16 và T7 trên mơi trưng PGA 65 Hình 3.18. S lưng bào t thu đưc ca 04 chng C07, C22, DY16 và T7 02 t l cơ cht khác nhau trên mơi trưng nhân nuơi 66 Hình 3.19. Din bin chiu cao cây tiêu các cơng thc thí nghim qua các1 thi đin nghiên cu 68
viii Hình 3.20. Din bin s lá/cây tiêu cácc cơng thc thí nghim qua các thi đim nghiên cu . 68 Hình 3.21. Cây tiêu sau 06 tun chng tuyn trùng và x lý nm 69 Hình 3.22. Din bin chiu dài/b r qua các thi đim nghiên cu 69 Hình 3.23. B r tiêu sau khi chng tuyn trùng và x lý nm sau 6 tun 70 Hình 3.24. Din bin trng lưng tươi và trng lưng khơ/cây 70 Hình 3.25. Din bin trng lưng tươi và trng lưng khơ/b r 71 Hình 3.26. S lưng tuyn trùng Meloidogyne spp. trong 100g đt, trng tuyn trùng trong 5g r qua các kỳ điu tra 72
1 M ĐU 1. Đt vn đ Cây h tiêu cĩ ngun gc t n đ, đưc gây trng cách đây khong 6.000 năm. H tiêu đã tr thành mt loi gia v ph bin rt quan trng, chim 34% t l giao dch trong th trưng gia v. Nhu cu s dng trong cơng nghip ch bin thc phm ngày càng tăng, các sn phm thc phm cĩ thành phn h tiêu ngày càng đa dng và nhiu chng loi như: trong sn xut mì ăn lin, trong bt nêm, trong các loi nhân bánh và cĩ trong c ko, Ti mt s nưc ngưi ta s dng h tiêu trong dưc phm và hĩa m phm. Vit Nam hin nay là mt trong nhng nưc đng đu v xut khu h tiêu trên th gii. Din tích h tiêu Vit Nam hin nay khong 55.000 ha (2008), vi sn lưng xut khu hàng năm chim 50% tng sn lưng xut khu tiêu tồn cu, khng đnh v trí s 1 trên th trưng quc t. Vì vy, cây h tiêu là mt trong nhng cây trng mang li ngun thu nhp quan trng cho nhiu đa phương trong c nưc. T năm 1995 tr li đây, cây h tiêu đưc phát trin vi quy mơ và tc đ khá ln ti các tnh Đăk Lăk, Đăk Nơng, Gia Lai, Bình Phưc, Qung Tr, Đng Nai, Ch tính riêng hai tnh Đăk Lăk và Đăk Nơng thì t năm 1995 đn nay, din tích h tiêu mi phát trin lên ti gn 10.000 ha. Tuy nhiên trong năm 2005, 2006 và đu năm 2007, dch hi trên cây h tiêu phát sinh và gây hi nghiêm trng cho nhiu vùng sn xut h tiêu tp trung. Riêng ti Đăk Nơng, bnh hi r do nm và tuyn trùng làm cht 969 ha tiêu trong năm 2005. Mt trong nhng đi tưng gây hi quan trng trên cây tiêu hin nay là tuyn trùng sn r (root knot nematodes) Meloidogyne spp. Đây đưc coi là nhĩm tuyn trùng ký sinh quan trng nht trong ngành nơng nghip. Nhĩm tuyn trùng này phân b rng khp th gii và ký sinh trên hu ht các loi cây trng các vùng khí hu khác nhau. Hin nay khong 80 lồi ký sinh thuc ging này,
2 trong đĩ cĩ 4 lồi ký sinh gây hi ph bin là M.incognita , M.arenaria, M.javanica và M.hapla [18]. Bin pháp phịng tr tuyn trùng ch yu hin nay là s dng mt s loi thuc đc hiu như Furadan, Marshal, Oncol, Nokap, Vimoca, Hiu qu cĩ làm gim mt s tuyn trùng, nhưng vưn cây vn b bnh và phi áp dng thuc cho các năm tip theo. Vic s dng thuc chưa mang li hiu qu cao và s dn đn hin tưng kháng thuc, mt cân bng h sinh vt và vi sinh vt đt, d dn đn hin tưng bc phát các dch bnh khác và đc bit là nh hưng mơi trưng và tn dư thuc trong nơng sn. Trong khi đĩ, vic áp dng các k thut tin b v cơng ngh sinh hc cũng như cơng ngh vi sinh trong trng trt hin nay vn cịn nhiu hn ch, nơng dân chưa cĩ thĩi quen s dng các sn phm sinh hc. Đng trưc tình hình đĩ, vic nghiên cu và chn lc vi sinh vt bn đa cĩ tính ký sinh, đi kháng cao trên tuyn trùng hi tiêu là vn đ đáng quan tâm, nhm gim thit hi và nâng cao năng sut, sn lưng, cht lưng sn phm. Mt trong nhng bin pháp hiu qu gĩp phn đm bo an tồn cho con ngưi và khơng gây ơ nhim mơi trưng là dùng bin pháp sinh hc đ phịng tr. Do vy mà chúng tơi thc hin đ tài: “Nghiên cu tuyn chn mt s vi nm đi kháng trên tuyn trùng Meloidogyne spp. gây hi cây h tiêu ti Đăk Nơng”. 2. Mc tiêu nghiên cu Phân lp và tuyn chn mt s dịng vi nm bn đa cĩ kh năng ký sinh trên tuyn trùng Meloidogyne spp. gây hi trên cây h tiêu ti đa bàn tnh Đăk Nơng. Xác đnh mt s yu t nh hưng đn tính ký sinh tuyn trùng ca vi nm đi kháng. Đánh giá hiu qu phịng tr tuyn trùng Meloidogyne spp. ca các dịng nm tuyn chn trên cây tiêu trong điu kin nhà lưi. 3. Ý nghĩa khoa hc và ý nghĩa thc tin 3.1. Ý nghĩa khoa hc
3 Ch đng s dng và bo tn ngun tài nguyên vi sinh vt phong phú, đa dng ti đa phương. B ging vi nm đưc phân lp t t nhiên cĩ th dùng đ to ngun ging ban đu cho các cơng trình nghiên cu tìm hiu cơ ch tác đng đi kháng ca các lồi vi nm đi kháng tuyn trùng; gĩp phn làm sáng t cơ s khoa hc v mi quan h gia vi nm đi kháng vi tuyn trùng gây bnh hi cây trng. 3.2. Ý nghĩa thc tin và hiu qu ng dng Gĩp phn khai thác tim năng ng dng ca ngun tài nguyên vi sinh vt bn đa vn rt phong phú, đa dng. - S dng các chng vi nm đi kháng như là mt tác nhân sinh hc trong phịng tr bnh hi cây trng ti đa phương. Đng thi s dng các chng này trong vic sn xut phân bĩn sinh hc th h mi, va cĩ tác dng phịng nga tác nhân gây bnh, va đy mnh các quá trình phân hy tàn dư thc vt trong đt, to s cân bng sinh thái và bo v mơi trưng. 4. Gii hn ca đ tài Trong quá trình thc hin, do thi gian, trang thit b, hĩa cht cĩ hn nên chúng tơi ch tin hành phân lp, th tính ký sinh ca mt s chng nm phân lp đưc ti mt s vùng trng tiêu trng đim ti Đăk Nơng. Đng thi, tt c nghiên cu ch đưc thc hin quy mơ phịng thí nghim, chưa đưc đưa vào th nghim phịng tr cây tiêu trên đng rung nên chưa đánh giá đưc kh năng thc nghim phịng tr tuyn trùng Meloidogyne spp. ca các lồi nm phân lp đưc.
4 Chương I: TNG QUAN TÀI LIU 1.1. Gii thiu chung v cây h tiêu 1.1.1. Ngun gc cây tiêu Tiêu cĩ ngun gc vùng Ghats min Tây n Đ, đây cĩ nhiu ging tiêu hoang di, mc rt lâu đi. Sau đĩ, tiêu đưc ngưi Hindu mang ti Java (Indonesia) vào khong 600 năm sau cơng nguyên. Cui th k 12, tiêu đưc trng Mã Lai. Đn th k 18, tiêu đưc trng Srilanka và Campuchia. Vào đu th k 20 thì tiêu đưc trng nhiu các nưc nhit đi như Châu Phi vi Mandagasca, Nigieria, Congo và Châu M vi Brazil, Mexico, Tiêu du nhp vào Đơng Dương t th k 17 nhưng mãi đn th k 18 mi bt đu phát trin mnh khi mt s ngưi Trung Hoa di dân vào Campuchia vùng dc b bin vnh Thái Lan như Konpong, Trach, Kep, Kampot và tiêu vào Đng bng Sơng Cu Long qua ngõ Hà Tiên ca tnh Kiên Giang, ri sau đĩ lan dn đn các tnh khác min Trung – Tây Nguyên như Tha Thiên – Hu, Qung Tr, Đăk Lăk, Gia Lai, Đăk Nơng, 1.1.2. Cơng dng ca cây tiêu Tiêu là loi cây trng cĩ th sng lâu năm và cĩ giá tr kinh t cao. Tiêu đưc s dng làm gia v, trong y dưc, trong cơng nghip hương liu và làm cht tr cơn trùng. Cht gia v: Ht tiêu cĩ v nĩng, cay, cĩ mùi thơm hp dn nên rt thích hp cho vic ch bin các mĩn ăn. Vì vy mà tiêu đã tr thành gia v đưc dùng rt ph bin trên th gii. Trong y dưc: Do cĩ s hin din ca cht piperin, tinh du và nha cĩ mùi thơm, cay, nĩng đc bit, tiêu cĩ tác dng kích thích tiêu hĩa, làm cho ăn ngon ming. Ngồi ra, tiêu cịn cĩ tác dng làm cho m bng, thưng dùng chung vi gng đ cha chng tiêu chy, ĩi ma khi ăn nhm mĩn ăn l, dùng chung vi hành lá trong tơ cháo gii cm Tuy nhiên, khi dùng quá nhiu, tiêu
5 cĩ th gây táo bĩn, kích thích niêm mc d dày, gây st, viêm đưng tiu và cĩ khi gây tiu ra máu. Trong cơng nghip hương liu: Cht piperin trong ht tiêu đưc thy phân thành piperidin và acid piperic. Oxy hĩa acid piperic bng permanganate kali (KMnO 4), thu đưc piperonal (heliotropin nhân to) cĩ mùi hương tương t như heliotropin và coumarin, dùng đ thay th các hương liu này trong k ngh làm nưc hoa. Tinh du tiêu vi mùi thơm đc bit đưc s dng trong cơng nghip hương liu và hĩa dưc. Tr cơn trùng: Trưc kia, ngưi ta dùng dung dch chit xut t ht tiêu xay tm vào da trong khi thuc đ nga cơn trùng phá hoi, nhưng t khi xut hin các loi thuc hĩa hc cơng dng và r tin hơn thì tiêu khơng cịn đưc s dng trong lĩnh vc này na. 1.1.3. Đc đim hình thái ca cây tiêu * H thng r: Thưng gm t 3 – 6 r cái và mt chùm r ph dưi mt đt, trên đt thân cĩ r bám (r thn ln). R cc: Ch cĩ nhng cây tiêu trng bng ht mi cĩ r cc. R này đâm sâu xung đt đn đ sâu 2,5 m, làm nhim v chính là hút nưc. R cái: Các r này cũng làm nhim v chính là hút nưc. Đi vi cây tiêu trng bng giâm cành, sau khi trng ra ngồi nc đưc 1 năm, các r cái này cĩ th ăn sâu đn 2 m. R ph: Các r ph mc thành chùm, phát trin theo chiu ngang, rt dày đc, phân b nhiu nht đ sâu 15 – 40 cm, làm nhim v hút nưc và hút cht dinh dưng trong đt đ nuơi cây. R cây tiêu thuc loi háo khí, khơng chu đưc ngp úng, do đĩ đ to cho r cái ăn sâu, cây chu hn tt và r ph phát trin tt hút đưc nhiu cht dinh dưng thì phi thưng xuyên cĩ bin pháp ci to làm cho đt đưc tơi xp, tăng hàm lưng mùn. Ch cn úng nưc t 12 24 gi thì b r cây tiêu đã b tn thương đáng k và cĩ th dn ti vic hư thi và dây tiêu cĩ th b cht dn.
6 R bám: Mc ra t các đt trên thân trên khơng, làm nhim v chính là giúp cây tiêu bám vào chối, vách tưng đ vươn lên cao. Kh năng hút nưc và hút cht dinh dưng ca r bám rt hn ch, gn như khơng đáng k. * Thân, cành, lá : Tiêu thuc loi thân tho mm do đưc phân thành nhiu đt, ti mi đt cĩ mt lá đơn, hình trái tim, mc cách. nách lá cĩ các mm ng cĩ th phát sinh thành các cành tưc, cành lươn, cành ác (cành cho trái) tùy theo tng giai đon phát trin ca cây tiêu. Cành tưc (cành vưt): Thưng phát sinh t mm nách trên các cây tiêu nh hơn 1 tui. Đi vi cây trưng thành, cành tưc phát sinh t các mm nách trên khung cành thân chính phía dưi thp ca tr tiêu, và thưng là cành cp 1. Đc đim ca cành tưc là gĩc đ phân cành nh, dưi 45 0, cành mc tương đi thng. Cành tưc cĩ sc sinh trưng mnh, khe, thưng đưc dùng đ giâm cành nhân ging. Cành lươn: Cành phát sinh t mm nách gn sát gc ca b khung thân chính ca cây tiêu trưng thành. Đc trưng ca cành lươn là cĩ dng bị sát đt và các lĩng rt dài. Cành lươn cũng đưc dùng đ nhân ging, tuy vy, t l sng thp và cây thưng ra hoa trái chm hơn so vi cành tưc nhưng tui th li dài và năng sut cao. Cành cho trái (cịn gi là cành ác hay cành ngang): Đĩ là cành mang trái, thưng phát sinh t mm nách trên cây tiêu ln hơn 1 năm tui. Đc trưng ca cành ác là gĩc đ phân cành ln, mc ngang, đ dài ca cành thưng ngn hơn 1 m, cành khúc khuu và lĩng rt ngn, cành cho trái trên b khung cây tiêu đa s là cành cp 2 tr lên. Cành cho trái nu đem giâm cành cũng ra r, cho trái rt sm. Tuy vy, cây phát trin chm, khơng leo mà mc thành bi vì lĩng đt khơng cĩ r bám hoc rt ít. Cây mau ci và năng sut thưng thp. * Hoa, qu: Cây tiêu ra hoa dưi dng hoa t hình gié, treo lng lng, dài 7 – 12 cm tùy ging tiêu và tùy điu kin chăm sĩc. Trên gié hoa cĩ bình quân 20 – 60 hoa xp thành hình xon c, hoa tiêu lưng tính hay đơn tính.
7 Trái tiêu thuc loi trái hch, khơng cĩ cung, mang 1 ht hình cu. T khi hoa xut hin đy đ cho đn khi trái chín kéo dài t 7 – 10 tháng chia làm các giai đon sau: Hoa t xut hin đy đ đn khi hoa n th phn: 1 – 1,5 tháng. Th phn, phát trin trái (4 – 5,5 tháng): giai đon này tiêu ln nhanh v kích thưc và đt đ ln ti đa ca trái, đây là giai đon tiêu cn nưc và dinh dưng nht. Trái chín (2 – 3 tháng): Trong giai đon này ht bt đu phát trin, đt đưng kính ti đa. Trái tiêu thưng chín tp trung vào các tháng 1 – 2 trong năm, đơi khi kéo dài đn các tháng 4 – 5 do các la hoa ra tr và cũng tùy theo ging. 1.2. Gii thiu chung v tuyn trùng thc vt Tuyn trùng thc vt là nhĩm đng vt khơng xương sng cĩ đc đim sinh thái thích nghi vi đi sng ký sinh thc vt. Nhĩm tuyn trùng này cĩ mt s đc trưng quan trng so vi nhĩm ký sinh đng vt và các nhĩm sinh thái khác như: cĩ kích thưc hin vi; phn ming cĩ cu to kim hút chuyn hĩa đ châm chích mơ thc vt và hút cht dinh dưng; kích thưc ca trng ln so vi kích thưc cơ th; đi sng ca chúng cĩ quan h bt buc và trc tip vi thc vt đang phát trin. Trong đĩ, cu to kim hút chuyn hĩa là khác bit quan trng nht. V mt phân loi hc, tuyn trùng ký sinh thc vt gm 4 nhĩm liên quan đn 4 b tuyn trùng là: B Tylenchida (ch tr mt s lồi tuyn trùng h Tylenchidae ); B Aphelenchida ; Các lồi tuyn trùng h Longidoridae ca b Dorylaimida ; Các lồi tuyn trùng h Trichodoridae thuc b Triplonchida . Trong các nhĩm ký sinh trên thì nhĩm lồi thuc b Tylenchida là nhĩm tuyn trùng ký sinh đơng đo nht và cĩ tm quan trng nht đi vi sn xut nơng nghip. Tuyn trùng thc vt sng và ký sinh tt c các phn ca thc vt đang phát trin, hoa, lá, ht, thân và r, trong đĩ r là nơi gp nhiu nhĩm tuyn trùng ký sinh nht.
8 Tuyn trùng ký sinh thc vt cĩ nhng tp quán dinh dưng rt khác nhau, mt s lồi dinh dưng trên nhng mơ ngồi ca thc vt, mt s khác thâm nhp vào các mơ sâu hơn, và mt s khác cĩ th làm cho cây ch to ra nhng ngun dinh dưng đc bit ti nơi chúng ký sinh. Tác hi do tuyn trùng gây ra đi vi thc vt thưng là tương đi nh, tuy nhiên khi mt đ ln chúng cĩ th gây hi nghiêm trng, thm chí chúng cĩ th gây cht thc vt. Ngồi ra, mt vài tuyn trùng cĩ th làm gim kh năng ca thc vt kháng li s xâm nhp ca các tác nhân vi sinh vt gây bnh khác và làm cho tác hi đi vi thc vt càng trm trng thêm. Mt s tuyn trùng ký sinh chuyn hĩa cĩ kh năng mang truyn virus gây bnh cho thc vt. Tuyn trùng ký sinh cĩ th làm gim 12,5% sn lưng cây trng và thit hi do tuyn trùng ký sinh đi vi cây trng nơng nghip ưc tính là hàng trăm t đơ la M mi năm. V hình thc kí sinh trên thc vt, tuyn trùng cĩ th phân thành 3 nhĩm ký sinh như sau: Ngoi ký sinh: tuyn trùng khơng xâm nhp vào bên trong mơ thc vt mà bám bên ngồi b mt r, dinh dưng ca tuyn trùng bng vic s dng kim chích châm chích và hút cht dinh dưng trong t bào thc vt. Bán ni ký sinh: ch phn đu ca tuyn trùng xâm nhp vào trong r, cịn phn sau cơ th tuyn trùng vn ngồi đt. Ni ký sinh: tồn b tuyn trùng xâm nhp vào r. Nhĩm này đưc chia 2 nhĩm nh: Ni ký sinh di chuyn: tuyn trùng vn gi kh năng di chuyn trong mơ thc vt và chúng chuyn đng t mơ này đn mơ khác đ dinh dưng. Ni ký sinh c đnh: sau khi xâm nhp vào r, tuyn trùng dinh dưng ti mt nơi c đnh (to nên các t bào dinh dưng), chúng mt kh năng di chuyn và tr nên phình to ra (béo phì). Các kiu ký sinh trên đây khơng loi tr ln nhau vì mt s ging tuyn trùng cĩ th là bán ni ký sinh hoc ngoi ký sinh di chuyn ph thuc vào vt ch. tuyn trùng sn r (Meloidogyne spp.) và tuyn trùng bào nang
9 (Heterodera /Globora ), u trùng tui 2 là giai đon xâm nhp vào r. Nhưng các tuyn trùng ngoi ký sinh và hu ht ni ký sinh di chuyn thì hu như tt c các giai đon đu cĩ th dinh dưng và xâm nhp vào r. mt s tuyn trùng (như Rotylenchus ), con cái trưc trưng thành là giai đon xâm nhp, cịn u trùng và con đc vn trong đt và khơng dinh dưng. Tĩm li, do nhn thc v tuyn trùng thc vt ngày càng phát trin, đc bit đ đáp ng cho mt nn nơng nghip bn vng vi trình đ sn xut cao trong s hin din ca tuyn trùng ký sinh, cn phi nghiên cu mi khía cnh ca mi quan h qua li gia tuyn trùng thc vt và thc vt trên cơ s s dng kin thc tích lũy đưc ca nhiu ngành sinh hc và các lĩnh vc liên quan nhm tìm hiu, nghiên cu các bin pháp qun lý, phịng tr đi tưng này mt cách cĩ hiu qu (Vũ Triu Mân, 2007) [18]. 1.3. Đc đim ca tuyn trùng Meloidogyne spp. Tuyn trùng sn r (rootknot nematodes) đưc coi là nhĩm tuyn trùng ký sinh quan trng nht, chúng gây hi trên hơn 3.000 lồi thc vt trên tồn th gii, bao gm hu ht các cây trng quan trng như rau màu, đu đ, ngũ cc, cây hịa tho, cây bi và cây ăn qu, tho mc và nhiu lồi cây cnh thân g (Malcolm & Charles, 2000) [52]. Tuyn trùng gây gim sn lưng thu hoch cũng như cht lưng sn phm cây trng. Hin nay đã thng kê khong gn 80 lồi ký sinh thuc ging này, trong đĩ cĩ 4 lồi ký sinh gây hi quan trng nht là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla . Đây là các lồi phân b rng và gây hi ln các vùng nơng nghip trên th gii. Ngồi ra, mt s lồi khác mc dù cũng gây hi quan trng nhưng chúng ch gây hi 1 2 cây trng và phân b hp. Tuyn trùng Meloidogyne spp. (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là lồi tuyn trùng ni ký sinh r thuc: Ging Meloidogyne H Meloidogynidae B Tylenchida
10 1.3.1. Đc đim sinh hc Trng ca tuyn trùng sn r đưc con cái đ ra ngồi trong mt bc gelatin (cịn gi là bc trng) nm trên b mt ca sn r. Đơi khi các bc trng này cũng cĩ th nm bên trong nt sn. Sau quá trình phát trin phơi thai, trng phát trin thành u trùng tui 1 ngay bên trong trng. Ln lt xác th nht xy ra trong trng và phát trin thành u trùng tui 2. Trng n ra u trùng tui 2 dng cm nhim IJ2 mà khơng cn cĩ s kích thích ca r thc vt. Khi chun b xâm nhp vào r, IJ2 tp trung dc theo các t bào non ngay ti phía sau vùng đnh r. IJ2 thưng tn cơng vào các mơ phân sinh đnh r, nơi các r bên mc ra to nên đim xâm nhp cho các IJ2 khác và làm cho b mt r b tn thương. Khi IJ2 tip xúc vi b mt r, chúng thưng dùng kim hút châm chích và xâm nhp ngay vào trong r. S xâm nhp ca chúng cĩ th xy ra bt kỳ phía nào ca r. Sau khi xâm nhp vào trong r, tuyn trùng di chuyn gia các t bào v r làm cho các t bào b tách dc ra, sau đĩ tuyn trùng đnh v ti vùng mơ phân sinh ca v r và bt đu quá trình dinh dưng. Khi dinh dưng, tuyn trùng cm phn đu vào các t bào mơ mch ca r, tit men tiêu hĩa làm cho quá trình sinh lý sinh hĩa ca mơ r thay đi và hình thành các đim dinh dưng cho tuyn trùng. Vùng này gm 5 6 t bào khng l (t bào cĩ nhiu nhân) đưc to thành trong vùng nhu mơ hoc vùng mơ libe, nơi đu tuyn trùng. Đây là s thích nghi chuyn hĩa cao ca t bào, chúng đưc to ra và duy trì bng tuyn trùng ký sinh. Cùng vi s hình thành t bào khng l các mơ r xung quanh nơi tuyn trùng ký sinh cũng phình to ra to thành sn r (gall hoc rootknot). Sn r thưng đưc to thành trong vịng 1 2 ngày sau khi tuyn trùng xâm nhp. Kích thưc ca nt sn liên quan đn cây ch, s lưng IJ2 xâm nhp và lồi tuyn trùng ký sinh. Bn thân tuyn trùng cm nhim, sau khi xâm nhp vào r cũng bt đu mt cách nhanh chĩng quá trình thay đi v hình thái: cơ th chúng phình ra và các ni quan cũng dn đưc phát trin. Quá trình phát trin ca tuyn trùng trong r t IJ2 tri qua 3 ln lt xác và đt đn trưng thành. Ln lt xác cui cùng là
11 s bin thái tht s đi vi con đc, t dng cun gp khúc trong IJ4 chúng đưc n ra và cĩ dng hình giun, trong khi đĩ con cái cĩ dng hình trịn như qu lê hay qu chanh. Tuyn trùng Meloidogyne spp. sinh sn bng 2 cách: mt vài lồi sinh sn hu tính giao phi bt buc (amphimixis) và phn ln các lồi sinh sn lưng tính (parthenogenessis) khơng cn con đc. Đi vi các lồi hu tính thì con đc cp đơi ngay vi con cái sau ln lt xác cui cùng. Tuyn trùng sn r cĩ quan h mt thit vi cây ch các điu kin mơi trưng (bao gm: nhit đ và các yu t sinh thái đt như đ m, cu trúc đt, đ thống khí, pH, ). Cĩ th phân bit 2 nhĩm sinh thái liên quan đn nhit đ là nhĩm ưa nĩng (các lồi đin hình như M. incognita, M. javanica, M. exigua ) và nhĩm ưa lnh (các lồi đin hình như M. hapla, M. chitwooodi và cĩ th c M. naasi ) liên quan đn pha chuyn hĩa lipide ca tuyn trùng xy ra 10 0C. Tác hi do tuyn trùng gây ra đi vi cây trng thưng cĩ liên quan đn loi đt kim, là mơi trưng to ra các sc bt li (stress) cho thc vt (Vũ Triu Mân, 2007) [18], [19]. Nguyn Vũ Thanh, Nguyn Ngc Châu (1993) [24] vịng đi ca tuyn trùng Meloidogyne incognita phát trin qua 5 giai đon chính: Trng (u trùng tui 1) u trùng tui 2 (u trùng cm nhim) u trùng tui 3 u trùng tui 4 tuyn trùng trưng thành. Giai đon u trùng cm nhim trong đt, cịn các giai đon khác hình thành và phát trin trong r tiêu. Trong 5 giai đon này thì u trùng tui 2 và tuyn trùng Meloidogyne spp. cái thưng dùng đ xác đnh lồi. 1.3.2. Các yu t sinh thái, mơi trưng nh hưng đn mt đ tuyn trùng Chu kỳ phát trin (vịng đi) ph thuc vào nhit đ các tháng trong năm và ph thuc vào cây ký ch: nhit đ thích hp cho tuyn trùng sinh trưng và phát trin là 2528 oC. nhit đ 28 oC, vịng đi ca M. incognita là 28 – 39 ngày trên cây thuc lá. Nhit đ thp 20 oC, vịng đi ca chúng kéo dài trong khong 5759 ngày. Mi con tuyn trùng cái cĩ th đ t 3503.000 qu trng trong bc trng, trung bình n 200600 tuyn trùng non. Trng và tuyn trùng non cĩ th tn ti trong đt hàng năm nu khơng gp điu kin thun li và cây
12 ký ch phù hp (Vũ Triu Mân, 2007) [19]. Đc tính đt như kt cu đt, m đ đt (Dropkin, 1980) [38] và pH (Wallace, 1970) [75] nh hưng đn sinh trưng, phát trin ca tuyn trùng. pH t 5,6 5,8 thì tt nht cho sinh trưng ca tiêu và cũng tt cho tuyn trùng tăng trưng vi mt đ cao trong đt (Zaubin, 1979) [79]. Nhit đ và lưng mưa là nhng yu t chi phi rt ln đn mt đ tuyn trùng gây hi. Biên đ dao đng ca mt đ tuyn trùng trong năm do các yu t này chi phi đn 7,5 ln. Loi đt trng cũng cĩ vai trị ln đn s phát trin ca tuyn trùng. Bnh sn r phát trin mnh trên đt basalt (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1993) [8]. Phân bĩn hu cơ và vơ cơ cũng nh hưng đáng k đn mt đ tuyn trùng. Thí nghim Tân Lâm cho thy bĩn phân chung đã hoai cho tiêu 20 40 kg/gc cĩ kh năng làm gim mt đ tuyn trùng 20 30 % (Nguyn Ngc Châu, 1994) [3], (Nguyn Ngc Châu, 1995a) [4]. Ging tiêu khác nhau cũng cĩ kh năng kháng bnh tuyn trùng khác nhau. Ti Tân Lâm tiêu s lá nh cĩ kh năng chng bnh tuyn trùng tt hơn so vi ging tiêu Lada Belantoeng lá ln nhp t nơi khác đn (Nguyn Ngc Châu, 1995b) [5]. T l bnh trên tiêu kinh doanh cao hơn tiêu kin thit cơ bn (Nguyn Th Lan, Vũ Triu Mân, 1990) [12]. Cây trng xen như đu đ, cúc vn th, đu hng cĩ kh năng gim mt đ tuyn trùng hi tiêu 20 30 % (Nguyn Ngc Châu, 1995a) [4]. 1.3.3. Tp quán sinh sng và gây hi Quan sát mơ hc ch ra rng: s xâm nhp nhiu nht ca u trùng tui 2 xut hin vùng đu mơ phân sinh r. Đu tiên thành lp các t bào ln, cùng lúc đĩ s phát trin ca nhng t bào này xy ra 2 giai đon sau: (1) S phân hy các vách t bào r k sát, sau đĩ là s dung hp các t bào này. (2) Gián phân liên tc khơng cĩ s phân bào (Freine & Santos, 1978) [39].
13 Tuyn trùng t đt xâm nhp vào r tiêu giai đon u trùng cm nhim IJ2. Sau khi xâm nhp vào r, tuyn trùng khu trú ti mt ch và dùng kim hút chc thng t bào mơ tr ca r, tit men tiêu hĩa vào mơ đ thc hin quá trình dinh dưng. Ti đây tuyn trùng nhanh chĩng phát trin qua các giai đon đ thành tuyn trùng trưng thành (tuyn trùng đc dng si ch, tuyn trùng cái dng hình qu lê). Dưi tác dng ca các men tiêu hĩa do tuyn trùng tit ra, các t bào xung quanh tuyn trùng phát trin bt thưng, to thành các t bào khng l cĩ nhiu nhân. Kt qu làm r phình to ra to thành nhng u hay nt sn, h r b bin dng. Nhng nt sn này cĩ th nh, riêng bit hoc ln và tp hp li thành chui, ph thuc vào mc đ nhim ca cây ký ch (Nguyn Ngc Châu và ctv., 1990) [9], (Nguyn Ngc Châu, Nguyn Vũ Thanh, 1991) [6], (Whitehead, 1998) [76]. 1.3.4. Quá trình phát trin ca bnh Tuyn trùng ký sinh khơng nhng to thành nt sn mà cịn làm cho r h tiêu bin đi màu sc và hy hoi chc năng (Nguyn Ngc Châu và ctv., 1990) [9], chia quá trình phát trin ca bnh làm 3 giai đon: Giai đon 1: Khi tuyn trùng mi xâm nhp vào r và to nt sn, r tiêu vn cịn màu sáng, chc năng ca r chưa b nh hưng nhiu. Giai đon 2: R chuyn sang màu nâu, chc năng dinh dưng và vn chuyn nưc ca r đã b nh hưng. Giai đon 3: R chuyn thành màu đen, chc năng ca r b phá hy hồn tồn. T giai đon 2, do r b tn thương và xy ra quá trình hoi sinh, to điu kin cho nm, vi khun xâm nhp và cĩ th gây thêm các bnh khác cho cây. Bnh sn r khơng ch biu hin nhng cây vàng mà cịn c nhng cây nhìn b ngồi cịn xanh tt. S dĩ cây cịn xanh là do bnh mi phát trin giai đon đu, chc năng ca r chưa b hy hoi, cịn nhng cây vàng thưng bnh đã phát trin giai đon cui, lúc này b r đã b phá hy nhiu, to điu kin đ các bnh nm, vi khun cùng phát trin và gây hi cho cây (Nguyn Ngc Châu và
14 ctv., 1990) [9]. Theo Winoto (1972) [77] Sarawak, Malaysia bnh vàng lá biu hin: lá mt dip lc, cây cịi cc và cĩ triu chng thiu dinh dưng nghiêm trng. Triu chng bnh tăng thêm khi cĩ s kt hp gia s nhim Meloidogyne incognita và Fusarium solani , s khơ hn và s nghèo dinh dưng. Theo Nambiar & Sarma (1977) [58], n Đ bnh héo chm thưng xut hin sau khi cĩ giĩ mùa Đơng Bc. Triu chng ban đu là nhng lá phía dưi b vàng tin dn lên nhng lá phía trên, nhng lá b nhim bt đu héo và rng. Thưng cĩ triu chng cháy đu lá và khơ cành. Dây tiêu biu hin vàng lá, sn r, thi c r nh và r ln mc đ khác nhau, cui cùng dây tiêu b cht, nhng bĩ mch ca chi và r hĩa nâu. De Waard (1979) [36] cho rng s phá hi tiêu đưc biu hin bng s tin trin ca lá vàng và s cht ca lá ngn nh hưng đn tiêu. Ranjith, A. M. (1985) quan sát bnh vàng lá khơ dây tiêu Pilicode, n Đ nhn thy s vàng lá bt đu đu lá, lan dn đn mép lá, gia các lá và sau cùng là tồn b lá khơ rng. S nhim chiu thng đng thưng nghiêm trng hơn nhánh ngang. Nhng dây tiêu b nhim bnh thưng b khơ trong vịng 2 3 tháng, nhưng sau mt trn mưa, nhng phn khơng b khơ bt đu đâm chi t nhng mt và chi non phát trin. 1.3.5. Các yu t lan truyn tuyn trùng h tiêu Tuyn trùng cĩ th lan truyn qua các con đưng sau: Tiêu ging t trong vưn ươm đã b nhim bnh. Qua ngưi sn xut, súc vt, dng c, máy mĩc canh tác. Lan truyn theo dịng chy t nhiên (Nguyn Ngc Châu, Nguyn Vũ Thanh, 1991) [6], (Nguyn Ngc Châu, 1995a) [4]. Ngun bnh cĩ sn lơ trưc khi trng tiêu: do các cây ký ch ca Meloidogyne spp. như bí đ, cà chua, thuc lá, c hơi (Nguyn Ngc Châu, Nguyn Vũ Thanh, 1991) [6].
15 1.3.6. Các lồi Meloidogyne spp. gây hi quan trng Theo Vũ Triu Mân (2007) [18] mt s lồi tuyn trùng Meloidogyne gây hi khá ph bin và quan trng đi vi thc vt hin nay: M. incognita là lồi ph bin nht, ký sinh gây hi trên nhiu cây trng khác nhau và phân b trên mt vùng đa lý rng t 40 vĩ đ bc đn 33 vĩ đ nam trên phm vi tồn th gii. Đây cũng là lồi ký sinh gây hi ph bin nht trên cây trng Vit Nam, trong đĩ chúng ký sinh gây hi ph bin nht : h tiêu, cà phê, cà chua, bí đ, đu đ, các cây h cà, h đu, chui, M. javanica. Là lồi ph bin th 2 sau lồi trên và cĩ di phân b tương t. Đây là lồi cĩ kh năng chu đng qua mùa khơ hn trong thi gian 3 6 tháng. Vit Nam, lồi này ký sinh tương đi ph bin sau lồi M. incognita , gây hi chính cho các cây lc, chui. M. arenaria. Là lồi ph bin th 3 sau, phân b khp th gii gn ging như các lồi M. incognita và M. javanica. Đây cũng là lồi ký sinh gây hi tương đi ph bin Vit Nam trên các cây đu, lc. M. graminicola. Ký sinh gây hi chính cho lúa cn vùng nhit đi và cn nhit đi (Đơng Nam Á, Nam Phi, M). nưc ta, lồi này ký sinh tương đi ph bin trên lúa cn (giai đon lúa non, khi chưa ngp nưc) vùng đng bng sơng Cu Long. 1.4. Các nghiên cu trong và ngồi nưc v tuyn trùng Meloidogyne spp. 1.4.1. Các nghiên cu v tuyn trùng Meloidogyne spp. trên th gii Bnh vàng lá tiêu hay “Bnh héo chm” đã đưc Van der Vecht báo cáo ln đu tiên vào năm 1932 trên đo Bangka, Indonesia (Van der Vecht, 1950) [73]. Triu chng tương t cũng đưc tìm thy trên cây cây tiêu các nưc trng tiêu trên th gii như n Đ (Nambiar & Sarma, 1977) [58], Indonesia (Harper, 1974) [41], (Bridge, 1978) [33], Malaysia (Winoto, 1972) [77], Thái Lan (Chantanao, 1978) [35]
16 Trên cây tiêu, Zimmerman là ngưi đu tiên chng minh s cĩ mt ca tuyn trùng nt sn (Meloidogyne spp .) nh hưng đn tiêu trng Java, Sarawak và Johore (Winoto, 1972) [77]. Sn xut tiêu Thái Lan b thit hi rt nhiu v kinh t do tuyn trùng nt sn. Winoto (1972) [77] ch ra rng M. incognita và M. javanica đu làm gim sinh trưng ca cây tiêu mt cách cĩ ý nghĩa. Ichinohe (1976) [42] điu tra Brazil vào lúc tiêu suy gim nghiêm trng cho bit ch cĩ 1/71 vưn điu tra khơng b nhim tuyn trùng nt sn; 91% s cây điu tra b nhim tuyn trùng; 75% s cây phân tích đu b nh hưng nghiêm trng ca nhng lồi tuyn trùng này. Lồi ưu th đưc nhn dng là M. incognita . T l bnh tăng cc đi tiêu 5 năm tui. các nưc Đơng Nam Á, ging Meloidogyne và Rotylenchulus đưc coi là k thù vơ cùng nguy him đi vi cây h tiêu. Ti Indonesia, năm 1975 làm gim sn lưng h tiêu khong 10%, cịn Malaysia nhiu cánh đng trng tiêu đã b cht tri do tuyn trùng ký sinh gây nt sn Meloidogyne spp. (Nguyn Vũ Thanh, 1983) [23]. M. incognita (Kofoid &White, 1991; Chitwood, 1949) là lồi tuyn trùng ni ký sinh c đnh, làm sưng phng r. Lồi tuyn trùng này xut hin ph bin trên cây tiêu (Holiday & Mowat, 1963; Winito, 1972; Sharma & Loof, 1974; ). Meloidogyne incognita sinh sn đơn tính, mc dù con đc ph bin và cĩ th tp hp giai đon cui đ dn d con cái (Whitehead, 1998) [76]; Vịng đi ca M. incognita thưng t 32 42 ngày nhit đ 25 30 oC (Campos, 1990) [34]; Mt khi trng ca M. incognita khong 1.000 trng. Nhit đ nh hưng nhiu đn hot đng tuyn trùng, đc bit là s n trng. Trng ca M. incognita n tt nht trong nưc nhit đ 25 oC (Mustika, 1990) [55]. R b phá hoi nng do Meloidogyne spp. s b bin dng và cu trúc mch b phá v làm cho s vn chuyn nưc và cht khống b cn tr, tăng trưng chm li. Trong điu kin khơ, hin tưng héo ri cĩ th xy ra và cũng cĩ nhng triu chng tương t như thiu phân (Taylor & Sasser, 1978) [72].
17 M. incognita và M. javanica đưc báo cáo là nguyên nhân làm gim sinh trưng và vàng lá trên cây tiêu (Winoto, 1972) [77], (Kueh & Teo, 1978) [45]. Meloidogyne incognita và Radopholus similis là hai lồi tuyn trùng chim ưu th và đưc xem như đĩng vai trị trong s xut hin bnh vàng lá trên tiêu n Đ và Indonesia (Nambiar & Sarma, 1977) [58], (Bridge, 1978) [33], (Mustika, 1978) [54], (Mohandas & Ramana, 1987) [53], (Ramana & Mohandas, 1987) [63], (Ramana et al., 1987) [64]. Bridge (1978) [33] phân lp đưc bao gm tuyn trùng Radopholus similis, M. incognita và nm Fusarium oxysporum, F. solani t nhng r tiêu b bnh Indonesia. Da trên nhng điu tìm thy này, ơng đã cho rng bnh vàng lá cĩ nguyên nhân rt phc tp, khơng phi ch do mt tác nhân gây bnh: mt lồi tuyn trùng hay mt lồi nm, mà nguyên nhân do s tương tác gia tuyn trùng và nm. Pillay và Sasikumaran (1984) [62] cho rng điu kin đt bt li cĩ th là nguyên nhân cơ bn ca bnh héo chm, mt bnh nguy him nh hưng nhiu đn cây tiêu Kerala, n Đ. R b hi do các lồi nm Phytophthora sp., Fusarium sp., Diplodia sp., Rhizoctonia sp. và tuyn trùng Meloidogyne incognita, Radopholus similis và s thiu cân bng dinh dưng cĩ th là nguyên nhân th yu. Sarma et al., 1989 [65] khi nghiên cu bnh tiêu n Đ cho bit nguyên nhân gây bnh héo chm là do s kt hp gia tuyn trùng ký sinh, nm và thiu dinh dưng. Nambiar và Sarma (1977) [58] cho rng nguyên nhân gây bnh héo chm cây tiêu n Đ bao gm các lồi nm như Fusarium sp. , Rhizoctonia sp. và tuyn trùng như: Radopholus similis, Meloidogyne incognita . Nguyên nhân gây bnh vàng lá ca cây tiêu đo Bangka, Indonesia là do s kt hp gia s thiu ht dinh dưng và s tn cơng ca tuyn trùng (Zaubin, 1979) [79]. Nguyên nhân cơ bn là do s thiu dinh dưng trong đt và s gây hi ca tuyn trùng đưc xem như tác nhân gây bnh th hai (Wahid,
18 1976) [74], (De Waard, 1979) [36]. De Waard (1986) [37] ch ra rng hin tưng “stress’’ nưc cĩ th kt hp vi nh hưng ca bnh do tuyn trùng gây hi. Sher et al. (1969) [67] tìm thy 9 lồi tuyn trùng gây bnh trên tiêu Thái Lan; Bridge (1978) [33] phân lp đưc 8 lồi tuyn trùng gây hi tiêu Bangka, Indonesia; Sundararaju et al. (1979) [71] đã cĩ danh sách 35 lồi và ging tuyn trùng ký sinh kt hp vi tiêu n Đ. Kuriyan et al., 1981 [47] quan sát tuyn trùng ký sinh vùng r tiêu trng Kerala, n Đ nhn thy: tt c tiêu trong vùng này đu b nhim M. incognita, R. similis và Helicotylenchus spp., trong đĩ tuyn trùng M. incognita chim ưu th. Tuyn trùng Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919; Chitwoot, 1949) là lồi tuyn trùng cĩ phm vi phân b rng trên phm vi tồn th gii vùng Nhit đi và Á nhit đi (Whitehead, 1998) [76]. Meloidogyne incognita phân b rng trên tiêu n Đ, Brazil, Sri Lanka, Indonesia, Philippines, Thái Lan, Vit Nam, Malaysia, Borneo, Cochin China, Brunei, Kampuchia (Lordello, 1974) [49], (Sharma & Loof, 1974) [66], (Lamberti et al., 1983) [48], (Ramana & Mohandas, 1987) [63], (Koshy & Bridge, 1990) [46]. Winoto (1972) [77] ch ra rng Meloidogyne incognita và Meloidogyne javanica c hai cĩ th làm gim sinh trưng ca cây tiêu mt cách cĩ ý nghĩa. Ichinohe (1976) [42] điu tra Brazil vào lúc tiêu suy gim nghiêm trng cho bit ch cĩ 1/71 vưn điu tra khơng b nhim tuyn trùng nt sn; 91% s cây điu tra b nhim tuyn trùng; 75% s cây phân tích đu b nh hưng nghiêm trng ca nhng lồi tuyn trùng này. Lồi ưu th đưc nhn dng là Meloidogyne incognita . T l bnh tăng cc đi tiêu 5 năm tui. các nưc Đơng Nam Á, ging Meloidogyne và Rotylenchulus đưc coi là k thù vơ cùng nguy him đi vi cây h tiêu. Ti Indonesia, năm 1975 làm gim sn lưng h tiêu khong 10%, cịn Malaysia nhiu cánh đng trng tiêu
19 đã b cht tri do tuyn trùng ký sinh gây nt sn M. sp. (Nguyn Vũ Thanh, 1983) [23]. 1.4.2. Các nghiên cu v tuyn trùng Meloidogyne spp. ti Vit Nam Riêng Vit Nam, bnh tuyn trùng h tiêu đưc coi là mt trong nhng bnh nan gii nht, đã và đang gây hi ln cho các vưn tiêu hin nay các tnh Min Trung – Tây Nguyên và Min Nam Vit Nam (Phm Văn Biên, 1989) [1], (Nguyn Ngc Châu, Nguyn Vũ Thanh, 1993) [24]. Tuyn trùng gây nt sn r h tiêu làm gim năng sut và cĩ nguy cơ phá hy các vưn tiêu Vit Nam (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1992) [6]. Ging Meloidogyne xut hin chim t l 100 % trên các vưn tiêu điu tra ca Min Đơng Nam B (Phm Văn Biên, 1989) [1]. Vit Nam lồi M. incognita ký sinh và gây hi trên gn 100 lồi cây trng khác nhau (Nguyn Vũ Thanh và Nguyn Ngc Châu, 1993) [24]. Các cây ký ch ca Meloidogyne incognita là mt s cây trng và cây hoang di như: bí đ, cà chua, thuc lá, thuc lào, cây ngh, cây gng, tàu bay, cây c hơi (Nguyn Ngc Châu và ctv., 1990) [9]; (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1991) [6]. Phan Quc Sng (1987, 1988a) [20], [21] cho rng bnh hi r nguyên nhân do tuyn trùng gây hi thưng là tuyn trùng nt sn Meloidogyne incognita và tuyn trùng đc hang Radopholus similis . Cùng tác đng vi tuyn trùng cịn cĩ mt s nm khác như: Fusarium sp ., Rhizoctonia bataticola . Chi cc KDTV vùng II (1987) [10] li cho rng tác nhân gây bnh trên tiêu gm mt s lồi tuyn trùng tn cơng gây hi b r, trong đĩ quan trng nht là tuyn trùng M. incognita và nm Fusarium spp S kt hp gia 2 tác nhân nm bnh và tuyn trùng tùy điu kin ngoi cnh, đt đai, ch đ chăm sĩc, mc nưc ngm, đã gây ra các triu chng khác nhau trên cây tiêu. Nguyên nhân làm cây tiêu suy yu, lá vàng và rng ch cịn trơ li b xương trên nc là do nm Fusarium solani , ngồi ra cịn cĩ s gây hi ca rp sáp, tuyn trùng (Nguyn Văn Nam, 1996) [15]. Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh (1993) [8]: Các lồi tuyn trùng
20 Meloidogyne spp. tuy khác nhau v ký ch song ging nhau v quá trình phát trin. Tc đ và thi gian phát trin ph thuc vào nhit đ, ánh sáng, ký ch mà chúng sinh ra. Thi gian phát trin và hình thành mt vịng đi ca tuyn trùng Meloidogyne incognita ph thuc vào nhit đ và m đ. Thi gian cho 1 vịng đi khép kín ca tuyn trùng là 26 31 ngày. Trong điu kin khí hu ti Tân Lâm, vịng đi vào mùa hè t 26 28 ngày, v mùa đơng 29 31 ngày (Nguyn Vũ Thanh, Nguyn Ngc Châu, 1993) [24]. Đi vi cây tiêu Vit Nam nhng nghiên cu gn đây đã phát hin đưc hơn 20 lồi tuyn trùng gây hi các hình thc và mc đ khác nhau (Phm Văn Biên, 1989) [1]. Thành phn tuyn trùng ký sinh cây tiêu ti 4 nơng trưng: Vit Trung, Quyt Thng, Cn Tiên và Tân Lâm tnh Bình Tr Thiên bao gm 22 lồi ca 11 ging thuc 7 h ca 2 b Tylenchida và Dorylaimida (Nguyn Vũ Thanh, 1983) [23]. Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, (1993) [8] đã xác đnh đưc thành phn tuyn trùng ký sinh cây h tiêu vùng Tân Lâm (Qung Tr) bao gm 49 lồi tuyn trùng thuc 19 ging, 14 h, 3 b. Trong đĩ cĩ 4 lồi ký sinh nguy him và gây hi chính cho tiêu là Meloidogyne incognita, Rotylenchulus reniformis, Xiphinema americanum và Paratrichodorus nanus . Đây là các lồi tuyn trùng gây hi rt ph bin các vùng trng tiêu. Thành phn tuyn trùng Min Đơng Nam B gm 10 lồi, trong đĩ ging Meloidogyne và Rotylenchulus xut hin khá ph bin (Phm Văn Biên, 1989, 1990) [1], [2]. Chi cc kim dch thc vt vùng II (1987) [10] cho bit thành phn tuyn trùng trong đt huyn Đc Linh, Thun Hi gm 7 lồi tuyn trùng. Bnh tuyn trùng h tiêu đưc coi là mt trong nhng bnh nan gii nht, đã và đang gây hi ln cho các vưn tiêu hin nay các tnh Min Trung và Min Nam Vit Nam (Phm Văn Biên, 1989) [1], (Nguyn Ngc Châu,
21 Nguyn Vũ Thanh, 1993) [8]. Tuyn trùng gây nt sn r h tiêu làm gim năng sut và cĩ nguy cơ phá hy các vưn tiêu Vit Nam (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1992) [7]. Ging Meloidogyne xut hin chim t l 100% trên các vưn tiêu điu tra ca Min Đơng Nam B (Phm Văn Biên, 1989) [1]. Nguyn Ngc Châu và ctv. (1990) [9] cho thy hu ht din tích trng tiêu ca Xí nghip h tiêu Tân Lâm đu b nhim tuyn trùng ký sinh gây nt sn mc đ khác nhau, nơi nh nht là 8,7%, nơi nng nht là 100% tiêu b nhim tuyn trùng. Năm 1993, t l nhim bnh tuyn trùng Meloidogyne incognita vùng Tân Lâm (Qung Tr) là 85,7% (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1993) [8]. Tuyn trùng nt sn gây hi trên tiêu kinh doanh, kin thit cơ bn và ngay trong các vưn ươm (Nguyn Vũ Thanh, 1983) [23], (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1993) [8]. Vin BVTV (2008) [30], tuyn trùng gây hi h tiêu Đăk Nơng ch yu là lồi Meloidogyne incognita , khi kt hp vi mt s nm gây hi: Phytophthora , Pythium , Fusarium làm cho cây rng đt, bnh nng gây cht cây. Quá trình gây hi din ra t t, cĩ khi mt vài tháng hoc hàng năm. Tuyn trùng M. incognita cĩ ph bin trong đt và r ca cây h tiêu, trong 100 mu r và đt thì ch cĩ: 15 mu đt và khơng cĩ mu r nào là khơng cĩ tuyn trùng, 11 mu đt và 25 mu r cĩ mt đ tuyn trùng cao > 1.000 con / 50g đt và 5 g r. Như vy các tác gi ngồi nưc và trong nưc đu cho rng Meloidogyne incognita là lồi tuyn trùng gây hi chính và ph bin trên cây tiêu. 1.5. Mt s bin pháp phịng tr tuyn trùng Meloidogyne spp. Trong thc t thưng ch phát hin tình trng bnh khi b lá cĩ biu hin suy gim nên vic cha tr thưng chm tr, hiu qu kém, dn đn tình trng tiêu cht, bnh kéo dài trong sn xut. Đ phịng tr bnh này cĩ hiu qu, cn thc hin phương châm: “Tích cc áp dng nhng bin pháp cĩ tác dng phịng bnh, phát hin sm đ tr bnh kp thi ” (Phm Văn Biên, 1989) [1].
22 Nhng cây đã b bnh nng khơng cịn kh năng cu cha thì đào ht r đem đi đt, phơi i đt, hun đt h trng (Chi cc kim dch thc vt vùng 2, 1987) [10], (Phan Quc Sng, 1987, 1988a) [20], [21], (Phm Văn Biên, 1989) [1], (Nguyn Ngc Châu, 1995a) [4]. Mt s bin pháp phịng tr đã đưc nghiên cu và ng dng trong phịng tr tuyn trùng gây hi cây h tiêu: 1.5.1. Bin pháp chn ging Chn ging chng bnh đ trng trong đĩ cĩ ging Lada Belantoeng cĩ kh năng kháng bnh r tt (Phan Quc Sng, 1987, 1988a) [20], [21]. Chn trng nhng ging cĩ năng sut khá và tương đi ít bnh như: tiêu trung lá ln, tiêu trung lá nh, tiêu s lá ln, tiêu Lada Belantoeng. Khơng ly dây ging t vưn cĩ bnh (Phm Văn Biên, 1989) [1]. 1.5.2. Bin pháp canh tác Nhng bnh sinh ra t đt cĩ th phịng tr bng k thut canh tác (Sarma et al., 1989) [65]. Bin đi mt ch đ canh tác đúng, giúp cây sinh trưng, phát trin tt là bin pháp quan trng hàng đu đ tuyn trùng khĩ cĩ th xâm nhp và gây hi cho cây (Phm Văn Biên, 1989) [1]. * V sinh đng rung: V sinh đng rung trưc khi ươm cây hoc trng mi tiêu, cày i, phơi đt trưc khi trng (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1991) [6]. Đi vi vùng khai hoang: V sinh đng rung, nht sch c hơi, cày i, phơi đt, khơng nên trng tiêu ngay mà nên trng 1 2 v lc hoc ngơ ri mi trng tiêu (Nguyn Ngc Châu và ctv., 1990) [9]. Làm đt, tiêu dit c di, rác, phơi khơ, đt b rác, c khơ. Cĩ th hun đt cùng vi c rác khi cn thit (Ngơ Xuân Trung và ctv., 1998) [28]. V sinh vưn tiêu: Dn sch c di trưc khi trng, làm đt đ i trong mùa khơ, đào h sn trưc khi trng, trong mùa nng vun đt cùng vi c trong h, hái các lá bnh, dây bnh, dây già (Phm Văn Biên, 1989) [1].
23 * Che t, tưi và tiêu nưc: Mùa nng t gc bng rơm r và tưi nưc, mùa mưa thốt nưc tránh đ úng nưc (Chi cc KDTV vùng 2, 1987) [10]; (Vin BVTV, 2007), [30]. T gc dày trong mùa khơ. Trong vưn và xung quanh gc tiêu trng cây cúc vn th ( Tagetes arecta ). Nu thy cây tiêu chm b bnh thì nh ly c r cây cúc vn th đem cht nh vùi vào xung quanh vùng b r ca gc tiêu (Phan Quc Sng, 1987) [20]. * Phân bĩn: Phịng tr bnh vàng lá bng cách x lý phân bĩn liu lưng 400 kg N, 180 kg P, 480 kg K, 425 kg Ca và 112 kg Mg kt hp t gc cĩ th cĩ hiu qu phịng bnh vàng lá (De Waard, 1979) [36]. Phân hu cơ như phân gà làm gim s hình thành nt sn r tiêu, t l nt sn cơng thc x lý phân gà thp hơn so vi cơng thc x lý Carbofuran nhưng khơng sai khác cĩ ý nghĩa, do vy phân gà đưc xem như là mt thuc tr tuyn trùng, bên cnh đĩ giá c thp nhưng hàm lưng dinh dưng cao và cĩ th làm tăng năng sut cây trng (Zaragosa, 1992) [78]. Các thí nghim bĩn phân chung hoai cho tiêu kinh doanh và kin thit cơ bn đu cho kt qu tt. các cơng thc x lý phân hu cơ mt đ tuyn trùng Meloidogyne incognita gim so vi đi chng khơng bĩn (Nguyn Ngc Châu, 1994) [3]. Bĩn phân chung hoai 5 10 kg/ gc, rc vơi kh trùng đt (600 kg/ ha) trưc khi trng mi (Chi cc KDTV vùng 2, 1987) [10]. Bĩn phân hu cơ đã hoai mc 10 30 kg/ nc/ năm. S dng đy đ và cân đi các loi phân N, P, K (Phm Văn Biên, 1989) [1]. Bĩn phân hp lý đi vi tng loi đt (Ngơ Xuân Trung và ctv., 1998) [28]. Sau khi thu hoch tiêu cn bĩn 10 20 tn/ ha phân chung và 400 kg NPK (đu mùa mưa) và 200kg NPK (gia mùa mưa) (Chi cc KDTV vùng 2, 1987) [10]. Tăng cưng bĩn phân hu cơ giai đon bnh cịn nh (Phan Quc Sng,
24 1987, 1988a) [20], [21]. Thí nghim bĩn ch phm phân vi sinh đa chc năng MT1 cĩ cha bt tho mc tr tuyn trùng, kt qu cĩ hn ch đưc dch hi và làm tăng năng sut h tiêu (Vin BVTV, 2007) [30]. 1.5.3. Bin pháp hĩa hc Đ phịng tr bnh héo chm cĩ th áp dng thuc tr tuyn trùng và thuc tr nm (Pillay & Sasikumaran, 1984) [62]. Bnh héo chm cĩ th phịng tr bng cách s dng thuc Phorate hoc Carbofuran (Sarma et al., 1989) [65]. Thí nghim đưc thc hin vi 10 loi thuc nhà lưi LPTI Indonesia, kt qu cho thy tt c các hot cht đu làm gim mt đ tuyn trùng trong đt. Trong đĩ Shell DD, Vapam EC, Nemagon 75 EC và Temik 10 G cĩ hiu qu phịng tr Meloidogyne spp. (Mustika & Zainuddin, 1978) [57]. Mt thí nghim trong chu và mt thí nghim ngồi đng đã đưc thc hin vi 0,15% ai Phenamiphos, Methomyl, Triazophos, Thiabendazole, Dazomet, Carbofuran và Oxamyl đ phịng tr tuyn trùng nt sn hi tiêu. Kt qu tt nht đt đưc tiêu 6 năm tui vi Carbofuran áp dng vi liu lưng 114 g/ gc tiêu. Bn ln x lý đưc thc hin vi 2 tun gia 2 ln x lý đu tiên và 1 tháng 1 ln đi vi nhng ln x lý sau đĩ. S lưng tuyn trùng đã gim nhiu và trng lưng r, thân và lá tiêu đưc ci tin (Kueh & Teo, 1978) [45]. Trưc khi đt hom ging 10 15 ngày cn ri Furadan 20 g/ gc đ tr tuyn trùng (Chi cc KDTV vùng 2, 1987) [10]. X lý thuc phịng bnh: mt năm hai ln vào đu mùa mưa và đu mùa khơ. Đi vi cây b bnh nng đã đào b, trưc khi trng li cĩ th x lý bng Benlat 0,1 %, tưi 2 3 lít/ gc. Trong trưng hp bnh đang phát trin, c 3 4 tun x lý thuc mt ln cho đn khi bnh gim (Phm Văn Biên, 1989) [1]. Cĩ th s dng thuc hĩa hc đ x lý đt phịng chng tác hi ca tuyn trùng như: Nemacur, Mocap, Basudin, Methylbromid, Aldicarb, Phenamiphos, Nemaphos (Phan Quc Sng, 1987, 1988a) [20], [21].
25 Hiu lc ca mt s thuc tr tuyn trùng đã đưc kho nghim ti Xí nghip h tiêu Tân Lâm (Qung Tr) trên 2 loi tiêu kinh doanh và kin thit cơ bn gm 4 cơng thc, trên 3 loi thuc. Kt qu c 3 loi thuc đu cĩ hiu lc cao, trong đĩ Mocap 6 EC cao nht (5 ml/ gc tiêu kinh doanh và 4 ml/ gc tiêu kin thit cơ bn), tip theo là Diafuran 3 G (120 g/ gc tiêu KD và 100 g/ gc tiêu KTCB) và Nemacur 10 G (40 g/ gc tiêu KD và 30 g/ gc tiêu KTCB) (Nguyn Ngc Châu và Nguyn Vũ Thanh, 1992) [7]. Phm Văn Biên và ctv. (1990) [2] cho rng: Mocap 10 H và Furadan 3 H đu tr tuyn trùng cĩ hiu qu nhưng Mocap cĩ phn tri hơn. Furadan 3H nu dùng đúng cách vi liu lưng 100 g/ nc cho hiu qu tương đương Mocap 10H. 1.5.4. Bin pháp phịng tr tng hp S kt hp thuc tr tuyn trùng, t gc và cây che ph đt khơng cĩ tính cnh tranh đã đưc đ ngh (Ichinohe, 1985) [43]. Thí nghim đưc thc hin Para State (Brazil) cho bit s nhim tuyn trùng cĩ th đưc phịng tr. Thuc tr tuyn trùng là Temik (Aldicarb) áp dng 1,25 g a.i/ cây lúc trng mi và 6 tháng sau đĩ hoc Furadan (Carbofuran) vi liu lưng 2,5 g a.i/ cây lúc trng mi làm gim mt đ tuyn trùng trong năm đu tiên. Tuyn trùng hi h tiêu đã và đang là vn đ nan gii nưc ta. Ti hu ht các vùng trng tiêu hin nay, gii pháp vn là dùng thuc hĩa hc. Vì vy xây dng qui trình phịng tr tng hp tuyn trùng hi h tiêu đ hn ch ti đa vic dùng thuc hĩa hc đc hi là nhu cu cp bách (Nguyn Ngc Châu, 1995a) [4]. Các bin pháp phịng tr tng hp tuyn trùng hi tiêu (Nguyn Ngc Châu, 1995a) [4]: Xây dng vưn ươm sch bnh; Quy hoch lơ tiêu đ ngăn chn s lây lan truyn bnh; Kim tra và x lý đt trưc khi trng tiêu; Kim tra đánh giá cp bnh; Hy tiêu b bnh nng; X lý thuc hĩa hc; S dng thuc tho mc; Bĩn phân chung hoai; Trng xen; V sinh đng rung; Chn ging
26 tiêu kháng bnh tuyn trùng; Bin pháp đu tranh sinh hc (dùng nm và vi khun gây bnh đ dit tuyn trùng). 1.5.5. Bin pháp sinh hc Cĩ 2 dng phịng tr sinh hc: PTSH nhân to bng cách nhân nuơi các tác nhân sinh hc đ đưa ra đng rung và PTSH t nhiên bng cách duy trì ngun thiên đch sn cĩ trong t nhiên đ hn ch mt đ tuyn trùng. Hin ti, bin pháp phịng tr sinh hc chưa thay th thuc hĩa hc do tác đng chm, giá thành các ch phm sinh hc cịn cao và khơng đáp ng đy đ nhu cu sn xut. Tuy nhiên, PTSH rt phù hp trong h thng qun lý tng hp tuyn trùng. 1.6. Vi sinh vt đi kháng và ký sinh tuyn trùng gây hi cây trng S ký sinh trên bào nang ca tuyn trùng cái bi nm trưc ht đưc ghi nhn bi Kfihn Đc (1877), (Brian Kerry, 1980). Vi sinh vt đt đã đưc đ ngh xem là nhng đi din kim sốt sinh hc đi vi nm bnh t gia nhng năm 1970 (Schippers et al., 1987 A, 1987 b). Sau đĩ, mt s nhà khoa hc đã kho sát tim năng ca vi sinh vt đn vic điu khin tuyn trùng ký sinh thc vt (Becker et al., 1988; Oostendorp và Sikora, 1989; Racke Và Sikora, 1985; Sikora, 1988; Zavaleta Mejia và Van Gundy, 1982). Ví d như, Pseudomonas spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Pasteuria penetrans và mt s loi nm đc bit khác đã đưc s dng đ làm gim bt nhng thit hi trong nơng nghip gây ra bi s đa dng ca tuyn trùng ký sinh (Becker Et al., 1988; Jafee, 1992; Kerry và Bourne, 1996; Stirling, 1991). Theo GS.TS Vũ Triu Mân (2007) [18]: Tuyn trùng ký sinh thc vt cũng b tn cơng bng nhiu thiên đch tn ti trong đt như virus, vi khun, nm, Rickettsia , đơn bào, Tardigrade , Tuberlaria , Enchytraeid , ve bét, cơn trùng và tuyn trùng ăn tht. Vì vy, nghiên cu s dng thiên đch ca tuyn trùng cĩ tm quan trng rt ln trong vic làm gim mt đ qun th đ hn ch tác hi do tuyn trùng ký sinh gây ra cho cây trng. Mt s tác nhân vi sinh vt đưc s dng trong phịng tr sinh hc:
27 + Vi khun Pasteuria penetrans : Là loi vi khun ký sinh bt buc mt s tuyn trùng ký sinh thc vt như các loi u trùng ca Meloidogyne spp., Pratylenchus spp., v.v . Tuyn trùng d dàng b nhim vi khun này trong đt khi chúng tip xúc vi ni bào t. Vi khun Pasteuria penetrans rt đc và cĩ th gim mt đ qun th tuyn trùng Meloidogyne trong chu đn 99% trong vịng 3 tun. Vi khun Pasteuria penetrans cĩ th tn ti mt s năm trong đt đưc làm khơ bng khí mà khơng h suy gim kh năng sng và b nh hưng rt ít bi các điu kin đt hoc thuc phịng tr tuyn trùng. + Nm by tuyn trùng: Đây là các lồi nm cĩ kh năng to ra nhng mng by dng lưi dính đ bt gi và ăn tht tuyn trùng. Hu ht các loi nm by đưc xem như khơng cĩ kh năng to khun lc nhanh, kh năng cnh tranh thp trong mơi trưng hoi sinh và khơng sn sàng n đnh khi b sung vào trong đt. Tuy nhiên, khi b sung mt ngun carbohydrate vào đt thay cho tuyn trùng s giúp nm mc nhanh hơn. + Nm ni ký sinh tuyn trùng: Đây là các lồi nm cĩ kh năng dính và xâm nhp vào cơ th tuyn trùng đ ký sinh gây bnh cho tuyn trùng. Mt s lồi nm như Nematoctonus spp., Meria coniospora đã đưc th nghim và cho kt qu nht đnh. Cĩ th phân bit 2 nhĩm nm ni ký sinh là: a) Nm ni ký sinh cơ th tuyn trùng sn xut ra các bào t nh các bào t này cũng cha các năng lưng nh đ bt đu quá trình khun lc trong đt. T đây các bào t duy trì s ưu th cho đn khi chúng dính bám vào tuyn trùng đi qua. Sau đĩ bào t ny mm và xâm nhp qua v cutin to khun lc trong cơ th vt ch tuyn trùng. Lồi Nematoctonus concurrens và N. haptocladus thuc nhĩm nm này nhng cĩ hiu lc khơng ln đi vi tuyn trùng. Lồi Hirsutella rhossiliensis cũng cĩ liên quan vi tuyn trùng Criconemella xenoplax . Tuy nhiên, hin ti rt ít kt qu áp dng thc t. b) Nm ni ký sinh trng tuyn trùng cĩ kh năng ký sinh tuyn trùng cái và trng ca mt s tuyn trùng bào nang và tuyn trùng sn r trưc khi u
28 trùng n ra. Tuy nhiên, nhng nm này khơng cĩ kh năng git u trùng dng hot đng trong đt. Hu ht trng tuyn trùng đu mn cm hơn vi s xâm nhp ca nm trưc khi phát trin u trùng tui 2. Nu con cái b nm ký sinh thì kh năng sinh sn ca chúng s b gim. Vì vy, nhng nm này rt hiu qu nu chúng cĩ kh năng ký sinh con cái và khi trng sm sau khi chúng đưc n ra trong r. Các nm ký sinh trng là ký sinh tm thi nên chúng cĩ th đưc nhân nuơi điu kin invitro và s tn ti ca chúng trong đt cĩ th khơng ph thuc vào s hin din ca truyn trùng. Theo Townshen et al. (1989) [44] thì tuyn trùng Meloidogyne hapla gây hi trên cây linh lăng và khoai tây cĩ kh năng b kim sốt bi nm Meria coniospora . Brian Kerry (1980) [32] tìm thy ba lồi nm: Catenaria auxiliarls (Kiihn), Nematophthora gynophila Kerry & Crump và Lagenidiaceous cĩ kh năng ký sinh trên truyn trùng cái bng các đng bào t ca nm ký sinh trên b mt ngồi ca cơ th cái, phá v lp biu bì ca tuyn trùng, và ngăn nga s hình thành u sưng. Trong quá trình nghiên cu, tìm kim nhng đi din vi sinh vt đi kháng ca M.xenoplax , s chú ý đưc tp trung vào Pseudomonads huỳnh quang vì nhĩm này xut hin phong phú xung quanh vùng r (Kluepfel, 1993; O'Sullivan và O'Gara, 1992). Hiu qu ký sinh ca nm Hirsutella minnesotensis trên qun th tuyn trùng M. hapla Michigan, Rhode Island, Connecticut, Lyndonville, New York, Geneva, Wisconsin. Thí nghim chng tuyn trùng lên cây khoai tây, sau đĩ chng nm Hirsutella minnesotensis , kt qu nm khng ch s tuyn trùng cĩ trong r t 6198% (Sevilhan Mennan et al., 2006) [97]. Morgan et al. (1984) [40]: tìm thy nm ký sinh M. incognita trên cánh đng đu tương ti Alabama. Morgan và cng s đã trình bày nm Verticillium chlamydosporium Goddard cĩ tác dng ký sinh lên con cái tuyn trùng M.arenaria ; Ngồi ra, ơng và cng s cũng bt gp các loi nm F.oxysporum
29 Schecht.; Paecilomyces lilacinus; Pseulopapulospora kendrickii Sharma và Verticillium chlamydosporium ký sinh trên trng tuyn trùng M.arenaria. Theo nghiên cu ca G. R. Stirling và R. Mankau (1978) thì s ký sinh trên trng Meloidogyne bi mt loi nm đi kháng là Dactylelht oviparasitica. Đây là mt loi nm đưc phân lp t trng ca Meloidogyne , chúng đưc tìm thy trên trng b ký sinh và bên trong đt, nm phát trin hoi sinh trên nhng trng đã b git. Đây cĩ th là mt đi din sinh vt đi kháng hu hiu đ phịng tr tuyn trùng Meloidogyne . Mt s loi nm cĩ kh năng ký sinh như: Exophiala pisciphila; Scytalidium fulvum ký sinh trng tuyn trùng; Scytalidium fulvum ký sinh bc trng bng cách các si nm ăn sâu vào bên trong; Paraphoma radicina ký sinh bc trng; Si nm Phoma terrestris ăn sâu vào bên trong trng; Phytophthora cinnamomi; F. solani; Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces variotii ký sinh trng tuyn trùng Heterodera glycines; F.oxysporum ký sinh bc trng (Ownley Gintin et al., 1983) [31]. Theo Nguyn Văn Nam (2009) [16]: Nguyên lý cơ bn ca nm ký sinh tuyn trùng, đc bit là nm ký sinh trng tuyn trùng, do cu to ca lp v trng tuyn trùng gm 3 lp chính cĩ đ dày t 50400 m, trong đĩ cĩ lp chitin dày nht và cng nht đ bo v trng tuyn trùng. Cơ ch liên quan đn quá trình ký sinh là nm tit ra mt s enzyme phân hy lp chitin và protein, đây là bưc đu tiên liên quan đn quá trình ký sinh. Nhiu lồi nm cĩ hot tính enzyme chitinase cĩ liên quan đn kh năng ký sinh tuyn trùng. Như nm Paecilomyces variotii DG3 cĩ kh năng tit enzyme chitinase (c th là Chi32 và Chi46) đ phân hy màng trng tuyn trùng, to điu kin cho si nm xâm nhp và phát trin bên trong trng tuyn trùng. Ngồi ra, mt s enzyme khác cũng liên quan đn quá trình ký sinh ca nm như collagenase, chitinase và protease, trong đĩ enzyme chitinase đĩng vai trị quan trng. Gn đây mt s enzyme t các lồi nm Verticillium spp., Paecillomyces spp. đưc nghiên cu sâu mc đ phân t đ làm rõ các cơ ch
30 liên quan đn tính ký sinh ca nm lên trng tuyn trùng. Enzyme chitinase 34 kDa t nm Verticillium suchlasporium cĩ nh hưng đn trng tuyn trùng Globodera pallida (Nguyen VN et al., 2008) [59].
31 Chương II: ĐI TƯNG, NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Đi tưng nghiên cu Tuyn trùng Meloidogyne spp . và các đc tính sinh lý ca tuyn trùng Meloidogyne spp gây hi tiêu trên đa bàn tnh Đăk Nơng. Các đc tính sinh hc ca các chng vi nm đi kháng cĩ kh năng dit tr trng và tuyn trùng Meloidogyne spp. Cây tiêu đưc trng đa bàn tnh Đăk Nơng. 2.2. Ni dung nghiên cu Phân lp và tuyn chn mt s dịng vi nm đi kháng tuyn trùng Meloidogyne spp. Nghiên cu mt s yu t nh hưng đn tính đi kháng và ký sinh ca nm lên tuyn trùng trong điu kin phịng thí nghim. Th nghim kh năng đi kháng ca nm trong phịng tr tuyn trùng trên cây tiêu trong điu kin nhà lưi. 2.3. Thi gian và đa đim thc hin * Thi gian thc hin: t tháng 10/2009 đn tháng 10/2010. * Đa đim thc hin: Đa đim thu mu: Các mu đt, r, tuyn trùng s đưc thu thp ti các vùng trng tiêu chính trên đa bàn tnh Đăk Nơng, c th: STT Đa đim 1 Th xã Gia Nghĩa 2 Huyn Đăk R’Lp 3 Huyn Đăk Song 4 Huy n Cư Jút
32 Thí nghim phân lp, đánh giá kh năng ký sinh, nhân sinh khi ca các dịng nm thc hin B mơn Bo v thc vt, Khoa Nơng lâm nghip Trưng Đi hc Tây Nguyên. Thí nghim đánh giá kh năng phịng tr tuyn trùng trên cây tiêu con đưc thc hin th trn Ea Pc – huyn Cư M’Gar – tnh Đăk Lăk. 2.4. Vt liu, hĩa cht và dng c thí nghim 2.4.1. Vt liu * Mu cây: Mu s dng đ nghiên cu là r cây tiêu thu thp t các vùng trng tiêu khác nhau ti đa bàn tnh Đăk Nơng; Mu r cây dưa leo trng trong phịng thí nghim đ nhân nuơi tuyn trùng Meloidogyne spp. Mu đưc thu thp, x lý và bo qun trong t lnh 07 ngày 46oC hoc 30 ngày nhit đ <0 oC. Cây tiêu con ging Vĩnh Linh 3,5 tháng tui, đưc trng trong túi nilong PE trng kích thưc 10 cm X 10 cm. Cây dưa leo con ging 3 mũi tên đ, đưc trng trong phịng thí nghim. * Mu đt Các mu đt đưc ly các tng: 0 10 cm, 10 20 cm, 20 – 30 cm ti các đa đim khác nhau ca tnh Đăk Nơng. 2.4.2. Hĩa cht, dng c và thit b * Hĩa cht Các loi đưng chun: Glucose, Saccarose, Lactose, Fructose, Mantose, ca hãng Merck (Đc), Trung Quc sn xut. Các loi mui: K 2HPO 4, KH 2PO 4, KI, MgSO 4.7H 2O, KNO 3, NaCl, FeSO 4. 7H 2O, (NH 4)2SO 4, CaCO 3, MnCl 2, Na 2CO 3, ZnCl 2, ZnSO 4, CoCl 2, HgCl 2, nhp t Trung Quc, Anh sn xut. Các loi cao: Cao tht, cao nm men, cao malt, peptone, ca hãng Merck (Đc). Các loi hĩa cht khác: Thch, tinh bt tan, azocasein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose), ca Nht, Trung Quc, Vit Nam sn xut.
33 Các dung mơi: Ethanol, isopropanol, methanol, acetone, (Trung Quc). * Dng c và thit b Bình đnh mc 50 ml, 100 ml, 1.000 ml, ng nghim, đĩa petri đưng kính 9 cm, erlen 250 ml, 500 ml, eppendorf loi 500l, 1,5 ml, 2 ml, que cy, que tri, dao cy, kp cy, đc l thch, đèn cn, phu, giy lc, ; Micropipet loi 100 l, 200 l, 1.000 l, 5.000 l; Bp đin, ni nu mơi trưng, máy say sinh t (say mu r); Các dng c thy tinh ca Trung Quc, Đc, Vit Nam KHVQH Olympus CH30, kính lúp soi ni Olympus (Nht); T m Sanyo Mou 112F (Đc); T sy Sanyo Mov112F (Nht); Ni hp kh trùng Hirayama (Nht); Máy lc Stuart Scientific (Anh); Máy đo pH Inolabloucl (Đc); Máy ct nưc Hamilton; Máy đm khun lc WTW BZG 30; Máy ly tâm Hettich (Đc); Máy khuy t n nhit Vortex mixer (Đc); Cân phân tích, cân k thut; Box cy vơ trùng Esco; Bung đm hng cu Brucke; Máy chp hình SAMSUNG. 2.4.3. Các cơng thc mơi trưng * Mơi trưng khoai tây PGA (Potato Glucose Agar): Thành phn Lưng Khoai tây 200 g Thch Agar 20 g Đưng DGlucose 20 g Nư c c t 1 lít Mơi trưng đưc hp kh trùng điu kin 121 oC, 1 atm trong 30 phút.
34 * Mơi trưng PRBA (Peptone Rose Bengal Agar): (Onkar and James 1985) Thành phn Lưng Peptone 2,5 g Dextrin 5 g Agar 10 g KH 2PO 4 0,5 g MgSO 4.7H 2O 0.25 g Rose Bengal 15 mg Streptomyces 25 mg Nưc ct 500 ml Mơi trưng đưc hp kh trùng điu kin 121 oC, 1 atm trong 30 phút. * Mơi trưng WA (Water Agar): Thành phn Lưng Agar 10 g Nưc ct 500 ml Mơi trưng đưc hp kh trùng điu kin 121 oC, 1 atm trong 30 phút. * Mơi trưng MA (Maize Agar): Thành phn Lưng Bt bp 20 g Agar 20 g Nưc ct 1.000 ml Mơi trưng đưc hp kh trùng điu kin 121 oC, 1 atm trong 30 phút. * Mơi trung khống ti thiu MM (Minimum Mineral): Thành phn Lưng Glucose 10 g (NH 4)2SO 4 4 g CaCl 2 0,25 g
35 MgSO 4.7H 2O 0,25 g Trace elemen * 2 ml Pepton 1 g Agar 20 g Nưc ct 1.000 ml * Trace elemen (Vi lưng): FeSO 4.7H 2O = 0,5 g; MnSO 4.H 2O = 0,15 g; ZnSO 4.7H 2O = 0,25 g; CoCl 2 = 0,2 g; H 2O = 100 ml). Mơi trưng đưc hp kh trùng điu kin 121 oC, 1 atm trong 30 phút. * Mơi trưng cm ng tng hp enzyme chitinase CBM (Chitin Broth Medium): Thành phn Lưng Swollen chitin 5 g (NH 4)2SO 4 4 g CaCl 2 0,25 g MgSO 4.7H 2O 0,25 g Trace elemen * 2 ml Pepton 1 g Nưc ct 1.000 ml * Trace elemen (Vi lưng): FeSO 4.7H 2O = 0,5 g; MnSO 4.H 2O = 0,15 g; ZnSO 4.7H 2O = 0,25 g; CoCl 2 = 0,2 g; H 2O = 100 ml). Mơi trưng hp kh trùng điu kin 121 oC, 1 atm trong 30 phút. Chun b dch huyn phù chitin 1%: Ly 5g chitin hịa tan trong 50ml HCl đm đc, khuy liên tc trong thi gian 3 phút 40oC. Sau đĩ chitin đưc kt ta to thành huyn phù bng cách thêm t t 500ml nưc lnh (5 oC). Dch huyn phù đưc thu li bng cách lc qua giy lc. Huyn phù đưc ra vi nưc ct nhiu ln cho đn pH khong 4,0. Sau đĩ bo qun lnh dch huyn phù. 2.5. Phương pháp nghiên cu 2.5.1. Phương pháp thu mu
36 Ly mu đt các tng: 0 10 cm, 10 20 cm, 20 – 30 cm vùng r cây. Mi tng ly mu đt 5 đim chéo gĩc, mi đim 1 3 cây, trn li mi tng 1 mu đt. Mu đt và mu r đưc ly cây vàng lá nh, ly theo 5 đim chéo gĩc, mi đim 1 3 cây, trn li thành 1 mu/ vưn. Mu r đưc ly mép tán, thu thp mu r cĩ s hin din nt sn. 2.5.2. Phương pháp x lý mu * Phương pháp x lý mu đt: Mu đt thu v trn đu, ly mt lưng nh mu tri đu, phơi nhit đ phịng trong 2 ngày. Sau đĩ nghin nh mu bng ci s, rây đ loi b phn ln, ly phn mn cho vào túi nilơng, bo qun trong t lnh nhit đ 4oC (khơng quá 7 ngày) hoc s dng đ phân lp ngay. * Phương pháp x lý mu r: Mu r đưc ra dưi vịi nưc mnh, đ khơ mu. R đưc ct thành đon dài 510 mm. Kh trùng bng dung dch HgCl 2 1/1.000 trong 1 phút. Ra li mu bng nưc ct vơ trùng nhiu ln, mi ln 5 phút, thm đ mu khơ. Cĩ th x dng mu đ cy vào mơi trưng phân lp ngay hoc bo qun trong t lnh 4 oC (khơng quá 7 ngày). 2.5.3. Phương pháp ly trích tuyn trùng * Phương pháp ly trích tuyn trùng t đt: Tuyn trùng trong đt đưc lc bng phương pháp lc Berman cĩ ci tin. Cân 50 g đt cho vào rây cĩ đưng kính 10 cm, bên trong rây đt mt mnh vi lc khơng cho đt và tàn dư thc vt rơi xung đĩa petri. Đt rây vào đĩa petri và cho nưc vào, gi mc nưc cho ngp 1/2 chiu cao rây. Tuyn trùng s di chuyn qua màng lc và rt xung đĩa petri. Thi gian lc là 24 gi điu kin nhit đ phịng. Khi đã đ thi gian, b rây ra khi đĩa, thu ly dch lc bên trong đĩa. Dùng kính hin vi và kính soi ni đ xác đnh thành phn và mt đ tuyn trùng. * Phương pháp ly trích tuyn trùng t r: Tuyn trùng trong r đưc ly trích bng phương pháp lc qua rây Maceration Sieving Method (Speiger và De Waele, 1997).
37 Ra sch mu dưi vịi nưc mnh, đ khơ ri ct thành tng đon 0,5 1 cm. Trn đu ri cân 5 g r cho vào máy xay sinh t cĩ cha 100 ml nưc, xay 3 ln, mi ln 10 giây, sau mi ln xay ngh 5 giây. Cho dch xay qua rây 500 µm 250 µm 100 µm và thu thp tuyn trùng trên rây 45 µm; Thu trng tuyn trùng trên rây 25 µm. Đ tăng mt đ tuyn trùng, trng tuyn trùng s dng đ tính t l ký sinh: thu dch tuyn trùng trên rây, ly tâm 5.000 vịng/phút trong 5 – 10 phút, hút b phn nưc ni bên trên và thu ly phn cn. 2.5.4. Nhân nuơi tuyn trùng Meloidogyne spp. trong phịng thí nghim Ly mu đt, phơi nng đ tiêu dit bt các đi tưng mm bnh khác cĩ trong đt. Cho đt vào các chu nh, trng dưa leo hoc cà chua (là ký ch ưa thích ca tuyn trùng Meloidogyne spp.) vào các chu này. Phân lp tuyn trùng Meloidogyne spp. và lây bnh nhân to lên các cây ký ch mn cm vi tuyn trùng (như cà tím, dưa leo, đin thanh, cà chua) bng cách cho dung dch cha tuyn trùng Meloidogyne spp. đã phân lp tưi vào các chu trng dưa leo. Nuơi trng các cây ký ch trong nhà lưi. 2.5.5. Phân lp nm và gi mu nm * Phương pháp phân lp nm t đt: Cân 10g mu đt đã x lý, cho vào bình tam giác 250 ml cha 100 ml dung dch nưc mui sinh lý đã vơ trùng (t l 1:10), lc trên máy lc vi vn tc 150 vịng/phút nhit đ 28oC trong vịng 24 gi. Dùng micropipet vơ trùng hút 1 ml dung dch trích cho vào ng nghim cha sn 9 ml nưc ct vơ trùng, lc đu và tip tc pha lỗng đn 1:100, 1:1.000. Dùng micropipet vơ trùng hút 0,5 ml dch đt nh sang đĩa Petri cha mơi trưng thch PRBA. Dùng que gt vơ trùng chang đu, sau đĩ nuơi nhit đ phịng t 47 ngày. Trên mi mu đt, khun lc ca nm đưc cy sang ng nghim thch nghiêng mơi trưng PGA đ làm sch. Sau đĩ nuơi nhit đ phịng 47 ngày, t các khun lc đưc làm sch tip tc cy truyn sang ng
38 nghim cha mơi trưng thch nghiêng PGA, tip tc nuơi điu kin trên trong 1014 ngày [13]. * Phương pháp phân lp nm t r: r sau khi thu thp v và x lý (phn 2.2), dùng kéo ct nh mu thành các đon 25 mm, cy vào mơi trưng phân lp như PGA cĩ kháng sinh Streptomycin hoc WA. Nuơi nhit đ phịng 47 ngày, cy các khun lc mc lên t mu r phân lp sang ng nghim cĩ cha mơi trưng PGA. Sau 47 ngày, tip tc cy truyn sang mơi trưng thch nghiêng PGA đ làm sch và bo qun mu s dng cho thí nghim. * Phương pháp bo qun ging: Các chng nm đã la chn đưc cy trên mơi trưng thch nghiêng PGA nhit đ phịng. Sau 57 ngày khi nm mc tt, các ng ging đưc bo qun trong t lnh 4 60C. Sau 2 3 tháng cy truyn li mt ln. Đ bo qun lâu, ging đưc gi trong ng cát, trong parafin lng vơ trùng gi lnh sâu trong glycerin hoc đơng khơ, bo qun đưc 6 – 24 tháng. * Nm đưc đnh danh da vào các khố phân loi: K. H. Domsch and W. Gams (1970 – 1972): Fungi in agricultural soils. Gary J. Samuel (2004): Trichoderma a guide to identification and biology. H. L Barnett, Ph.D (1955 – 1960): Illustrated Genera of Imperfect Fungi. 2.5.6. Xác đnh kh năng đi kháng ca các lồi nm phân lp đưc lên tuyn trùng Meloidogyne spp . trong điu kin invitro * Sàng lc tính đi kháng trong điu kin invitro: Dùng phương pháp thi thch đ xác đnh hot tính ký sinh. Nm đã làm thun đưc cy lên mơi trưng PGA trên đĩa petri đ to khun lc đơn, sau 39 ngày, dùng khoan nút chai khoan các thi thch cĩ cha si nm đt vào đĩa petri cĩ cha mơi trưng WA đ th tính ký sinh. C mi đĩa petri, đt 09 thi nm chia thành 03 nhĩm, mi nhĩm 03 thi. Sau đĩ đem t 3 – 5 ngày 25 oC trong vịng 35 ngày; Nh 30 µm dch tuyn trùng và trng (cha khong 80 – 100 trng) đã ly trích lên trên b mt mi thi nm trên đĩa mơi trưng WA và đem 25 oC. Sau đĩ dùng dao ct nh lp trên ca thi nm đã nh dch tuyn trùng, đưa lên kính hin vi quan sát đ phĩng đi X 10; X 40
39 ln và tính t l trng b ký sinh sau 1, 2, 3 ngày x lý (Nguyen Van Nam, 2009) [61]. Xác đnh kiu ký sinh ca tng loi nm lên trng tuyn trùng. Mc đ ký sinh trng tuyn trùng ca nm đưc phân thành 4 cp: Ký sinh cao (+++): T l trng tuyn trùng b ký sinh trên 80%. Ký sinh trung bình (++): T l trng tuyn trùng b ký sinh t 50 – 80%. Ký sinh yu (+): T l trng tuyn trùng b ký sinh dưi 50%. Khơng ký sinh (): T l trng tuyn trùng b ký sinh 0%. 2.5.7. Phương pháp nhân nuơi các chng nm đưc tuyn chn Mơi trưng nhân nuơi cp I: Nm đưc nuơi cy trên mơi trưng PGA trong đĩa petri. Xác đnh kh năng sinh bào t, hu bào t ca các chng nm sau 3, 5, 7, 9 ngày nuơi cy. Mơi trưng nhân nuơi cp II: Thành phn cơ cht làm mơi trưng: Thành phn T l 4:1 T l 1:1 Bt bp 800 g 500 g Tru 200 g 500 g Nưc ct 500 ml 500 ml + Phương pháp x lý mơi trưng: Tru + 300 ml nưc, trn đu cho thm nưc, cho bt bp vào + 200ml nưc cịn li, tip tc trn đu (đm bo đ m 7075%). Phân phi vào các túi nilong PE chu nhit (hoc bình tam giác 500 ml), bt kín bng nút bơng và giy bc. Kh trùng mơi trưng 121 0C, áp sut 1 atm, trong vịng 30 phút, sau đĩ ly ra đ ngui, hp li mơi trưng ln 2 và 3 sau 24 h, 48 h. + Phương pháp nhân nuơi: Cy 5ml dch bào t vào mơi trưng và lc đu. nhit đ phịng, c sau 3 ngày li lc đu lên. Sau khi nhân nuơi khong 15 ngày và thy bào t nm mc xanh đy mơi trưng thì cĩ th đem s dng. Ch tiêu theo dõi: Tính s lưng bào t/cm 2 đi vi mơi trưng cp I và lưng bào t/gam ch phm đi vi mơi trưng nhân nuơi cp II bng bung đm hng cu Brucke.
40 2.5.8. Nghiên cu các yu t nh hưng đn kh năng ký sinh ca nm * Nghiên cu nh hưng ca mơi trưng nuơi cy lên kh năng ký sinh ca nm: Cy nm lên 4 loi mơi trưng PGA, WA, MA, MM. Th kh năng ký sinh và tính t l ký sinh như mc 2.5.6. * Nghiên cu nh hưng ca nhit đ nuơi cy khác nhau đn kh năng ký sinh ca nm lên tuyn trùng: Th kh năng ký sinh và tính t l ký sinh ca nm lên tuyn trùng các mc nhit đ 20 oC, 28 oC và 35 oC. * Nghiên cu nh hưng ca pH khác nhau đn kh năng ký sinh ca nm lên tuyn trùng: Cy nm lên mơi trưng PGA cĩ mc đưc xác đnh là pH = 4,5; pH = 5,5; pH = 6,5. Sau đĩ th kh năng ký sinh và tính t l ký sinh như mc 2.5.6. * Nghiên cu nh hưng ca ánh sáng đn kh năng ký sinh ca nm lên tuyn trùng: Cy nm lên mơi trưng PGA, nuơi nhit đ phịng t 3 – 9 ngày, dùng khoan nút chai đc l các thi thch cho qua mơi trưng WA, nuơi khong 3 – 5 ngày 3 điu kin ánh sáng khác nhau (chiu sáng 100%; ti 100%; sáng 50% + ti 50%). Sau đĩ th kh năng ký sinh và tính t l ký sinh như mc 2.5.6. * Mt s yu t sinh hc ca nm liên quan đn tính ký sinh và đi kháng (enzyme chitinase, protease): Chun b enzyme trong mơi trưng nuơi cy nm. + Chun b enzyme Chitinase và Protease: Nm đưc nuơi cy trong mơi trưng khống ti thiu cha hàm lưng chitin nht đnh đ kích thích to enzyme chitinase. Nuơi cy 25 oC, tc đ lc 150 vịng/phút trong thi gian 12 ngày. Tách chit enzyme thơ bng cách ly tâm lnh (4 oC) 10.000 vịng/phút trong 10 phút, loi b cn và thu ly dch ni cĩ cha enzyme. + Xác đnh hot tính enzym chitinase: Hn hp phn ng gm 100 l dch chit và 900 l dung dch huyn phù chitin 1%, pH = 5. Điu kin phn ng 37 oC, tc đ lc 70 rpm trong thi gian 1 gi. Phn ng đưc kt thúc bng dung dch NaOH 1N, hàm lưng đưng kh đưc đo và xác đnh theo phương pháp Schale’s vi phương trình đưng chun là cht Nacetylglucosamine. Đơn v enzyme đưc xác đnh theo phương pháp chung U/ml.
41 + Xác đnh hot tính protease: s dng 50 l dch ni nm trn vi 450 l azocasein 1% trong đm phosphate (pH 7,0) và trong 1 gi 50 oC. Phn ng này đưc ngng li bng cách thêm 250 l ca acid trichloroacetic 25% (TCA). Đ trong 15 phút, các protein kt ta đưc g b bng cách ly tâm 10.000 vịng/phút trong 10 phút; Peptide hịa tan trong phn ni trên mt (500 l) đưc trn vi 500 l NaOH 1N. Hn hp đưc đo bưc sĩng 440 nm vi albumin huyt thanh bị (BSA, Sigma) là dung dch chun. Mt đơn v hot tính protease đưc tính bng s protein mà kt qu tăng 0,01 đơn v hp th mi phút. 2.6. Th nghim tính đi kháng ca mt s chng nm cĩ tính đi kháng cao trong điu kin nhà lưi * Chun b thí nghim: Đt (trn 2 phn đt + 1 phn cát + 1 phn hu cơ sch) đưc x lý bng cách tri mng, phơi nng trong 5 ngày đ tiêu dit bt vi sinh vt, cho vào các túi nilong PE kích thưc 10cm x 10cm, trng 2 hom tiêu/túi nilong. Chăm sĩc và nuơi hom tiêu t 34 tháng tui thì s dng làm thí nghim. Chun b tuyn trùng: ly trích tuyn trùng t r dưa leo đã nhân nuơi và gi làm thí nghim. Chun b nm ký sinh: nhân nuơi nm trên mơi trưng cp 1 và cp 2, s dng nm mơi trưng nhân nuơi cp 2 đ làm thí nghim. Phương pháp lây bnh nhân to: Lây bnh nhân to bng cách tưi dch tuyn trùng đã ly trích vào các chu cây con, sau đĩ tưi ngun nm ký sinh đã sàng lc đưc vào các chu này. Theo dõi kh năng gây bnh ca tuyn trùng cho cây con và đánh giá kh năng đi kháng và ký sinh ca nm da vào mc đ gây hi và ch tiêu sinh trưng ca cây. Thí nghim đưc b trí ti th trn Ea Pk, huyn Cư M’gar, Đăk Lăk. Thí nghim gm 6 cơng thc (CT), mi cơng thc 5 cây tiêu con, đưc lp li 3 ln.
42 * B trí thí nghim: Các cơng thc thí nghim như sau: STT Cơng thc Ký hiu Thành phn Cách x lý Khơng x lý nm và tuyn 1 Cơng thc 1 CT1 Đi chng trùng 2 Cơng thc 2 CT2 M.i Khơng x lý nm Meloidogyne incognita lây trưc 3 Cơng thc 3 CT3 M.i + C07 2 tun, sau đĩ lây C07 Meloidogyne incognita lây trưc 4 Cơng thc 4 CT4 M.i + C22 2 tun, sau đĩ lây C22 Meloidogyne incognita lây trưc 5 Cơng thc 5 CT5 M.i + DY16 2 tun, sau đĩ lây DY16 Meloidogyne incognita lây trưc 6 Cơng thc 6 CT6 M.i + T7 2 tun, sau đĩ lây T7 Tng s cây thí nghim: 6 CT × 5 cây/ CT × 3 ln nhc li = 90 cây. Lây nm C07, C22, DY16, T7 vi lưng bào t 10 9 bào t/ ml. Lây tuyn trùng vi mt đ 1.000 con/ 1 kg đt. * Ch tiêu theo dõi: Quan sát, đánh giá kh năng đi kháng ca nm vi tuyn trùng thơng qua các ch tiêu sinh trưng và phát trin, ch s bnh ca cây tiêu con. + Ch tiêu sinh trưng: Chiu cao cây (cm) sau khi x lý chng nm 2, 4, 6, 8 tun. S lá/cây sau khi x lý chng nm 2, 4, 6, 8 tun. Chiu dài r/cây sau khi x lý chng nm 2, 4, 6, 8 tun. Trng lưng tươi/cây sau khi x lý chng nm 2, 4, 6, 8 tun. Trng lưng khơ/cây sau khi x lý chng nm 2, 4, 6, 8 tun. + Ch s bnh: T l % u sưng trên b r mi cơng thc thí nghim. S lưng tuyn trùng / 50g đt.
43 S lưng tuyn trùng / 5g r. * Phương pháp theo dõi: Chiu cao cây (cm): đo chiu cao 03 cây ngu nhiên/ 1 CT. S lá: đm s lá 03 cây ngu nhiên/ 1 CT. Chiu dài r (cm): đo chiu dài b r 03 cây ngu nhiên/ 1 CT. Trng lưng tươi (g): Cân trng lưng phn tươi ca cây, ca r 03 cây ngu nhiên/ 1 CT. Trng lưng khơ (g): Phn tươi (ca cây, r cây) đem sy nhit đ 105 oC, đn khi cân trng lưng khơng đi; Cân trng lưng khơ ca cây, r 03 cây ngu nhiên/ 1 CT. T l u sưng/ r (%): tính t l u sưng xut hin trên b r ca 03 cây ngu nhiên/ 1 CT. Mt đ tuyn trùng Meloidogyne spp. trong đt: Đm s lưng tuyn trùng cĩ trong 100g đt/ 1 CT. Mt đ tuyn trùng Meloidogyne spp. trong r: Đm s lưng tuyn trùng cĩ trong 05g r/ 1 CT. 2.7. Phương pháp xác đnh s lưng bào t Đ xác đnh mt đ dch bào t, tin hành đm trc tip s bào t bng thưc đm hng cu Brucke [13]. Cơng thc tính s lưng bào t/ml: S lưng t bào trong 1ml mu nghiên cu đưc tính bng cơng thc sau: N = [(a/b) x 400/ 0,1] x 10 3 x 10 n Trong đĩ: N: S lưng bào t trong 1ml mu nghiên cu. a: S t bào trong 5 ơ vuơng ln (80 ơ vuơng nh). b: S ơ vuơng nh trong 5 ơ vuơng ln. 400: Tng s ơ vuơng nh trong ơ trung tâm. 0,1: Th tích dch t bào (tính bng mm 3) cha trong ơ trung tâm. 10 3: S chuyn mm 3 thành ml. 10 n: Đ pha lỗng mu.
44 Cơng thc tính s lưng bào t/ đĩa = S lưng BT trong 1ml dch mu (N) x lưng nưc hịa lỗng + 5% tht thốt. S lưng BT trong 1g cht bt = S lưng BT trong 1ml mu (N) x lưng nưc hồ lỗng + 10% (lưng BT tht thốt). 2.8. Phương pháp x lý s liu S liu thu thp đưc t các thí nghim đưc chuyn đi thành s liu thng kê tương ng và đưc biu th bng (X ± CV). Kt qu nghiên cu đưc x lý bng Excel và phn mm SPSS 16.0.
45 Chương III: KT QU NGHIÊN CU VÀ THO LUN 3.1. Phân lp, làm thun và lưu gi các chng nm bn đa các đa đim nghiên cu Chúng tơi tin hành thu mu đt và mu r ti nhng vưn tiêu cĩ biu hin vàng lá, r cĩ u sưng đ ly trích tuyn trùng Meloidogyne spp. s dng làm vt liu trong thí nghim. Đng thi các mu đt và mu r này cũng đưc s dng đ phân lp các dịng nm bn đa dùng trong thí nghim sàng lc kh năng ký sinh ca nm lên tuyn trùng Meloidogyne spp. Bng 3.1. S lưng các chng vi nm phân lp đưc ti các đa đim nghiên cu STT Tng thu mu CJ GN ĐS ĐR Tng T l (%) 1 010 cm 14 8 13 9 44 47,31 2 1020 cm 8 5 9 5 27 29,03 3 2030 cm 7 5 6 4 22 23,66 4 Mu r 5 3 4 2 14 Tng cng 34 21 32 20 107 Ghi chú: CJ: Cư Jút; GN: Gia Nghĩa; ĐR: Đăk R’Lp; ĐS: Đăk Song. Kt qu phân lp cho thy mt đ vi nm các mu đt nghiên cu cao; các tng đt và đa đim khác nhau thì s lưng các chng vi nm phân lp đưc cũng khác nhau. C th tng đt 010cm thì cĩ t l các dịng vi nm phân lp đưc là cao nht (47,31%), sau đĩ đn tng 1020cm (29,03%) và 2030cm (23,66%). Thành phn các dịng vi nm phân lp đưc t mu r tương đi thp. Bng 3.2. Mt đ vi nm phân lp t đt ti các đa đim nghiên cu STT Đa đim thu mu Ký hiu Mt đ (CFU/g) 1 Cư Jút CJ (5,20 ± 8,08) *10 4 2 Gia Nghĩa GN (4,70 ± 7,94) *10 4 3 Đăk R'Lp DR (5,00 ± 2,51) *10 4 4 Đăk Song DS (4,60 ± 3,60) *10 4
46 23,6 26,7 CJ GN DR DS 25,6 24,1 Hình 3.1. T l (%) mt đ vi nm phân lp đưc ti các đa đim nghiên cu. Kt qu bng 3.2 và hình 3.1 cho thy: Mt đ vi nm phân lp t các đa đim nghiên cu, c th là các vưn tiêu cĩ triu chng bnh hi do tuyn trùng và nm tương đi cao và khơng chênh lch nhiu. Các dịng nm sau khi phân lp, đưc làm thun qua cy chuyn nhiu ln trên mơi trưng thch PGA; Da vào các đc đim hình thái v khun lc, h si nm, màu sc mơi trưng, cành sinh bào t, bào t ca các chng nm phân lp đưc và khĩa đnh danh nm, chúng tơi đã thu thp đưc 36 chng nm khác nhau và đnh danh đưc 34 chng đn ging và 02 chng chưa đnh danh đưc (gi là chng khác). Thành phn vi nm, tn sut xut hin ca các chng ti các đa đim nghiên cu đưc trình bày bng 3.3. 35,00 30,00 25,00 20,00 Aspergillus Penicillium Phytophthora T l (%) l T 15,00 Trichoderma 10,00 5,00 0,00 Cư Jút Gia Nghĩa Đăk R'Lp Đăk Song Đa đim Hình 3.2. T l các ging nm chính xut hin ti các mu đt và mu r ti các đa đim nghiên cu.
47 Bng 3.3. Thành phn vi nm phân lp đưc t các mu đt, mu r ca bn đa đim nghiên cu. Tn sut xut hin (%) Stt Nhĩm ging Cư Jút Gia Nghĩa Đăk R'Lp Đăk Song TB 1 Aspergillus 29,6±1,04 29,1±3,08 25,2±0,99 28,9±3,23 28,2±1,13 2 Collectotrichum 4,13±0,79 5,68±3,40 2,45±1,06 3 Fusarium 8,18 ±2,37 5,24±3,37 6,51±2,06 6,49±0,94 6,60±1,05 4 Gliocladium 3,17±0,16 3,14±1,60 1,58±0,59 5 Mucor 2,52±1,44 2,67±1,34 4,29±1,20 7,43±3,73 4,23±1,11 6 Penicillium 8,32±4,59 10,4±6,36 7,14±2,35 9,64±1,96 8,87±1,83 7 Phytophthora 7,92±2,89 12,0±2,60 11,8±2,50 6,49±0,94 9,53±1,24 8 Pythium 6,54±1,87 5,24±3,37 7,30±0,63 3,14±1,60 5,55±1,02 9 Rhizopus 1,69±0,84 1,39±1,39 2,22±1,11 4,90±3,06 2,55±0,88 10 Rhizoctonia 5,24±3,37 5,40±1,27 4,74±2,47 3,84±1,15 11 Sclerotinia 6,52±4,60 1,11±1,11 1,91±1,30 12 Trichoderma 30,7±3,91 17,1±3,34 15,7±1,20 13,0±1,88 19,1±2,38 13 Khác 4,59±2,06 5,24±3,37 9,14±4,25 6,49±0,94 6,36±1,36 Kt qu bng 3.3 và hình 3.2 cho thy: các đa đim khác nhau cĩ thành phn vi nm cũng như tn sut xut hin ca các chng vi nm khơng ging nhau. Trong đĩ các lồi nm xut hin nhiu, chim s lưng ln trong các mu phân lp đưc là ging Aspergillus , Penicillium , Trichoderma , Phytophthora ; Cịn các ging khác cĩ tn sut xut hin ít hơn. Riêng ging Trichoderma xut hin khá ph bin, đc bit các chng Trichoderma thu thp đưc khá cao ti đa đim Cư Jút (30,7%). 3.2. Sàng lc và tuyn chn các chng nm cĩ kh năng ký sinh tuyn trùng 3.2.1. Sàng lc kh năng ký sinh tuyn trùng ca các chng nm Chúng tơi dùng 16 chng Trichoderma (trong đĩ: chng phân lp đưc là 09 và 07 chng s dng t ngun cĩ sn ca phịng thí nghim B mơn BVTV – Trưng Đi hc Tây Nguyên); bn chng Metarrhizium ; 01 chng Beauveria (ngun: phịng thí nghim B mơn BVTV – Trưng Đi hc Tây Nguyên); Thí
48 nghim đưc thc hin đng lot trên đĩa petri (như mc 2.5.6). Quan sát kh năng ký sinh, hình thc ký sinh và tính t l ký sinh dưi kính hin vi sau 1, 2, 3 ngày x lý. Kt qu sàng lc kh năng ký sinh đưc th hin bng 3.4. Bng 3.4. Kh năng ký sinh trng tuyn trùng ca các chng nm KH T l KS (%) Kh năng STT Kiu ký sinh chng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 ký sinh 1 ĐC 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 2 BEAU 55,0 ± 2,17 h 67,5 ± 2,60 gh 81,3 ± 2,60 f +++ bào t 3 C06 18,5 ± 2,67 cd 31,1 ± 2,57 d 41,5 ± 1,33 c + Tan 4 C07 45,4 ± 3,41 g 80,83 ± 2,54 j 92,5 ± 2,60 g +++ Tan, to búi 5 C08 37,0 ± 2,89 f 48,67 ± 1,76 f 62,0 ± 3,46 d ++ Tan 6 C09 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 7 C10 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 8 C20 13,7 ± 2,89 bc 23,70 ± 0,98 c 22,2 ± 1,28 b + Tan 9 C22 56,7 ± 2,53 h 66,67 ± 1,10 g 85,0 ± 2,60 f +++ To búi, tan 10 C33 20,7 ± 1,61 d 31,85 ± 3,23 d 38,9 ± 2,80 c + Tan 11 C34 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 12 M1 18,0 ± 2,31 cd 29,0 ± 1,53 cd 40,0 ± 1,16 c + Tan 13 M2 57,5 ± 1,44 h 63,33 ± 4,10 g 71,3 ± 2,17 e ++ bào t 14 M3 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 15 M4 8,52 ± 0,98 b 14,81 ± 0,98 b 21,9 ± 0,98 b + Tan 16 DY16 46,3 ± 2,60 g 74,17 ± 0,42 i 85,4 ± 1,10 f +++ Tan, to búi 17 DY19 27,4 ± 2,25 e 38,52 ± 3,03 e 63,0 ± 2,67 d ++ Tan 18 DY59 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 19 T1 30,0 ± 4,02 e 32,50 ± 3,31 d 40,0 ± 1,44 c + Búi, tan 20 T7 32,9 ± 3,98 ef 72,50 ± 0,72 hi 86,3 ± 3,15 f +++ Tan, to búi 21 YT1 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 22 YT2 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a * Ký hiu: ký sinh cao (+++), ký sinh trung bình (++), ký sinh yu (+) và khơng ký sinh (). * Hình thc ký sinh: Tan (Nm phá hy hồn tồn trng tuyn trùng); To bào t (Nm ký sinh trng to thành bào t hình trng); To búi (Si nm bao ly trng, to thành búi).
49 Sau 1 ngày Sau 2 ngày Sau 3 ngày 92,50 85,00 85,42 86,25 81,25 71,25 62,00 62,96 41,48 38,89 40,00 40,00 22,22 21,85 0,00 0,000,00 0,00 0,00 0,00 0,000,00 9 U 7 9 0 3 16 1 1 ĐC A 0 0 2 M1 M2 M3 M4 T T7 T E C06 C C08 C C10 C C22 C3 C34 Y Y59 Y YT2 B D DY1D Hình 3.3. T l ký sinh ca các chng nm sàng lc T l ký sinh (%) 100 g 90 f f f f 80 e 70 d d 60 50 c c c 40 c 30 b b 20 10 a a a a a a a a 0 T1 T7 M1 M2 M3 M4 ĐC C06 C07 C08 C09 C10 C20 C22 C33 C34 YT1 YT2 BEAU DY16 DY19 DY59 Chng nm Hình 3.4. T l ký sinh sau 3 ngày ca các chng nm Qua kt qu thu đưc bng 3.4 và hình 3.3, hình 3.4, chúng tơi nhn thy kh năng ký sinh, t l ký sinh trng tuyn trùng ca các chng nm khác nhau là rt khác nhau. Trong 21 chng vi nm đưc s dng đ th kh năng ký sinh, cĩ 05 chng ký sinh mnh (chim 23,8%); 03 chng ký sinh trung bình (14,3%); 06 chng ký sinh yu (28,6%) và 07 chng khơng cĩ kh năng ký sinh (chim 33,3%). Đáng chú ý là các chng BEAU (81,25%), C07 (92,5%), C22 (85%), DY16 (85,42%), T7 (86,25%) cĩ t l ký sinh rt cao sau 3 ngày th tính ký sinh; Các chng nm cịn li cĩ kh năng ký sinh thp hơn, mt s chng khơng thy cĩ kh năng ký sinh trng tuyn trùng.
50 3.2.2. Hình thc ký sinh trng tuyn trùng ca các chng nm trong điu kin nghiên cu Quan sát thc t dưi kính hin vi, chúng tơi nhn thy kiu ký sinh ca các chng nm ch yu là: Làm tan, phá hy hồn tồn trng tuyn trùng; Si nm bao ly trng to thành búi (xem hình 3.5 C, D, F); Hoc nm ký sinh trng, to thành mt bào t hình trng (xem hình 3.5 B, E). B C A D E F Hình 3.5. Kh năng ký sinh ca các chng nm lên trng tuyn trùng Meloidogyne spp. Trng bình thưng (A); BEAU ( B); C07 ( C); C22 ( D); M2 ( E); T7 ( F) 3.2.3. Kh năng ký sinh ca các chng nm tuyn chn Sau khi sàng lc, so sánh kh năng ký sinh ca các chng nm khác nhau. Chúng tơi chn đưc bn chng nm cĩ t l ký sinh mnh nht (Ký hiu là: C07, C22, DY16 và T7). Các chng nm này đưc s dng cho các nghiên cu tip theo. Chúng tơi tin hành th nghim li kh năng ký sinh ca các chng nm đưc tuyn chn so vi đi chng theo phương pháp đưc mơ t phn 2.5.6. Kt qu đưc ghi nhn bng 3.5.
51 Bng 3.5. T l ký sinh ca bn chng nm cĩ hot tính ký sinh cao trên tuyn trùng Meloidogyne spp. STT KH Sau 1 ngày Sau 2 ngày Sau 3 ngày 1 ĐC 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 2 C07 42,96 ± 3,97 c 73,68 ± 3,14 c 91,35 ± 1,48 c 3 C22 50,67 ± 1,02 d 62,62 ± 2,46 b 85,37 ± 0,60 b 4 DY16 46,26 ± 2,06 cd 71,75 ± 2,64 c 85,11 ± 2,40 b 5 T7 32,38 ± 2,51 b 69,55 ± 2,34 bc 86,63 ± 1,02 b 100 90 80 70 60 Sau 1 ngày 50 Sau 2 ngày 40 30 Sau 3 ngày 20 Tkýl sinh (%) 10 0 ĐC C07 C22 DY16 T7 Chng nm Hình 3.6. T l ký sinh ca bn chng nm cĩ hot tính ký sinh cao trên trng tuyn trùng Meloidogyne spp. Kt qu thu đưc cho thy mc dù c bn chng đưc tuyn chn đu cĩ kh năng ký sinh cao sau 03 ngày th, song t l ký sinh ca các chng nm này cĩ s khác nhau. Kh năng ký sinh ca chng C07 là cao nht (91,35%); Các chng cịn li tuy cĩ chênh lch, nhưng khơng đáng k. Qua quan sát thc t dưi kính hin vi, kiu ký sinh ca c bn chng nm ch yu là làm tan hồn tồn trng, các si nm bao ly trng to thành búi. Kh năng ký sinh ca các chng nm này ch yu tp trung mnh các trng cịn non, các trng đã hình thành u trùng (dng IJ1 và IJ2) thì kh năng ký sinh yu hơn hoc hu như khơng ký sinh (xem hình 3.7).
52 A B C D A E F G Hình 3.7. Hình thc ký sinh ca các chng nm đưc tuyn chn lên trng tuyn trùng Meloidogyne spp. Trng non ( A); IJ1 ( B); IJ2 ( C); C07 ( D); C22 ( E); DY16 (F); T7 ( G) 3.3. Nghiên cu các yu t nh hưng đn kh năng ký sinh ca nm lên tuyn trùng Meloidogyne spp. Kh năng sinh trưng, phát trin ca các lồi nm nhng điu kin khác nhau là rt khác nhau, nên kh năng ký sinh ca các lồi nm này lên tuyn trùng Meloidogyne spp. cũng khác nhau. Vì vy, chúng tơi tin hành thí nghim nghiên cu mt s yu t nh hưng đn kh năng ký sinh tuyn trùng ca các chng nm đưc tuyn chn. 3.3.1. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn kh năng ký sinh ca nm Đ nghiên cu kh năng ký sinh ca các chng nm lên trng tuyn trùng các mơi trưng nuơi cy khác nhau, chúng tơi tin hành nuơi cy bn chng (C07, C22, DY16 và T7) trên bn loi mơi trưng là: PGA, WA, MA và MM cùng mt nhit đ là 28 oC. Sau đĩ tin hành th tính ký sinh như mc 2.5.6.
53 100 90 80 70 60 50 PDA 40 WA 30 MA 20 T l ký sinh (%) sinh ký l T 10 MM 0 ĐC C07 C22 DY16 T7 Chng nm Hình 3.8. T l ký sinh ca các chng nm C07, C22, DY16 và T7 các mơi trưng nuơi cy khác nhau Qua quan sát thc t và theo dõi s phát trin ca bn chng nm C07, C22, DY16 và T7 trên 4 loi mơi trưng PGA, WA, MA, MM sau 5 ngày nuơi cy, chúng tơi nhn thy c 4 chng nm này đu cĩ kh năng phát trin khí sinh trên c 4 loi mơi trưng. Tuy nhiên, mc đ phát trin ca 4 chng nm này trên mi loi mơi trưng là khác nhau và gia 4 chng cũng cĩ s khác bit (bng 3.6). Trong bn mơi trưng thì PGA là mơi trưng thích hp nht cho c bn chng nm C07, C22, DY16 và T7 sinh trưng phát trin c v h si cũng như kh năng to bào t mnh. Riêng 03 mơi trưng cịn li (WA, MA, MM) thì nm phát trin kém hơn, h si ch là nhng si nm mc thưa tht bị sát b mt thch, đưng kính khun lc nh, kh năng sinh bào t kém hơn so vi mơi trưng PGA. Như vy, mơi trưng dinh dưng là mt yu t quan trng nh hưng đn kh năng sinh trưng, phát trin ca các lồi nm. Do đĩ cũng nh hưng đn kh năng ký sinh ca các chng nm này lên trng tuyn trùng Meloidogyne . Trên mơi trưng PGA, h si nm phát trin mnh nên kh năng ký sinh là cao nht. Sau đĩ là mơi trưng MA và MM, riêng mơi trưng WA cĩ t l ký sinh thp nht vì đây là mơi trưng nghèo dinh dưng, h si nm phát trin chm, thưa tht nên kh năng ký sinh ca các chng nm nuơi trên mơi trưng WA cũng thp (hình 3.8.).
54 Bng 3.6. Đc đim khun lc sau 5 ngày nuơi cy và t l ký sinh ca nm trên các mơi trưng khác nhau PGA WA MA MM STT CHNG Đc đim khun KT T l Đc đim khun KT T l Đc đim khun KT T l Đc đim khun KT T l lc (m) KS lc (m) KS lc (m) KS lc (m) KS Si trng mng Si trng mng Si trng mng, Si bơng trng 91,35 44,67 thưa tht, bt 74,24 58,33 thưa tht, bt mn, đi xng, 1 C07 xp, ít bào t, h 9,0 ± 8,2 ± xanh hơi xù nm 8,5 ± 8,4 ± trng ít, mc ri bt xanh hơi si ta đng tâm. 1,48 c 2,03 b vịng ngồi mép 2,48 b 1,45 c rác. trng mc ri rác. đĩa. H si phát trin mnh, trng xp, Si trng mng Si trng mng, Si trng mn, 85,37 45,00 69,70 57,00 mơi trưng mt thưa tht, ngồi bt xanh đm xù bt trng ri rác 2 C22 9,0 ± 8,0 ± 8,4 ± 8,5 ± s đim màu cùng cĩ vịng là xì mc đu khp vịng ngồi, mơi 0,60 b 1,16b 2,64 b 1,16 bc vàng nht, bào t các trng nh. b mt đĩa trưng màu vàng. ít Mơi trưng màu Si trng mng, Si trng mng Si trng, hơi vàng nht, bào t 85,11 46,00 bt xanh nht xù 71,52 60,33 thưa tht, bt bơng, bt xanh 3 DY16 màu xanh đm 9,0 ± 8,2 ± xì, mc ri rác 8,5 ± 8,5 ± xanh hơi trng ri rác, mơi to 1 vịng ln 2,40 b 1,53 b trên b mt mơi 5,51 b 0,88 c mc ri rác. trưng màu vàng. trung tâm. trư ng. Mơi trưng vàng chanh, si bơng Si trng mng Si trng mng Si trng mn, ta 86,63 44,00 70,00 53,67 mn, to nhiu thưa tht hơi xù, thưa tht hơi xù, đi xng, cĩ ít 4 T7 9,0 ± 7,5 ± 8,0 ± 8,2 ± đim khun lc bt trng hơi bt trng hơi bt xanh hơi 1,02 b 1,53 b 4,17 b 1,45 b xanh đm ri rác xanh mc ri rác. xanh mc ri rác. trng ri rác trên mơi trưng