Luận văn Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông - Nguyễn Tiến Dũng

pdf

139 trang huongle 1970

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông - Nguyễn Tiến Dũng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_phan_lap_tuyen_chon_mot_so_chung_vi_khuan_co_dinh_d.pdf

Nội dung text: Luận văn Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Nông - Nguyễn Tiến Dũng

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN NGUYN TIN DŨNG PHÂN LP, TUYN CHN MT S CHNG VI KHUN C ĐNH ĐM Azospirillum TRONG R CÂY NGƠ TI MT S ĐA ĐIM CA TNH ĐĂK NƠNG LUN VĂN THC SĨ: SINH HC BUƠN MA THUT, NĂM 2011
B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN NGUYN TIN DŨNG PHÂN LP, TUYN CHN MT S CHNG VI KHUN C ĐNH ĐM Azospirillum TRONG R CÂY NGƠ TI MT S ĐA ĐIM CA TNH ĐĂK NƠNG Chuyên ngành: Sinh hc thc nghim Mã s: 604230 LUN VĂN THC SĨ: Sinh hc Ngưi hưng dn khoa hc: PGS.TS Nguyn Anh Dũng BUƠN MA THUT, NĂM 2011
i LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi. Các s liu, kt qu nêu trong lun văn là trung thc và chưa đưc ai cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. Ngưi cam đoan Nguyn Tin Dũng
ii LI CM ƠN Đ hồn tt khĩa lun này, tơi xin bày t lịng cm ơn chân thành và sâu sc nht ti: Trưng Đi hc Tây Nguyên, các Phịng ban và Khoa chc năng đã t chc đào to, qun lý và to điu kin thun cho tơi hồn tt khĩa hc và lun văn. Các thy, cơ giáo trong và ngồi trưng đã nhit tình ging dy và cung cp nhng kin thc quý báu trong sut khĩa hc. PGS. TS Nguyn Anh Dũng, ngưi quan tâm, nhit tình hưng dn và to mi điu kin thun li đ tơi hồn thành khĩa lun. PGS. TS Nguyn Hu Hip thuc vin nghiên cu và phát trin Cơng Ngh Sinh hc, trưng Đi hc Cn Thơ đã cĩ nhng trao đi quý báu và to điu kin thun li đ tơi hồn thành khĩa lun. Tơi xin gi li cm ơn chân thành ti B mơn Sinh hc thc vt, B mơn SHTN, B mơn khoa hc đt, Tri thc nghim Khoa Nơng Lâm và Phịng thí nghim CNSH&MT là các đơn v đã to điu kin thun li đ tơi thc hin và hồn tt khĩa lun. Tơi xin gi li cm ơn chân thành ti tp th cán b, giáo viên trưng THCS Tơ Hiu, huyn Krơng Ana, tnh Đăklăk đã to điu kin thun li đ tơi thc hin và hồn tt khĩa lun. Tơi xin gi li cm ơn chân thành ti tp th lp Cao hc Sinh hc thc nghim K03 đã cùng tơi san s nhng bun vui, cùng tơi hc tp và trao đi kin thc trong sut khĩa hc. Tơi xin gi li cm ơn ti em Nguyn Xuân Tài lp Khoa hc cây trng K2007, em Lê Th Hương lp C nhân Sinh K2007 đã cùng tơi tham gia nghiên cu đ tài. Đc bit, xin gi li cm ơn chân thành và sâu sc nht ti nhng ngưi thân trong gia đình đã luơn quan tâm, tin tưng, đng viên tơi trong sut quá trình hc cũng như thc hin lun văn. Buơn Ma Thut , tháng 09 năm 2011 Nguyn Tin Dũng
iii MC LC Trang M ĐU 1 1. Tính cp thit ca đ tài 1 2. Mc tiêu ca đ tài 2 3. Ý nghĩa ca đ tài 2 PHN I. TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1 Gii thiu v cây ngơ 3 1.1.1 Phân loi thc vt 3 1.1.2 Đc đim hình thái cây ngơ 3 1.1.3 Yêu cu sinh thái ca cây ngơ 4 1.1.3.1 Yêu cu nhit đ 4 1.1.3.2 Yêu cu v ánh sáng 4 1.1.3.3 Yêu cu v nưc 5 1.1.3.4 Yêu cu v đt 5 1.1.3.5 Yêu cu ch đ khơng khí trong đt 5 1.1.4 Vai trị các cht dinh dưng vi cây ngơ 6 1.1.4.1 Vai trị ca đm 6 1.1.4.2 Vai trị ca lân 6 1.1.4.3 Vai trị ca kali 6 1.1.4.4 Vai trị các nguyên t vi lưng 7 1.2 Tng quan v vi khun c đnh Nitơ (N) 7 1.2.1 Vi khun c đnh N t do 7 1.2.1.1 Vi khun c đnh N t do hiu khí 7 1.2.1.2 Vi khun c đnh N t do k khí Clostridium 9 1.2.2 Vi khun c đnh N cng sinh 9 1.2.2.1 Các vi khun sng cng sinh vi cây h Đu 9 1.2.2.2 Các vi khun sng cng sinh vi cây khơng thuc h Đu 10
iv 1.3 Tình hình nghiên cu ngồi nuc 13 1.4 Nghiên cu trong nưc 15 PHN II. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 17 2.1 Ni dung nghiên cu 17 2.2 Vt liu và đa đim nghiên cu 17 2.2.1 Vt liu và thit b nghiên cu 17 2.2.2 Đa đim nghiên cu 18 2.2.3 Thi gian nghiên cu 18 2.3 Phương pháp nghiên cu 18 2.3.1 Phương pháp thu mu 18 2.3.2 Phương pháp phân lp 18 2.3.3 Phương pháp mơ t đc đim hình thái, đc đim sinh hc ca các chng Azospirillum 20 2.3.4 Phương pháp xác đnh kh năng to IAA ca các chng Azospirillum 20 2.3.5 Phương pháp tuyn chn các chng Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm bng nghiên cu th nghim trên cây ngơ 21 2.3.6 Phương pháp đnh danh các chng Azospirillum đưc tuyn chn bng k thut PCR 23 2.3.7 Phương pháp nghiên cu xây dng quy trình nhân sinh khi ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn 23 2.3.7.1 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 23 2.3.7.2 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 25 2.3.7.3 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum 25 2.3.7.4 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 25
v 2.3.7.5 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 25 2.3.8 Phương pháp đánh giá kh năng c đnh đm ca các chng vi khun Azospirillum đưc tuyn chn trên đng rung 26 2.3.9 Phương pháp x lý s liu thng kê 28 PHN III. KT QU VÀ THO LUN 29 3.1 Phân lp các chng vi khun Azospirillum trong r cây ngơ ti mt s đa đim ca tnh Đăk Nơng 29 3.2 Mơ t đc đim hình thái, đc đim sinh hc ca các chng Azospirillum 30 3.3 Kt qu nghiên cu xác đnh kh năng to IAA ca các chng Azospirillum 34 3.4 Kt qu tuyn chn các chng Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm bng nghiên cu th nghim trên cây ngơ 37 3.4.1 nh hưng ca các chng Azospirillum đn sinh trưng ca cây ngơ trong bu đt 37 3.4.2 nh hưng ca các chng Azospirillum đn hàm lưng đm trong lá ngơ 41 3.4.3 nh hưng ca các chng Azospirillum đn hàm lưng dip lc trong lá 43 3.5 Kt qu đnh danh các chng Azospirillum đưc tuyn chn bng k thut PCR 45 3.6 Nghiên cu xây dng quy trình nhân sinh khi ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn 46 3.6.1 Nghiên cu nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 46 3.6.2 Kt qu nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 47 3.6.3 Kt qu nghiên cu nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum 49 3.6.4 Kt qu nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 51
vi 3.6.5 Kt qu nghiên cu nh hưng ca nhit đ mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 53 3.7 Kt qu đánh giá kh năng c đnh đm ca các chng vi khun Azospirillum đưc tuyn chn trên đng rung 55 3.7.1 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn sinh trưng ca cây ngơ 55 3.7.1.1 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn chiu cao cây ngơ 55 3.7.1.2 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn s lá ca cây ngơ 58 3.7.1.3 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn chiu dài lá cây ngơ 61 3.7.1.4 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn đưng kính gc 63 3.7.1.5 Kt qu xác đnh hàm lưng dip lc trong lá 65 3.7.2 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn năng sut ca cây ngơ 66 PHN IV. KT LUN VÀ KIN NGH 72 4.1 Kt lun 72 4.2 Kin ngh 73 TÀI LIU THAM KHO PH LC
vii CÁC CH VIT TT ABA Abscisic acid BNF Biological nitrogen fixation bp Base pairs Cs Cng s Cl Clo DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate ĐC Đi chng EtBr Ethidium bromide GA Gibberillins IAA Indole 3 acetic acid IBA Indole 3 butyric acid K2O Kali nguyên cht Mg Magie N Đm NT Nghim thc PCR Polymerase chain reaction PHB Poly hydroxybutyrate P2O5 Lân nguyên ch t S Lưu huỳnh VK Vi khun
viii DANH MC CÁC BNG Trang Bng 3.1. Đc đim hình thái khun lc ca các chng Azospirillum 30 Bng 3.2. Kt qu nhum gram ca các chng Azospirillum 33 Bng 3.3. Giá tr OD 530nm đo đưc các nng đ IAA pha lỗng khác nhau 34 Bng 3.4. Kt qu nghiên cu kh năng tng hp IAA ca các chng Azospirillum (mg/l) 35 Bng 3.5. Các ch tiêu sinh trưng ca cây ngơ trng trong bu đt 37 Bng 3.6. nh hưng ca các chng Azospirillum đn sinh khi tươi và khơ ca cây ngơ 39 Bng 3.7. nh hưng ca các chng Azospirillum đn hàm lưng N tng s trong lá ngơ. 41 Bng 3.8. Hàm lưng dip lc trong lá ngơ (mg/g) 43 Bng 3.9. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) 46 Bng 3.10. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) 48 Bng 3.11. nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) 50 Bng 3.12. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) 52 Bng 3.13. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) 54 Bng 3.14. nh hưng ca nghim thc đn chiu cao cây (cm) 56 Bng 3.15. nh hưng ca nghim thc đn s lá ca cây ngơ (lá/cây) 59 Bng 3.16. nh hưng ca nghim thc đn chiu dài lá ca cây ngơ (cm) 61 Bng 3.17. nh hưng ca nghim thc đn đưng kính gc cây ngơ (mm) 64 Bng 3.18. Hàm lưng dip lc trong lá ngơ (mg/g) 65
ix Bng 3.19. Các ch tiêu năng sut ca cây ngơ trng ngồi đng 67 Bng 3.20. Khi lưng khơ 100 ht và năng sut lý thuyt 70
x DANH MC CÁC BIU Đ Trang Biu đ 3.1. Phương trình đưng chun v mi tương quan tuyn tính gia ch s OD 530nm và nng đ IAA (mg/l) 35 Biu đ 3.2. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 47 Biu đ 3.3. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 49 Biu đ 3.4. nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum 51 Biu đ 3.5. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 53 Biu đ 3.6. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 55 Biu đ 3.7. Hàm lưng dip lc trong lá (mg/g) 66 Biu đ 3.8. nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn s ht/hàng ca bp ngơ. 68 Biu đ 3.9. nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn chiu dài ca bp ngơ. 69 Biu đ 3.10. nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn năng sut lý thuyt. 71
xi DANH MC CÁC HÌNH Trang Hình 3.1. Phân lp vi khun t mơi trưng bán đc Nfb 29 Hình 3.2. Kt qu đin di DNA ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn 45
1 M ĐU 1. Tính cp thit ca đ tài Phân vi sinh cĩ nhiu ưu đim so vi phân hĩa hc, ngồi tác dng nâng cao năng sut và cht lưng cây trng, tit kim phân vơ cơ, gim chi phí sn sut thì phân vi sinh cịn gĩp phn quan trng trong vic bo v mơi trưng và phát trin nơng nghip bn vng. Tuy nhiên tình hình sn xut phân vi sinh nưc ta vn chưa đáp ng đ nhu cu thc tin sn xut ca nn nơng nghip, do quy mơ sn xut nh, cht lưng sn phm chưa hồn thin và n đnh. Do đĩ, nghiên cu đ hồn thin và nâng cao cht lưng phân vi sinh là vic làm ht sc cn thit. Trong đĩ, vic phân lp và tuyn chn các chng vi sinh vt là khâu đu tiên và quan trng trong quy trình to ra ch phm [5]. Hưng đn mt nn sn xut nơng nghip sinh thái bn vng, trong vài chc năm gn đây ngày càng gia tăng các nghiên cu vi khun cĩ ích khu trú trong r cây trng khơng thuc cây h đu, đc bit cây ngũ cc. Theo Doebereiner, vi khun Azospirillum trong r cây khơng gp phi s cnh tranh ngun Carbon như vi khun khu trú trên b mt r và cĩ th cung cp đm cho cây trng mà khơng phi nh đn khi t bào cht [35]. Nhĩm Azospirillum là vi khun sng trong r các loi cây ngũ cc như lúa, ngơ. Nhĩm vi khun này cĩ kh năng c đnh N, tng hp nhiu cht kích thích sinh trưng thc vt IAA, GA 3 gĩp phn nâng cao đ phì nhiêu ca đt, kích thích tăng trưng, tăng năng sut cây trng, hn ch bĩn phân hĩa hc và phát trin nn nơng nghip sinh thái bn vng [35] Vit Nam đã cĩ mt s nghiên cu, phân lp các chng vi khun thuc chi Azospirillum trong r lúa. Bên cnh đĩ, ngơ là mt đi tưng cĩ vịng đi sinh trưng và phát trin tương đi ngn, ít đu tư, hiu qu kinh t cao, đưc trng ph bin. Tuy nhiên, nhng nghiên cu v vi khun c đnh đm Azospirillum trong r cây ngơ cịn rt ít. Đc bit, hin nay chưa cĩ mt nghiên
2 cu nào v thành phn lồi ca chi Azospirillum trong r cây ngơ ti mt s đa phương ca tnh Đăk Nơng. Xut phát t thc t đĩ, chúng tơi tin hành nghiên cu đ tài: “Phân lp, tuyn chn mt s chng vi khun c đnh đm Azospirillum trong r cây ngơ ti mt s đa đim ca tnh Đăk Nơng”. 2. Mc tiêu ca đ tài Phân lp và tuyn chn đưc mt s chng Azospirillum c đnh đm trong r cây ngơ. Xây dng qui trình nhân sinh khi mt s chng Azospirillum cĩ hot tính c đnh đm làm phân sinh hc chuyên dng cho cây ngơ. 3. Ý nghĩa ca đ tài Ý nghĩa khoa hc Xác đnh đưc mt s chng Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm, sng ni sinh trong r cây ngơ. Ý nghĩa thc tin Kt qu ca đ tài là cơ s cho vic la chn các chng Azospirillum sng ni sinh trong r cây ngơ cĩ hot tính c đnh đm đ sn xut phân vi sinh cĩ hiu qu, nâng cao đ phì nhiêu ca đt, hn ch bĩn phân hĩa hc, tăng năng sut cây ngơ và gĩp phn phát trin mt nn nơng nghip sinh thái bn vng.
3 PHN I. TNG QUAN TÀI LIU 1.1 Gii thiu v cây ngơ 1.1.1 Phân loi thc vt Ngơ cĩ tên khoa hc là Zea mays L (Zea: T Hi Lp đ ch cây ngũ cc và t Mays là t “Mahix” tên gi cây ngơ ca ngưi bn đa da đ [7]. Cũng cĩ th Mays là t “Maya” tên mt b tc da đ vùng Trung M xut x ca cây ngơ) [18]. Cây ngơ thuc: Ngành : Maopholiophyta Lp : Liliopsida B : Poales Chi : Zea Lồi : Mays 1.1.2 Đc đim hình thái cây ngơ [7],[15],[16] R ngơ: trong quá trình sinh trưng phát trin, cây ngơ cĩ 3 loi r. Đĩ là: r mm, r đt và r chân king. Thân ngơ: thân đc, đưng kính thân khong 2 – 4cm tùy thuc vào ging, mùa v và trình đ thâm canh, thân cĩ nhiu lĩng. Trong điu kin bình thưng ngơ cao t 1,8 – 2m, t khi mc đn khi cây cĩ 6 – 7 lá thân phát trin chm, t lúc 8 – 9 lá đn nhú c, n hoa cây phát trin nhanh và đn khi hoa đc phơi màu, bp phun râu cây vn tip tc ln. Sau khi th phn thì thân ngng phát trin. Lá ngơ: gm cĩ lá mm, lá thân, lá ngn và lá b. Lá đưc chia thành các b phn như: b lá, phin lá và thìa lá. Phin lá rng và dài, mép lá gn sĩng, cĩ nhiu lơng tơ. Gân lá song song. Lá mang bp cĩ chiu dài dài nht. Hoa ngơ: gm hoa đc (bơng c) và hoa cái. Bơng c cĩ nhiu nhánh, mi nhánh cĩ nhiu hoa xp thành tng chùm, mi chùm cĩ hai hoa, mi hoa cĩ 3 nh đc, mi nh đc cĩ 1 bao phn, mt bao phn cĩ hai ơ, mt ơ cha t 1000 – 2500 ht phn. Hoa cái sinh ra t nách lá gm cĩ lõi bp cĩ nhiu đt
4 ngn cĩ lá bao bi, mi hoa cái cĩ mt râu. Hoa cái mc tng đơi trên hoa t. Mi chùm hoa cĩ hai hàng hoa nhưng hoa th hai b thối hĩa ch mt hoa hình thành ht, mt đơi chùm hoa cho hai hàng ht nên hàng ht trên bp luơn luơn chn. Ht ngơ: thuc loi qu dĩnh, gm các b phn chính là v ht, lp alơron, phơi và ni nhũ, phía dưi ca ht cĩ gc ht là phn dính lin ht vi lõi ngơ. Ht ngơ đưc hình thành gm các giai đon: t th phn đn chín sa là 10 – 15 ngày, t chín sa đn chín sáp là 15 – 20 ngày và t chín sáp đn chín hồn tồn là 10 – 15 ngày. 1.1.3 Yêu cu sinh thái ca cây ngơ [18],[22] 1.1.3.1 Yêu cu nhit đ Ngơ là cây trng ưa khí hu m, nhit đ thích hp vào khong 20 0C 28 0C. Nhit đ cĩ th nh hưng đn thi gian sinh trưng ca cây ngơ. Trong c chu kỳ sng cũng như trong tng thi kỳ sinh trưng phát trin ca cây ngơ cn mt lưng tích nhit nht đnh. Đ lưng nhit cây mi sinh trưng phát trin bình thưng. Tùy vào tng ging khác nhau mà cn mt lưng nhit khác nhau. Ging càng chín mun thì cn lưng tích nhit càng cao. 1.1.3.2 Yêu cu v ánh sáng Ngơ là cây cĩ ngun gc nhit đi thuc nhĩm cây ngày ngn. Ánh sáng là yu t quan trng cho sinh trưng và phát trin ca cây ngơ, to điu kin thun li cho quá trình tích lu cht dinh dưng và nh hưng đn đ dài ca quá trình sinh trưng. Trung bình cn 12 gi chiu sáng/ngày. Nghiên cu phn ng ca cây ngơ vi đ dài ngày cho thy cây ngơ hình thành các kiu hình thái khác nhau. D.Azit đã ch ra rng: Các ging ngơ châu Âu do kt qu chn lc đã hồn thành đưc chu kỳ ánh sáng trong điu kin ngày dài, loi tr đưc yêu cu ngày ngn. Cuperman và Razumov cho rng rút ngn thi gian chiu sáng ban ngày đn 12 gii s thúc đy s tr c và hình thành bp. Ánh sáng nh hưng đn sinh trưng ca cây ngơ hai mt là s gi chiu sáng và cht lưng ánh sáng. Nhng tia sáng dài đã kìm hãm s sinh
5 trưng ca cây ngơ, các tia sáng ngn li thúc đy s phát trin. Nghiên cu ca Cuperman đã xác đnh thi gian chiu sáng và cht lưng ánh sáng đã gây nh hưng rt ln đn s phát trin ca bp và bơng c ca cây ngơ. Trong điu kin chiu sáng bng ánh sáng trng và xanh lam thì s phát trin ca cây din ra nhanh nht. Trong diu kin chiu sáng bng ánh sáng đ thì s phát trin ca bơng c hu như khơng b nh hưng nhưng s hình thành ca bp chm li. Ánh sáng lc kìm ch s sinh trưng và phát dc ca bp. 1.1.3.3 Yêu cu v nưc Ngơ là cây trng cn, b r ngơ phát trin rt mnh, hút nưc khe và s dng tit kim nưc. Cây ngơ sinh trưng nhanh to ra sinh khi ln. Do vy cây cn mt lưng nưc rt ln. Trung bình cây ngơ trong mt chu kỳ sng cn khong 200 lít nưc đ sinh trưng và phát trin. các thi kì sinh trưng khác nhau cây ngơ yêu cu lưng mưa và lưng nưc tưi khác nhau. Cây ngơ khơng chu đưc úng, đ m ca đt quá cao, ln hơn 80% cĩ nh hưng xu đn sinh trưng phát trin ca cây ngơ, đc bit là t lúc cây mc đn khi cây đưc 8 lá. Vào giai đon này ch cn ngp nưc 1 – 2 ngày cây ngơ cũng cĩ th b cht úng. m đ thích hp khong 70%. 1.1.3.4 Yêu cu v đt Đt rt quan trng trong sn xut ngơ, đt trng ngơ phi tơi xp, nhiu mùn, hàm lưng dinh dưng cao, d thốt nưc, tng canh tác dày, pH t 6 – 7, thun li cho vic tưi nưc vào mùa khơ và tiêu nưc vào mùa mưa. Hu ht, ngơ đưc trng trên đt cn, khơng ngp nưc, đt cĩ thành phn cơ gii nh, đt cát pha, trên các loi đt v trưc trng các cây h đu, hoc các cây phân xanh ci to đt. 1.1.3.5 Yêu cu ch đ khơng khí trong đt Đ thu hoch sn lưng ngơ cao, ngồi vic cung cp nưc và dinh dưng cịn phi chú ý đn ch đ khơng khí trong đt. Ch đ khơng khí nh hưng gián tip thơng qua nhiu khâu khác nhau như là vi sinh vt, quá trình bin đi hĩa hc trong đt. Cây ngơ đc bit là r ngơ phát trin tt trong điu kin háo
6 khí, nu đt cht bí thiu tơi xp thì r ngơ phát trin kém, ăn nơng, r ngn ít lơng hút, kh năng hút dinh dưng khống và nưc kém. Dn đn tình trng cây ngơ thiu dinh dưng s sinh trưng, phát trin kém. 1.1.4 Vai trị các cht dinh dưng vi cây ngơ [16],[18],[22] 1.1.4.1 Vai trị ca đm Đm là yu t dinh dưng quan trng nht, đĩng vai trị to năng sut và cht lưng ca ngơ, 66% đm đưc tích lu trong ht. Cây ngơ hút đm tăng dn t khi cây cĩ 3 – 4 lá ti trưc tr c. nưc ta, mt s kt qu nghiên cu cho thy thi kỳ hút đm mnh nht là 6 – 12 lá và trưc khi tr c, nu các giai đon này mà thiu đm thì năng sut gim rõ rt. Triu chng thiu đm ngơ: cây thp, lá nh cĩ màu vàng, các lá già cĩ vt xém đ, cây sinh trưng chm, cn ci, c ít, bp nh, năng sut thp. 1.1.4.2 Vai trị ca lân Lân cĩ vai trị quan trng vi cây ngơ tuy nhiên kh năng hút lân giai đon cây non li rt yu. Thi kỳ 3 – 4 lá, cây ngơ hút khơng đưc nhiu lân, đĩ là thi kỳ khng hong lân ca ngơ, nu thiu lân trong giai đon này s làm gim năng sut nghiêm trng. Cây ngơ hút nhiu lân nht ( khong 62% tng lưng lân yêu cu) thi kỳ 6 – 12 lá sau đĩ gim đi các thi kỳ sau. Triu chng thiu lân ca ngơ biu hin bng màu huyt d trên b lá và gc cây, trái cong queo. Trưng hp thiu nng lá s chuyn vàng và cht. Hin tưng này xy ra lá già trưc, sau đĩ chuyn sang lá non và ph bin ngơ v đơng trong điu kin thi tit khc nghit. 1.1.4.3 Vai trị ca kali Kali cĩ vai trị rt quan trng ti s sinh trưng, phát trin và năng sut ca ngơ. Kali tích lu nhiu thân, lá (khong 80%) và tích lu trong ht ít hơn. Cây ngơ hút kali mnh ngay t giai đon sinh trưng ban đu. T khi cây mc ti tr c ngơ đã hút khong 70% lưng kali cây cn. Thiu kali, protein và st s tích t gây cn tr quá trình vn chuyn cht hu cơ. Thiu kali là nguyên nhân r ngang phát trin mnh, r ăn sâu kém phát
7 trin, do đĩ cây d đ. Thiu kali th hin các triu chng như chuyn nâu và khơ dc theo mép và chĩp lá, bp nh, nhiu ht lép đu bp (bp đuơi chut) và năng sut thp. 1.1.4.4 Vai trị các nguyên t vi lưng Đi vi cây ngơ, các cht vi lưng thưng thiu là km và molypđen. Thiu km lá cĩ màu trng (bnh bch tng), gia các gân lá cĩ nhng di màu vàng sáng, các lĩng ngn li. Hin tưng thiu km thưng xy ra trên đt kim, nghèo mùn, đt giàu lân d tiêu hay bĩn quá nhiu lân. Thiu molypđen lá chuyn xanh nht, lá non teo li và héo, nng hơn lá ngn khơng bung ra đưc, cĩ nhiu vt xém vàng. 1.2 Tng quan v vi khun c đnh Nitơ (N ) Vi sinh vt c đnh N cĩ mt vai trị quan trng trong chu trình tun hồn N2 và cung cp mt lưng N đáng k cho cây trng. Theo tính tốn ca các nhà khoa hc, các nhĩm vi sinh vt c đnh N BNF (Biological nitrogen fixation) cĩ th cung cp ti 240 x 10 6 tn N/năm trên c hành tinh, gp 6 ln lưng N mà c th gii sn xut bng con đưng hĩa hc. Vi sinh vt c đnh N là các nhĩm vi sinh vt cĩ kh năng chuyn hĩa khí + N2 di dào trong khơng khí (79%) thành dng NH 4 cung cp cho cây. Vi khun c đnh N gm cĩ hai nhĩm ln:[5]. Vi khun c đnh N t do gm: + Vi khun c đnh N t do hiu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp. + Vi khun c đnh N k khí: Vi khun thuc nhĩm Clostridium . Vi khun c đnh N cng sinh như cng sinh vi r cây h đu Rhizobium, cng sinh vi r lúa Azoarcus, 1.2.1 Vi khun c đnh N t do 1.2.1.1 Vi khun c đnh N t do hiu khí
8 Nhĩm này gm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp. [5] Beijerinskia sp. Đưc phân lp bi Starkey (1939), là loi cĩ đc đim ging vi Azotobacter sp. T bào cĩ hình dng thay đi như hình cu, hình que, hình bu dc. Beijerinski là vi khun gram âm, khơng sinh bào t. Cĩ kh năng sng tt trong mơi trưng axit ( pH=3). Vi khun cĩ kh năng c đnh đưc 16 20 mg N khi đng hĩa ht 1g dinh dưng Carbon. Ngồi kh năng c đnh N chúng cịn cĩ kh năng tng hp các cht kích thích sinh trưng cho cây trng. Azotobacter sp. Là vi khun gram âm, khơng sinh bào t cĩ kh năng c đnh N t do. Khi chưa trưng thành t bào thưng cĩ hình que, sinh sn bng cách phân ct, di chuyn nh tiêm mao. Khi trưng thành mt kh năng di chuyn, kích thưc thu nh thành dng cu đưc bao bc bi mt lp nhy. Khun lc ca Azotobacter cĩ dng cu li, nhn bĩng, cĩ khi nhăn nheo. Các nịi phân lp t t nhiên cĩ kh năng c đnh 10 15mg N khi tiêu th ht 1g dinh dưng Carbon. Mt s nịi tuyn chn cĩ kh năng c đnh ti 30mg/1g dinh dưng Carbon. Trong đt, Azotobacter tp trung vùng đt xung quanh r cây. Ngồi kh năng cung cp dinh dưng N cho cây nĩ cịn cĩ kh năng kích thích ny mm, kích thích sinh trưng. Trong đt, Azotobacter thưng ph bin các nịi sau: + Azotobacter chrococum: kích thưc t bào 2,0 x 3,1 micromet, cĩ kh năng di đng khi cịn non. Khi già hình thành nang xác. Khun lc cĩ màu nâu hoc đen khi v già, khơng khuch tán ra mơi trưng. + Azotobacter beijerinckii: cĩ kích thưc 2,4 x 4,6 micromet. Khơng cĩ kh năng di đng và hình thành nang xác. Khun lc khi già cĩ màu nâu sáng, sc t khơng khuch tán ra mơi trưịng nuơi cy.
9 + Azotobacter vinelandii: t bào cĩ kích thưc 1,5 x 3,4 micromet, cĩ kh năng di đng và hình thành nang xác. Khun lc màu lc huỳnh quang, sc t khuch tán vào mơi trưng. + Azotobacter agilis: t bào cĩ kích thưc 2,8 x 3,3 micromet, cĩ kh năng di đng, khơng hình thành nang xác, khun lc màu vàng lc huỳnh quang, sc t khuch tán vào mơi trưng [5]. 1.2.1.2 Vi khun c đnh N t do k khí Clostridium Clostridium đưc phát hin ln đu tiên bi Vinogradxki (1893). Vi khun Clostridium cĩ kích thưc 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, cĩ th đng riêng r hoc kp đơi thành chui ngn. Bào t hình bu dc, cĩ kh năng chu đưc nhit đ cao và khơ hn. Clostridium cĩ kh năng tích lũy đưc 10 15mg N phân t khi đng hĩa ht 1g đưng Carbon [5]. 1.2.2 Vi khun c đnh N cng sinh 1.2.2.1 Các vi khun sng cng sinh vi cây h Đu Vi khun c đnh N cng sinh vi cây h đu cịn gi là vi khun nt sn. Chúng hình thành các nt sn vi r cây h đu như cây đu tương, lc, đin thanh, mung, ct khí, trinh n, chúng s dng dinh dưng carbon ca cây và c đnh N khơng khí đ s dng và cung cp mt phn cho cây ch. Gm cĩ: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium [9]. Rhizobium Năm 1868, nhà khoa hc Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lp đưc lồi vi khun sng cng sinh trong nt sn r mt cây thuc b đu, ơng đã đt tên là Basilusradicicola . Năm 1889, vi khun này đưc xp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989). Trên mơi trưng đc, chúng cĩ khun lc trơn bĩng, nhy, khi cịn non cĩ kh năng di đng nh tiêm mao, khi t bào già tr nên bt đng.
10 Rhizobium thuc loi ho khí ưa pH trung tính hoc kim ( pH t 6,5 7,5), nhit đ thích hp 24 – 26 0C. Chúng xâm nhim vào r cây b đu thơng qua lơng hút, đơi khi qua vt thương v r. Dưi nh hưng ca vi khun, r tit ra enzyme polyalacturonase phân hu thành lơng hút to điu kin cho vi khun xâm nhp vào r. Theo tính tốn ca các nhà khoa hc nhĩm vi khun này cĩ kh năng cung cp cho cây 80 120kg N/ ha. Bradyrhizobium Vi khun hình que, kích thưc trung bình 0,5 0,9 x 1,2 3,0 m, thưng cha cht d tr PHB. Trên mơi trưng đc, khun lc ca chúng cĩ dng trơn, bĩng, nhy, khơng màu. Bradyrhizobium là vi khun hiu khí, tuy nhiên chúng cĩ th phát trin đưc ngay trong trưng hp ch cĩ mt áp lc oxy rt thp khong 0,001atm. Chúng phát trin thích hp pH= 6,5 7,5. Nhit đ phát trin thích hp là 24 – 26 0C, nhit đ 37 0C s phát trin ca chúng b cn tr mt cách rõ rt. Azorhizobium Azorhizobium là mt ging mi đưc đ ngh vi mt lồi là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khun cng sinh r và thân ca Sesbania rostrata Sinorhizobium Gm các vi khun phát trin nhanh, cng sinh nt r cây đu nành đưc phân lp t Trung Quc. Ging Sinorhizobium gm cĩ 2 lồi là Sinorhizobium fredii và Sinorhizobium xinjiangensis . 1.2.2.2 Các vi khun sng cng sinh vi cây khơng thuc h Đu Vi khun lam ( Cyanobacteria ): Mt s vi khun lam t dưng đm hay thanh to sng chung vi nhiu vi sinh vt chân hch, t các loi nm cho đn các thc vt ht kín [5]. Azospirillum Phát hin năm 1974, là vi khun Gram âm cĩ dng xon, sng t do, đưng kính 1m, dài 2,1 3,8m chuyn đng trong mơi trưng lng bi mt tiêm mao
11 dài đu ( polan flagellum), trong mơi trưng đc 30 0C nhiu tiêm mao bên (lateral flagellum) ngn hơn cũng đưc thành lp. Trong nhng năm gn đây ngưi ta phát hin nhiu nhĩm vi khun này sng trong vùng r, trong r cây, thân cây và lá các cây khơng thuc h đu như lúa, bp, mía, sorghum, và mt s loi c. Azospirillum giúp tăng năng sut lúa t 32 81% điu kin nhà lưi (Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng điu kin ngồi đng vi khun ny ch làm tăng năng sut lúa đưc 10 30% [9]. Azospirillum tăng sinh c trong điu kin hiu khí và k khí vi s hin din hoc khơng cĩ hp cht nitơ trong mơi trưng, nhưng thích hp là vi hiu khí. Nhit đ ti ho t 35 37 0C. Mt s dịng Azospirillum là nhng vi sinh vt t dưng khơng bt buc. Vi khun Azospirillum phát trin tt trên mui ca nhng acid hu cơ như malate, succinate, hay pyruvate. Fructore và nhng đưng đơi khác cũng cĩ th đưc vi khun s dng như là ngun carbon . Mt s dịng Azospirillum cn biotin cho s phát trin ca chúng [5], [9]. Ngồi kh năng c đnh nitơ chúng cịn cĩ kh năng kh nitrat, chng li vi khun gây bnh thi lá cây dâu tm. Theo Eckert (2001) chi Azospirillum cĩ 7 lồi là: A. brasilense; A. lipoferum ; A. amazonense; A. irakense; A. halopraeferens; A. largimobile và A. doebereineae [35]. Mt s báo cáo gn đây cho thy vi khun này cĩ th tit ra nhng kích thích t tăng trưng như: IAA (Indole 3 acetic acid), IBA (Indole 3 butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins. Nhng kích thích t đĩ làm tăng chiu dài r, tăng th tích r và s lưng r. T đĩ, chúng làm tăng kh năng hp thu khống cht và nưc, tăng kh năng sinh trưng và phát trin cũng như tăng năng sut ca cây. Ngồi ra, chúng cịn giúp cho cây chng chu đưc điu kin khơ hn. Gluconacetobacter diazotrophicus [9]. Năm 1988, đưc Cavalcante V. A và Dobereiner J phân lp ln đu tiên t r và thân cây mía trng nhiu khu vc khác nhau trên khp Brazil.
12 G. diazotrophicus là vi khun Gram âm; ưa acid; vi hiu khí bt buc; t bào dng que thng trịn đu ( 0,7 0,9m đn khong 1 2m) tn ti dng đơn, đơi hoc chui mà khơng cĩ ni bào t; s dng đưng (glucose, fructose, sucrose ) nng đ khác nhau làm ngun C nhưng tăng trưng tt nht là nng đ sucrose 10% và pH = 5,5. G. diazotrophicus cĩ kh năng c đnh đm và sn xut ra hormone thc vt ( auxin, gibberellin), cĩ th hồ tan Zn và phosphorus nên G. diazotrophicus đưc xem là mt lồi vi khun đy ha hn, vi kh năng cung cp gn mt na nitơ c đnh đưc dng hu ích cho cây [9]. Herbaspirillum [9]. Herbaspirillum là các vi khun hình que, Gram âm, rng khong 0,5 0,6m. Chúng sinh trưng tt trong mơi trưng cĩ dicarboxylic và tng hp nitơ trong mt khong pH bin thiên t 5,3 8. Trong mơi trưng bán đc vi khun Herbaspirillum to thành mt lp màng mng, trng, mn ( pellicle). Khi cy chuyn lên mơi trưng đc JNFb thì lp màng này phát trin thành khun lc nh, m, ánh xanh và trên mơi trưng đc BMS thu đưc khun lc màu trng sa. Herbaspirillum cĩ kh năng c đnh đm cng sinh trong mơ ca nhng cây thân c như: Lúa, bp, mía, sorghum, chui và khĩm. Ngồi ra chúng cịn to ra nhng sn phm ca phytohormones như auxins và gibberillins rt tt cho s tăng trưng ca cây. Burkholderia [9]. Vi khun Burkholderia thuc vi khun Gram âm, cĩ hình dng hình que, đưng kính khong 1m, chúng cĩ th di chuyn nh các chiên mao đu ( Jesús et al, 2004). Burkholderia sinh trưng và phát trin trong điu kin k khí hoc hiu khí, nhưng trong mơi trưng ít khí oxy thì phát trin tt nht, chúng phát trin sâu trong mơi trưng nuơi cy t 1 4mm (Paulina et al, 2001). Trong mơi trưng
13 nuơi cy chúng to thành các khun lc màu trng hoc hơi vàng, đưng kính khong 2 4mm, trịn, phng hoc dài (Jesús et al, 2004). Burkholderia sng cng sinh vi cây trng và cĩ kh năng c đnh đm.Ví d như khi các vi khun Burkholderia sng cng sinh vi cây luá s c đnh đm khong 19% tng lưng đm cn thit cho nhu cu ca cây lúa. Năng sut ca cây lúa cĩ chng lồi Burkholderia vietnamiensis tương đương vi năng sut ca cây lúa khơng chng lồi Burkholderia vietnamiensis nhưng cĩ bĩn phân đm 25 30kg/ha (Van et al, 2000). 1.3 Tình hình nghiên cu ngồi nuc Hiu qu ca vic nhim ch phm Azotobacter sp cho đt và ht ging, cây con đã đưc chng minh trên các thí nghim đng rung. Theo nghiên cu ca Puneet (1998) cho thy vic nhim Azotobacter sp kích thích ny mm ca ht, kích thích ra r và sinh trưng, năng sut lúa mì, ngơ tăng 1015% so vi đi chng [32]. Tng kt các kt qu nghiên cu ca Nht Bn, Hoa Kỳ, Trung Quc, n Đ cho thy s dng ch phm Azotobacter cĩ th cung cp cho cây trng t 30 60 kg N/ha/năm và tng lưng N do vi sinh vt tng hp trên hành tinh cĩ th đt đn 240 triu tn/năm. Vi khun c đnh N t do Azotobacter cịn cĩ kh năng tng hp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưng cây trng [35]. Fulchieri (1993) nghiên cu s dng 3 chng Azospirillum đ x lý ht cho ngơ. Kt qu cho thy đã làm tăng chiu cao cây, tăng sinh khi và tăng năng sut ngơ lên 59% so vi đi chng, các chng này cĩ th cung cp khong 60 kg N/ha [35]. Nghiên cu ca Puneet (1998) cũng cho thy nu bĩn phi hp Azotobacter sp. vi các chng phân gii P như Aspergillus niger s làm tăng năng sut lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter ch tăng 9% . Kapoor cũng cho kt qu tương t khi phi hp chng Azotobacter sp vi các chng phân gii
14 phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp. Thí nghim làm tăng năng sut lúa, bơng vi lên 1020% [32]. ElKomy (2005) nghiên cu phi hp hai chng c đnh N Azospirillum và phân gii lân Bacillus megaterium x lý cho lúa mì. Kt qu cho thy hàm lưng N trong thân lúa mì ca các thí nghim cĩ x lý hai chng này tăng 37 53%; hàm lưng P trong thân tăng 48,6%; hàm lưng K tăng 1014,3% so vi đi chng khơng x lý. Kt qu nghiên cu cũng cho thy x lý phi hp hai chng cĩ tác dng cng hưng, tt hơn x lý đơn chng [35]. Zemrany (2006) nghiên cu s dng chng A. lipoferum cho ngơ. Kt qu cho thy khi s dng chng này đã làm gim 50% lưng N cho cây mà năng sut ngơ vn đm bo [35]. Abbas Akbari và cng s (2007) đã phân lp và tuyn chn đưc mt s chng Azospirillum sp cĩ kh năng sinh tng hp IAA kích thích sinh trưng ca cây lúa mì. Kt qu là s nhim các chng Azospirillum ssp đã làm tăng đưng kính gc lúa, chiu dài r, trng lưng khơ và s lưng lơng r so vi đi chng [29]. Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cu s dng Azospirillum brasilense kt hp vi than bùn cho Setaria italica và ngơ. Kt qu cho thy chiu dài thân, trng lưng khơ, năng sut tăng đáng k. Sinh khi vi khun là 10 8 CFU/1g than bùn cĩ hiu qu gây nhim ht ging cao nht [26]. Fabricio Cassa´n và cng s ( 2009) đã nghiên cu phi hp hai chng Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 x lí cho ngơ và đu tương. Kt qu cho thy x lí phi hp hai chng cho hiu qu cao hơn so vi x lí đơn chng. T l ny mm, chiu cao cây, chiu dài r, trong lưng khơ đu tăng so vi đi chng [27]. Cristiana Felici và cng s (2008) đã nghiên cu phi hp hai chng Bacillus subtilis và Azospirillum brasilense x lý cho cà chua. Kt qu cho thy khi phi hp hai chng cho hiu qu kém hơn so vi x lý đơn chng [24].
15 G. Holguin, C. L. Patten, B. R. Glick (1999) đã tng hp nghiên cu v di truyn và sinh hc phân t ca vi khun Azospirillum , cho thy các gen nif H, nif DK quy đnh tng hp nitrogennase cn cho quá trình c đnh đm ca vi khun [28]. Martı´n Dı´azZorita và cng s (2009) đã nghiên cu x lý gây nhim vi khun Azospirillum cho lúa mì, trong điu kin trng khơ hn. Kt qu cho thy cây tăng trưng tt, tăng chiu cao, đưng kính gc, hàm lưng tích lũy cht khơ tăng, năng sut ht khơ tăng 260kg/ha, tương đương sn lưng tăng 8% (so vi đi chng [30]. Andres D. Naiman và cng s ( 2009) đã nghiên cu x lý gây nhim vi khun Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì. Kt qu cho thy chiu cao cây tăng 12%, đưng kính gc thân tăng 40%, năng sut tăng 16% [23]. 1.4 Nghiên cu trong nưc Nhm mc tiêu phát trin nơng nghip sinh thái bn vng và ng dng CNSH vào nơng nghip, trong nhng năm gn đây Vit Nam cĩ khá nhiu nghiên cu v Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh hc. Phm Bích Hiên và cng s ( 2003) đã nghiên cu 10 chng Azotobacter ca Vit Nam và nhn thy rng ngồi kh năng c đnh N chúng cịn cĩ kh năng sinh tng hp cht kích thích sinh trưng IAA. Nhit đ thích hp ca các chng này là 2530 0C, pH thích nghi rng t 5,5 8,0 [8]. Phm Ngc Lan (1999) đã phân lp đưc 37 chng Azotobacter trên đt gị đi vùng Tha Thiên Hu. Nhĩm nghiên cu cũng tuyn chn đưc hai chng cĩ kh năng kháng kháng sinh, tn ti đưc pH kim ( pH = 8). Kt qu th nghim gây nhim cây ging keo tai tưng trong vưn ươm đã làm tăng t l sng, sinh khi, chiu cao cây và hàm lưng N trong lá cũng cao hơn so vi đi chng [13].
16 Nguyn Th Phương Chi (1999) nghiên cu bĩn th nghim chng c đnh N t do Azotobacter và chng phân gii phosphate Archomobacter , Pseudomonas aeruginosa . Kt qu cho thy ch phm sinh hc làm tăng sinh trưng chiu cao m 7,47 16,93% và năng sut lúa tăng t 13,39 – 55,85% [3]. Lâm Minh Tú, Trn Văn Tuân (2003) nghiên cu sn xut mt s phân bĩn đơn chng, đa chng cho cây trng. Các chng s dng trong nghiên cu là Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa. Th nghim trên khoai tây làm tăng năng sut t 100 300% so vi đi chng [ 20 ]. Phm Văn Ton (2003) s dng phân bĩn sinh hc gim đưc 20% phân bĩn vơ cơ N, P, K nhưng năng sut khoai tây vn tăng so vi đi chng 1550%, cà chua tăng 1234%, lc tăng 30% và gim đáng k bnh héo xanh [19]. Nguyn Ngc Dũng, H Th Kim Anh (1999) nghiên cu nh hưng ca các chng c đnh N trong r lúa đn sinh trưng ca mm lúa CR 203. Nhĩm tác gi đã phân lp đưc 78 chng cng sinh vi r lúa. Các chng này cĩ đc đim ca chi Azospirillum. Các chng này kích thích s ny mm và r ca lúa CR 203 [1]. Lăng Ngc Du (2004) đã nghiên cu kh năng to IAA ca vi khun Azospirillum lipoferum , tin hành nuơi cy chng vi khun này trên mơi trưng Nfb cĩ b sung Tryptophan, theo dõi ti nhng thi đim khác nhau. Kt qu cho thy ti thi đim 10 ngày sau khi cy kh năng tao IAA cao nht [4].
17 PHN II. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1 Ni dung nghiên cu Đ đt đưc mc tiêu ca đ tài chúng tơi tin hành nghiên cu các ni dung sau: 1. Phân lp và mơ t đc đim sinh hc mt s chng Azospirillum . 2. Tuyn chn các chng Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm bng nghiên cu th nghim trên cây ngơ. 3. Nghiên cu xây dng quy trình nhân sinh khi ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn. 2.2 Vt liu và đa đim nghiên cu 2.2.1 Vt liu và thit b nghiên cu * Vt liu: Các chng vi khun c đnh đm Azospirillum đưc phân lp t r cây ngơ trong giai đon tr c ti huyn Krơng Nơ, Cư Jut, Đăk Mil thuc tnh Đăk Nơng. Ging ngơ lai C919 cung cp bi Cơng ty Monsanto Vit Nam . Vi khun Azospirillum lipoferum AL10 do vin nghiên cu và phát trin Cơng Ngh Sinh hc Đi hc Cn Thơ cp. Cp mi chuyên bit đ nhn din Azospirillum lipoferum đưc Vin nghiên cu và phát trin Cơng Ngh Sinh hc, Trưng Đi hc Cn Thơ thit k da theo trình t gen nif H ca vi khun Azospirillum lipoferum gm: + Mi xuơi: 5 ’GTA AAT CCA CCA CCT CCC 3’ và + Mi ngưc: 5 ’ TGT AGA TTT CCT GGG CCT3’. * Hĩa cht: Acid Malic, KH 2PO 4, Na 2MoO 4, CuSO 4, ZnSO 4, Saccarose, Agar, Biotin, Pyridoxine * Thit b nghiên cu: Đĩa petri, micropipette, que cy, box cy vơ trùng, máy quang ph spectrophotometer Plus 100 (Nht Bn), máy nhit, ni hp
18 kh trùng, PCR C1000 (Biorad, M); GelDoc (Biorad, M); Đin di Biorad (M). 2.2.2 Đa đim nghiên cu Đa đim thu mu: đưc thc hin ti các huyn Krơng Nơ, Cư Jut, Đăk Mil thuc tnh Đăk Nơng. Đa đim thí nghim: đưc thc hin ti B mơn Sinh hc thc vt, Khoa Nơng Lâm nghip, Phịng thí nghim CNSH & MT, Trưng Đi hc Tây Nguyên. Đa đim thc nghim: ti Tri thc nghim Khoa Nơng Lâm nghip, trưng Đi hc Tây Nguyên. 2.2.3 Thi gian nghiên cu Đ tài thc hin t tháng 08/2010 ti tháng 08/2011. 2.3 Phương pháp nghiên cu 2.3.1 Phương pháp thu mu R cây ngơ trong giai đon tr c thuc các ging khác nhau đưc thu thp mt cách ngu nhiên, mi rung ly năm cây (4 cây 4 gĩc và 1 cây gia rung) ti các huyn Krơng Nơ, Cư Jut, Đăk Mil thuc tnh Đăk Nơng. Tồn b b r đưc đng trong túi nilon đã kh trùng. Các mu sau khi ly đưc ghi nhãn nơi ly, ngày ly và ngưi thu mu. Mu r cây ngơ sau khi thu đưc đem ti phịng thí nghim, ra tht sch đt bám r dưi vịi nưc chy, đ ráo t nhiên, đ riêng tng mu ri tin hành phân lp hoc bc riêng tng mu trong túi nilon đã kh trùng buc cht và bo qun trong t lnh (5 0C) nu chưa phân lp ngay [5], [17]. 2.3.2 Phương pháp phân lp Ct r thành nhng khúc nh 2 3cm. Các mu r đưc đ riêng trong các bình tam giác tin hành kh trùng b mt. R đưc kh trùng bng dung dch 0 chloromine 1% trong 30 phút, tip tc kh trùng bng cn 70 5 phút, H 2O2 3 phút ri ra tht sch bng nưc ct vơ trùng (6 ln). Sau đĩ ly khong 2g mu
19 cho vào ci giã nhuyn ri thêm 0,5 2ml nưc ct vơ trùng vào ci, đ yên 10 phút và hút ly phn trong cho vào eppendorf, đ yên 10 phút cho dch mu lng xung và ly phn nưc trong đ tin hành phân lp. Ly 0,5ml dch nghin r cho vào ng nghim cha 5ml mơi trưng NFb bán đc (khơng đm). nhit đ 32 0C trong vịng 4 5 ngày, mi nghim thc lp li 3 ln. Quan sát nhng ng nghim cĩ vịng đm (vịng pellicle), cách b mt mơi trưng 2 – 5 mm ch th cĩ s hin din ca vi khun Azospirillum . Chuyn vi khun t mơi trưng bán đc sang mơi trưng đc tin hành làm thun ging [21]. Làm thun ging: Cy ria các khun lc đưc la chn lên các đĩa petri cha mơi trưng NFb đc đ thu khun lc đơn. Quá trình làm thun đưc tin hành 2 3 ln. Chn khun lc đơn đã đưc làm thun cy chuyn vào ng thch nghiêng đ gi ging [5], [21]. * Mơi trưng Nfb khơng đm: [25], [34]. Acid Malic: 5g K2HPO 4: 0,5g MgSO 4 .7H 2O: 0,2g NaCl: 0,1g CaCl 2: 0,02g KOH: 4g 1 ml dung dch stock vitamin (10 mg biotin và 20mg pyridoxine trong 100 ml nưc ct). 2ml dung dch vi lưng (200mg Na 2MoO 4 .2H 2O, 235mg MnSO 4.H 2O, 280 mg H 3BO 3, 8 mg CuSO 4.5H 2O, 24 mg ZnSO 4.7H 2O hịa tan trong 200 ml nưc ct). Agar: 1,75 g/ lít 2ml Bromthymol blue 0,5% Thêm nưc ct va đ 1 lít. pH điu chnh đn 6,8.
20 * Mơi trưng đc cĩ cha 15g/lít agar (Dobreigner, 1995) 2.3.3 Phương pháp mơ t đc đim hình thái, đc đim sinh hc ca các chng Azospirillum Mơ t các đc đim hình thái ca các chng dưi kính hin vi, xác đnh đc đim sinh hc và đnh danh theo khố phân loi ca Bergey 1994. 2.3.4 Phương pháp xác đnh kh năng to IAA ca các chng Azospirillum Đánh giá kh năng to IAA ca các chng Azospirillum da trên nng đ IAA cĩ trong dich chit t dch nuơi cy vi khun. Nng đ IAA cĩ trong dch chit càng cao chng t kh năng to IAA ca chng vi khun càng mnh. Nng đ IAA đưc xác đnh bng phương pháp so màu Salkowski bưc sĩng 530 nm [27]. * Phương pháp xác đnh phương trình đưng chun ca mi tương quan gia ch s OD 530nm và nng đ IAA. Chun b dung dch đm phosphat ( 200ml) A: KH 2PO 4 0,136g/100ml nưc ct; B: K 2HPO 4 0,174g/100ml nưc ct; Ly 39ml A + 61ml B cho thêm nưc ct va đ 200ml, điu chnh pH 7. Chun b thuc th Salkowski Ly 553 ml H 2SO 4 (98%) cho vào nưc ct đ 1 lít, đ ngui sau 12 gi đưc dung dch H 2SO 4 đm đc 10,8M. Cân 4,5g FeCl 3 cho vào 1 lít H 2SO 4 10,8M đã pha trên đ đưc thuc th Salkowski. Chun b đưng chun IAA Cân 1,6 mg IAA tng hp hịa tan vi 10 ml dung dch đm phosphat đưc nng đ là 160mg/l. Sau đĩ tin hành pha lỗng ra các nng đ 0, 5, 10, 16, 20, 40, 80 mg/l. Ly 4 ml thuc th cho vào các ng nghim cĩ nng đ IAA khác nhau cĩ th tích 2 ml, mi nng đ lp li 3 ln.
21 Đ 10 phút trong ti nhit đ phịng đ phn ng xy ra hồn tồn, sau đĩ tin hành đo OD bưc sĩng 530 nm. T kt qu trên, chúng tơi xác đnh đưc phương trình đưng chun ca dung dch IAA thơng qua ch s OD 530nm . Da vào phương trình đưng chun đ xác đnh nng đ IAA ( mg/l) do các vi khun to ra cĩ trong mơi trưng nuơi cy. Bng nng đ IAA thành lp đ th đưng chun ng 1 2 3 4 5 6 7 IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,2 0,25 0,5 1 Dung dich đm 2 1,9375 1,875 1,84 1,75 1,5 1 (ml) Nng đ IAA 0 5 10 16 20 40 80 (mg/l) Thuc th 4 4 4 4 4 4 4 Salkowski (ml) Thc hin nuơi cy các chng Azospirillum phân lp đưc trên mơi trưng chit khoai tây (BMS). Chun b mơi trưng lng trong các bình tam giác, mi bình cha 50ml dch mơi trưng, hp kh trùng, đ ngui. Tin hành cy các chng Azospirillum vào các bình tam giác cha mơi trưng đã kh trùng. Nuơi nhit đ phịng, trên máy lc xoay vịng 150 vịng/phút. Sau 72h thu dch nuơi cy và li tâm 8000 vịng/phút, li tâm 4 phút, ly dch trong đ đo lưng IAA đưc vi khun tng hp và tit ra mơi trưng bng phương pháp so màu Salkowski bưc sĩng 530 nm, thí nghim đưc lp li 3 ln. 2.3.5 Phương pháp tuyn chn các chng Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm bng nghiên cu th nghim trên cây ngơ Đánh giá hot tính c đnh đm ca các chng Azospirillum da trên N tng s cĩ trong lá và các ch tiêu sinh trưng ca cây ngơ. N tng s cĩ trong lá
22 và các ch tiêu sinh trưng ca cây ngơ ca các lơ thc nghim càng cao hơn so vi lơ đi chng, chng t hot tính c đnh đm ca chng vi khun càng mnh. * Phương pháp thí nghim: Ht ngơ lai C919 đưc kh trùng bng H 2O2 3% trong 3 phút, ra li 4 ln vi nưc ct. Sau đĩ, cho ht vào đĩa petri cĩ bơng đã đưc kh trùng, vi mt ít nưc và cho ti khi ht nt mng chun b ny mm. Ra sch ht bng nưc ct. Vi khun Azospirillum đưc nuơi trong ng nghim sau 72 h ly dch sinh khi t bào cho ht ngơ vào và ngâm 15 phút. Sau đĩ đem gieo 1 ht/bu đt. Loi đt đĩng bu là đt đ Bazan ch ly lp đt mt, mi bu đĩng khong 5 kg đt. Mi chng Azospirillum cĩ 1 nghim thc, mi nghim thc cĩ 15 bu đt, thí nghim đưc lp li 3 ln. Nghim thc 1: Đi chng khơng bĩn phân, khơng nhim vi khun Azospirillum Nghim thc 2: Khơng bĩn phân, nhim vi khun Azospirillum . Các ch tiêu theo dõi cây ngơ sau khi gieo 45 ngày: Chiu cao cây, s lá trên cây, chiu dài lá, đưng kính gc, chiu dài r, khi lưng tươi, khơ. Các ch tiêu phân tích: Hàm lưng đm tng s, hàm lưng dip lc trong lá. * Phương pháp xác đnh hàm lưng đm tng s: Theo phương pháp Kjeldanl [2],[14]. * Phương pháp xác đnh hàm lưng dip lc: Hàm lưng dip lc (chlorophyll) và carotenoid đưc xác đnh bng phương pháp so màu [36]. Ly 500mg lá, ct nh, ngâm trong 50ml aceton 80%, đ trong ti. Sau 3 ngày ly tồn b dch chit đnh mc đn 100ml. Sau đĩ ly dch chit đo các bưc sĩng 663nm, 645nm và 440,5nm. Hàm lưng chlorophyll a (C a), chlorophyll b (C b) và carotenoid (C car ) đưc tính theo cơng thc: Ca = 0,0127 x OD 663 0,00269 x OD 645 1 Cb (mg x g ) = 0,0299 x OD 645 0,00468 x OD 663 1 Ccar (mg x g ) = 0,004695 x OD 440,5 0,000268 x (C a + C b)
23 2.3.6 Phương pháp đnh danh các chng Azospirillum đưc tuyn chn bng k thut PCR Nuơi cy vi khun pha log (sau 36 h), ly trích DNA vi khun và tin hành nhân DNA bng máy PCR ri chy đin di sn phm. So sánh đ ln DNA vi khun vi thang chun và vi mu đi chng dương Azospirillum lipoferum AL10 . Nu đ dài ca DNA vi khun cn nhn din là 400bp, ging mu đi chng dương thì đĩ là vi khun Azospirillum lipoferum. Phn ng khuch đi DNA đưc thc hin trong th tích 25 l. Mt phn ng bao gm: 1,0L DNA vi khun; 2,5L 10X PCR buffer; 1,0L mi xuơi; 1,0L mi ngưc; 1,0L dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 0,5L Taq polymerase; 18L nưc ct vơ trùng. Chu kỳ phn ng PCR gm các bưc th t như sau: Bưc 1: Bin tính các mu ADN 95 0C trong 5 phút Bưc 2: Thc hin tip 95 0C trong 1 phút Bưc 3: H nhit đ đn 55 0C trong 1 phút Bưc 4: Nâng nhit đ lên 72 0C trong 1 phút Bưc 2 đn bưc 4 lp li 30 chu kỳ. Bưc 5: Gi 72 0C trong 10 phút Bo qun sn phm PCR 4 0C. Đin di gel cha sn phm phn ng PCR: Các sn phm sau khi đưc khuch đi bng phn ng PCR, tip tc đem đin di trên gel agarose 1,2% cĩ b sung thêm ethidium bromide (EtBr). 2.3.7 Phương pháp nghiên cu xây dng quy trình nhân sinh khi ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn 2.3.7.1 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum
24 Các chng Azospirillum s đưc nuơi trên 3 loi mơi trưng Nfb, Fallik, mơi trưng nưc chit khoai tây (BMS), nhit đ phịng, trên máy lc xoay h vịng 150 vịng/phút. Sau 72 tin hành đo OD 660 đ xác đnh sinh khi t bào. Mt đ t bào đưc xác đnh tương quan OD 660 = 1,0 tương đương vi mt đ 10 9 t bào/ml [26]. Chn mơi trưng thun li nht cho sinh trưng ca vi khun Azospirillum đ tin hành nhng thí nghim tip theo. * Mơi trưng Nfb [25], [34]. Acid Malic: 5g K2HPO 4: 0,5g MgSO 4 .7H 2O: 0,2g NaCl: 0,1g CaCl 2: 0,02g KOH: 4g Thành phn khống vi lưng, vitamin như mơi trưng phân lp. Thêm nưc ct cho đ 1000ml Điu chnh pH: 6,8 * Mơi trưng ca Fallik [26]. KH 2PO 4: 4g K2HPO 4: 6 g NaSuccinate: 5g NH 4Cl: 1g MgSO 4 .7H 2O: 0,2g Cao nm men: 0,2g NaOH: 3,5g Nưc ct va đ 1 lít Điu chnh pH: 6,8 * Mơi trưng nưc chit khoai tây (BMS) [12], [34]. Nưc chit khoai tây: 500ml ( 200g/l ) Acid Malic: 2,5g
25 KOH: 2,0g Đưng Sacarose: 2,5 g Thành phn khống vi lưng, vitamin như mơi trưng phân lp. Thêm nưc ct va đ 1 lít. pH điu chnh đn 6,8. 2.3.7.2 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum Tin hành nuơi cy các chng Azospirillum trên mơi trưng thun li nht chn ra t thí nghim trên, nuơi cy nhit đ phịng, pH = 6,8 trên máy lc 150 h h h h vịng/phút. Sau 24 , 48 , 72 , 96 tin hành đo OD 660 đ xác đnh sinh khi t bào [6]. 2.3.7.3 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum Tin hành nuơi cy các chng Azospirillum trên mơi trưng thun li nht (mơi trưng dng lng) chn ra t thí nghim trên, nuơi cy nhit đ phịng, pH = 6,8 trên máy lc xoay vịng các tc đ 0, 100, 150, 200, 250 vịng/phút. Sau thi gian thun li nht chn ra t các thí nghim trên tin hành đo OD 660 đ xác đnh sinh khi t bào [6]. 2.3.7.4 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum Tin hành nuơi cy các chng Azospirillum trên mơi trưng (mơi trưng dng lng), các pH 5,8; 6,3; 6,8; 7,3 và 7,8. Nuơi cy nhit đ phịng, trên máy lc xoay vịng 150 vịng/phút. Sau thi gian thun li nht chn ra t các thí nghim trên tin hành đo OD 660 đ xác đnh sinh khi t bào [6]. 2.3.7.5 Phương pháp nghiên cu nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum Tin hành nuơi cy các chng Azospirillum c đnh đm trên mơi trưng, pH thun li nht chn ra t các thí nghim trên các nhit đ 27 0C, 32 0C,
26 37 0C, 42 0C. Sau thi gian thun li nht chn ra t các thí nghim trên tin hành đo OD 660 đ xác đnh sinh khi t bào [6]. 2.3.8 Phương pháp đánh giá kh năng c đnh đm ca các chng vi khun Azospirillum đưc tuyn chn trên đng rung Ht ngơ lai C919 đưc kh trùng bng H 2O2 3% trong 3 phút, ra li 4 ln vi nưc ct. Sau đĩ, cho ht vào đĩa petri cĩ bơng đã đưc kh trùng, vi mt ít nưc và cho ti khi ht nt mng chun b ny mm. Ra sch ht bng nưc ct. Các chng vi khun Azospirillum đã đưc tuyn chon đưc nuơi trong ng nghim sau 72 gi ly dch sinh khi t bào cho ht ngơ vào và ngâm 15 phút. Vi đi chng thì ngâm bng nưc ct. Sau đĩ đem gieo, mi hc gieo 2 ht. * B trí thí nghim B trí theo phương pháp khi ngu nhiên đy đ thí nghim cĩ 11 nghim thc, 3 ln lp li. Nghim thc 1: khơng bĩn phân đm, khơng nhim vi khun Azospirillum . Nghim thc 2: khơng bĩn phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng K17. Nghim thc 3: khơng bĩn phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng K25. Nghim thc 4: khơng bĩn phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng D06. Nghim thc 5: bĩn 50% phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng K17. Nghim thc 6: bĩn 50% phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng K25. Nghim thc 7: bĩn 50% phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng D06. Nghim thc 8: bĩn 75% phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng K17.
27 Nghim thc 9: bĩn 75% phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng K25. Nghim thc 10: bĩn 75% phân đm, nhim vi khun Azospirillum chng D06. Nghim thc 11: bĩn 100% phân đm, khơng nhim vi khun Azospirillum . Din tích mi ơ thí nghim: 2m 2 (Chiu dài: 2m; Chiu rng: 1m) Tng din tích thí nghim: (11 ơ x 2m 2/ơ) x 3 ln lp li = 66m 2. Sơ đ b trí thí nghim Lp li Nghim thc I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 II 4 8 6 5 11 10 1 9 2 3 7 III 9 10 7 1 3 2 4 6 11 8 5 * Điu kin thí nghim + Khong cách gieo Gieo hàng kép: hàng kép cách nhau 100cm hàng đơn cách nhau 30cm, cây cách cây 25cm. + Lưng phân bĩn cho 1 ha Phân chung (hu cơ): 8 tn/ha. Phân vơ cơ: 300kg Urea + 350kg Lân Văn Đin + 150kg KaliClorua (Theo qui trình ca khuyn nơng tnh Đak Lak). + Phương pháp bĩn Bĩn lĩt: 100% phân chung + 100% phân lân. Bĩn thúc: Ln 1: khi cây ngơ cĩ 3 – 4 lá ( sau gieo 15 – 18 ngày). Bĩn cách gc 10cm. + Vi nghim thc 5, 6, 7 thì bĩn lưng đm 15%. + Vi nghim thc 8, 9, 10 thì bĩn lưng đm là 22,5%. + Vi nghim thc 11 thì bĩn lưng đm 30%.
28 Ln 2: khi cây ngơ cĩ 7 – 9 lá ( sau gieo 30 – 35 ngày). Bĩn cách gc 10 – 15cm. + Vi nghim thc 5, 6, 7 thì bĩn lưng đm 20%, kali là 50%. + Vi nghim thc 8, 9, 10 thì bĩn lưng đm 30%, kali là 50%. + Vi nghim thc 11 thì bĩn lưng đm 40%, kali là 50%. Ln 3: khi cây ngơ xốy nõn ( sau gieo 40 – 45 ngày). Bĩn cách gc 15cm. + Vi nghim thc 5, 6, 7 thì bĩn lưng đm là 15%, kali là 50%. + Vi nghim thc 8, 9, 10 thì bĩn lưng đm là 22,5%, kali là 50%. + Vi nghim thc 11 thì bĩn lưng đm 30%, kali là 50%. * Các ch tiêu và phương pháp theo dõi Cây theo dõi đưc xác đnh sau khi ngơ mc đưc 2 tun. Cây theo dõi ly ngu nhiên trong ơ thí nghim, mi nghim thc đo 6 cây. Đánh du cây theo dõi đ tip tc đo các ln sau. Các ch tiêu theo dõi bao gm: Chiu cao cây (cm), s lá trên cây, chiu dài lá (cm), 14 ngày đo 1 ln. Đưng kính gc (mm) đo vào tun th 6 và th 8 sau khi ngơ mc, hàm lưng dip lc trong lá. Các ch tiêu năng sut gm: Chiu dài trái bp, s ht/hàng, s hàng ht/trái, đưng kính trái bp, khi lưng khơ 100 ht và năng sut lý thuyt. 2.3.9 Phương pháp x lý s liu thng kê Các s liu đưc x lý trên phn mm MSTATC version 2.10 ca Đi hc Michigan, M. Đ th tương quan và phương trình tương quan gia ch s mt đ quang OD vi sinh khi t bào, nng đ IAA đưc x lý trên phn mm EXCELL 2003 ca Microsoft. Các biu đ khác cũng đưc x lý trên phn mm này.
29 PHN III. KT QU VÀ THO LUN 3.1 Phân lp các chng vi khun Azospirillum trong r cây ngơ ti mt s đa đim ca tnh Đăk Nơng Vịng pellicle ( hin din cĩ vi khun Azospirillum ) Hình 3.1. Phân lp vi khun t mơi trưng bán đc Nfb Sau khi phân lp và làm thun, chúng tơi thu đưc 43 chng vi khun c đnh đm Azospirillum . Trong đĩ, huyn Krơng Nơ phân lp đưc 22 chng ký hiu K01, K03, K12, K15, K16, K17, K18, K19, K21, K22, K23, K25, K26, K33, K36, K37, K38, K39, K40, K51, K54, K55; huyn Cư Jut phân lp đưc 10 chng ký hiu C01, C03, C05, C22, C23, C24, C31, C32, C33, C40; huyn Đăk Mil phân lp đưc 11 chng ký hiu D02, D04, D06, D07, D08, D09, D10, D15, D17, D46, D47. Điu này cho thy nhng mu r ngơ đưc ly trên nn đt huyn Krơng Nơ phân lp đưc vi khun thun li hơn so vi mu r ngơ đưc ly trên nn đt hai huyn cịn li. Các chng vi khun này đu cĩ các đc đim hồn tồn phù hp vi nhng nghiên cu trưc đây v vi khun Azospirillum , như nghiên cu ca Nguyn Khc Minh Loan và Đào Thanh Hồng (2005) [11], Nguyn Hu Hip, Ngơ Ngc Hưng và Nguyn Th Phương Tâm (2006) [10]. Các chng vi khun phân lp đưc đu sinh trưng và phát trin trong điu kin vi hiu khí, to thành
30 mt vịng pellicle trng đc bên dưi mơi trưng Nfb bán đc 25mm và làm bin đi màu mơi trưng t màu xanh lá sang màu xanh dương. 3.2 Mơ t đc đim hình thái, đc đim sinh hc ca các chng Azospirillum Chúng tơi quan sát các đc đim khun lc ca các chng vi khun và làm tiêu bn t bào đ xem trên kính hin vi. Các khun lc đưc quan sát bng mt thưng và trên vt kính 4x và 10x. Tiêu bn t bào nhum gram đưc quan sát vt kính 40x, 100x. Các khun lc s đưc phân loi sơ b da vào hình thái ca khun lc và hình thái t bào ca vi khun. Kt qu cho bi bng sau. Bng 3.1. Đc đim hình thái khun lc ca các chng Azospirillum Đc đim hình thái ca khun lc STT Chng Mt ct Hình dng B mt Màu sc Mép ngang Trng Bng 1 K01 Trịn Bĩng Li trong phng Bng 2 K03 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Bng 3 K12 Trịn Nhn Trng đc Li phng Trng Bng 4 K15 Trịn Bĩng, nhn Li trong phng Bng 5 K16 Trịn đu Bĩng, nhn Trng sa Li phng Bng 6 K17 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Bng 7 K18 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Trng Bng 8 K19 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 9 K21 Trịn đu Bĩng, nhn Trng sa Li phng Bng 10 K22 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Bng 11 K23 Trịn Bĩng Trng đc Li phng
31 Bng 12 K25 Trịn đu Bĩng, nhn Trng sa Li phng Trng Bng 13 K26 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 14 K33 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Bng 15 K36 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Bng 16 K37 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Bng 17 K38 Trịn đu Bĩng, nhn Trng sa Li phng Bng 18 K39 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Trng Bng 19 K40 Trịn Bĩng Li trong phng Trng Bng 20 K51 Trịn Bĩng Li trong phng Trng Bng 21 K54 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 22 K55 Trịn Bĩng Trng sa Li phng Bng 23 C01 Trịn Nhn Trng đc Li phng Trịn Trng Bng 24 C03 Bĩng, nhn Li khơng đu trong phng Trng Bng 25 C05 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 26 C22 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Bng 27 C23 Trịn Nhn Trng đc Li phng Trịn Trng Bng 28 C24 Bĩng Li khơng đu trong phng Trng Bng 29 C31 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng
32 Bng 30 C32 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Trịn, Bng 31 C33 Nhn Trng đc Li khơng đu phng Trịn Trng Bng 32 C40 Bĩng Li khơng đu trong phng Trng Bng 33 D02 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 34 D04 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Bng 35 D06 Trịn đu Bĩng Trng sa Li phng Trịn Trng Bng 36 D07 Bĩng Li khơng đu trong phng Trng Bng 37 D08 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 38 D09 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Trịn, Bng 39 D10 Nhn Trng đc Li khơng đu phng Trịn Trng Bng 40 D15 Bĩng Li khơng đu trong phng Trng Bng 41 D17 Trịn đu Bĩng, nhn Li trong phng Bng 42 D46 Trịn Bĩng Trng đc Li phng Trịn, Bng 43 D47 Nhn Trng đc Li khơng đu phng
33 Bng 3.2. Kt qu nhum gram ca các chng Azospirillum STT Chng Gram Hình dng t bào Kích thưc t bào 1 K01 Hình que 2,5 5,1m x 2 2,5m 2 K03 Hình que 1,5 2,5m x 1 1,5m 3 K12 Hình que 2,5 5m x 2 2,5m 4 K15 Hình que 1,5 2,5m x 0,5 1,5m 5 K16 Hình que 4 5m x 2 2,5m 6 K17 Hình que 2,1 3,2m x 1 1,3m 7 K18 Hình que 2,3 2,8m x 1 1,5m 8 K19 Hình que 1,5 2,5m x 1 1,5m 9 K21 Hình que 3,5 5,5m x 2 2,5m 10 K22 Hình que 1,5 2m x 1 1,5m 11 K23 Hình que 2 2,5m x 1 1,5m 12 K25 Hình que 2,5 3,5m x 1,5 2m 13 K26 Hình que 1,5 2,5m x 1 1,5m 14 K33 Hình que 2,5 5m x 2 2,5m 15 K36 Hình que 1,5 3m x 1 2m 16 K37 Hình que 2 2,5m x 1 1,5m 17 K38 Hình que 1,5 2,5m x 1 2m 18 K39 Hình que 1,5 2,5m x 0,5 1,5m 19 K40 Hình que 1,5 3m x 1 1,5m 20 K51 Hình que 2 2,5m x 1 1,5m 21 K54 Hình que 25,5m x 22,5m 22 K55 Hình que 2,5 3,5m x 1,5 2m 23 C01 Hình que 2 5m x 2 2,5m 24 C03 Hình que 2 2,5m x 1 2m 25 C05 Hình que 1,5 3m x 1 1,5m 26 C22 Hình que 1,5 2,5m x 0,5 1,5m 27 C23 Hình que 1,5 2,5m x 1 2m 28 C24 Hình que 2 2,5m x 0,5 1,5m 29 C31 Hình que 2,5 3m x 1 1,5m 30 C32 Hình que 2,5 5m x 2 2,5m 31 C33 Hình que 2,5 5m x 2 2,5m 32 C40 Hình que 2,5 3,5m x 2 2,5m 33 D02 Hình que 2,5 5,5m x 2 2,5m 34 D04 Hình que 1,5 2,5m x 1 1,5m 35 D06 Hình que 2,2 2,5m x 1 1,5m 36 D07 Hình que 1,5 2,5m x 1 1,5m 37 D08 Hình que 2,5 5,2m x 1,5 2,5m 38 D09 Hình que 2,5 5,5m x 2 2,5m 39 D10 Hình que 2 2,5m x 0,5 1,5m
34 40 D15 Hình que 1,5 3m x 1 1,5m 41 D17 Hình que 1,5 2,5m x 1 2m 42 D46 Hình que 1,5 2,5m x ,05 1,5m 43 D47 Hình que 2,5 3m x 1,5 2m “”: Gram âm Az 2.2 T bng 3.1 và bng 3.2 mơ t các đc đim v hình thái, màu sc khun lc, gram vi khun, cho thy các chng phân lp đưc đu mang nhng đc đim hồn tồn phù hp vi nhng nghiên cu trưc đây v vi khun Azospirillum. 3.3 Kt qu nghiên cu xác đnh kh năng to IAA ca các chng Azospirillum Đ xác đnh hàm lưng IAA đưc sinh ra bi các chng vi khun chúng tơi tin hành xây dng phương trình đưng chun v mi tương quan gia ch s OD 530 và nng đ IAA. Kt qu đo đưc theo bng 3.3. Bng 3.3. Giá tr OD 530nm đo đưc các nng đ IAA pha lỗng khác nhau ng 1 2 3 4 5 6 7 IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,2 0,25 0,5 1 Dung dich đm 2 1,9375 1,875 1,84 1,75 1,5 1 (ml) Nng đ IAA 0 5 10 16 20 40 80 (mg/l) Thuc th 4 4 4 4 4 4 4 Salkowski (ml) OD 530nm 0 0,172 0,250 0,318 0,464 0,927 1,662 T giá tr OD 530nm đo đưc chúng tơi xây dng phương trình đưng chun sau:
35 Biu đ 3.1. Phương trình đưng chun v mi tương quan tuyn tính gia ch s OD 530nm và nng đ IAA (mg/l) 1,8 y = 0,0207x + 0,0368 1,6 R2 = 0,995 1,4 1,2 530nm 1 0,8 OD 0,6 Linear (OD) Ch s OD s Ch 0,4 0,2 0 0 50 100 Nng đ(mg/l) Tin hành nuơi cy các chng vi khun trên mơi trưng BMS. Sau 3 ngày tin hành ly tâm thu dch trong cho phn ng vi thuc th Salkowski và đo OD 530 . T giá tr OD đo đưc và phương trình đưng chun chúng tơi xác đnh đưc hàm lưng IAA do các chng vi khun sinh ra. Kt qu th hin bng 3.4. Bng 3.4. Kt qu nghiên cu kh năng tng hp IAA ca các chng Azospirillum (mg/l). Hàm lưng IAA (mg/l) Chng vi STT khun Ln 1 Ln 2 Ln 3 Trung bình 1 K01 3,73 4,60 6,05 4,79 2 K03 2,86 3,54 3,73 3,38 3 K12 25,76 21,36 21,27 22,80 4 K15 1,65 1,89 1,60 1,72 5 K16 5,28 4,70 5,66 5,21 6 K17 13,58 15,71 14,50 14,60 7 K18 11,99 10,25 7,84 10,03
36 8 K19 10,15 9,38 10,59 10,04 9 K21 7,35 5,76 5,08 6,06 10 K22 8,61 8,03 8,42 8,35 11 K23 10,54 10,11 8,32 9,66 12 K25 9,29 9,33 7,26 8,62 13 K26 9,53 10,59 8,56 9,56 14 K33 1,80 3,63 3,73 3,05 15 K36 8,80 7,35 11,07 9,08 16 K37 11,56 12,18 10,49 11,41 17 K38 13,54 10,49 10,73 11,59 18 K39 13,39 13,73 14,16 13,76 19 K40 13,92 13,00 13,68 13,54 20 K51 1,36 1,70 3,20 2,09 21 K54 19,19 23,39 23,34 21,97 22 K55 11,22 10,98 10,49 10,90 23 C01 14,36 14,26 13,34 13,99 24 C03 9,53 9,62 9,29 9,48 25 C05 15,18 16,77 16,29 16,08 26 C22 19,04 18,66 18,37 18,69 27 C23 18,61 18,27 18,46 18,45 28 C24 17,11 18,27 18,03 17,80 29 C31 13,87 13,92 13,78 13,86 30 C32 14,02 14,84 14,45 14,44 31 C33 16,19 15,95 15,61 15,92 32 C40 14,94 14,84 14,99 14,92 33 D02 5,23 10,15 7,35 7,58 34 D04 9,33 8,61 10,59 9,51 35 D06 10,64 12,14 9,53 10,77 36 D07 3,10 2,96 3,63 3,23 37 D08 5,32 5,86 4,70 5,29 38 D09 10,59 10,69 10,25 10,51 39 D10 15,03 13,39 14,94 14,45 40 D15 2,04 2,09 2,76 2,30 41 D17 5,76 5,42 6,34 5,84 42 D46 10,11 11,12 9,62 10,28 43 D47 6,19 5,37 7,26 6,27 ANOVA Z CV (%) 10,26% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa T kt qu bng 3.4 chúng tơi nhn thy rng tt c các chng vi khun đu cĩ kh năng sinh IAA. Tuy nhiên, hàm lưng IAA tng hp đưc cĩ s
37 chênh lch khác nhau và cĩ ý nghĩa v thng kê. C th chng K15 cho hàm lưng IAA thp nht (1,72mg/l), cịn hàm lưng IAA do chng K12 tng hp là cao nht (22,80mg/l). Kt qu nghiên cu ca Fabricio Cassa’na và cng s cũng đã cho bit lồi Azospirillum brasilense Az39 cĩ kh năng tng hp 12,73 13,49 g/ml ( mt đ 3,4 x 10 8 t bào/ml), vic tng hp các phytohormon đưc xem là mt yu t quan trng, đc bit là IAA [27]. 3.4 Kt qu tuyn chn các chng Azospirillum cĩ kh năng c đnh đm bng nghiên cu th nghim trên cây ngơ 3.4.1 nh hưng ca các chng Azospirillum đn sinh trưng ca cây ngơ trong bu đt Đ nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đn sinh trưng ca cây ngơ. Chúng tơi tin hành x lý nhin các chng vi khun vi ht ngơ trưc khi gieo vào bu đt. Thi gian x lý ht là 15 phút, ht đưc ngâm trong dch sinh khi t bào vi mt đ 10 9 t bào/ml. Thí nghim gm nghim thc khơng bĩn phân nhim vi các chng Azospirillum và đi chng là khơng bĩn phân khơng nhim vi khun. Khi cây ngơ đưc 45 ngày chúng tơi tin hành ly kt qu. Kt qu đưc th hin trong bng 3.5. Bng 3.5. Các ch tiêu sinh trưng ca cây ngơ trng trong bu đt Chng vi Chiu dài Chiu cao Đưng kính STT S lá khun lá (cm) cây (cm) gc (mm) 1 K01 5,33 40,00 50,33 9,57 2 K03 5,00 36,33 45,33 10,10 3 K12 6,33 40,33 61,33 11,93 4 K15 6,00 48,00 58,33 10,80 5 K16 6,67 37,33 51,33 10,67 6 K17 9,67 74,33 95,00 19,13 7 K18 6,67 52,33 64,33 13,33 8 K19 6,00 43,67 59,00 12,47 9 K21 5,00 36,00 46,00 10,53 10 K22 5,67 36,33 45,33 10,63 11 K23 7,00 55,67 71,00 12,83 12 K25 7,33 54,00 68,67 15,47
38 13 K26 6,67 41,00 54,00 10,30 14 K33 6,00 42, 67 57,00 11,53 15 K36 7,00 58,00 71,33 13,03 16 K37 5,67 43, 33 53,67 9,53 17 K38 7,67 56,33 66,67 14,67 18 K39 6,00 44,00 58,33 10,43 19 K40 6,67 53,33 63,00 12,40 20 K51 7,33 42,00 55,33 10,33 21 K54 5,67 39,00 61,00 12,70 22 K55 6,33 51,00 62,33 12,13 23 C01 6,00 46,33 63,67 10,07 24 C03 6,00 44,33 56,67 13,30 25 C05 6,00 39, 67 50,67 13,93 26 C22 6,00 44, 33 63,00 10,33 27 C23 6,33 42, 67 62,67 8,37 28 C24 6,33 43,33 51,67 12,43 29 C31 7,00 51,67 66,00 11,53 30 C32 6,00 46,00 60,00 10,13 31 C33 7,33 61,00 80,00 20,00 32 C40 6,00 41,67 52,33 10,83 33 D02 6,00 42,67 56,00 9,37 34 D04 6,33 47,33 62,33 10,90 35 D06 6,67 56,67 78,33 12,67 36 D07 6,00 40,33 51,67 9,80 37 D08 6,00 44,33 58,00 9,60 38 D09 6,67 52,33 72,00 13,13 39 D10 7,00 50,67 68,33 11,73 40 D15 6,67 50,00 66,00 11,67 41 D17 6,67 50,00 64,67 11,73 42 D46 7,00 47,33 60,00 10,83 43 D47 6,00 43,33 59,67 9,57 44 ĐC 6,00 29,67 43,67 7,00 ANOVA Z CV (%) 7,60% 7,57% 6,70% 9,82% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Qua bng kt qu chi thy đa s nghim thc nhim vi khun Azospirillum và khơng bĩn phân cho chiu cao cây, s lá trên cây, chiu dài lá và đưng kính gc thân luơn ln hơn so vi nghim thc khơng chng vi khun khơng bĩn phân. Chng t các chng Azospirillum cĩ nh hưng tích cc lên s
39 phát trin ca cây ngơ. C th là nghim thc x lý nhim các chng vi khun vi ht ngơ cho chiu cao cây cao nht đt 95 cm, s lá trên cây 9,67 lá, chiu dài lá 74cm và đưng kính gc thân 19,13mm (chng K17) tăng 2,18 ln (chiu cao cây), 1,6 ln (s lá trên cây), 2,5 ln (chiu dài lá) và 2,7 ln (đưng kính gc) so vi đi chng. S khác bit này cĩ ý nghĩa v thng kê, vi mc ý nghĩa 0,01. Ngồi ra thí nghiêm trong bu đt cịn cho thy s khác bit h r và hàm lưng cht khơ ca cây. Điu này đưc ghi nhn trong bng 3.6. Bng 3.6. nh hưng ca các chng Azospirillum đn sinh khi tươi và khơ ca cây ngơ Khi Sinh khi Sinh khi Chng vi Chiu dài STT lưng r tươi/cây khơ/cây khun r (cm) (gam) (gam) (gam) 1 K01 107,00 21,00 137,67 18,34 2 K03 118,33 23,33 150,00 20,07 3 K12 110,00 21,67 161,67 22,04 4 K15 136,67 21,33 135,00 20,05 5 K16 119,33 23,00 143,67 18,91 6 K17 104,00 50,00 403,33 63,97 7 K18 105,00 23,33 173,33 22,14 8 K19 124,00 21,00 165,00 22,16 9 K21 113,33 21,00 135,67 17,79 10 K22 138,33 19,67 126,33 14,88 11 K23 121,67 28,33 188,33 29,61 12 K25 101,67 56,67 296,67 38,13 13 K26 120,00 19,33 161,00 26,20 14 K33 123,33 20,33 150,33 21,75 15 K36 105,00 31,67 211,67 28,37 16 K37 105,67 23,33 120,00 14,10 17 K38 101,67 23,33 210,00 30,91 18 K39 110,67 19,67 116,33 14,67 19 K40 110,00 30,00 173,33 28,56 20 K51 142,00 21,33 144,00 19,48
40 21 K54 89,33 22,33 209,00 15,12 22 K55 100,00 38,67 283,67 45,18 23 C01 88,33 19,33 100,00 20,41 24 C03 101,67 19,00 78,67 14,70 25 C05 75,00 20,00 80,00 15,83 26 C22 81,67 20,67 103,33 21,32 27 C23 85,00 20,33 93,33 17,19 28 C24 95,00 16,00 73,33 13,41 29 C31 88,33 22,33 116,67 23,22 30 C32 87,00 21,33 90,00 19,64 31 C33 110,00 34,67 216,67 53,88 32 C40 73,33 18,00 73,33 15,76 33 D02 103,33 23,33 126,67 16,49 34 D04 90,00 20,00 103,33 18,43 35 D06 104,00 33,33 168,33 45,60 36 D07 103,33 16,00 76,67 16,04 37 D08 78,33 19,67 94,00 16,79 38 D09 98,33 30,00 125,00 28,38 39 D10 100,00 25,00 105,00 22,37 40 D15 93,33 20,33 113,33 23,88 41 D17 91,67 19,00 99,33 20,92 42 D46 88,33 16,33 90,00 17,27 43 D47 102,67 20,00 84,33 16,81 44 ĐC 74,00 14,00 66,67 12,71 ANOVA Z CV (%) 18,07% 17,41% 12.57% 10,86% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Qua bng 3.6 ta thy do nh hưng ca vi khun Azospirillum đã làm tăng s phát trin ca b r cây ngơ, giúp cây hút cht dinh dưng tt hơn. nghim thc cĩ x lý nhim vi khun r cây ngơ cĩ chiu dài r tăng gp 1,3 1,6 ln, khi lưng r tăng gp 2,14 4,05 ln so vi nghim thc khơng nhim vi khun. đây 3 chng K17, K23, K25, K36, K38, K40, K55, C33, D06 và D09 cho biu hin tt hơn các chng cịn li. Đc bit, khi khơng bĩn phân mà cĩ nhim vi khun thì sinh khi khơ ca cây tăng gp 2,3 5,03 ln so vi đi chng khơng bĩn phân khơng nhim vi
41 khun. Hàm lưng cht khơ thu đưc khi x lý vi các chng K17 là 63,97g/cây, K55 là 45,18g/cây, C33 là 53,88g/cây và D06 là 45,60g/cây. S khác bit này cĩ ý nghĩa v thng kê, vi mc ý nghĩa 0,01. Kt qu này tương đương vi kt qu thí nghim v A. brasilense trên lúa mì Brazil làm tăng trng lưng khơ cây 1,78 ln so vi đi chng khơng bĩn đm khơng chng vi khun ca Boddey và Dobereiner (1988). 3.4.2 nh hưng ca các chng Azospirillum đn hàm lưng đm trong lá ngơ Kt qu phân tích hàm lưng đm trong lá ngơ các nghim thc và đi chng đưc trình bày trong bng 3.7. Bng 3.7. nh hưng ca các chng Azospirillum đn hàm lưng N tng s trong lá ngơ. Chng vi N tng s (%) STT khun Ln 1 Ln 2 Ln 3 Trung bình 1 K01 1,521 1,448 1,376 1,448 2 K03 1,521 1,521 1,666 1,569 3 K12 1,159 1,086 1,014 1,086 4 K15 1,014 1,086 1,014 1,038 5 K16 0,724 0,579 0,579 0,628 6 K17 1,883 1,883 2,028 1,931 7 K18 1,521 1,448 1,376 1, 448 8 K19 0,941 0,869 0,941 0,917 9 K21 1,014 1,014 1,014 1,014 10 K22 0,941 0,941 1,014 0,966 11 K23 1,231 1,086 1,159 1,159 12 K25 1,738 1,666 1,738 1,714 13 K31 0,797 0,724 0,652 0,724 14 K26 0,869 0,797 0,941 0,869 15 K33 0,362 0,362 0,579 0,435 16 K36 1,304 1,159 1,231 1,231 17 K37 0,797 0,797 0,869 0,821 18 K38 0,941 0,869 1,014 0,941
42 19 K39 0,652 0,724 0,652 0,676 20 K40 0,797 0,869 0,869 0,845 21 K51 0,362 0,290 0,217 0,290 22 K54 0,435 0,290 0,290 0,338 23 K55 0,579 0,652 0,652 0,628 24 C01 0,797 0,797 0,869 0,821 25 C03 0,652 0,579 0,724 0,652 26 C05 1,086 1,086 1,159 1,110 27 C22 0,869 0,941 1,014 0,941 28 C23 0,579 0,579 0,579 0,579 29 C24 0,579 0,724 0,579 0,628 30 C31 0,724 0,579 0,507 0,604 31 C32 0,579 0,797 0,652 0,676 32 C33 1,376 1,231 1,159 1,255 33 C40 0,579 0,652 0,652 0,628 34 D02 0,579 0,507 0,579 0,555 35 D04 1,593 1,521 1,521 1,545 36 D05 0,724 0,652 1,521 0,966 37 D06 1,521 1,304 1,376 1,400 38 D08 1,666 1,666 1,521 1,617 39 D09 0,362 0,435 0,507 0,435 40 D10 1,014 1,014 1,159 1,062 41 D17 1,738 1,666 1,593 1,666 42 D46 1,086 1,159 1,304 1,183 43 D47 0,362 0,290 0,362 0,338 44 ĐC 0,362 0,435 0,507 0,435 ANOVA Z CV (%) 10,58% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Qua bng kt qu 3.7 ta thy đa s các nghim thc cĩ x lý nhim vi khun cĩ kt qu phân tích hàm lưng đm trong lá cao hơn so vi đi chng. Hàm lưng đm trong lá ngơ khi x lý nhim vi chng K17 là 1,931%, K25 là 1,714%, D06 là 1,4% cao hơn đi chng ln lưt là 4,44 ln, 3,94 ln và 3,22 ln. S khác bit này cĩ ý nghĩa v thng kê vi mc ý nghĩa 0,01. Điu này cho thy vi khun Azospirillum ch c đnh nitơ khi sng trong r ca cây ch và cung cp đm mà chúng c đnh đưc cho cây. Nghiên cu ca Raymond S. Pacovsky
43 (1989) đã cho rng vic b sung vi khun Azospirillum cĩ tác dng làm bin đi các quá trình sinh hố trong cơ th thc vât ch. S hin din ca lồi vi sinh vt này giúp cho vic đng hố các cht và vn chuyn dinh dưng cho cây nh đĩ làm tăng tích lu cht khơ. 3.4.3 nh hưng ca các chng Azospirillum đn hàm lưng dip lc trong lá Như đã bit mi b phn xanh ca cây đu cĩ kh năng quang hp nhưng ch yu là lá. Lá cĩ nhng đc đim v hình thái và gii phu thích hp vi chc năng quang hp đc bit là s hin din ca dip lc vi các sc t quang hp. Đ xác đnh hàm lưng dip lc trong lá chúng tơi tin hành đo OD dch chit lá các bưc sĩng 663nm, 645nm và 440,5nm. Bng 3.8. Hàm lưng dip lc trong lá ngơ (mg/g) Chng Chlorophyll a Chlorophyll b Carotenoid Tng dip STT vi (C a) (C b) (C car ) lc khun 1 K01 1,742 0,776 0,887 2,517 ab 2 K03 1,892 0,804 0,847 2,696 ab 3 K12 2,168 0,884 0,989 3,051 ab 4 K15 1,657 0,706 0,842 2,363 ab 5 K16 1,625 0,565 0,807 2,190 ab 6 K17 1,864 0,808 1,018 2,673 ab 7 K18 1,777 0,789 0,883 2,566 ab 8 K19 1,387 0,583 0,750 1,971 ab 9 K21 2,108 1,101 0,910 3,210 ab 10 K22 2,132 0,911 0,778 3,043 ab 11 K23 2,229 0,982 0,955 3,211 ab 12 K25 2,395 1,059 0,810 3,454 ab 13 K26 1,550 0,610 0,663 2,160 ab 14 K33 2,230 1,935 0,712 4,165 a 15 K36 2,395 1,082 0,180 3,477 ab 16 K37 1,417 0,653 0,785 2,070 ab 17 K38 2,058 0,944 0,927 3,002 ab
44 18 K39 1,912 0,814 0,772 2,725 ab 19 K40 1,698 0,772 0,837 2,469 ab 20 K51 2,171 0,955 1,032 3,125 ab 21 K54 1,959 0,805 1,008 2,764 ab 22 K55 2,325 1,099 0,957 3,424 ab 23 C01 1,440 0,653 0,688 2,094 ab 24 C03 1,630 0,701 0,753 2,332 ab 25 C05 1,727 0,715 0,879 2,442 ab 26 C22 1,548 0,680 0,711 2,228 ab 27 C23 1,680 0,747 0,916 2,426 ab 28 C24 1,817 0,745 0,891 2,562 ab 29 C31 1,765 0,741 0,961 2,506 ab 30 C32 1,591 0,664 0,693 2,255 ab 31 C33 1,433 0,616 0,777 2,049 ab 32 C40 1,515 0,692 0,859 2,207 ab 33 D02 1,477 0,614 0,728 2,091 ab 34 D04 1,874 0,862 0,993 2,736 ab 35 D06 1,745 0,737 0,899 2,482 ab 36 D07 1,959 0,819 0,983 2,778 ab 37 D08 1,414 0,623 0,626 2,037 ab 38 D09 1,557 0,726 0,855 2,282 ab 39 D10 1,819 0,785 0,847 2,604 ab 40 D15 1,626 0,691 0,800 2,318 ab 41 D17 1,354 0,596 0,715 1,950 ab 42 D46 1,852 0,784 0,949 2,636 ab 43 D47 1,874 0,781 0,806 2,656 ab 44 ĐC 0,920 0,361 0,476 1,281 b ANOVA Z CV (%) 0,73% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Kt qu các nghim thc x lý ht ngơ vi các chng vi khun trưc khi trng cho hàm lưng chlorophyll a, chlorophyll b và hàm lưng carrotenoid cao hơn hn so đi chng. Tng hàm lưng dip lc ca các nghim thc x lý vi khun dao đng trong khong 1,950 4,15mg/g; trong khi đĩ đi chng ch đt 1,281mg/g.
45 Hàm lưng dip lc trong lá càng cao chng t kh năng quang hp ca cây càng mnh, t đĩ cây sinh trưng và phát trin tt hơn. Điu này cho thy li ích ca các chng Azospirillum khi cng sinh vi cây ngơ. Kt qu ghi nhn bng 3.8. 3.5 Kt qu đnh danh các chng Azospirillum đưc tuyn chn bng k thut PCR Sau khi tuyn chn đưc 10 chng vi khun Azospirillum (K17, K23, K25, K36, K38, K40, K55, C33, D06 và D09) cĩ nh hưng tt đn sinh trưng ca cây ngơ trng trong bu đt chúng tơi tin hành đnh danh các chng này bng k thut PCR. 4/10 chng vi khun cho kt qu đin di sn phm PCR v trí đc hiu vi band DNA v trí 400bp ging như đi chng dương Azospirillum lipoferum AL10, đĩ là các chng K17, K25, K55 và D06. Như vy, đã xác đnh đưc tên ca các chng là thuc chi Azospirillum và lồi là lipoferum và tên ca 4 chng này là: Azospirillum lipoferum K17; Azospirillum lipoferum K25; Azospirillum lipoferum K55 và Azospirillum lipoferum D06. 1 2 3 4 5 T () (+) 6 7 8 9 10 600 bp 400 bp Hình 3.2. Kt qu đin di DNA ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn Ghi chú : Ging T: Thang 100 bp; ging (): Chng âm; ging (+): Chng dương Azospirillum lipoferum AL10; ging 1: Chng K17; ging 3: Chng K25; ging 4: Chng K55 và ging 7: Chng D06; các ging cịn li khơng phi là Azospirillum lipoferum ( khơng cĩ band 400bp hoc cĩ band ph).
46 3.6 Nghiên cu xây dng quy trình nhân sinh khi ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn 3.6.1 Nghiên cu nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum Mơi trưng nuơi cy nh hưng trc tip đn s sinh trưng ca vi sinh vt. Trong quá trình nhân ging mun thu đưc lưng ging ln cĩ sc sng mnh và tit kim thi gian nuơi cy cn phi cĩ mơi trưng thích hp. Tin hành nuơi cy các chng vi khun Azospirillum đã chn lc trên ba mơi trưng nuơi cy khác nhau là Nfb, Fallik, nưc chit khoai tây (BMS) đ thăm dị nh hưng ca mơi trưng đn s sinh trưng ca vi khun. Kt qu cho bi bng sau. Bng 3.9. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) Mơi trưng Nưc chit Nfb Fallik khoai tây Chng vi khun ( BMS) K17 0,143 c 1,275 b 1,840 a K25 0,144 c 1,348 b 1,764 a D06 0,130 c 1,173 b 1,798 a AL10 0,138 c 1,274 b 1,815 a Mơi trưng Chng vi khun ANOVA Z Mơi trưng và chng vi khun CV (%) 1,11% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa y: Các ch s ch cái ging nhau trên cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan’s Multiple Rang Test.
47 T kt qu cho thy các mơi trưng cĩ ngun đm rt thích hp cho s tăng sinh ca các vi khun. Đc bit mơi trưng nưc chit khoai tây, s tăng sinh khi ca các chng vi khun cao hơn nhiu so vi mơi trưng Nfb ( khơng cĩ đm). C th sinh khi tăng 0,5 – 0,6 ln so vi mơi trưng Fallik và 1,6 ln so vi mơi trưng Nfb, s khác bit này rt cĩ ý nghĩa v thng kê vi mc ý nghĩa 0,01. Kt qu cịn đưc thy rõ qua biu đ 3.2. Nhìn vào biu đ 3.2 ta thy tt c chng vi khun tuyn chn đu cĩ kh năng sinh trưng tt trên c ba mơi trưng. Tuy nhiên kh năng sinh trưng ca vi khun trên mơi trưng BMS là rt cao. Điu này đưc gii thích do mơi trưng BMS là mơi trưng t nhiên, cĩ đy đ các yu t vi lương, vitamin cn thit cho s sinh trưng ca vi khun. Biu đ 3.2. nh hưng ca mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum /ml 2.000 9 a a a a a x x 10 1.500 b b b b Nfb 1.000 Fallik BMS 0.500 Tng s t bào c c c c 0.000 K17 K25 D06 AL10 Chng vi khun 3.6.2 Kt qu nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum Nuơi chng vi khun Azospirillum đã chn lc trên mơi trưng BMS nhit đ phịng, tc đ lc 150 vịng/phút, lưng ging đem cy ban đu là
48 100l/50ml mơi trưng (mt đ t bào là 10 5 t bào/ml). Sau các khong thi h h h h gian 24 , 48 72 , 96 tin hành đo OD 660 xác đnh sinh khi t bào. Thí nghim lp li ba ln. Các kt qu đưc trình bày bng 3.10 và biu đ 3.3. Bng 3.10. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) Thi gian 24 h 48 h 72 h 96 h Chng vi khun K17 0,269 f 1,862 c 1,991 a 1,729 de K25 0,208 f 1,868 bc 1,971 ab 1,615 e D06 0,265 f 1,834 cd 1,914 abc 1,552 e AL10 0,203 f 1,835 c 1,843 c 1,622 e Thi gian Chng vi khun ANOVA Z Thi gian và chng vi khun CV (%) 3,29% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa y: Các ch s ch cái ging nhau trên cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan’s Multiple Rang Test. Như vy, trong 24 gi nuơi cy đu tiên, sinh khi các chng vi khun tang trưng chm ch vào khong 0,269 x 10 9 t bào/ml. Sau 48 gi nuơi cy sinh khi bt đu tăng lên. Tt c các chng đu đt đn mc sinh khi cc đi 72 gi nuơi cy, sau đĩ sinh khi bt đu gim. Chng K17 cĩ tc đ sinh trưng nhanh hơn các chng cịn li. C th 72 gi nuơi cy sinh khi đt 1,991 x 10 9 t bào/ml. Kt qu nghiên cu phù hp vi nghiên cu ca Elazar Fallik’ and Yaacov Okon (1996) v vi khun Azospirillum [26].
49 Biu đ 3.3. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 2.500 /ml 9 2.000 x x 10 K17 1.500 K25 D06 1.000 AL10 Tng s t bào 0.500 0.000 24h 48h 72h 96h Thi gian 3.6.3 Kt qu nghiên cu nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum Nguyên t O 2 hin din trong hu ht các thành phn quan trng trong t bào như prơtêin, đưng, lipid. S hin din ca O2 là rt quan trng đi vi s tăng trưng vi sinh vt. Vi sinh vt hiu khí cn O2 đ tăng trưng. Ngưc li, vi sinh vt k khí khơng cn hoc cn rt ít O2. Ngồi ra, các vi sinh vt ch tăng trưng đưc trong điu kin mơi trưng cha nng đ O2 thp đưc gi là vi hiu khí [5],[6],[17]. Do đĩ, trng thái nui cy s nh hưng đn s trao đi cht, sinh trưng ca vi sinh vt. Chúng tơi tin hành thí nghim nh hưng tc đ lc đn s sinh trưng ca vi khun năm mc khác nhau: 0rpm, 100rpm, 150rpm, 200rpm, 250rpm. Kt qu thu bi bng sau 3.11.
50 Bng 3.11. nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) Tc đ lc 0rpm 100rpm 150rpm 200rpm 250rpm Chng vi khun K17 1,013 gh 1,683 c 2,152 a 1,224 f 0,798 ijk K25 1,042 gh 1,583 cd 2,219 a 1,324 ef 0,779 jk D06 0,969 hi 1,736 bc 2,175 a 1,184 fg 0,769 jk AL10 0,952 hij 1,411 de 1,87 b 1,460 de 0,764 k Tc đ lc Chng vi khun ANOVA Z Chng vi khun và tc đ lc CV (%) 5,62% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa y: Các ch s ch cái ging nhau trên cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan’s Multiple Rang Test. Qua bng kt qu 3.11 và biu đ 3.4 cho thy các chng vi khun Azospirillum là vi khun vi hiu khí, ging vi kt qu ca các nghiên cu trưc đĩ v vi khun Azospirillum . tc đ lc 150rpm sinh khi vi khun đt cao nht là 2,219 x 10 9 t bào/ml cịn tc đ lc 250rpm thì sinh khi gim mnh 9 ch cịn 0,764 x 10 t bào/ml. Điu đĩ chng t các vi khun này cn ít O 2 cho hot đng ca chúng. Khi nuơi cy tĩnh thì sinh khi vi khun khơng tăng, điu này đưc gii thích do vi khun cn ít O 2 lên tp trung nhiu to thành màng mng cách đu mt thống mơi trưng 2 – 4 mm, phn dinh dưng ca mơi trưng nuơi cy dưi khơng đưc vi khun s dng mt cách trit đ. Do đĩ khi nuơi cy các chng này thì tc đ lc 150rpm là tt nht.
51 Biu đ 3.4. nh hưng ca tc đ lc đn sinh khi ca các chng Azospirillum 2.5 /ml 9 2 x x 10 K17 1.5 K25 D06 1 AL10 Tng s t bào t s Tng 0.5 0 0rpm 100rpm 150rpm 200rpm 250rpm Tc đ lc ( vịng/phút) 3.6.4 Kt qu nghiên cu nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum pH cĩ nh hưng trc tip đn s tăng trưng ca vi sinh vt. Hu ht các vi khun sinh trưng ti ưu pH trung tính. S tăng hoc gim pH s cĩ hi cho vi sinh vt nĩi chung do làm thay đi trng thái ion hĩa ca các nhĩm prơtêin và s sng sĩt ca t bào [5],[6],[17]. Đ xác nh hưng ca pH đn kh năng sinh trưng ca các chng vi khun đưc chn lc. Trong nghiên cu này, chúng tơi kho sát s sinh trưng ca các chng vi khun các giá tr pH khác nhau: 5,8; 6,3; 6,8; 7,3 và 7,8 trên máy lc 150 vịng/phút. Kt qu đưc trình bày trong các bng 3.12 và biu đ 3.5.
52 Bng 3.12. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) pH pH = 5,8 pH = 6,3 pH = 6,8 pH = 7,3 pH = 7,8 Chng vi khun K17 1,461 g 1,827 d 2,17 a 1,559 ef 0,695 j K25 1,496 fg 1,818 d 2,197 a 1,548 ef 0,785 i D06 1,559 ef 1,776 d 2,051 b 1,460 g 0,779 i AL10 1,37 h 1,927 c 2,207 a 1,582 e 0,63 j pH Chng vi khun ANOVA Z pH và chng vi khun CV (%) 2,21% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa y: Các ch s ch cái ging nhau trên cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan’s Multiple Rang Test. Qua bng kt qu 3.12 và biu đ 3.5 cho thy các chng vi khun Azospirillum nuơi cy trong mơi trưng cĩ đ pH = 5,8 hu như tăng trưng rt chm. Chúng sinh trưng tt khong pH 6,3 – 6,8 và đt c đi pH = 6,8. C th sinh khi đt 2,197 x 10 9 t bào/ml chng K25 và 2,207 x 10 9 t bào/ml chng AL10. Khi pH ln hơn 7,8, sinh khi vi khun gim mnh.
53 Biu đ 3.5. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 2.5 /ml 9 x 10 x 2 K17 1.5 K25 1 D06 AL10 Tng s t bào 0.5 0 pH5.8 pH6.3 pH6.8 pH7.3 pH7.8 pH mơi trưng Nhiu nghiên cu đã cho bit, vi khun c đnh nitơ ch thc hin quá trình c đnh N 2 trong phm vi pH hp 5,5 – 7,2, đơi khi lên đn 7,7. Tuy vy, mt s chng vi khun vn cĩ th sinh trưng, phát trin trong khong pH khá rng như Xanthobacter là 5,8 – 9, Beijerinckia cĩ th sinh trưng trong mơi trưng cĩ pH 3,0 – 9,5 hoc 10 và các lồi vi khun khác nhau nhy cm mt cách khơng ging nhau đơi vi pH ca mơi trưng [33]. 3.6.5 Kt qu nghiên cu nh hưng ca nhit đ mơi trưng nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum Mi cơ th vi sinh vt đu chu tác đng ca nhit đ ba gii hn khác nhau: Nhit đ thp nht, nhit đ ti thích và nhit đ cao nht. Nhit đ s nh hưng đn hot đng ca enzyme, quá trình trao đi cht ca t bào. Chính vì vy nghiên cu nh hưng ca nhit đ đn kh năng sinh trưng ca các chng vi sinh vt là cn thit [5],[6],[17]. Chúng tơi tin hành nuơi cy vi sinh vt trên mơi trưng BMS bn mc nhit đ khác nhau: nhit 27 0C, 32 0C, 37 0C, 42 0C
54 trên máy lc 150 vịng/phút. Sau 72 h nuơi cy, tin hành xác đnh sinh khi t bào. Kt qu đưc trình bày trong bng 3.13 và biu đ 3.6. Bng 3.13. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum ( x 10 9 t bào/ml) Nhit đ 27 0C 32 0C 37 0C 42 0C Chng vi khun K17 1,717 cd 2,198 a 0,944 g 0,473 hi K25 1,76 c 2,251 a 1,118 f 0,385 i D06 1,586e 2,205 a 0,979 g 0,402 i AL10 1,595 de 2,068b 0,953 g 0,567 h Nhit đ Chng vi khun ANOVA Z Nhit đ và chng vi khun CV (%) 3,80% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa y: Các ch s ch cái ging nhau trên cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Duncan’s Multiple Rang Test. T bng 3.13 cho thy các chng Azospirillum đu sinh trưng tt nhit đ 32 0C, ging vi đi chng Azospirillum lipoferum AL10. các nhit đ cịn li thì sinh khi thu đưc thp hơn. C th 27 0C thì chng K17, chng K25 thu đưc sinh khi ln lưt là 1,717 x 10 9 t bào/ml; 1,76 x 10 9 t bào/ml. Trong khi đĩ đi chng Azospirillum lipoferum AL10 ch đt 1,595 x 10 9 t bào/ml. 42 0C thì chng K17, chng K25 thu đưc sinh khi ln lưt là 0,473 x 10 9 t bào/ml; 0,385 x 10 9 t bào/ml. Trong khi đĩ đi chng Azospirillum lipoferum AL10 ch đt 0,567 x 10 9 t bào/ml. S khác bit này cĩ ý nghĩa v thng kê, vi mc ý nghĩa 0,01. Điu này th hin rõ trong biu đ 3.6.
55 Biu đ 3.6. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azospirillum 2.5 /ml 9 2 x 10 x K17 1.5 K25 D06 1 AL10 0.5 Tng s t bào 0 27 32 37 42 Nhit đ ( oC) Như vy qua biu đ 3.6 cho thy c bn chng vi khun các mc nhit đ khác nhau thì đu cĩ s khác bit rõ v tc đ sinh trưng. Kh năng sinh trưng ca bn chng vi khun mnh khong nhit đ 27 0C – 320C. Nhit đ càng cao đn 420C thì kh năng sinh trưng ca các chng đu gim mnh. Điu này cho thy các vi khun Azospirillum nhit đ ti thích là 32 0C, nhit đ này h thng enzyme ca vi khun hot đng mnh giúp vi khun tăng cưng quá trình trao đi cht, tăng sinh khi ca t bào. 3.7 Kt qu đánh giá kh năng c đnh đm ca các chng vi khun Azospirillum đưc tuyn chn trên đng rung 3.7.1 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn sinh trưng ca cây ngơ 3.7.1.1 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn chiu cao cây ngơ Chiu cao cây là mt trong nhng ch tiêu quan trng phn ánh thc trng ca cây đưc trng trong điu kin như th nào. Nu trng trong điu kin nhit
56 đ, m đ, ánh sáng, dinh dưng và thâm canh thun li cây s cao hơn và ngưc li thì cây s thp hơn. Bên cnh đĩ, chiu cao cây cịn do đc tính ca tng ging. Trong quá trình theo dõi chiu cao cây ca các nghim thc, chúng tơi nhn thy các nghim thc khác nhau thì chiu cao cây cũng khác nhau. Tuy nhiên, s chênh lch này khác nhau các giai đon sinh trưng. Kt qu đưc trình bày qua bng 3.14. Bng 3.14. nh hưng ca nghim thc đn chiu cao cây (cm) Thi gian theo dõi (sau mc) Nghim thc 2 tun 4 tun 6 tun 8 tun NT1 0VK 0N 34,33 62,67 139,50 168,33 NT2 K17 0N 40,83 72,83 149,83 175,83 NT3 K25 0N 40,17 70,50 148,00 175,17 NT4 D06 0N 37,50 67,17 148,33 174,00 NT5 K17 50%N 43,83 74,83 161,33 193,00 NT6 K25 50%N 42,83 74,50 159,33 190,33 NT7 D06 50%N 41,50 72,00 156,17 186,50 NT8 K17 75%N 44,50 81,83 172,17 203,50 NT9 K25 75%N 43,00 78,83 170,50 201,67 NT10 D06 75%N 42,17 74,33 168,00 197,50 NT11 0VK 100%N 44,17 80,50 171,67 202,67 Nghim thc ANOVA Z Thi gian Nghim thc và thi gian CV (%) 0, 99% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Giai đon 2 tun sau mc: Chiu cao cây ca các nghim thc dao đng t 34,33cm đn 44,50cm. Đây là giai đon mà cây ngơ chuyn t dinh dưng ht sang dinh dưng đt, chính vì vy mà vic s dng vi khun c đnh đm và phân đm đã bt đu nh hưng đn chiu cao ca cây ngơ. Nghim thc ch s dng 100% phân đm khơng vi khun thì chiu cao ca cây là 44,17cm, thp hơn nghim thc 8 s dng vi khun K17 và 75% phân đm 0,33 cm. Các
57 nghim thc 11, 10, 9, 8 chiu cao cây ngơ khơng khác bit nhau nhiu nhưng chiu cao ca cây so vi các nghim thc cịn li cĩ s khác bit. Đc bit nghim thc 8 cĩ chiu cao hơn nghim thc 1 là 10,07 cm. S khác bit này cĩ ý nghĩa v thng kê vi mc ý nghĩa 0,01. Giai đon 4 tun sau mc: Chiu cao cây ca các nghim thc dao đng t 62,67 cm đn 81,83 cm. Chiu cao cây ca các nghim thc cĩ s dng phân đm và vi khun c đnh đm đu cao hơn so vi nghim thc khơng s dng phân đm và khơng vi khun. Chiu cao cây ca nghim thc 8 cao hơn nghim thc 11 là 1,33 cm chng t chng K17 đã tác đng đn sinh trưng ca cây ngơ, mc dù vi lưng đm ít hơn nhưng chiu cao cây thì ln hơn. Mt khác mc đm như nhau hoc khơng bĩn đm thì nghim thc cĩ vi khun thì chng vi khun K17 đu cao hơn so vi chng K25, D06, chng t hot tính c đnh đm ca chng K17 ln hơn hai chng cịn li. Nghim thc khơng s dng phân đm và khơng cĩ vi khun (nghim thc 1) cĩ chiu cao là 62,67 cm, thp hơn so vi các nghim thc cịn li và thp hơn nghim thc 11 là 17,83 cm. Ta thy đưc phân đm đã tác đng rt ln đn chiu cao ca cây ngơ, vic khơng bĩn phân đm và khơng cĩ chng vi khun c đnh đm đã nh hưng đn sinh trưng ca cây ngơ giai đon này rt nhiu. Qua x lý thng kê chúng tơi thy, nghim thc 11 khơng sai khác so vi nghim thc 8, 9, 10 vi mc ý nghĩa 0,01. Giai đon 6 tun sau mc: Chiu cao cây ca các nghim thc dao đng t 139,50 cm đn 172,17 cm, đây là thi kì vươn cao ca cây và là giai đon mà các các nghim thc cĩ tc đ tăng trưng chiu cao cây nhanh nht trong tt c các giai đon theo dõi. Qua bng 3.14 chúng tơi nhn thy, tc đ tăng trưng chiu cao ca cây ngơ giai đon này rt ln, nht là các nghim thc 8, 9, 10 là các nghim thc cĩ s dng vi khun c đnh đm và mc bĩn đm 75%, tc đ tăng trưng chiu cao cịn cao hơn c nghim thc s dng mc phân đm là 100% nhưng khơng cĩ chng vi khun c đnh đm (nghim thc 11). giai đon này nhim thc 8 cĩ chiu cao cây là 172,17 cm, nghim thc 9 là 170,50
58 cm, nghim thc 10 là 168,00 cm, nghim thc 11 là 171,67 cm. Các nghim thc khơng s dng phân đm mà ch cĩ chng vi khun c đnh đm cũng cao hơn so vi nghim thc 1 t 8,5 đn 10,33 cm. Chúng tơi cũng thy rng, giai đon này vi mc đm như nhau thì nghim thc cĩ vi khun là chng vi khun K17 đu cao hơn so vi chng K25, D06, chng t hot tính c đnh đm ca chng K17 giai đon này là ln hơn hai chng cịn li. Qua x lý thng kê thì nghim thc 11 khơng sai khác so vi nghim thc 8, 9, 10. Chúng tơi thy giai đon này, vi khun c đnh đm cĩ nh hưng đn chiu cao ca cây ngơ thơng qua vic bĩn đm, vi mc đm càng tăng thì chiu cao cây càng ln và các nghim thc bĩn đm vi mc 75% thì cĩ chiu cao cây cao hơn so vi mc 50%. Giai đon 8 tun sau mc: Chiu cao cây ca các nghim thc dao đng t 161,50 cm đn 202,67 cm. Đây là giai đon cui thi kỳ vươn cao, là giai đon mà các các nghim thc cĩ tc đ tăng trưng chiu cao thp nht trong tt c các giai đon theo dõi. Chiu cao cây ca nghim thc 8, 9, 10 và nghim thc 11 chênh lch khơng đáng k. Vi mc đm 75% và vi khun c đnh đm thì chiu cao ca các nghim thc này tương đương vi mc bĩn đm 100% mà khơng cĩ vi khun, điu này chng t hot tính c đnh đm đã nh hưng đn chiu cao ca cây ngơ, mc dù vi lưng đm ít hơn nhưng vn cĩ chiu cao ngang nhau. Qua x lý thng kê chúng tơi nhn thy, nghim thc 11 khơng sai khác so vi nghim thc 8, 9, 10 vi mc ý nghĩa 0,01. 3.7.1.2 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn s lá ca cây ngơ Lá là b phn quang hp ch yu ca cây ngơ quyt đnh đn năng sut, phm cht ht. S lá trên cây nhiu hay ít ph thuc vào ging và phn ng ca ging vi điu kin mơi trưng như: ánh sáng, nhit đ và lưng mưa trong tng tháng, đc bit là giai đon trưc 8 tun sau mc. Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn s lá ca cây ngơ các nghim thc đưc trình bày trong bng 3.15.
59 Bng 3.15. nh hưng ca nghim thc đn s lá ca cây ngơ (lá/cây) Thi gian theo dõi (sau mc) Nghim thc 2 tun 4 tun 6 tun 8 tun NT1 0VK 0N 4,50 7,83 13,17 16,17 NT2 K17 0N 4,83 7,83 13,50 16,67 NT3 K25 0N 4,50 7,83 13,50 16,67 NT4 D06 0N 4,50 8,00 13,67 16,50 NT5 K17 50%N 5,00 8,17 14,17 17,33 NT6 K25 50%N 5,00 8,17 14,17 17,17 NT7 D06 50%N 4,67 7,83 13,83 16,83 NT8 K17 75%N 5,17 8,50 14,50 17,83 NT9 K25 75%N 5,00 8,33 14,33 17,67 NT10 D06 75%N 4,50 8,17 14,17 17,33 NT11 0VK 100%N 5,17 8,33 14,50 17,83 Nghim thc Thi gian ANOVA Z Nghim thc và thi gian CV (%) 4,15% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Giai đon 2 tun sau mc: Các nghim thc cĩ s lá dao đng t 4,50 đn 5,17 lá/cây. Giai đon này s lá các nghim thc cĩ s dng vi khun và cĩ bĩn đm đu cao hơn nghim thc 1. Tuy nhiên, s khác bit ca các nghim thc khơng cĩ ý nghĩa thng kê mc ý nghĩa 0,01. Điu này cho thy, vic bĩn đm cũng như s dng vi khun c đnh đm chưa nh hưng đn s lá giai đon này. Giai đon 4 tun sau mc: Các nghim thc cĩ s lá dao đng t 7,83 đn 8,50 lá/cây. Cao nht là nghim thc 8 vi s lá là 8,50 lá/cây, sau đĩ là nghim thc 9 và 11 vi s lá là 8,33 lá/cây; các nghim thc 4, 5, 6, 7 và 10 đu cĩ s lá cao hơn nghim thc 1 khơng s dng vi khun và khơng bĩn đm. Tuy nhiên, s khác bit ca các nghim thc khơng cĩ ý nghĩa thng kê mc ý
60 nghĩa 0,01. Điu này cũng cho ta thy, vic bĩn đm cũng như s dng vi khun c đnh đm chưa nh hưng hoc nh hưng rt ít đn s lá giai đon này. Giai đon sau mc 6 tun: Đây là thi kỳ vươn cao ca cây, s lá ca các nghim thc dao đng t 13,17 lá/cây đn 14,50 lá/cây. Tc đ ra lá ca các nghim thc nhanh nht trong các giai đon theo dõi. S lá nhiu nht trên cây là nghim thc 8 và 11 vi s lá là 14,50 lá/cây. giai đon này thì nghim thc bĩn 100% phân đm, khơng vi khun cĩ s lá bng nghim thc 8. Vi nghim thc 10 tuy lưng đm nhiu hơn nhưng ch cĩ s lá là 14,17 lá/cây giai đon này và bng vi nghim thc 5 và 6. nghim thc 1, vic khơng bĩn đm và khơng cĩ vi khun c đnh đm đã hn ch đn kh năng ra lá giai đon này cho nên s lá ch là 13,17 lá/cây. Nghim thc khơng bĩn đm mà ch cĩ vi khun c đnh đm thì s lá cũng ln hơn nghim thc 1 là 0,33 lá/cây. Qua x lý thng kê chúng tơi nhn thy, nghim thc 11 khơng sai khác so vi nghim thc 5, 6, 7, 8, 9, 10 vi mc ý nghĩa 0,01. Giai đon sau mc 8 tun: Đây là giai đon cui thi kỳ vươn cao, cây ngơ đã n đnh s lá/cây và bưc vào thi kỳ tr c phun râu. Tng s lá trên cây ca các nghim thc dao đng t 16,17 lá/cây đn 17,83 lá/cây. Nghim thc cĩ s lá nhiu nht giai đon này là nghim thc 8 và nghim thc 11, đu cĩ s lá là 17,83 lá/cây; nghim thc 9 cĩ s lá là 17,67 lá/cây; nghim thc 10 là 17,33 lá/cây. Giai đon này, vic s dng phân đm và vi khun c đnh đm đã nh hưng đn s lá trên cây ngơ. Các nghim thc cĩ s dng vi khun và phân đm đu cĩ s lá nhiu hơn vic khơng s dng vi khun và khơng bĩn phân đm ( nghim thc 1). S lá cĩ xu hưng tăng cùng vi vic tăng lưng phân đm. Tuy nhiên, mc đm 75% và cĩ vi khun K17 thì s lá bng vi vic s dng 100% phân đm khơng vi khun, như vy các chng c đnh đm đã nh hưng đn s ra lá trong giai đon này. Qua x lý thng kê chúng tơi nhn thy, nghim thc 11 khơng sai khác so vi nghim thc 5, 6, 7, 8, 9, 10 vi mc ý nghĩa 0,01.
61 3.7.1.3 Kt qu nghiên cu nh hưng ca các chng Azospirillum đưc tuyn chn đn chiu dài lá cây ngơ Kt qu v chiu dài lá ca các nghim thc đưc th hin bng 3.16. Bng 3.16. nh hưng ca nghim thc đn chiu dài lá ca cây ngơ (cm) Thi gian theo dõi (sau mc) Nghim thc 2 tun 4 tun 6 tun 8 tun NT1 0VK 0N 26,83 49,17 87,17 90,33 NT2 K17 0N 31,83 58,50 90,33 93,00 NT3 K25 0N 29,83 56,17 90,83 92,83 NT4 D06 0N 27,17 52,00 89,50 92,33 NT5 K17 50%N 35,50 63,17 95,17 97,00 NT6 K25 50%N 33,83 60,17 94,67 96,33 NT7 D06 50%N 32,00 58,83 94,83 95,83 NT8 K17 75%N 37,50 68,83 103,17 103,83 NT9 K25 75%N 34,33 65,33 102,50 103,33 NT10 D06 75%N 33,67 61,00 99,33 100,50 NT11 0VK 100%N 33,83 65,67 102,83 104,17 Nghim thc ANOVA Z Thi gian Nghim thc và thi gian CV (%) 1,51% Z , NS: Khác bit cĩ ý nghĩa mc P ≤ 0,01, khác bit khơng cĩ ý nghĩa Giai đon 2 tun sau mc: Các nghim thc cĩ chiu dài lá dao đng t 26,83 – 37,50 cm. giai đon này chiu dài lá ca các nghim thc cĩ vi khun c đnh đm cũng như cĩ bĩn phân đm thì chiu dài lá đu cao hơn nghim thc 1, khơng bĩn phân đm và khơng cĩ chng vi khun c đnh đm. Kt qu cũng cho thy, vic bĩn phân đm đã nh hưng đn chiu dài ca lá. mc đm 50%, nghim thc 5 cĩ chiu dài lá là 35,50 cm, nghim thc 6 cĩ chiu dài lá là 33,83 cm, nghim thc 7 cĩ chiu dài lá là 32,00 cm. mc đm 75% nghim thc 8 cĩ chiu dài lá là 37,50 cm; nghim thc 9 cĩ chiu dài lá là 34,33 cm; nghim thc 10 cĩ chiu dài lá là 33,67 cm đu cao hơn nghim thc 11 vi đm 100% nhưng khơng cĩ vi khun cĩ chiu dài lá là 33,83 cm. Như