Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk - Nguyễn Văn Bốn

pdf

92 trang huongle 3250

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk - Nguyễn Văn Bốn", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_phan_lap_va_tuyen_chon_mot_so_chung_nam_moc_co_hoat.pdf

Nội dung text: Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính Chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk - Nguyễn Văn Bốn

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGU YÊN s NGUYN VĂN BN PHÂN LP VÀ TUYN CHN MT S CHNG NM MC CĨ HOT TÍNH CHITINASE CAO TI TNH ĐK LK LUN VĂN THC SĨ SINH HC BUƠN MA THU T, NĂM 2011
B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN NGUYN VĂN BN PHÂN LP VÀ TUYN CHN MT S CHNG NM MC CĨ HOT TÍNH CHITINASE CAO TI TNH ĐK LK Chuyên ngành: Sinh hc thc nghim Mã s: 604230 LUN VĂN THC SĨ: SINH HC Ngưi hưng dn khoa hc: PGS.TS Nguyn Anh Dũng BUƠN MA THUT, NĂM 2011
LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi. Các s liu, kt qu nêu trong lun văn là trung thc và chưa đưc ai cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. Ngưi cam đoan Nguyn Văn Bn
LI CM ƠN Đ hồn thành lun văn này, tơi xin chân thành cm ơn: Thy PGS.TS Nguyn Anh Dũng đã dành nhiu thi gian, tn tình hưng dn tơi trong sut thi gian thc tp và hồn thành lun văn này. Cơ TS. Võ Th Phương Khanh, thy TS. Ngơ Đi Nghip đã cĩ nhiu ý kin quý báu đĩng gĩp, giúp đ tơi hồn thành lun văn này. Quý thy cơ giáo trưng Đi hc Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phịng Đào to Sau đi hc, ban giám hiu nhà trưng đã tn tình ging dy và to điu kin thun li cho tơi trong sut thi gian khố hc. Các bn sinh viên: Hnh, Vui, Cương, Cưng, L lp CN Sinh K07 và Đưc, Tho, Hồi, Danh, Lu, Ana, Oánh, Lun lp CN Sinh K08 đã tham gia tích cc trong quá trình tơi thc hin đ tài này. Các thy cơ trong b mơn Sinh hc thc nghim đã to mi điu kin v thi gian, đng viên tinh thn cho tơi trong sut khĩa hc. Các anh ch em trong lp Cao hc Sinh hc thc nghim K3 đã đồn kt giúp đ, chia s và đng viên tơi trong sut 3 năm hc cao hc. Cui cùng, tơi xin cm ơn sâu sc nhng ngưi thân trong gia đình: B, m, Các anh trai, các ch dâu, các cháu, v và con trai, gia đình b m v đã là ch da vng chc cho tơi v tình cm cũng như vt cht cn thit giúp tơi cĩ ngh lc đ cơng tác, và phn đu. Nguyn Văn Bn
CÁC CH VIT TT HTch: Hot tính chung chitinase HTr: Hot tính riêng chitinase [chitin]: Nng đ chitin ĐC: Đi chng GlcNAc: Nacetyl glucosamine DNS: Acid 3,5 dinitrosalicylic UI: đơn v hot đ
MC LC M đu 1. Đt vn đ 1 2. Mc tiêu ca đ tài 1 3. Ý nghĩa khoa hc 2 4. Ý nghĩa thc tin 2 Chương 1. Tng quan tài liu 1.1. Tng quan v chitin và chitinase 3 1.1.1. Chitin 3 1.1.1.1. Cu to chitin 3 1.1.1.2. Phân b và s lưng 3 1.1.1.3. Đc đim khác 4 1.1.1.4. ng dng 5 1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 6 1.2.1. Khái nim 6 1.2.2. Phân loi chitinase 7 1.2.2.1. Da vào cu trúc phân t 7 1.2.2.2. Da vào trình t amino acid 7 1.2.2.3. Da vào phn ng phân ct 9 1.2.3. Các ngun thu nhn enzyme chitinase 9 1.2.3.1. Chitinase vi khun 9 1.2.3.2. Chitinase nm 10 1.2.3.3. Chitinase thc vt 10 1.2.3.4. Chitinase đng vt 11 1.2.4. Các đc tính cơ bn ca enzyme chitinase 11 1.2.4.1. Khi lưng phân t 11 1.2.4.2. Đim đng đin Ph hp thu Hng s Michaelis 11 1.2.4.3. nh hưng ca nhit đ 12
1.2.4.4. nh hưng ca pH 12 1.2.4.5. Cht tăng hot, cht c ch 12 1.2.4.6. S n đnh 14 1.2.5. Các loi cơ cht ca enzyme chitinase 14 1.2.5.1. Chitin 14 1.2.5.2. Các dn xut ca chitin 14 1.2.6. Cơ ch tác đng ca các loi enzyme chitinase 15 1.3. T ng quan v nm mc 15 1.3.1. Khái nim 15 1.3.2. Hình dng và kích thưc 16 1.3.3. Cu to t bào si nm 17 1.3.4. Dinh dưng và tăng trưng ca nm mc 17 1.3.5. V trí và vai trị ca nm mc 18 1.4. Tng quan tình hình nghiên cu trong và ngồi nưc 19 Chương 2. Ni dung và phương pháp nghiên cu 2.1. Ni dung nghiên cu 23 2.2. Vt liu và thit b 23 2.3. Phương pháp nghiên cu 23 2.3.1. Đa đim thu thp mu 23 2.3.2. Các loi mơi trưng 23 2.3.3. Phương pháp phân lp 24 2.3.4. Phương pháp tuyn chn các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao 24 2.3.5. Xác đnh hot đ chitinase theo phương pháp đnh lưng đưng kh 25 vi thuc th DNS 2.3.6. Phương pháp đnh danh các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao 28 2.3.7. Ti ưu hĩa mơi trưng và điu kin nuơi cy các chng nm mc 28 tuyn chn nhm thu nhn chitinase cĩ hot tính cao 2.3.8. Nghiên cu xác đnh tác nhân ta phù hp 29 2.3.9. Xác đnh tính cht cơ bn ca chitinase 30 2.3.9. X lý s liu 33 Chương 3. Kt qu và tho lun
3.1. Kt qu phân lp các chng nm mc cĩ hot tính chitinase ti Đăk Lăk 34 3.2. Tuyn chn và đnh danh các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao 37 3.2.1. Tuyn chn các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao 37 3.2.2. Đnh danh các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao 40 3.3. Ti ưu hĩa mơi trưng và điu kin nuơi cy các chng nm mc 42 tuyn chn nhm thu nhn chitinase cĩ hot tính cao 3.3.1. nh hưng ca nng đ chitin trong mơi trưng nuơi cy 42 3.3.2. nh hưng ca ngun nitơ b sung vào mơi trưng nuơi cy 43 3.3.3. nh hưng ca nhit đ nuơi cy 45 3.3.4. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy 46 3.3.5. nh hưng ca tc đ lc 48 3.3.6. nh hưng ca thi gian nuơi cy 49 3.4. Tác nhân ta phù hp cho quá tình tách chit chitinase t nm mc 50 Penicillium janthinellum 3.5. Xác đnh mt s tính cht cơ bn ca chitinase t nm mc 52 Penicillium janthinell 3.5.1. Xác đnh nhit đ ti ưu cho hot tính chitinase 52 3.5.2. Xác đnh pH ti ưu cho hot tính chitinase 53 3.5.3. Xác đnh nng đ cơ cht ti ưu cho hot tính chitinase 54 3.5.4. nh hưng ca mt s ion kim loi đn hot tính chitinase 56 3.5.5. Xác đnh thi gian phn ng ti ưu 57 3.5. Tinh sch chitinase 58 Kt lun và kin ngh 61 Tài liu tham kho 62 Ph lc 67
DANH MC BNG Bng 3 .1. Đc đim khun lc ca các chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk 34 Bng 3.2. Hàm lưng đưng kh trong dch nuơi cy và hot tính chitinase ca các chng nm mc 37 Bng 3.3. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các nng đ chitin khác nhau 43 Bng 3.4. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy b sung các ngun nitơ khác nhau 44 Bng 3.5. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các nhit đ khác nhau 46 Bng 3.6. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các pH khác nhau 47 Bng 3.7. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các tc đ lc khác nhau 48 Bng 3.8. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy trong các khong thi gian khác nhau 49 Bng 3.9. nh hưng ca tác nhân ta đn hiu sut thu hi và hot tính chitinase ca nm mc Penicillium janthinellum 51 Bng 3.10. nh hưng ca mt s ion kim loi đn hot tính chitinase 55 Bng 3.11. nh hưng ca thi gian phn ng đn hot tính chitinase 57 Bng 3.12. Hàm lưng protein, HTch, HTr trưc và sau khi lc gel 59
DANH MC HÌNH Hình 1.1. Cu trúc ca chitin 3 Hình 2.1. Phn ng phân ct chitin bng chitinase 25 Hình 2.2. Phn ng ca đưng kh vi thuc th DNS 25 Hình 3.1 . Hot tính chitinase ca các chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk 39 Hình 3.2 . nh hưng ca nng đ chitin đn hot tính chitinase 43 Hình 3.3 . nh hưng ca ngun Nitơ đn hot tính chitinase 44 Hình 3.4 . nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn hot tính chitinase 46 Hình 3.5 . nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn hot tính chitinase 47 Hình 3.6 . nh hưng ca tc đ lc đn hot tính chitinase 49 Hình 3.7 . nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn hot tính chitinase 49 Hình 3.8 . nh hưng ca tác nhân ta đn hiu sut thu hi protein và hot tính chitinase ca nm mc Penicillium janthinellum 52 Hình 3.9 . nh hưng ca nhit đ phn ng đn hot tính chitinase 53 Hình 3.10 . nh hưng ca pH đn hot tính chitinase 54 Hình 3.11 . nh hưng ca nng đ chitin đn hot tính chitinase 55 Hình 3.12 . nh hưng ca mt s ion kim loi đn hot tính chitinase 56 Hình 3.13 . nh hưng ca thi gian phn ng đn hot tính chitinase 57 Hình 3.14 . Kt qu đo mt đ quang dch protein sau lc gel Sephadex 59 Hình 3.15 . nh hưng ca phương pháp lc gel ti hàm lưng protein, HTch, HTr ca chitinase 60 Hình 3.16 . Kt qu đo mt đ quang dch protein sau tinh sch bng ct chitin 60 Hình 3.17 . Hình 3.17. Vịng phân gii chitin 60
DANH MC NH nh 3.1 Khun lc ca 34 chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk 37 nh 3.2 Hình thái ca 3 chng nm mc D4, D9, D31 41
M ĐU
1 1. Đt vn đ Oligo N – acetyl – Glucosamine (mt sn phm ca quá trình thy phân chitin) đã đưc bit đn như mt loi thuc quý, mt loi thuc đa hiu đưc s dng đ cha tr nhiu bnh như: bnh khp, bnh viêm phi, bnh viêm d dày, Ngồi ra, Oligo N acetyl – Glucosamine cịn cĩ kh năng chng khi u, kháng nm và kháng vi khun [1]. Chính vì cĩ đc tính quý như vy mà vic sn xut Oligo N – acetyl – Glucosamine đang đưc quan tâm. Oligo N – acetyl – Glucosamine đưc thu nhn bng cách thy phân chitin dưi s xúc tác ca enzyme chitinase. Trong t nhiên, chitinase cĩ th đưc tách chit t nhiu ngun khác nhau: đng vt (tuyn tu, và dch d dày cá; dch rut ca c sên; ), thc vt (m cao su, thuc lá, lúa mì, cà rt, ), các lồi chân khp (arthropods ) [17] Tuy nhiên, quy trình thu nhn chitinase t các ngun này khá phc tp, khơng th tin hành t đng hố [25][26], do đĩ giá thành ch phm cao và cũng khơng th đáp ng đ nhu cu thc t . Trong t nhiên, cịn cĩ mt ngun quý giá và vơ tn đ thu nhn enzyme. Đĩ chính là vi sinh vt. Trong s các đi tưng vi sinh vt, nm mc là mt ngun khá ph bin đ thu nhn nhiu loi enzyme, trong đĩ cĩ chitinase [25]. Trong nưc cũng như trên th gii đã cĩ nhiu cơng trình nghiên cu v chitinase [13]. Tuy nhiên, hin nay vn chưa cĩ mt nghiên cu nào v phân lp và sàng lc các chng nm mc đ thu nhn chitinase mang tính h thng khu vc Tây Nguyên, c th là Đk Lk đưc cơng b trên các tp chí trong và ngồi nưc. Đ gĩp phn tham gia vào vic nghiên cu enzyme chitinase t vi sinh vt ti Tây Nguyên, chúng tơi đ xut đ tài “Phân lp và tuyn chn mt s chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao ti tnh Đk Lk”. 2. Mc tiêu ca đ tài Phân lp và tuyn chn mt s chng nm mc cĩ kh năng phân gii chitin. Xây dng quy trình tách chit chitinase và xác đnh mt s tính cht cơ bn ca chitinase tách chit t mơi trưng nuơi cy nm mc.
2 3. Ý nghĩa khoa hc Kt qu ca đ tài gĩp phn vào vic nghiên cu enzyme chitinase t vi sinh vt c th là t nm mc trên đa bàn tnh Đk Lk. 4. Ý nghĩa thc tin Sn phm ca đ tài là mt s chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao đưc tuyn chn. T các chng này, cĩ th đưa vào sn xut chitinase thương phm dùng cho nhiu mc đích khác nhau hoc s dng trc tip các chng này đ kho sát kh năng đi kháng vi mt s nm bnh hưng ti to ch phm sinh hc cĩ hot tính kháng bnh cho cây trng.
Chương 1 TNG QUAN TÀI LIU
3 1.1. Tng quan v chitin và chitinase 1.1.1. Chitin [17][23] 1.1.1.1. Cu to chitin Chitin cĩ cơng thc hĩa hc (C 8H13 NO 5)n trong đĩ C chim 47,29%, H chim 6,45%, N chim 6,89% và O chim 39,37%. dng t nhiên, chitin là mt cht rn màu trng vơ đnh hình, dai, cĩ si, ph thuc vào ngun gc và phương pháp thu nhn. V cu trúc, chitin (cịn gi là poly[1,4(NacetylβDglucosamine)]) là mt polysaccharide bao gm các gc NacetylDglucosamine [GlcNAc], cịn gi là (1>4)2acetamido2deoxyβDglucose] gn vi nhau bng liên kt β1,4Oglycoside. Hình 1.1 . Cu trúc ca chitin V mt cu trúc lp th, chitin cĩ 3 dng: α, β, δ. S khác nhau này biu hin s sp xp các chui. αchitin các chui xuơi và ngưc xen k nhau, β chitin thì cùng hưng và δchitin cĩ 2 chui xuơi xen k vi 2 chui ngưc. Dng chim nhiu nht là αchitin. 1.1.1.2. Phân b và s lưng Chitin cĩ mt nhiu nhĩm sinh vt khác nhau. nm, chitin là thành phn chính yu và kt hp vi các hp cht khác to ra thành ca khun ty và bào t nm si như: Chytridiaceae , Blastodiaceae , Ascomycetes , Basidiomycetes . nhng lồi đng vt khơng xương sng như: Crustacea (giáp xác), Onychophora (nhĩm cĩ mĩng), Myriapoda (đa túc) và Arachnida (nhn), chitin đĩng vai trị là
4 b xương ngồi dưi dng phc hp chitinprotein. T l chitin : protein thơng thưng khong 55 : 45 và t l này thay đi trong sut quá trình phát trin và khác nhau gia các lồi. Insecta (cơn trùng), chitin là v bc cơ th và màng bao cht dinh dưng. Ngồi ra, chitin cịn cĩ to lc và nhuyn th ( Mollusca ), trùng đt (Annelida ), rut khoang ( Coelenterata Cnidaria ). các lồi thc vt, chitin và đưng amin đĩng vai trị khơng quan trng trong quá trình trao đi cht hay v cu trúc hình thái. V s lưng, chitin là mt trong ba loi polysaccharide phong phú nht trong thiên nhiên (cellulose, tinh bt và chitin). Chitin đng v trí th hai sau cellulose. Chitin và cellulose tương ng vi nhau v nhiu đim v cu to và chc năng. V chc năng, chúng đu là nhng polysaccharide cu trúc. V cu trúc phân t, chitin cĩ cu trúc tương t cellulose ngoi tr nhĩm OH C 2 đưc thay th bng mt nhĩm acetylamine. Chitin cĩ th thay th mt phn hay tồn b cellulose hoc glucan trong thành t bào nm và vài loi to. 1.1.1.3. Đc đim khác Chitin khơng tan trong nưc, dung dch kim lỗng và thuc th Schweitzer. Chitin cĩ th tan trong mt s dung dch như HCl đm đc, HNO 3, acid fomic khan và mt s mui trung tính. Nu đun nĩng chitin trong dung dch kim mnh, mt phn nhĩm Nacetyl b kh (deacetyl hĩa) to thành chitosan. Ngưc li, trong dung dch HCl đm đc, quá trình thy phân chitin xy ra các ni β1,4 o o glycoside làm [α]D t 14 dn đi sang +56 , sau đĩ là s thay đi các nhĩm acetyl. Đ nht ca chitin trong dung dch acid nitric là 14,3.10 3 đi vi chitin nguyên cht t v cua, 13,1.10 3 đi vi chitin t nm. Các giá tr này xp x như nhau chng t khi lưng ca chúng gn như nhau. Trong vic đnh tính cũng như so sánh chitin t nhng ngun thc vt, đng vt khác nhau, phương pháp nhiu x tia X cĩ l là phương pháp vt lý duy nht cĩ ý nghĩa và cĩ giá tr. Trong khi đĩ, các phương pháp đnh lưng chitin đu cĩ đ chính xác gii hn, nhng điu kin cn thit cho vic tinh ch chitin cĩ kh năng làm thay đi polysaccharide này, vì vy khĩ đt đưc chitin tinh khit. Ngồi ra,
5 ngưi ta cĩ th to thành chitin t UridindiphosphateNacetylDGlucosamine nh enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) ly trích t nm. 1.1.1.4. ng dng Vi k thut ch bin hin đi, chitin và các dn xut ca chúng cĩ mt tim năng to ln đc bit là trong các lĩnh vc như y sinh hc, dinh dưng, ch bin thc phm, dưc phm, vi sinh, nơng nghip và m phm. Chitin cĩ th ng dng làm cht ph gia trong thc phm, to đ bn dai cho thc phm thay th mt s cht khơng cho phép (như hàn the ). Chitin làm cht mang trong c đnh enzyme hay c đnh t bào, làm cht mang to các giá th trng cây cnh. Cịn chitosan, dn xut ca chitin, cĩ đ bn dai, đàn hi, cĩ th to thành các màng mng gn như trong sut, s dng các màng chitosan đ bo qun các loi trái cây, làm màng bao thuc, màng bao thc phm (tht ngui, lp xưng ) cịn làm nguyên liu đ c đnh enzyme hay c đnh t bào vi sinh vt. Chitosan đưc đánh giá cao trong hàng lot nhng ng dng trong y hc như: băng bĩ và làm lành vt thương, màng thm tích, ch khâu vt thương t tiêu hu, nhân t n đnh liposome, dit vi khun, dit virus, chng ung thư, cht làm gim lưng cholesterol trong máu, cht kích thích ca h thng min dch. S phân hy t nhiên ca chitin rt quan trng khơng ch trong chu trình tun hồn ca carbon và nitơ mà cịn to ra các cht phn ng hĩa hc quan trng. Các đơn phân ca chitin và chitosan là NacetylDglucosamine (GlcNAc) và glucosamine, là nhng tác nhân cha bnh viêm khp xương mãn tính, viêm rut và viêm d dày. Các oligomer cĩ ngun gc t chitin cũng cĩ hot tính kháng khi u, kháng nm, kháng khun, là thành phn to nên glycolipid và glycoprotein cĩ vai trị quan trng trong sinh hc và nhiu ng dng khác. Hàng ngàn bài báo v chitin và các dn xut ca chúng đã đưc xut bn cùng vi khong gn 200 bng sáng ch đã đưc lưu hành ti M. Các cơng trình nghiên cu và bng sáng ch v các ch phm này cũng đã xut hin nhiu nưc trên th gii. Các nhà khoa hc t hàng chc nưc trên th gii trong đĩ cĩ M và Nga đã tp trung li 3 năm mt ln đ trao đi các bài báo, nghiên cu khoa hc mi nht v chitin và các dn xut ca chúng. Nhng điu đĩ cho thy chitin và
6 các dn xut ca chúng rt đưc quan tâm trên th gii vì kh năng ng dng rt rng cùng vi nhng đc tính đc bit ca chúng. Hàng năm chitin đưc sn xut ra khong 5.11 triu tn trên tồn th gii. Nht và M là nhng nưc sn xut chitin ln nht. Vit Nam, chitin ch yu là ph ph liu dng rn vi s lưng khng l đưc thi ra hng ngày t ngành cơng nghip ch bin và xut khu thy hi sn. V ca tơm (tơm hùm, tơm th), cua và các lồi giáp xác trên bin là ngun cung cp chitin tt nht. Trong v tơm cua, chitin chim t 2050% khi lưng khơ, khong 12% trong tơm nưc ngt, cịn li là các cht vơ cơ, ch yu là carbonate calci. Nu tn dng đưc ngun cung cp chitin này thì va gim thiu ơ nhim mơi trưng, va to thành các sn phm thc s cĩ giá tr [4]. 1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) [17][23][25][26] 1.2.1. Khái nim Chitinase là enzyme thy phân chitin thành các Nacetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua vic xúc tác s thy phân liên kt β1,4glycoside gia C1 và C4 ca hai phân t Nacetylglucosamine liên kt vi nhau trong chitin. Enzyme này cĩ nhiu lồi khác nhau như thc vt, đng vt khơng xương sng, cơn trùng, chân khp, nm, vi khun và virus. Chân khp và nm cn chitinase trong s phân chia t bào đ tăng trưng. Chitinase đưc to thành trong sut quá trình sinh trưng ca nm. Đi vi nm mc, chitinase tham gia nhiu chc năng như phân gii thành t bào, ny mm bào t, phát trin khun ty và t phân khun ty, bit hĩa bào t, đng hĩa chitin và ký sinh. vi khun, chitinase đưc to ra đ s dng chitin làm ngun carbon và năng lưng. thc vt, chitinase là mt thành phn ca phn ng chng li s xâm nhim và stress, phi hp hot đng vi các protein phịng v khác. Chitinase thương phm cĩ giá rt đt, đc bit là chitinase tinh sch. Vì vy vic s dng chitinase thơ tr nên ph bin, thú v hơn trong vic sn xut GluNAc và các oligomer cĩ ngun gc t chitin.
7 1.2.2. Phân loi chitinase 1.2.2.1. Da vào cu trúc phân t Chitinase đưc sp xp vào 2 h Glycohydrolase (enzyme thy phân đưng): - H glycohydrolase 18: là h chitinase ln nht vi khong 180 chi, cĩ cu trúc xác đnh gm 8 xon α/β cun trịn, đưc tìm thy nhiu loi sinh vt như vi khun, nm, thc vt, cơn trùng, hu nhũ và virus. H này bao gm ch yu là enzyme chitinase, ngồi ra cịn cĩ các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và Nacetylglucosamineidase. Trong h này, chitinase t các prokaryote ch cĩ 2 motif trình t ngn đưc bo tn cao (bao gm 1 gc acid glutamic đưc bo tn) ging vi enzyme ca eukaryote (10% ca tồn b các gc ging nhau). Tuy nhiên, c 2 loi chitinase đu cĩ cùng domain xúc tác barrel (βα)8. Trong c 2 enzyme, rãnh gn cơ cht đu nm đu C ca si trong cu trúc barrel (βα)8 và gc acid glutamic cho proton xúc tác cĩ 1 v trí tương đương. Khơng ging vi các glycoside hydrolase khác, chitinase h 18 cĩ cơ ch phn ng bt thưng bao gm vic tác đng lên nhĩm Nacetyl ca cơ cht trên nguyên t C anomer. Vic này dn đn vic to ra cht trung gian bao gm vịng pyranose ca glucosamine kt hp vi vịng 5 oxazoline. - H glycohydrolase 19: h này gm hơn 130 chi, thưng thy ch yu thc vt như cà chua ( Solanum tuberosum ), ci ( Arabidopsis thaliana ), đu Hà Lan (Pisum sativum ), ngồi ra cịn cĩ x khun Streptomyces griceus , vi khun Haemophilus influenzae Chúng cĩ cu trúc hình cu cĩ cun ging lysozyme (EC 3.2.1.17) ca đng vt và phage, bao gm motif cun α+β và hot đng thơng qua cơ ch nghch chuyn. Thc vt và vi sinh vt như Streptomyces to chitinase thuc c 2 h, trong khi cơn trùng và hu ht sinh vt khác ch to chitinase thuc h glycohydrolase 18. 1.2.2.2. Da vào trình t amino acid Da vào trình t đu amin (N), s đnh v ca enzyme, đim đng đin, peptid nhn bit và vùng cm ng, ngưi ta phân loi enzyme chitinase thành 5 nhĩm: - Nhĩm I: là nhng đng phân enzyme trong phân t cĩ vùng đu N giàu cysteine cha khong 40 amino acid (ging vi vùng đu N hevein và các
8 enzyme khác cĩ ái lc đi vi chitin hay Nacetylglucosamine) ni vi tâm xúc tác thơng qua mt đon giàu glycin hoc prolin đu carboxyl (C)(peptid nhn bit). Vùng giàu cysteine cĩ vai trị quan trng đi vi s gn kt enzyme và cơ cht chitin nhưng khơng cn cho hot đng xúc tác. Các vùng gn chitin này khơng phi luơn đĩng vai trị quan trng trong vic tăng cưng hot tính xúc tác enzyme mà chúng cn đ to các đc tính sinh hc riêng bit cho chitinase nhiu lồi khác nhau. nm men, vùng gn chitin nm đu C giúp đnh v chitinase trên thành t bào nm men, đĩng vai trị trong vic phân tách t bào m khi các t bào ch em. thuc lá và nhiu lồi thc vt khác, các chitinase này nm trong khơng bào và đưc cm ng t s nhim nm, vi khun hay virus. Chitinase nhĩm I ca thuc lá cĩ vùng đu C giàu cystein đĩng vai trị là vùng gn chitin. - Nhĩm II: là nhng đng phân enzyme trong phân t ch cĩ tâm xúc tác cĩ trình t amino acid tương t chitinase nhĩm I, thiu đon giàu cysteine đu N và peptid nhn bit đu C. Chitinase nhĩm II cĩ thc vt, nm và vi khun. Chúng đưc cm ng bi các tác nhân bên ngồi. thc vt, các protein nhĩm II thuc loi protein kháng bnh và đưc t bào tit ra dưi nhiu điu kin stress khác nhau. - Nhĩm III: Trình t amino acid hồn tồn khác vi chitinase nhĩm I và II, nhưng rt ging v trình t vi lysozyme Hevea brasiliensis , vì th chúng mang hot tính lysozyme. thc vt, các chitinase nhĩm III là các protein kháng bnh và đưc tit ra ngoi bào. - Nhĩm IV: là nhng đng phân enzyme ch yu cĩ lá cây hai lá mm, 41 47% trình t amino acid tâm xúc tác ca chúng tương t như chitinase nhĩm I và khá ging vi chitinase vi khun. Trong phân t cũng cĩ đon giàu cysteine nhưng kích thưc phân t nh hơn đáng k so vi chitinase nhĩm I. - Nhĩm V: da trên nhng d liu v trình t, ngưi ta nhn thy vùng gn chitin (vùng giàu cysteine) cĩ th đã gim đi nhiu ln trong quá trình tin hĩa thc vt bc cao.
9 1.2.2.3. Da vào phn ng phân ct Enzyme phân gii chitin bao gm: endochitinase, chitin1,4β chitobiosidase, NacetylβDglucosamineidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân ct ni mch chitin mt cách ngu nhiên to các đon oligosaccharide, đã đưc nghiên cu t dch chit mơi trưng nuơi cy nm mc Trichoderma harzianum (2 loi endochitinase: M 1=36kDa, pI 1=5,3±0,2 và M 2=40kDa, pI 2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8). Chitin1,4βchitobiosidase là enzyme phân ct chitin (exochitinase) t đu khơng kh to thành các sn phm chính là các chitobiose, c th enzyme này đưc thu t Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2). NacetylβDglucosamineidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) là enzyme phân ct chitin t mt đu cho sn phm chính là các monomer NacetylD glucosamine. Chitobiase là enzyme phân ct chitobiose thành 2 đơn phân NacetylD glucosamine. Ngồi ra, đi vi chitosan dn xut deacetyl hĩa ca chitin, chitosanase (EC 3.2.2.132) xúc tác thy phân chitosan to thành các oligosaccharide tương ng. 1.2.3. Các ngun thu nhn enzyme chitinase 1.2.3.1. Chitinase vi khun Vi khun sn sinh enzyme chitinase nhm đáp ng nhu cu dinh dưng. Chúng thưng tng hp nhiu loi chitinase đ cĩ th phân ct đưc các loi chitin đa dng trong t nhiên. Như vy, chitinase vi khun đĩng vai trị quan trng trong chu trình chitin trong t nhiên. Enzyme chitinase đưc tìm thy trong vi khun: Chromobacterium , Klebsiella , Pseudomonas , Clostridium , Vibrio và đc bit là nhĩm Streptomycetes . Enzyme chitinase cĩ th là enzyme cu trúc hoc enzyme cm ng. Tuy nhiên trong các mơi trưng nuơi cy vi sinh vt, ngưi ta đu cho thêm chitincơ cht ca enzyme chitinase đ làm tăng kh năng tng hp enzyme chitinase, đng thi n đnh hot tính enzyme chitinase sau quá trình chit tách. Vi khun tng hp
10 enzyme chitinase nhm phân gii chitin trong mơi trưng to ngun carbon cho vi khun sinh trưng, phát trin. 1.2.3.2. Chitinase nm Chitinase cũng đưc to ra bi các lồi nm si. Các chng nm mc cho enzyme chitinase cao như: Trichoderma , Gliocladium , Calvatia, đc bit là các lồi nm ln như Lycoperdon , Coprinus Tương t như vi khun, enzyme chitinase ca nm cũng đĩng vai trị quan trng v mt dinh dưng nhưng khác là hot đng ca chúng rt linh hot trong quá trình phát trin và trong s phát sinh hình thái ca nm bi vì chitin là thành phn chính ca vách t bào nm. 1.2.3.3. Chitinase thc vt Các thc vt bc cao cĩ kh năng to enzyme chitinase như: cao su ( Hevea brasiliensis ), thuc lá ( Nicotiana sp), lúa, lúa mì, lúa mch ( Hordeum vulgare ), lúa mch đen, cà rt, bp ci, bp, khoai tây, đu Hà Lan, đu nành, c t và đc bit mt s lồi to bin cũng là ngun cung cp enzyme chitinase. Chitinase thc vt tn ti ch yu các mơ nht đnh hoc cơ quan sinh sn như ht ging, c, hoa và đưc cm ng bi cơn trùng và các tác nhân gây hi trên thc vt. Bên trong t bào thc vt, chitinase nm trong khơng bào cùng vi các enzyme chng bnh khác. Ví d các endochitinase mang tính base trong lá đu tp trung trong khơng bào và cĩ cha hu ht các hot tính chitinase ni bào. Nh vy, khơng bào thc vt đưc xem tương t như tiêu th đng vt. Bi vì bn thân thc vt khơng cĩ cha cơ cht ca nhng enzyme phân gii như chitinase và β1,3 glucanase, s tn ti ca nhng enzyme này cho thy chúng cĩ vai trị kháng khun, kháng nm ký sinh gây bnh và c cơn trùng. Các protein kháng khun (pathogenesisrelated protein) khác nhau đưc phân lp t thc vt bao gm thionin, protein bt hot ribosome, defensin, nsLTP và các enzyme phân gii như β1,3glucanase và chitinase. Nhiu chitinase, ging như các protein khác đĩng vai trị bo v, cĩ th chu đưc các protease ngoi bào, hoc mang tính acid hoc mang tính base (thơng thưng các protein mang tính acid đưc tit vào apoplast hoc mơi trưng ngoi bào, trong khi dng base thưng tp
11 trung ni bào trong các khơng bào). Trình t ca các chitinase acid ging vi các chitinase base, ch khác ch chúng khơng cĩ vùng đu N hevein. Xét v đc tính phân ct, chitinase thc vt thưng là endochitinase phân ct ngu nhiên. Mt s chitinase thc vt cĩ hot tính lysozyme ct liên kt β1,4 gia acid Nacetylmuramic và các gc Nacetylglucosamine trong peptidoglycan. Ví d như chitinase phân lp t đu đ, Rubus hispidus và Parthenocissus quinquefolia . 1.2.3.4. Chitinase đng vt T mt s đng vt nguyên sinh và t các mơ, tuyn khác nhau trong h tiêu hĩa ca nhiu lồi đng vt khơng xương: rut khoang, giun trịn, thân mm, chân đt (ví d trong dch rut ca c sên Helix aspersa ), ta cĩ th thu nhn đưc enzyme chitinase. Đi vi đng vt cĩ xương sng, enzyme chitinase đưc tit ra t tuyn ty và dch d dày ca các lồi cá, lưng cư, bị sát ăn sâu b, trong dung dch d dày ca nhng lồi chim, thú ăn sâu b. Ngồi ra, enzyme chitinase cịn đưc thu nhn t dch biu bì ca giun trịn trong sut quá trình phát trin và dch tit biu bì ca các lồi chân đt vào thi đim thay v, lt da. Enzyme chitinase giúp cơn trùng tiêu hĩa màng ngồi (cuticle) trong quá trình bin thái hay lt xác. 1.2.4. Các đc tính cơ bn ca enzyme chitinase 1.2.4.1. Khi lưng phân t Enzyme chitinase tìm thy thc vt bc cao và to bin cĩ khi lưng phân t khong 2540kDa [23]. Mt s chitinase cĩ khi lưng phân t khong 40 90kDa. Enzyme chitinase ca các lồi thân mm, chân đt, đng vt cĩ xương (cá, lưng cư, thú) cĩ khi lưng phân t cao hơn, khong 120kDa. Khi lưng phân t ca enzyme chitinase thu nhn t nm và vi khun cĩ khong bin đi rng, t 30 đn 120kDa. Mt s enzyme chitinase cĩ khi lưng phân t thp cĩ th đưc to ra t mt enzyme ln hơn bng cách phân ct mt phn protein. 1.2.4.2. Đim đng đin Ph hp thu Hng s Michaelis Enzyme chitinase cĩ giá tr pI thay đi rng: 3,010,0 thc vt bc cao và to, 4,79,3 cơn trùng, giáp xác, thân mm và cá, 3,58,8 vi sinh vt. H s hp thu E 280 mg/ml=1,24; ph hp thu ch là bưc sĩng đơn 280nm.
12 Hng s Michaelis: 0,0100,011 (g/100ml). 1.2.4.3. nh hưng ca nhit đ Nhìn chung, nhit đ ti ưu cho enzyme chitinase vi sinh vt hot đng là 40 oC, ngoi tr Aspergillus niger tng hp enzyme chitinase hot đng trên cơ cht là glycol chitin cĩ nhit đ ti thích là 50 oC. Tuy nhiên, tùy theo ngun gc thu nhn mà enzyme chitinase cĩ th cĩ nhng nhit đ ti ưu khác nhau. Thí d, nhit đ ti ưu ca chitinase t khoai tây ngt là 25 oC [12]. các enzyme t c t Diosscorea opposita THUNB nhit đ ti ưu là 4570 oC [5]. Các enzyme chitinase thc vt thuc nhĩm III và các chitinase t Bacillus licheniformis phân lp trong sui nưc nĩng cho thy cĩ kh năng chu đng nhit đ cao đn 80 oC. Mt khác, chitinase t cơn trùng (tm ) khơng n đnh nhit đ 40 oC vì cơn trùng phát trin nhit đ 25 oC. Do đĩ, nhit đ ti ưu ca enzyme chitinase cơn trùng khơng cao. 1.2.4.4. nh hưng ca pH pH ti ưu ca enzyme chitinase t 49 đi vi các chitinase thc vt bc cao và to, enzyme chitinase đng vt cĩ vú là 4,87,5 và vi sinh vt là 3,58,0. Theo các nhà khoa hc, pH ti thích ca enzyme chitinase cĩ th cĩ s ph thuc vào cơ cht đưc s dng. Đa s các enzyme chitinase đã đưc nghiên cu cĩ pH ti thích khong 5,0 khi cơ cht là chitin, enzyme chitinase ca Streptomyces grieus cĩ pH ti thích khong 6,3, giá tr này khoai tây ngt Ipomoea batatas là 5,0. các enzyme t c t Diosscorea opposita THUNB pH ti ưu là 3,54,0. Tùy mc đích phân tích, nhng cơ cht hịa tan như glycol chitin và Nacetylchitooligosaccharide đưc s dng thay th cho chitin. pH ti ưu ca enzyme chitinase khi cơ cht là glycol chitin thuc khong pH kim yu. Hot tính enzyme chitinase s nhanh chĩng b c ch pH<4,5, ngoi tr chitinase trong d dày ca đng vt cĩ xương sng vn hot đng pH 3,0. 1.2.4.5. Cht tăng hot, cht c ch - Allosamidin Allosamidin là mt pseudotrisaccharide gm 2 đơn v Nacetylallosamin gn vi nhau nh liên kt β1,4 và mt nhĩm allosamizoline. Nhĩm allosamizoline
13 tương t như cht trung gian phn ng oxocarbonium, cu to bao gm 1 cyclopentane và mt vịng aminooxazoline. V cu to, allose ch khác glucose C3 trong đĩ nhĩm hydroxyl nm thng trong allose và nm ngang trong glucose. Allosamidin là cht c ch chitinase đu tiên đưc phân lp t khun ty ca Streptomyces sp. No.1713. Allosamidin và nhng dn xut ca nĩ c ch enzyme chitinase đưc tng hp t tm, tơm he và mt s vi sinh vt ( Piromyces communis , Streptomyces sp và Streptomyces olivaceoviridis ). Ngồi ra, allosamidin cũng đưc phát hin cĩ kh năng gn kt vi các enzyme chitinase thc vt như hevamine và c ch các enzyme chitinase thc vt (đa s thuc h Glycohydrolase 18). Đin hình nĩ c ch chitinase H cây c ci vi ID 50 (liu lưng 50% cht c ch là 44,7M). Nĩi chung, allosamidin c ch mnh chitinase h 18 và khơng c ch protein lịng trng trng gà hay lysozyme ngưi. V cơ ch c ch, allosamidine c ch chitinase theo cơ ch cnh tranh nhĩm allosamizoline gn vào tâm ca trung tâm hot đng chitinase, gi làm cht trung gian phn ng oxocarbonium nm gia C 1 ca NacetylDglucosamine và oxy carbonyl ca nhĩm Nacetyl C 2 trong quá trình thy gii. Trong đĩ đin tích dương C 1 đưc n đnh bng oxy carbonyl ca nhĩm Nacetyl C 2. Allosamidin khá đt và khĩ tng hp. Mc dù các oligomer carbohydrate và nhng dn xut ca chúng cĩ th dùng đ thit k cht c ch glycoside hydrolase, chúng thưng khĩ tng hp và quá ln đ đi qua màng t bào. - Các ion kim loi Các ion kim loi Hg 2+ , Ag + là nhng cht c ch. Đi vi ion Cu +, cĩ 2 dng enzyme chitinase: mt b c ch và mt đưc tăng cưng nh Cu 2+ đưc tìm thy mt s lồi cá và vi sinh vt như Pseudomonas aeruginosa . - Các cht khác Dipeptide CI4 [cyclo(LArgDPro)] là mt sn phm t nhiên đưc tng hp t vi khun nưc mn Pseudomonas IZ208. CI4 c ch vic phân tách t bào Saccharomyces cerevisiae và ngăn cn s to khun ty ca nm bnh Candida albicans ngưi. V cơ ch, CI4 c ch chitinase h 18 vì chúng cĩ cu trúc ging cht trung gian phn ng. Các cht c ch chitinase h 18 cĩ nh hưng đn
14 chu trình sng ca nhiu loi nm và ngăn cn s truyn ký sinh trùng st rét (Plasmodium falciparum ) t vt ch đn cơn trùng. 2 peptide c ch glycoside hydrolase khác là argifin và argadin cĩ th c ch chitinase nng đ nano hay micro mole. Các peptide này gn trc tip lên các gc tâm hot đng ca enzyme và chim các v trí 1, +1 và +2. mc dù nhng cht c ch này là peptide nhưng chúng cĩ nhiu nhánh bên bt thưng như acetyl hay vịng thơm. Ngưc li, huyt thanh albumin cĩ vai trị làm tăng hot đng ca enzyme chitinase nhưng s nh hưng này ch rõ ràng sau 23 gi đu ca phn ng. 1.2.4.6. S n đnh Enzyme chitinase thơ hoc tinh sch n đnh trong trng thái đơng lnh khong 2 năm. S n đnh ca enzyme chitinase s cao hơn khi cĩ mt ca cơ cht là chitin. Chúng b kh hot tính nhanh chĩng 37 oC trong trưng hp khơng cĩ mt chitin. Chu kỳ bán hy 37 oC là 40 ngày và 5 oC là 230 ngày. Enzyme chitinase bt hot bi oxygen, hng s bt hot 20 oC là k=0,145/h. 1.2.5. Các loi cơ cht ca enzyme chitinase 1.2.5.1. Chitin Cơ cht ch yu ca enzyme chitinase là chitin. lp v cơn trùng và giáp xác, chitin đưc gn kt vi protein. Trong mt vài trưng hp, lp biu bì này đưc làm cng bi các liên kt chéo vi polysaccharide khác (cellulose, mannan, glucan ). Ngồi ra, chitin cũng cĩ cu trúc liên h vi murein, cu trúc polymer hin din vách t bào vi khun. 1.2.5.2. Các dn xut ca chitin Enzyme chitinase cĩ th tác đng lên mt s dn xut ca chitin như glycol chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfate, 4methylumbellferyltri N acetylchitotrioside (MUCphát huỳnh quang). Enzyme chitinase khơng hot đng trên các cơ cht: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoc mucin.
15 1.2.6. Cơ ch tác đng ca các loi enzyme chitinase Endochitinase phân ct ngu nhiên trong ni mch ca chitin và chitooligomer, sn phm to thành là mt hn hp các polymer cĩ khi lưng phân t khác nhau, nhưng chim đa s là các diacetylchitobiose (GlcNAc) 2 do hot tính endochitinase khơng th phân ct thêm đưc na. Hu ht chitinase thuc loi này. Chitin 1,4chitobiosidase phân ct chitin và chitooligomer mc trùng hp ln hơn hay bng 3 [(GlcNAc) n vi n ≥3] t đu khơng kh và ch phĩng thích diacetylchitobiose (GlcNAc) 2. βNacetylhexosaminidase phân ct các chitooligomer hay chitin mt cách liên tc t đu khơng kh và ch phĩng thích các đơn phân Nacetylglucosamine. Ngồi ra, đ kho sát kiu phân ct, ngưi ta s dng Nacetyl chitooligosaccharide làm cơ cht. Các oligosaccharide thưng đưc thy phân bên trong trên mt vài v trí xác đnh hoc mt cách ngu nhiên. Mt s enzyme chitinase cĩ kh năng thy phân trisaccharide, mt s khác thì khơng. Cũng cĩ 2 dng chitinase thy phân pentasaccharide: mt phân ct bên trong to disaccharide và trisaccharide, mt phân ct bên ngồi to các monosaccharide và tetrasaccharide. Tĩm li, chitinase thc cht là enzyme ct ngu nhiên. 1.3. Tng quan v nm mc [4] 1.3.1. Khái nim Nm mc (fungus) là vi sinh vt chân hch, th tn (thalophyte), t bào khơng cĩ dip lc t, sng d dưng (hoi sinh, ký sinh, cng sinh), vách t bào cu to ch yu là chitin, cĩ hay khơng cĩ celuloza và mt s thành phn khác cĩ hàm lưng thp. Nm hc (Mycology) đưc khai sinh bi nhà thc vt hc ngưi Ý tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liu cơng b “ging cây l” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo Ekriksson Gunnan (1978) thì ngưi cĩ cơng nghiên cu sâu v nm mc li là Elias Fries (1794 1874). Theo Elizabeth Tootyll (1984) nm mc cĩ khong 5.100 ging và 50.000 lồi đưc mơ t, tuy nhiên, ưc tính cĩ trên 100.000 đn 250.000 lồi nm hin din trên trái đt. Nhiu lồi nm mc cĩ kh năng ký sinh trên nhiu ký ch như đng vt, thc vt, đc bit trên con ngưi, cây trng, vt nuơi, sn phm sau thu hoch chưa hoc đã qua ch bin, bo qun.
16 Mt s là tác nhân gây bnh, làm hư các thit b thy tinh bo qun khơng tt nhưng cũng cĩ nhiu lồi cĩ ích như tng hp ra acit hu cơ, thuc kháng sinh, vitamin, kích thích t tăng trưng thc vt đã đưc đưa vào sn xut cơng nghip và cĩ mt s nm đưc dùng làm đi tưng nghiên cu v di truyn hc. Nm nĩi chung và vi sinh vt thuc mt gii riêng bit. Nm mc cĩ chung 7 đc đim sau đây: + Cơ th nm là mt tn (thalus) tc là mt cơ th cĩ b máy dinh dưng chưa phân hĩa thành các cơ quan riêng bit. Tn cĩ th đơn bào hoc đa bào , đa s cĩ dng si gi là si nm hay khun ty, si nm cĩ th cĩ hoc khơng cĩ vách ngăn. + Các vách ngang si nm ngăn vách đu cĩ l thơng. Tùy loi nm mà l thơng cĩ th là 1 l thơng khá ln chính gia hoc là cĩ nhiu l thơng tương đi nh. + Nm cĩ rt nhiu đim chung vi các sinh vt cĩ nhân tht nht là v cu to ca nhân. Nm khác hn cu to vi các vi sinh vt thuc nhĩm nhân nguyên thy như vi khun và vi khun lam. + Nm cĩ nhng đc đim riêng bit v mt hĩa hc t bào. Nm khơng cĩ cu trúc thng nht gia các nhĩm v thành phn thành t bào. Ch cĩ mt s ít nm cha cellulose trong thành t bào. Cht d tr ca nm khơng phi là tinh bt mà là glycogen như đng vt. + Nm khơng cha dip lc vì th chúng ch cĩ th sng hoi sinh, kí sinh hoc cng sinh. + Nm sinh sn bng bào t vơ tính và bào t hu tính. + Nm khơng cĩ mt chu trình phát trin chung. 1.3.2. Hình dng và kích thưc Đa s nm cĩ hình si (filamentous fungi nm si), si cĩ ngăn vách (đa bào) hay khơng cĩ ngăn vách (đơn bào). Si nm thưng là mt ng hình tr dài cĩ kích thưc ln nh khác nhau tùy lồi. Đưng kính ca si nm thưng t 35m, cĩ khi đn 10m, thm chí đn 1mm. Chiu dài ca si nm cĩ th ti vài chc centimet. Các si nm phát trin chiu dài theo kiu tăng trưng ngn. Các si nm cĩ th phân nhánh và các nhánh cĩ th li phân nhánh liên tip to thành h si nm (mycelium) khí sinh xù xì như bơng. Trên mơi trưng đc và trên mt s
17 cơ cht trong t nhiên, bào t nm, t bào nm hoc mt đon si nm cĩ th phát trin thành mt h si nm cĩ hình dng nht đnh gi là khun lc nm. 1.3.3. Cu to t bào si nm T bào nm cĩ cu trúc tương t như nhng t bào vi sinh vt chân hch khác. Vách t bào nm cu to bi vi si chitin và cĩ hoc khơng cĩ celluloz. Chitin là thành phn chính ca vách t bào hu ht các lồi nm tr nhĩm Oomycetina. Nhng vi si chitin đưc hình thành nh vào enzim chitin synthase. T bào cht ca t bào nm cha mng ni cht (endoplasmic reticulum), khơng bào (vacuoles), ty th (mitochondria) và ht d tr (glycogen và lipid), đc bit cu trúc ty th t bào nm tương t như cu trúc ty th t bào thc vt. Ngồi ra, t bào nm cịn cĩ ribơ th (ribosomes) và nhng th khác chưa r chc năng. T bào nm khơng cĩ dip lc t, mt vài lồi nm cĩ ri rác trong t bào mt loi sc t đc trưng mà Matsueda (1978) đu tiên ly trích đưc và gi là neocercosporin (C 2H26 O10 ) cĩ màu tím đ nm Cercosporina kikuchi. T bào nm khơng nht thit cĩ mt nhân mà thưng cĩ nhiu nhân. Nhân ca t bào nm cĩ hình cu hay bu dc vi màng đơi, bên trong màng nhân cha RNA, phospholipid và protein dy 0,02 m. 1.3.4. Dinh dưng và tăng trưng ca nm mc Hu ht các lồi nm mc khơng cn ánh sáng trong quá trình sinh trưng. Tuy nhiên, cĩ mt s lồi li cn ánh sáng trong quá trình to bào t (Buller, 1950). Nhit đ ti thiu cn cho s phát trin là t 20oC đn 50oC, ti ho t 22 oC đn 27 oC và nhit đ ti đa mà chúng cĩ th chu đng đưc là 35 oC đn 40 oC, cá bit cĩ mt s ít lồi cĩ th sng sĩt 0oC và 60 oC. Nĩi chung, nm mc cĩ th phát trin tt mơi trưng acid (pH 6) nhưng pH ti ưu là 5 – 6.5, mt s lồi phát trin tt pH 9 (Ingold, 1967). Oxy cũng cn cho s phát trin ca nm mc vì chúng là nhĩm hiu khí bt buc và s phát trin s ngưng khi khơng cĩ oxi và dĩ nhiên nưc là yu t cn thit cho s phát trin.
18 Nm mc khơng cĩ dip lc t nên chúng cn đưc cung cp dinh dưng t bên ngồi (nhĩm d dưng), mt s sng sĩt và phát trin nh kh năng ký sinh (sng ký sinh trong cơ th đng vt hay thc vt) hay hoi sinh (saprophytes) trên xác bã hu cơ, cũng cĩ nhĩm nm r hay đa y sng cng sinh vi nhĩm thc vt nht đnh. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho bit ngun dưng cht cn thit cho nm đưc xp theo th t sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, Bo, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên t này hin din trong các ngun thc ăn vơ cơ đơn gin như mui ammonium s đưc nm hp thu d dàng, nu t ngun thc ăn hu cơ phc tp nm s sn sinh và tit ra bên ngồi các loi enzyme thích hp đ ct các đi phân t này thành nhng phân t nh đ d hp thu vào trong t bào. 1.3.5. V trí và vai trị ca nm mc Nm mc cĩ nh hưng xu đn cuc sng con ngưi mt cách trc tip bng cách làm hư hng, gim phm cht lương thc, thc phm trưc và sau thu hoch, trong ch bin, bo qun. Nm mc cịn gây hư hi vt dng, qun áo hay gây bnh cho ngưi, đng vt khác và cây trng. Tuy nhiên, các qui trình ch bin thc phm cĩ liên quan đn lên men đu cn đn s cĩ mt ca vi sinh vt trong đĩ cĩ nm mc. Nm mc cũng giúp tng hp nhng loi kháng sinh (penicillin, griseofulvin), acid hu cơ (oxalic acid, citric acid, gluconic acid ), vitamin nhĩm B, kích thích t (gibberellin, auxin, cytokinin), mt s enzyme và các hot cht khác dùng trong cơng nghip thc phm và y dưc, đã đưc s dng rng rãi trên th gii. Ngồi ra, nm cịn gi vai trị quan trng trong vic phân gii cht hu cơ tr li đ mu m cho đt trng. Mt s lồi thuc ging Rhizopus, Mucor, Candida gây bnh trên ngưi, Microsporum gây bnh trên chĩ, Aspergillus fumigatus gây bnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bnh nm ký sinh trên cá. Nhng lồi nm gây bnh trên cây trng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora. đc bit nm Aspergilus flavus và Aspergillus fumigatus phát trin trên ngũ cc trong điu kin thun li sinh ra đc t aflatoxin.
19 Bên cnh tác đng gây hi, mt s lồi nm mc rt hu ích trong sn xut và đi sng như nm ăn, nm dưc phm (nm linh chi, Penicillium notatum tng hp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tng hp nên griseofulvin ), nm Aspergillus niger tng hp các acit hu cơ như acit citric, acit gluconic, nm Gibberella fujikuroi tng hp kích thích t gibberellin và mt s lồi nm thuc nhĩm Phycomycetina hay deuteromycetina cĩ th ký sinh trên cơn trùng gây hi qua đĩ cĩ th dùng làm thiên đch dit cơn trùng. Ngồi ra, nhng lồi nm sng cng sinh vi thc vt như Nm r ( Mycorrhizae ), giúp cho r cây hút đưc nhiu hơn lưng phân vơ cơ khĩ tan và cung cp cho nhu cu phát trin ca cây trng. Nm cịn là đi tưng nghiên cu v di truyn hc như nm Neurospora crassa , nm Physarum polycephalum dùng đ tng hp DNA và nhng nghiên cu khác. 1.4. Tng quan tình hình nghiên cu trong và ngồi nưc Trên th gii đã cĩ rt nhiu cơng trình nghiêng cu v chitinase vi nhiu mc đ và lĩnh vc ng dng: Nhiu cơng trình nghiên cu v tách chit và tinh sch chitinase t nhiu ngun khác nhau đã đưc cơng b như Izabela S. Santos và cng s (2004) đã tách chit, tinh sch và xác đnh tính cht ca chitinase thu nhn t ht Adenanthera pavonina . L [29]; WenChi Hou và cng s (1998) đã nghiên nghiên cu hot tính chitinase ca khoai lang Ipomoea batatas [L.] Lam var. Tainong57 [30]; Xiuyun Ye, Tzi Bun Ng (2005) nghiên cu chitinase tách chit t đu (mung bean) vi hot tính kháng nm [31]; WooJin Jung và cng s (2006) nghiên cu tinh sch và xác đnh tính cht ca exoBglucosaminidase t Aspergillus fumigatus S26 [32]; Jayme A. SouzaNeto và cng s (2003) cũng đã nghiên cu hot tính chitinase trong u trùng mui [33], Vn đ tuyn chn các chng vi sinh vt cĩ hot tính chitinase cao và ti ưu mơi trưng cũng như điu kin nuơi cy chúng đ thu nhn chitinase đã đưc nhiu nhà khoa hc quan tâm nghiên cu: ElKatatny và cng s (2000) đã nghiên cu sn xut chitinase và B1,3glucanase t Trichoderma harzianum đ kim sốt nm Sclerotium rolfsii [34]; N.N. Nawani, B.P. Kapadnis (2005) đã nghiên cu ti ưu sn xut chitinase bng phương pháp dùng thng kê da trên thit k thc nghim
20 [35]; Parameswaran Binod và cng s (2005) đã ti ưu sn xut và tinh sch chitinase t Pennicillum aculeatum NRRL 2129 bng phương pháp lên men lng [36]. Gn đây, Yano, S. NopakRNA Rattanakit đã nghiên cu thu nhn, tinh sch và xác đnh tính cht chitinase ca Streptomyces cyaneus SP27, Nhng nghiên cu sâu hơn như phân lp to dịng và biu hin gen cũng đã đưc thc hin nhm tăng kh năng tng hp chitinase ca sinh vt: ChienJui Huang và ChaoYing Chen (2005) nghiên cu biu hin gen mc cao và xác đnh tính cht ca hai chitinase: ChiCH và ChiCW ca Bacillus cereus 289 trong Escherichia coli [37]; YongSeok Lee và cng s (2006) cũng đã nghiên cu to dịng, tinh sch và xác đnh tính cht ca chitinase t Bacillus sp. DAU101, Bên cnh nhng nghiên cu trên, mt lot các nghiên cu v chitinase đnh hưng ng dng cơng ngh sinh hc trong nơng, lâm, ngư, y đã đưc cơng b : WenTeish Chang và cng s (2007) nghiên cu s dng dch chit t mơi trưng (cĩ cha bt v tơm, cua sn xut t cht thi bin) nuơi cy Bacillus cereus QQ308 đ c ch nm bnh Fusarium oxysporum, Fusarium solani và Pythium ultimum làm tăng s phát trin ca cây [28]; Pernille H.B. Poulsen và cng s (2007) đã b sung chitin vào phân compost đ x lý cht thi (hu cơ) h gia đình, kt qu đã làm tăng hot tính chitinase trong đng , tăng s đa dng di truyn ca vi sinh vt đng thi tăng kh năng khống hĩa cht thi hu cơ so vi đi chng [27]; Laura Ramı´rezCoutin’o, Marı´a del Carmen Marı´nCervantes và cng s (2006) đã s dng chitinases t Lecanicillium fungicola đ thy phân chitin nhm sn xut oligosaccharides [18]; năm 2002 cĩ mt nghiên cu khá thú v: Mongkol Sukwattanasinitt và cng s đã th nghim ng dng enzyme thương mi khơng cĩ chitinase t nm si thy gii Bchitin đ thu nhn 2acetamido2deoxyD glucose [38], Ti Vit Nam, các nghiên cu v chitinase phát trin mnh trong nhng năm gn đây. Cĩ hai hưng nghiên cu ch đo: Hưng nghiên cu khá ph bin là tách chit, tinh sch, xác đnh điu kin ti ưu cho sinh tng hp và phn ng ca chitinase t nhiu ngun khác nhau da trên s đa dng v chng loi sinh vt bn đa:
21 Chitinase t thc vt: cĩ nghiên cu ca Đng Trung Thành (2008) v thu nhn enzyme chitinase trong cây khoai lang (Ipomoea batatas) ti Khánh Hịa [15]; Ti Đăk Lăk , Nguyn Quang Nhân và cng s (2009) đã nghiên cu thu nhn, tinh sch và xác đnh tính cht ca chitinase t m cao su (Hevea brasilliensis) [13]. Cĩ khá nhiu nghiên cu hưng ti vic thu nhn chitinase t vi sinh vt: Đinh Minh Hip và cng s (2007) đã kho sát hot tính các enzyme chitinase, B glucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease ca các chng Trichoderma phân lp ti vit Nam [6]; Nguyn Bo Hưng và cng s (2010) cũng đã phân lp và đánh giá mt s đc tính ca chitinase t Trichoderma Asperellum [7]; Nguyn Phương Nhu và cng s (2010), đã nghiên cu mt s yu t nh hưng ti kh năng sinh tng hp chitinase ca chng vi khun Bacillus Circulans HT11 [14]; Phm Th Ngc Lan và Hồng Quc Anh (2010), tin hành nghiên cu tuyn chn chng vi khun phân hy chitin và kho sát điu kin sinh tng hp chitinase [8]; Cũng trong năm 2010, Nguyn Văn Bn đã nghiên cu tách chit và xác đnh tính cht chitinase t mơi trưng nuơi cy nm mc phân lp ti Buơn Ma Thut, Mt hưng nghiên cu mi mang tính đnh hưng cho vic ng dng các vi sinh vt cĩ hot tính chitinase hoc ch phm chitinase trong vic khng ch dch hi cho cây trng: Nguyn Văn Nam (Đi hc Tây Nguyên) và cng s đã nghiên cu sâu v cơ ch đi kháng ca các dịng nm Trichoderma vi nm bnh hi cây trng: Năm 2009 nhĩm tác gi đã cơng b hai cơng trình nghiên cu v Cơ ch thy phân ca enzyme Chi32 và Chi46 tinh sch t nm Paecilomyces variotii lên chitin cu thành trong si nm Fusarium solani [11] và Vai trị ca các enzyme này trong quá trình ký sinh trng tuyn trùng Meloidogyme incognita [12]; Năm 2010, nhĩm tác gi tip tc đăng ti mt nghiên cu v chc năng chitinase ca nm Trichoderma harzianum T1 trong quá trình đi kháng vi nm bnh Fusarium solani [10]. Gn đây (2011), Trn Th Thu Hà (Đi hc Nơng Lâm Hu), cũng đã nghiên cu vai trị ca chitinase tái t hp t Trichoderma trong phịng tr bnh hi cây trng.
22 Hin nay, vn chưa cĩ mt nghiên cu nào v phân lp và sàng lc các chng nm mc đ thu nhn chitinase mang tính h thng khu vc Tây Nguyên, c th là Đk Lk đưc cơng b trên các tp chí trong và ngồi nưc. Đ gĩp phn tham gia vào vic nghiên cu enzyme chitinase t vi sinh vt ti Tây Nguyên, chúng tơi đ xut đ tài “Phân lp và tuyn chn mt s chng chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao ti tnh Đk Lk”.
Chương 2 NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU
23 2.1. Ni dung nghiên cu Nghiên cu phân lp và tuyn chn các chng nm mc cĩ kh năng phân gii chitin. Ti ưu hĩa mơi trưng và điu kin nuơi cy các chng nm mc tuyn chn nhm thu nhn chitinase cĩ hot tính cao. Nghiên cu la chn tác nhân ta phù hp cho quá tình tách chit enzyme chitinase t chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao nht đưc tuyn chn. Nghiên cu mt s tính cht cơ bn ca chitinase t chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao nht đưc tuyn chn. Tinh sch chitinase. 2.2. Vt liu và thit b Đ tài cĩ s dng các hố cht: NaNO 3, K 2HPO 4, MgSO 4, KCl, FeSO 4, Chitin, Agar, Glucose, thuc th DNS, thuc nhum Coomassie Brilliant Blue, N Acetylglucosamine (GlcNAc), NaOH, Albumine huyt thanh bị, Gel Sephadex G50 , Acrylamide (FW 71,08), Bis Acrylamide (FW 154,2), Tris (FW 121,1), SDS, Amoniumpersulfate (APS), TEMED, Glacial acetic acid, methanol tuyt đi. Đĩa peptri, micropipette, que cy, que gt, ng nghim, bình tam giác 50, 100, 250 ml, bình đnh mc 50, 100ml, Ni hp áp lc, t sy, t m, máy quang ph 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway), cân đin t, b đin di, kính hin vi, máy lc n nhit, box cy vơ trùng, 2.3. Phương pháp nghiên cu 2.3.1. Đa đim thu thp mu Các chng nm mc cĩ hot tính chitinase đưc phân lp t đt đ bazan và đt xám ti Dăk lăk. 2.3.2. Các loi mơi trưng [16] + Mơi trưng Czapek chitin: dùng đ phân lp, cy chuyn NaNO 3: 3,5g K2HPO 4: 1,5 g MgSO 4: 0,5g
24 KCl: 0,5g FeSO 4: 0,1g B sung huyn phù chitin 1%: 50ml Agar: 20 g B sung nưc cho đ 1000ml + Mơi trưng PGA: dùng đ quan sát và mơ t hình thái Khoai tây: 200 g Glucose: 20 g Agar: 20 g Nưc ct: 1000ml + Mơi trưng nuơi cy nm mc thu nhn chitinase: dùng mơi trưng Czapek – chitin nhưng khơng b sung agar. Các mơi trưng đưc hp kh trùng 121 0C trong 30 phút, đ ngui đn 40 0C – 50 0C thì b sung 50mg kháng sinh Streptomycine (kháng sinh phi đưc pha và b sung trong điu kin vơ trùng) và đ ra đĩa petri vơ trùng. 2.3.3. Phương pháp phân lp[2] + Cân 1 gam đt cho vào ci s thêm vào 10ml nưc ct vơ trùng, nghin nh. Pha lỗng dung dch đt các đ pha lỗng 10 1, 10 2, 10 3. + Dùng pipet man vơ trùng hút 0,5ml dung dch đt đã pha lỗng lên đĩa peptri cha mơi trưng phân lp. 23 ngày nhit đ phịng, ly ra quan sát các chng nm mc phân lp đưc ri cy chuyn nhiu ln đ làm thun các chng nm mc. 2.3.4. Phương pháp tuyn chn các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao [36] + Tin hành: c hun b mơi trưng Czapek (khơng cĩ agar) đã thay th glucose bng huyn phù chitin 1%. Cho vào mi ng nhim 10 ml mơi trưng đem hp kh trùng 121 oC sau 30 phút. Cy các chng nm mc (phân lp đươc) vào ng nghim. Nuơi cy lc 150 vịng / phút nhit đ phịng sau 14 ngày đem ly tâm loi b h si và bào t, thu nhn dch mơi trưng nuơi cy lng. + Ch tiêu theo dõi: đ tuyn chn đưc các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao chúng tơi da vào hai ch tiêu: hàm lưng đưng kh trong dch nuơi cy và hot tính chitinase ca tng chng.
25 2.3.5. Xác đnh hot đ chitinase theo phương pháp đnh lưng đưng kh vi thuc th DNS [9] • Nguyên tc Phương pháp da trên cơ s thy phân chitin bi chitinase thành N acetylglucosamine (GlcNAc). Hình 2.1. Phn ng phân ct chitin bng chitinase GlcNAc là mt loi đưng kh. Đưng kh trong mơi trưng kim nĩng s kh thuc th DNS (acid 3,5dinitrosalicylic) màu vàng thành acid 3amino5 nitrosalicylic màu đ da cam. Cưng đ màu ca hn hp phn ng t l thun vi đ hp th (OD) ti bưc sĩng 540nm và t l thun vi hàm lưng đưng kh trong mu. Da vào đ th chun vi nng đ ca Nacetylglucosamine tinh khit và OD 540nm s tính đưc hàm lưng đưng kh ca mu nghiên cu, qua đĩ bit đưc hot tính chitinase ca enzyme Đưng kh trong mơi trưng kim nĩng Acid 3,5dinitrosalicylic (màu vàng) Acid 3amino5nitrosalicylic (màu da cam) Hình 2.2. Phn ng ca đưng kh vi thuc th DNS
26 • Đnh nghĩa đơn v hot đ chitinase: Mt đơn v hot đ (UI) chitinase đưc đnh nghĩa là lưng enzyme xúc tác thy phân chitin to các đu kh tương ng vi 1g Nacetylglucosamine trong 1 phút dưi điu kin phn ng. • Hố cht - Thuc th DNS. - Dung dch huyn phù chitin 1%: ly 5g chitin hịa tan vào 50ml HCl đm đc. Khuy liên tc trong thi gian 3 phút 40 oC. Sau đĩ, va khuy va thêm t t 500ml nưc lnh (5 oC). Dch huyn phù thu li bng cách ly tâm (3500 vịng/phút trong 7 phút). Huyn phù đưc ra vi nưc ct nhiu ln cho đn pH thích hp ri căn th tích bng đm citrate pH 5. Sau đĩ bo qun lnh dch huyn phù. - Dung dch Nacetylglucosamine chun 500 g/ml pha trong nưc ct. • Tin hành Dng đưng chun Nacetylglucosamine : - T dung dch Nacetylglucosamine chun pha các dung dch Nacetyl glucosamine cĩ nng đ t 0250 g /ml ng s 1 2 3 4 5 6 GlcNAc chun (ml) 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 Nưc ct (ml) 3,0 2,7 2,4 2,1 1,8 1,5 Nng đ GlcNAc ( g /ml ) 0,0 50 100 150 200 250 Thuc th DNS (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - Lc đu, đun sơi cách thy trong 5 phút. Làm ngui, đo OD bưc sĩng 540nm. V đưng chun theo nng đ GlcNAc và OD 540 . Xác đnh hot đ chitinase ca mu enzyme : Hn hp phn ng gm: trn 1ml dch huyn phù chitin 1% và 1ml dch enzyme thêm 2ml đm citrate pH 5, lc đu. Hn hp phn ng đưc 35 oC trong thi gian 7 gi, phn ng đưc ngng li bng cách đun sơi cách thy trong 5 phút, đ ngui ti nhit đ phịng.
27 Sau đĩ ly tâm dch phn ng rút ra 3ml dch trong t mi ng. Thêm 1ml DNS, lc đu, đun sơi cách thy trong 5 phút, làm ngui đn nhit đ phịng và đo OD bưc sĩng 540nm. Tin hành vi mu kim chng tương t như mu thí nghim ch khác là enzyme đưc b sung khi đã đưc bt hot [13]. • Cách tính kt qu X . K . V HTch = (Cơng thc 1) v . t Trong đĩ: HTch: Hot tính chung chitinase (UI/ml). X : Lưng đưng kh sinh ra ( g/ml). K : H s pha lỗng. V : Tng th tích dung dch phn ng (ml). v : Th tích enzyme đem phn ng (ml). T : Thi gian phn ng (phút). Cơng thc xác đnh hot đ riêng HTch (Cơng thc 2) HTr = C Trong đĩ: HTr: Hot tính riêng chitinase (UI/mg protein). C: Nng đ protein (mg/ml). • Nng đ protein đưc xác đnh theo phương pháp Bradford [9] Nguyên tc: Các protein khi phn ng vi xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue CBB) s hình thành hp cht cĩ màu cĩ kh năng hp th ánh sáng bưc sĩng 595 nm, cưng đ màu t l vi nng đ protein trong dung dch. Phương pháp cĩ đ nhy cao cho phép phát hin ti vài g protein/ml, d thc hin và tit kim thi gian. Tin hành: Chun b dung dich albumin chun: cân chính xác 10mg Albumin pha trong 1ml nưc ct lc đu cho tan ht và gi 20 0C. Khi dùng pha lỗng 100 ln đ đưc dung dch Albumin 0,1mg/ml.
28 Pha thuc th Bradford: cân 50mg Coomassie Brilliant Blue và 25ml Ethanol 99 0 và 50ml acid phosphoric 85%, đnh mc ti 500ml bng nưc ct. Đng trong chai nâu cĩ nút đy kín. Tin hành lp đ th chun: ly 6 ng nghim đánh s t 1 đn 6 và cho vào đĩ các cht theo bng sau: Nng đ Dung dch Albumin Nưc ct Thuc th ng s Albumin 0,1 mg/ml (ml) (ml) Bradford (ml) ( g /ml ) 1 0,0 1,0 0,0 5,0 2 0,2 0,8 20 5,0 3 0,4 0,6 40 5,0 4 0,6 0,4 60 5,0 5 0,8 0,2 80 5,0 6 1,0 0,0 100 5,0 Lc đu và đ yên mt lúc, sau đĩ đem đo đ hp thu bưc sĩng 595 nm, t đĩ xây dng phương trình đưng protein. Xác đnh protein trong mu dch chit: ly 1ml dch chit cho vào ng nghim, ri thêm vào đĩ 5ml thuc th Bradford, đo OD 595 . Th giá tr OD 595 ca mu vào phương trình đưng chun protein. 2.3.6. Phương pháp đnh danh các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao + Đnh danh sơ b da vào mơ t hình thái các chng nm mc [4]. + Đnh danh theo phương pháp sinh hc phân t: gii trình t gen 28S rRNA và tra cu trên BLAST SEARCH các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao nht [10]. 2.3.7. Ti ưu hĩa mơi trưng và điu kin nuơi cy các chng nm mc tuyn chn nhm thu nhn chitinase cĩ hot tính cao Mơi trưng Czapek lng đưc la chn đ ti ưu thành phn dinh dưng và điu kin nuơi cy chng nm mc cĩ hot tính chitinase mnh nht. Thành phn dinh dưng ca mơi trưng nuơi cy: Kho sát nng đ chitin (t 0,1 đn 1%w/v), ngun dinh dưng nitơ (peptone, amonium sulfate, natri nitrate và urea 1%w/v) b sung vào mơi trưng nuơi cy [34][22][36][40].
29 Điu kin nuơi cy: Kho sát các kiu kin nuơi cy như nhit đ (t 28 o 55 C); pH ca mơi trưng nuơi cy (pH t 4 đn 10) dùng HCl 5% và NaCO 3 5% đ điu chnh pH; tc đ lc đưc kho sát ba mc 0; 150 và 300 (vịng/phút); ngưng thi gian nuơi cy đưc kho sát t 5 đn 20 ngày[19][34]. Ch tiêu theo dõi: HTch (UI/ml). 2.3.8. Nghiên cu xác đnh tác nhân ta phù hp [13] Tin hành: ta dch nuơi cy vi các tác nhân ta: ethanol, acetone, và amonium sulfate vi t l như sau: Th tích dch nuơi cy/th tích ethanol = 1/2, 1/3, 1/4 và 1/5 Th tích dch nuơi cy/th tích acetone = 1/1, 1/2, 1/3 và 1/4 (NH 4)2SO 4 các nng đ bão hịa: 70%, 80%, 90% và 95% Cho tác nhân ta t t vào dch nuơi cy, khuy đu, đ yên nhit đ thp (26oC) trong khong 2 gi đ enzyme ta ht. Ly tâm hoc lc đ thu ta. Hồ tan ta tr li vi nưc ct (thí nghim đnh lưng protein) hoc đm citrate pH5 (thí nghim xác đnh HTch) ri xác đnh hàm lưng protein theo phương pháp Bradford và xác đnh hot tính chitinase theo phương pháp đnh lưng đưng kh bng thuc th DNS . Ch tiêu theo dõi: hiu sut ta protein và HTch, tác nhân ta nào phù hp s ta đưc nhiu protein và cho enzyme cĩ hot tính chitinase cao. Phương pháp thm tích: Sử dụng màng thẩm tích cellophane, cắt màng theo chiều dài mong muốn, ngâm trong acid acetic 1% trong 1 giờ, sau đó chuyển qua nước cất. Tiếp tục luộc ống trong dung dịch EDTA kiềm (1% sodium carbonate, 10 -3M EDTA) trong 1 giờ, sau đó thay bằng nước cất. Màng được bảo quản trong o nước cất ở 4 C có bổ sung một ít sodium azide (NaN 3). Cột chặt một đầu túi, rĩt dung dịch enzyme cần loại muối vào túi, chừa lại một khoảng không khí (khoảng 10% thể tích), buộc chặt đầu còn lại. Túi thẩm tích được đặt vào dung dịch đệm citrate pH 5,0 trong một becher to, cột một đầu túi vào đũa thủy tinh gác ngang miệng becher. Dùng máy khuấy từ khuấy nhẹ nhàng liên tục. Thay dịch đệm vài
30 lần để loại muối. Sử dụng phương pháp này đối với các mẫu tủa bằng muối (NH 4)2SO 4. 2.3.9. Xác đnh tính cht cơ bn ca chitinase + Xác đnh nhit đ ti ưu cho hot tính chitinase: phn ng xác đnh hot tính chitinase đưc tin hành pH 5 trong 7 gi vi các mc nhit đ: 30 oC, 35 oC, 40 oC, 45oC, 50 oC, 55 oC 60 oC và 65 oC, ri xác đnh HTch [7]. + Xác đnh pH ti ưu cho hot tính chitinase: phn ng xác đnh hot tính chitinase đưc tin hành nhit đ ti ưu trong 7 gi vi dãy pH 3,0; 3,6; 4,2; 4,8; 5,4 và 6, ri xác đnh HTch. Thí nghim cĩ s dng đm citrate (pH 3,0 – 6,2) [7]. + Xác đnh nng đ cơ cht ti ti ưu cho hot tính chitinase: phn ng xác đnh hot tính chitinase đưc tin hành pH và nhit đ ti ưu trong 7 gi vi các các nng đ huyn phù chitin: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 và 80 mg/ml, ri xác đnh HTch [13]. + nh hưng ca ion kim loi đn hot tính chitinase: kho sát nh hưng ca 4 ion kim loi: Mn 2+ , Mg 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ vi ba nng đ 3; 5 và 7mM. Ly 1ml enzyme trn vi 1ml dung dch huyn phù chitin và 2 ml các dung dch mui vi 3 nng đ 6; 10 và 14mM pha trong đm citrate pH5 và nhit đ thích hp trong 7 gi. Mu đi chng đưc tin hành trong điu kin tương t như vy nhưng khơng cĩ mt dung dch mui. T kt qu xác đnh HTch, cĩ th kt lun nh hưng hot hĩa hay c ch ca các ion kim loi đn hot tính chitinase [13][7]. + Xác đnh thi gian phn ng ti ưu: tin hành phn ng thy phân huyn phù chitin điu kin ti ưu vi thi gian khác nhau: 1; 2; 3; 4; 5; 6 và 7 ngày ri xác đnh HTch ca tng ngày [7]. + Tinh sch chitinase bng phương pháp sc ký lc gel Sephadex [7], • Nguyên tc: Phương pháp lc gel Sephadex dùng đ tách các phân t trong mt hn hp theo kích thưc, hình dáng và khi lưng phân t. Các phân t cĩ kích thưc nh đ lt vào bên trong l gel thì b gi li, di chuyn chm qua ct. Trong khi đĩ các phân t cĩ kích thưc ln nm k h gia các ht gel s di chuyn nhanh hơn và đưc gii phĩng ra khi ct sm hơn các phân t nh.
31 • Dng c và hĩa cht: - ng nghim loi nh (đưc ngâm ty trùng trong dd sulfocromic trong 24 gi, ra sch, tráng nưc ct và sy khơ). - Máy quang ph 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway) - Dung dch NaN 3 0,02%. - Gel Sephadex G 50 (Kích thưc l 20 – 80 m, khong khi lưng phân t protein phân tách 1500 – 30000Da, h s trương n 911ml/g gel khơ): Cân 2g gel khơ ngâm trong lưng tha NaN 3 0,02% trong 24 gi đ gel trương n hồn tồn. - Dung dch đm citrate pH 5,0. - Dung dch HNO 3 50%. • Tin hành Ra ct bng HNO 3 50% ri ra li bng nưc ct nhiu ln, tráng bng acetone, đ khơ. Cho vào đáy ct lp bơng gịn thy tinh và lp giy lc bên trên đ to mt phng. Đĩng khĩa ct, dùng becher cho t t dung dch gel ngâm trong NaN 3 0,02% vào ct. Gel cho vào ct phi liên tc, tránh hin tưng phân lp. Khi gel đã cao hơn 10cm cĩ th m khĩa t t đ cho lưng nưc dư trong gel chy bt đi. Tip tc nhi ct cho đn khi lp gel cao khong 4/5 chiu dài ct. Sau khi nhi ct xong, ct mt ming giy lc đt lên trên mt lp gel nhm tránh hin tưng xáo trn b mt gel khi cho mu vào ct. Cho dung dch đm vào đ chy n đnh ct trong 30 phút. Chnh tc đ dịng khong 2ml/ 910 phút. Chn mu enzyme cĩ hot tính tt nht đ qua gel, trưc khi np cn chnh li nng đ protein cho thích hp khong 0,5 – 1 mg/ml. Đi lp dung dch bên trên va chm b mt gel thì khĩa ct. Hút 0,5ml dung dch enzyme cho vào ct. M khĩa cho dung dch chy tip. Khi mu enzyme va thm ht vào b mt gel, cho dung dch đm liên tc vào ct gel đ ra gii. Dch ra gii bên dưi đưc hng vào các ng nghim. Hng khong 2040 ng, mi ng 2ml. Đem các ng đo OD bưc sĩng 280nm. Da vào giá tr đo đưc, v thành các đnh (peak), gm
32 các ng nghim thuc cùng mt peak. Chn nhng peak cao đem xác đnh hàm lưng protein và xác đnh hot tính enzyme. + Tinh sch chitinase bng phương pháp sc ký ái lc dùng ct chitin [39]: • Nguyên tc: da trên nguên tc tương tác đc hiu gia enzyme và cơ cht. Dùng pH thích hp đ to ra ái lc giu protein đích (chitinase) vi cơ cht (chitin) và s ra gii protein dích ra kh cơ cht. • Dng c và hĩa cht: - ng nghim loi nh (đưc ngâm ty trùng trong dd sulfocromic trong 24 gi, ra sch, tráng nưc ct và sy khơ). - Máy quang ph 6405 UV/Vis spectrophotometer (Jenway). - Bt chitin tinh sch, bơng thy tinh. - Các loi đm: + NaCl 0.5M trong đm phosphate 20mM (pH6.0) (1). + Natri acetate 20mM (pH5,0) (2). + Natri acetate 20mM (pH4,0) (3). + Phosphate 1mM (pH6,0) (4). • Tin hành: - Cân khong 710 gram bt chitin ri ngâm trong nưc ct, sau12 gi khuy lc chit b phn dch ni, tip tc b sung nưc ct ri chit b phn dch ni cho đn khi loi b đưc ht các phn t chitin cĩ kích thưc nh. - Chun b ct: ra ct bng dung dch đm (3), dùng 1 ít bơng thy tinh nhi đáy ct, sau đĩ tim hành nhi chitin đã trương n vào ct. Sau khi nhi ct xong, ct mt ming giy lc hoc bơng thy tinh đt lên trên mt lp chitin nhm tránh hin tưng xáo trn b mt ct khi cho mu vào ct. Cho dung dch đm (1) vào đ chy n đnh ct trong khong 1530 phút. Chnh tc đ dịng khong 4s/git. - Np mu: trưc khi np cn chnh li nng đ protein cho thích hp khong 10 – 15 mg/ml bng cách ta ri hịa tan tr li bng đm (1). Đi
33 lp dung dch bên trên va chm b mt chitin thì khĩa ct. Hút khong 23 ml dung dch enzyme cho vào ct. M khĩa cho dung dch chy tip. - Chy sc ký: ln lưt chy các dung dch đm sau: + Đm (1) chy 3 ct: chitinase bm vào ct. + Đm (2) chy 3 ct: ra ri các protein ngoi tr chitinase. + Đm (3) chy cho đn khi kt thúc nhm ra gii chitinase. - Dch ra gii bên dưi đưc hng vào các ng nghim. Hng khong 40 60 ng, mi ng 2ml. Đem các ng đo OD bưc sĩng 280nm. Da vào giá tr đo đưc, v thành các đnh (peak), gom các ng nghim thuc cùng mt peak. Chn nhng peak cao đem xác đnh hàm lưng protein và xác đnh hot tính enzyme. - Trưc khi xác đnh hot tính chitinase cn tin hành thm tích bng đm (4). 2.3.9. X lý s liu: s liu thc nghim đưc x lý trên phn mm Microsoft Execel 2007 và MSTATC 2003.
Chương 3 KT QU VÀ THO LUN
34 3.1. Kt qu phân lp các chng nm mc cĩ hot tính chitinase ti Đăk Lăk Mơi trưng Czapek cĩ b sung huyn phù chitin đưc dùng đ phân lp các chng nm mc cĩ hot tính chitinase trong đt ti Đăk Lăk. Kt qu đã phân lp đưc 34 chng nm mc ký hiu t D1 đn D34 trong đĩ 19 chng (D1 – D19) đưc phân lp t đt đ và 15 chng (D20 – D34) t đt xám. Các khun lc mc lên đưc quan sát và mơ t trong bng 3.1. Bng 3 .1. Đc đim khun lc ca các chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk Đc đim khun lc Ký Sc t STT hiu Rìa khun Hình dng Màu sc Đ ni hịa chng lc tan 1 D1 Trịn cĩ vành mép Trng Nhung G gh 2 D2 Trịn cĩ vành mép Xanh rêu Lơng Li nhn 3 D3 R Trng Lưn sĩng G gh 4 D4 R Xám tro R G gh 5 D5 R Xám tro Lơng Lõm 6 D6 Trịn, mép vin răng cưa Xám Nhung Bng phng 7 D7 Trịn cĩ vành mép Trng Nhung Li nhn 8 D8 Trịn cĩ vành mép Xanh rêu Lơng Li nhn Nâu đen Ttrng, 9 D9 Dng đng tâm Nhung Phng xanh, cam 10 D10 Trịn cĩ vành mép Nâu Lơng Li nhn 11 D11 R Vàng Lưn sĩng G gh Ăn sâu vào 12 D12 R Đen Cành thch 13 D13 Đng tâm Xanh Lơng G gh 14 D14 Mép dng r Cam Lơng Li cong 15 D15 R Tr ng, đen Cành Dng nĩn Nâu đen 16 D16 Trịn cĩ vành mép Xanh rêu Lơng Li nhn
35 17 D17 Trịn cĩ vành mép Nâu Lơng Li cong 18 D18 Khơng đu Nâu Mép cĩ múi Phng Đen 19 D19 R Trng Lưn sĩng G gh 20 D20 Trịn cĩ vin mép Trng Nhung Li cong Nâu đen 21 D21 Trịn cĩ vin mép Xanh Cành Dng nĩn 22 D22 Trịn cĩ vin mép Nâu Lơng Li nhn 23 D23 Trịn cĩ vin mép Xanh Lơng Phng 24 D24 Trịn đng tâm Đen, trng Nhung Lõm 25 D25 Trịn, vin răng cưa Xanh nâu Bng phng Li cong 26 D26 R Nâu Cành G gh 27 D27 Trịn cĩ vin mép Xám tro Lơng Li cong 28 D28 Trịn cĩ vin mép Trng Lơng Li cong Bng 29 D29 R Trng Cành phng 30 D30 Trịn, vin mép răng cưa Xám tro Lơng Li cong 31 D31 Trịn cĩ vành mép Xanh rêu Lơng Li nhn 32 D32 R Xanh trng Lơng G gh 33 D33 R Trng Lưn sĩng G gh 34 D34 R Trng Cành Dng nĩn
37 nh 3.1. Khun lc ca 34 chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk 3.2. Tuyn chn và đnh danh các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao 3.2.1. Tuyn chn các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao Các chng nm mc cĩ hot tính chitinase đưc phân lp ti Đăk Lăk (34 chng) tip tc đưc nuơi cy đng lot trong mơi trưng cm ng (cĩ chitin) đ so sánh HTch. Kt qu thc nghim đưc ghi nhn trong bng 3.2 và hình 3.1. Bng 3.2. Hàm lưng đưng kh trong dch nuơi cy và hot tính chitinase ca các chng nm mc Hàm lưng đưng Chng Gía tr Hot tính chung kh trong dch nm mc OD 540nm chitinase (UI/ml) nuơi cy (mg/ml) D1 0,050 40,24 0,11 i D2 0,047 39,33 0,11 i D3 0,032 34,79 0,10 i D4 2,450 767,52 2,13b D5 0,010 28,12 0,08 i D6 0,016 29,94 0,08 i D7 0,016 29,94 0,08 i D8 0,011 28,42 0,08 i D9 2,935 914,48 2,54 a
38 D10 0,018 30,55 0,08 i D11 0,022 31,76 0,09 i D12 0,013 29,03 0,08 i D13 0,015 29,64 0,08 i D14 0,330 125,09 0,35 efg D15 0,030 34,18 0,09 i D16 0,015 29,64 0,08 i D17 0,280 109,94 0,31 fgh D18 0,940 309,94 0,86 d D19 0,430 155,39 0,43 ef D20 0,024 32,36 0,09 i D21 0,810 270,55 0,75 d D22 0,170 76,61 0,21 ghi D23 0,019 30,85 0,09 i D24 1,810 573,58 1,59 c D25 0,030 34,18 0,09 i D26 0,030 34,18 0,09 i D27 0,540 188,73 0,52 e D28 0,016 29,94 0,08 i D29 0,013 29,03 0,08 i D30 0,009 27,82 0,08 i D31 2,300 722,06 2,01 b D32 1,752 556,00 1,54 c D33 0,011 28,42 0,08 i D34 0,070 46,30 0,13 hi ANOVA z / CHNG NM CV(%) 15,38 Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test.
39 Các chng nm mc đưc nuơi cy trong mơi trưng cm ng s sinh ra chitinase. Enzyme này thc hin phn ng thy phân, ct huyn phù chitin thành các Nacetyl glucosamine (đưng kh) hoc các olygomer phân t thp cũng cĩ tính kh. Do đĩ, hàm lưng đưng kh trong dch nuơi cy cũng phn ánh kh năng sinh chitinase ca các chng nm mc. T bng s liu 3.2, cho thy trong dch nuơi cy các chng nm mc đu cĩ đưng kh. Điu này chng t tt c các chng nm mc trên cĩ kh năng sinh chitinase trong mơi trưng cm ng. Tuy nhiên, hàm lưng đưng kh trong dch nuơi cy ch là ch tiêu mang tính cht đnh tính. Đ tuyn chn các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao, chúng tơi căn c ch yu vào hot tính chitinase. Kt qu thí nghim cho thy HTch ca các chng chênh lch nhau khá ln, s sai khác này rt cĩ ý nghĩa v mt thng kê. C th cĩ 22 chng (t l 64,7%) cho hot tính chitinase rt thp (HTch 2,01UI/ml, phân hng: ba). Hình 3.1. Hot tính chitinase ca các chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk
40 Theo kt qu nghiên cu, các chng nm mc mà chúng tơi tuyn chn cĩ hot tính chitinase vưt tri so vi nhng nghiên cu ca các tác gi khác cũng trên đi tưng là vi nm . Nhĩm nghiên cu Đinh Minh Hip và cng s (2007) đã k ho sát hot tính các enzyme chitinase, Bglucanase, cellulase, pectinase, amylase, protease ca các chng Trichoderma phân lp ti vit Nam , kt qu chng chng nm mc cho hot tính chitinase cao nht cũng ch đt 18,2x10 2U/ml [6]. Parameswaran Binod và cng s (2005) nghiên cu sn xut và tinh sch chitinase t các chng Penicillium aculeatum cho kt qu hot tính chitinase ca chng cao nht là 1.86 UI/ml. N.N. Nawani (2004) và cng s cũng kho sát hot tính chitinase ca 3 chng Streptomyces sp . NK1057, Streptomyces sp . NK528 và Streptomyces sp . NK95 kt qu chng NK1057 cho hot tính chitnase cao nht là 294mU/ml. T s so sánh sơ b trên cho thy, nhiu chng nm mc phân lp ti Đăk Lăk cĩ hot tính chitinase rt cao, m ra trin vng s dng các chng nm này đ nuơi cy thu nhn chitinase thương mi cĩ hiu qu. Da vào kt qu sàng lc trên, chúng tơi chn ba chng nm mc D4, D9 và D31 cĩ hot tính chitinase cao nht đ tin hành các thí nghim tip theo. 3.2.2. Đnh danh các chng nm mc cĩ hot tính chitinase cao Ba chng nm mc D4, D9 và D31 đưc đnh danh sơ b da vào đc đim hình thái: + Chng D4 thuc ging Trichoderma cĩ đc đim: bào t hình trịn, khơng thành chui. Cung sinh bào t dài ch phân nhánh đu cùng và khác bit rõ rt vi si nm dinh dưng. Nhánh bên phân nhánh ngn và dày mang nhng th hình chai cm li ngn và mp, mi th hình chai ch mang mt bào t đu cùng. + Chng D9 thuc ging Penicillium cĩ đc đim: cung sinh bào t hơi phình ra đu cùng, ngn phân nhánh thành chùm. Đu cùng cung sinh bào t cĩ mang các th bình, bào t hình cu đn thuơn dài nm trên th bình. + Chng D31 thuc ging Paecilomyces cĩ đc đim: cung sinh bào t phình to phân bng, thon đu cùng. đu cùng mang bào t. Bào t hình cu, dng chui dài.
41 A B* C D FE A B C D E A B C D E nh 3.2.Hình thái ca ba chng nm mc D4, D9 và D31. (A: Chng nm mc nuơi cy trên mơi trưng PGA trong đĩa petri sau 3 ngày; B: khun lc; C: cung mang bào t quan sát vt kính 10X; D: cung mang bào t quan sát vt kính 40X; E: bào t. B *: b mt chng nm mc D4). Các chng nm mc này tip tc đưc đnh danh theo phương pháp sinh hc phân t da vào gen 28S rRNA. Gen 28S rRNA ca các chng nm mc cĩ trình t nucleotid như sau: + Gen 28S rRNA ca chng D4: GGGGTTCTCTCCGGTGCACTTCGCCGCGTTCAGGCCAGCATCAGTT CGTCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTCCGGGAGTGTT ATAGCCCGTTGCATAATACCCTGCGGTGGACTGAGGACCGCGCATCTGC AAGGATGCTGGCGTAATGGTCACCAGCGACCCGTCTTGAAAC + Gen 28S rRNA ca chng D9: GTCCGAGCCGAAGCGCGTTCCTCGGTCCGGGCTGGCCGCATGGCACC CTCGGCTATAAGACGCCCCGGGGGGCGTTACATTCCGAGGGCCTTTGACC GGCCGCCCAAACCGACGCTGGCCCGCCCGCGGGGAAGTACACCGGCCCG AAGGCCGGCTGAACCCCGCGAGCGAGTCTGGTCGCAAGCGCTTCCCTT
42 + Gen 28S rRNA ca chng D31: CGTTCTCGCTGGTGCACTCCGCCGGGTTCAGGCCAGCATCAGTTCG CCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTACGGGAGTGTTAT AGCCCGTTGCATAATACCCTGGGGCGGACTGAGGTTCGCGCTCCGCAA GGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGAAAC T trình t nucleotid ca gen 28S rRNA, tin hành tra cu trên BLAST SEARCH. Kt qu đnh danh cho thy chng D4 là Trichoderma hamatum , D9 là Penicillium janthinellum và D31 là Paecilomyces lilacinus . 3.3. Ti ưu hĩa mơi trưng và điu kin nuơi cy các chng nm mc tuyn chn nhm thu nhn chitinase cĩ hot tính cao 3.3.1. nh hưng ca nng đ chitin trong mơi trưng nuơi cy Trong trưng hp này chitin va là ngun carbon va là cơ cht cm ng sinh chitinase, do đĩ vic kho sát đ tìm ra nng đ chitin trong mơi trưng nuơi cy ti ưu cho vic sinh tng hp chitinase ca các chng nm mc là rt quan trng. Kt qu thí nghim đưc ghi nhn trong bng 3.3 và minh ha hình 3.2. Kt qu thí nghim cho thy nng đ chitin thích hp đ nuơi cy nm mc Trichoderma hamatum là 0,25%, trong khi đĩ Penicillium janthinellum và Paecilomyces lilacinus li sinh chitinase cĩ hot tính cao nht nng đ chitin 0,5%. Các chng nm mc này sinh chitinase mnh nng đ huyn phù chitin b sung thp hơn so vi mt s nm mc: Trichoderma harzianum [34] và Penicillium aculeatum NRRL 2129 [40]. M. H. ElKatatny và cng s (2000) khi kho sát la chn ngun carbon phù hp đã phát hin ra chitin là cơ cht cm ng tt nht Trichoderma harzianum sinh tng hp chitinases trên nn mơi trưng Czapek và nng đ chitin 0,75% là ti ho cho tng hp chitinase và chitin 1% là tt nht cho tng hp B1,3glucanase. Tương t, trong nghiên cu ca Parameswaran Binod và cng s (2006) v la chn ngun chitin phù hp cho quá trình tng hp chitinase. Khi b sung huyn phù chitin 1%, hot tính chitinase ca Penicillium aculeatum NRRL 2129 mnh nht (4.62 U/gds).
43 Bng 3.3. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các nng đ chitin khác nhau: Đơn v tính UI/ml Nng đ chitin z 0,10 0,25 0,50 0,75 1,00 (%) Anova Nm mc (%) CV Trichoderma 1,8b 1,97 a 0,94 b 0,97 b 0,98 b 15,02 hamatum Penicillium 1,40 c 1,74 bc 3,11 a 2,18 b 1,19 c 12,08 janthinellum Paecilomyces 1,18 b 1,27 b 2,49 a 1,47 b 1,42 b 13,39 lilacinus Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Hình 3.2. nh hưng ca nng đ chitin đn hot tính chitinase 3.3.2. nh hưng ca ngun nitơ b sung vào mơi trưng nuơi cy Nitơ là ngun dinh dưng quan trng cho quá trình sinh tng hp protein, do đĩ s tác đng đn quá trình sinh chitinase. Tuy nhiên, mi loi vi sinh vt li cĩ
44 kh năng đng hĩa các ngun nitơ khác nhau. Vì vy, vic la chn ngun nitơ phù hp cũng rt cn thit. Hình 3.3. nh hưng ca ngun nitơ đn hot tính chitinase Các chng nm mc đưc nuơi cy trên hai ngun nitơ khác nhau: nitơ hu cơ (peptone) và nitơ vơ cơ (natrinitrate, ure và amonium sulfate). Kt qu thí nghim đưc ghi nhn bng 3.4 và minh ha qua hình 3.3. Bng 3.4. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy b sung các ngun nitơ khác nhau: Đơn v tính UI/ml Ngun nitơ Amonium z 1% ĐC Natrinitrate Peptone Ure sulfate Nm mc Anova CV (%) (%) CV Trichoderma 4,35 a 2,08 c 1,67 d 2,78 b 1,77 cd 5,86 hamatum Penicillium 2,64 b 1,85 c 1,71 c 4,66 a 2,49 b 6,34 janthinellum Paecilomyces 2,60 b 2,53 b 1,67 c 3,58 a 1,66 c 8,10 lilacinus Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Kt qu thc nghim đưc x lý anova và trc nghim phân hng Ducan theo phn mm MSTATC cho thy c 3 ngun nitơ vơ cơ b sung vào mơi
45 trưng nuơi cy đu làm gim kh năng sinh tng hp chitinase ca c ba chng nm, trong đĩ amonium sulfate làm gim HTch nhiu nht. Trong khi đĩ, peptone li cĩ tác đng tích cc đn quá trình sinh chitinase ca Penicillium janthinellum và Paecilomyces lilacinus , làm gim hot tính chitinase đi vi Trichoderma hamatum . Nhìn chung, peptone là ngun dinh dưng nitơ cĩ tác đng tt hơn c các ngun nitơ khác đưc s dng trong thí nghim. Các chng nm mc này cĩ kh năng đng hĩa ngun nitơ rt khác bit so vi nm mc Penicillium aculeatum NRRL 2129 nhưng khá tương đng vi Trichoderma harzianum trong nghiên cu ca Parameswaran Binod và cng s (2006) [40]. Trong khi các ngun nitơ natrinitrate, ure và anonium sulfate là khơng phù hp cho quá trình sinh tng hp chitinase ca Trichoderma harzianum và ba chng nm ca chúng tơi, thì chúng li là ngun nitơ tt nht đi vi Penicillium aculeatum NRRL 2129. 3.3.3. nh hưng ca nhit đ nuơi cy Các chng nm mc đưc nuơi cy trong mơi trưng Czapek lng b sung chitin 0,25% (nuơi cy Trichoderma hamatum ), 0,5% (nuơi cy Penicillium janthinellum và Paecilomyces lilacinus ) và peptone 1%, pH mơi trưng nuơi cy 6,5, thi gian 14 ngày. Kt qu thc nghim đưc ghi nhn bng 3.5 và minh ha trong hình 3.4. Kt qu cho thy nhit đ nuơi cy ti ưu cho Trichoderma hamatum và Paecilomyces lilacinus sinh chitinase cĩ hot tính cao nm ngưng khá thp (28 oC). Trong khi đĩ nhit đ nuơi cy ti thích cho nm Penicillium janthinellum sinh chitinase li mc cao hơn (35 oC). Ngưng nhit đ nuơi cy ti ưu ca Trichoderma hamatum và Paecilomyces lilacinus đ sn sinh chitinase cĩ hot tính cao khá tương đng vi nhit đ ti ưu (t 2530 oC) ca nm mc Trichoderma harzianum [34].
46 Bng 3.5. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các nhit đ khác nhau: Đơn v tính UI/ml Nhit đ o z ( C) 28 oC 35 oC 45 oC 55 oC Anova CV (%) Nm mc Trichoderma 4,78 a 2,56 b 2,39 b 2,23 b 5,04 hamatum Penicillium 2,71 b 5,49 a 2,68 b 2,55 b 4,71 janthinellum Paecilomyces 3,46 a 1,75 b 2,18 b 2,06 b 7,33 lilacinus Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Hình 3.4. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn hot tính chitinase 3.3.4. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy
47 Các chng nm mc đưc nuơi cy trong mơi trưng Czapek lng vi thành phn dinh dưng và điu kin nuơi cy ti ưu cho tng chng. Kt qu thc nghim đưc ghi nhn trong bng 3.6 và hình 3.5. Bng 3.6. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các pH khác nhau: Đơn v tính UI/ml pH z z CV 4 5 6 7 8 9 10 (%) Nm mc Anova Trichoderma 2,69 a 2,83 a 2,42 a 1,77 b 1,33 b 1,27 b 1,26 b 10,15 hamatum Penicillium 2,88 b 3,10 ab 3,18 a 2,60 c 1,36 d 1,30 d 1,26 d 4,13 janthinellum Paecilomyces 3,24 a 3,39 a 2,44 b 1,39 c 1,39 c 1,27 c 1,26 c 6,63 lilacinus Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Kt qu thí nghim cho thy c ba chng nm cĩ s tương đng v pH mơi trưng nuơi cy ti ưu cho quá trình sinh chitinase (pH ti thích đu vùng axit đn axit yu). pH nuơi cy ti ưu t 46 đi vi Trichoderma hamatum, t 56 đi vi Penicillium janthinellum và t 45 đi vi Paecilomyces lilacinus. Vùng pH opt ca ba chng này tương t như pH opt ca Trichoderma harzianum trong nghiên cu ca M. H. ElKatatny và cng s (2000), pH opt ca chng nm này là 6 [34].
48 Hình 3.5. nh hưng ca pH mơi trưng nuơi cy đn hot tính chitinase 3.3.5. nh hưng ca tc đ lc Nm mc thuc vi sinh vt hiu khí, trong quá trình sinh trưng và phát trin rt cn cĩ oxy cho quá trình trao đi cht. Vic khuy lc nhm cung cp thêm oxy hịa tan và phân tán đu các yu t dinh dưng trong mơi trưng nuơi cy. Vì vy, vic xác đnh s vịng lc phù hp là rt quan trng khi nuơi cy nm mc trong mơi trưng lng đ thu nhn enzyme cũng như các cht cĩ hot tính sinh hc khác. Các chng nm mc đưc nuơi cy trong mơi trưng Czapek lng vi thành phn dinh dưng và điu kin nuơi cy ti ưu cho tng chng. Nuơi cy trong điu kin lc các mc: 0; 150 và 300 vịng/phút. Kt qu thí nghim đưc th hin bng 3.7 và hình 3.6. Bng 3.7. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy các tc đ lc khác nhau: Đơn v tính UI/ml Tc đ lc z (vịng/phút) 0 150 300 Anova CV (%) Nm mc
49 Trichoderma hamatum 2,06c 2,66 b 4,91 a 3,12 Penicillium janthinellum 2,57 b 3,24 a 2,38b 6,34 Paecilomyces lilacinus 3,52b 3,96a 2,17 c 4,40 Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Kt qu thí nghim cho thy tc đ lc cĩ nh hưng rõ rt ti hot tính chitinase ca các chng nm mc. Penicillium janthinellum và Paecilomyces lilacinus cho hot tính chitinase cao nht t đ lc 150 vịng/phút. Trong khi đĩ Trichoderma hamatum li thích hp vi tc đ lc cao 300 vịng/phút. M. H. El Katatny và cơng s (2000) trong thí nghiêm ti ưu diu kin nuơi cy lc cho chng Trichoderma harzianum sinh chitinase hot tính enzyme cũng đt cc đi khi nuơi cy lc 150 vịng/phút [34]. 3.3.6. nh hưng ca thi gian nuơi cy Các chng nm mc đưc nuơi cy trong điu kin ti ưu vi các khong thi gian khác nhau t 5 đn 20 ngày, kt qu thí nghim đưc ghi nhn bng 3.8 và hình 3.7. Hình 3.6. nh hưng ca tc Hình 3.7. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn đ lc đn hot tính chitinase hot tính chitinase
50 Bng 3.8. Hot tính chitinase ca 3 chng nm mc trong mơi trưng nuơi cy trong các khong thi gian khác nhau: Đơn v tính UI/ml Thi gian (ngày) z 5 8 11 14 17 20 Anova Nm mc CV (%) Trichoderma 2,13 g 2,62 f 4,55 c 3,42 e 2,94 f 2,90 f hamatum Penicillium 2,14 g 5,57 b 6,95 a 6,78 a 4,84 c 4,04 d 3,96 janthinellum Paecilomyces 2,20 g 2,60 f 4,57 c 4,90 c 2,59 f 2,86 f lilacinus Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong bng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Sau 5 ngày , hot tính chitinase trong dch nuơi cy ca c ba chng tương đương nhau (khong 2UI/ml). Hot tính chitinase ca Penicillium janthinellum tăng rt mnh 8 ngày nuơi cy và đt cc đi ngày th 11 (6,95UI//ml). Trong khi đĩ, hot tính chitinase ca Trichoderma hamatum và Paecilomyces lilacinus li tăng chm giai đon đu (58 ngày), tăng mnh và đt cc đi ngày th 11. Nhìn chung thi gian nuơi cy ti ưu các chng nm mc đ thu nhn chitianse cĩ hot tính cao là 11 ngày (đi vi Trichoderma hamatum ), 1114 ngày (đi vi Penicillium janthinellum và Paecilomyces lilacinus ). Thi gian nuơi cy ti ưu ca ba chng nm này dài hơn so vi mt s chng nm trong các nghiên cu đã đưc cơng b: Trichoderma harzianum [34] thi gian ti ưu là 7 ngày, Tương t, Trichoderma harzianum TUBF 927 [40] thi gian tt nht là 150 gi cịn Penicillium funiculosum NRRL 1768, Penicillium pinophilum NRRL 1066 và Penicillium aculeatum NRRL 2129 [36] thì thi gian tơi ưu ch cn 7296 gi. Sau quá trình ti ưu, hot tính chitinase tăng lên đáng k, tăng hơn 2,1 ln chng Trichoderma hamatum (t 2,13UI/ml lên 4,55UI//ml), hơn 2,7 ln chng Penicillium janthinellum (t 2,54 lên 6,95 UI/ml), gn 2,5 ln chng Paecilomyces lilacinus (t 2,01 lên 4,90UI/ml) và thí nghim này cũng cho thy
51 hot tính chitinase ca Penicillium janthinellum vưt tri so vi hai chng cịn li. Nm mc Penicillium janthinellum đưc la chn cho các thí nghim tip theo. 3.4. Tác nhân ta phù hp cho quá trình tách chit chitinase t nm mc Penicillium janthinellum Đ tách chit enzyme ra khi dch mơi trưng nuơi cy, thì phi tin hành kt ta. Cĩ nhiu tác nhân ta khác nhau: dung mơi hu cơ (ethanol, acetone, isopropanol), mui trung tính (amonium sulfate, Natri clorua). Mi loi tác nhân ta cĩ nh hưng khác nhau ti hot tính và hiu sut ta mi loi enzyme. Do đĩ, vic la chn tác nhân ta phù hp s giúp enzyme gi đưc hot tính hoc gim hot tính mc ti thiu. Nuơi cy chng nm mc Penicillium janthinellum trong điu kin ti ưu, sau 11 ngày ly tâm ly dch trong làm nguyên liu cho thí nghim. Đ xác đnh tác nhân ta phù hp, chúng tơi tin hành ta dch nuơi cy vi 3 tác nhân ta ph bin: ethanol, acetone và amonium sulfate, hịa tan ta tr li vi đm hoc nưc ct bng th tích dch chit thơ ban đu. Sau đĩ, xác đnh hàm lưng protein và hot tính chitinase. Kt qu đưc ghi nhn trong Bng 3.9. Bng 3.9. nh hưng ca tác nhân ta đn hiu sut thu hi và hot tính chitinase ca nm mc Penicillium janthinellum HTr Hàm lưng Hiu sut HTch Tác nhân T l ta, Chitinase protein ta protein Chitinase ta % mui (UI/mg (mg/ml) (%) (UI/ml) protein) T l th 1/2 0,112 45,71 e 0,89 e 7,95 tích ethanol 1/3 0,171 69,80 d 1,87 d 10,94 96 o/dch 1/4 0,231 94,30ab 3,61 b 15,49 nuơi cy 1/5 0,239 97,55 a 3,54 b 14,81 f e T l th 1/1 0,103 42,04 0,92 8,93 tích Acetone 1/2 0,193 78,78 c 2,71 c 14,04 /dch nuơi 1/3 0,201 82,04 c 2,81 c 13,98 cy 1/4 0,199 81,22 c 2,79 c 14,02
52 Phn % 70% 0,159 64,90 e 2,56 c 16,10 Amonium 80% 0,226 92,24 b 4,06 a 17,96 sulfate bão 90% 0,231 94,29 ab 4,16 a 18,01 hịa 95% 0,237 96,73 ab 4,09 a 17,26 Anova z CV (%) 2,66 4,20 Dch chit thơ cĩ hàm lưng protein là 0,245mg/ml, HTch chitinase là 5,03 UI/ml và hot tính riêng là 2,053 UI/mg protein Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt ct khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. T kt qu thc nghim cho thy, các tác nhân ta khác nhau, t l ta khác nhau cĩ nh hưng ti hiu sut ta và hot tính enzyme chitinase. Trong ba tác nhân ta, acetone cho hiu sut ta và hot tính chitinase thp nht cịn ethanol và amonium sulfate cho hiu sut ta protein ngang nhau, nhưng hot tính chitinase khi ta bng amonium sulfate cao hơn hn so vi ta bng ethanol. Vy, amonium sulfate đưc la chn là tác nhân ta phù hp nht đ thu nhn chitinase. Tuy nhiên, ta bng ethanol li tin li hơn, vì b qua đưc bưc thm tính sau khi ta.
53 Hình 3.8. nh hưng ca tác nhân ta đn hiu sut thu hi protein và hot tính chitinase ca nm mc Penicillium janthinellum 3.5. Xác đnh mt s tính cht cơ bn ca chitinase t nm mc Penicillium janthinellum 3.5.1. Xác đnh nhit đ ti ưu cho hot tính chitinase Nhit đ nh hưng ln đn vn tc ca phn ng cũng như là đ bn ca enzyme. Đa s enzyme vi sinh vt cĩ nhit đ ti thích là 40 oC, tuy nhiên tùy vào ngun gc tách chit mà nhit đ ti ưu cĩ th thay đi. Đ xác đnh nhit đ ti ưu, chúng tơi tin hành kho sát dãy nhit đ phn ng t 30 oC 65 oC. Kt qu thí nghim đưc th hin hình 3.9. Kt qu thí nghim cho thy nhit đ nh hưng rõ đn hot tính chitinase. S khác bit v hot tính chitinase các nghim thc khác nhau là rt cĩ ý nghĩa, trong đĩ cĩ hai nghim thc cho hot tính chitinase cao nht là nghim thc 50 oC và 55 oC. Vy, nhit đ ti ưu cho hot tính chitinase ca nm mc Penicillium janthinellum là 5055oC. Kt qu này tương t vi kt qu ca Nguyn Quang Nhân và cng s (2009) nghiên cu thu nhn chitinase t m cao su Hevea brasilliensis [13], nhĩm tác gi đã xác đnh đưc nhit đ ti ưu cho enzyme này là 55 oC. Cũng nghiên cu trên vi nm
54 (Pennicillum aculeatum NRRL 2129), Parameswaran Binod và cng s (2005) đã ti ưu nhit đ phn ng cho chitinase ca vi nm này và kt qu nhit đ ti thích cũng là 50 oC [36]. Tuy nhiên, nhit đ ti ưu cho hot tính chitinase ca nm Penicillium janthinellum cao hơn so vi nm Trichoderma asperellum trong nghiên cu ca Nguyn Bo Hưng và cng s (2010) [7], nhit đ ti thích cho hot tính chitinase ca chng nm này là 40 oC. Hình 3.9. nh hưng ca nhit đ phn ng đn hot tính chitinase 3.5.2. Xác đnh pH ti ưu cho hot tính chitinase pH ti ưu ca chitinase t vi sinh vt bin thiên khá rng t 3,58,0. Nhiu nghiên cu đã đưc cơng b trong và ngồi nưc cho thy pH opt ca chitinase tách chit t nm mc thưng trong khong 4,05,5. Vì vy, chúng tơi la chn dãy pH t 3,06,0 đ kho sát và đm citrate đưc s dng đ chnh đ pH. Kt qu thc nghim đưc minh ha hình 3.10. S sai khác v hot tính chitinase gia pH 4,85,4 so vi các pH khác là rt cĩ ý nghĩa v mt thng kê. Kt qu cũng cho thy pH opt là t 4,85,4. pH này khá trùng khp vi khong pHopt 56 trong thí nghim ti ưu điu kin nuơi cy ca chính chng nm này.
55 Hình 3.10. nh hưng ca pH đn hot tính chitinase 3.5.3. Xác đnh nng đ cơ cht ti ưu cho hot tính chitinase Khi các điu kin ca phn ng như đ pH, nhit đ, nng đ enzyme, đưc c đnh, thì hot tính xúc tác s ph thuc vào nng đ cơ cht. Nng đ cơ cht quá thp hoc quá cao đu khơng cĩ li cho phn ng, dn đn hiu sut phân gii cơ cht khơng cao. Vì vy, kho sát đ tìm nng đ cơ cht phù hp là rt quan trng. Tin hành các phn ng thy phân nng đ chitin: t 10 đn 80 mg/ml trong 7gi. Sau đĩ, xác đnh hot tính chitinase, kt qu đưc th hin trong hình 3.11. Trong giai đon đu ca phn ng khi nng đ chitin cịn thp (1040mg/ml) thì hot tính chitinase tăng mnh cùng vi s tăng ca nng đ ca cơ cht, hot tính chitinase tăng lên hơn 1,9 ln trong giai đon này. Tip sau đĩ hot tính chitinase khơng tăng khi tip tc tăng nng đ chitin. Lúc này, nng đ cơ cht cĩ th đã dư tha. Vy, trong điu kin phn ng, nng đ chitin 40mg/ml là ti ưu.
56 Hình 3.11. nh hưng ca nng đ chitin đn hot tính chitinase 3.5.4. nh hưng ca mt s ion kim loi đn hot tính chitinase Tin hành phn ng trong điu kin 50 oC, pH 4,8, chitin 40mg/ml b sung ion kim loi (nng đ 3; 5 và 7mM) trong các nghim thc. Kt qu đưc th hin trong Bng 3.10 và hình 3.12. Bng 3.10. nh hưng ca mt s ion kim loi đn hot tính chitinase Ion kim ĐC Mn 2+ Mg 2+ Cu 2+ Fe 2+ loi Nng đ 0 3 5 7 3 5 7 3 5 7 3 5 7 mM HTch 4,1bc 4,3b 4,9a 5,1a 1,9ef 1,7f 0,8g 3,7cd 3,3d 2,3e 4,2b 4,4b 4,3b UI/ml % tăng/ gim + + + - - - - - - + + + 0 HTch so 4,9 19,5 24,4 53,7 58,5 80,5 9,8 19,5 43,9 2,4 7,3 4,9 vi ĐC Anova z CV (%) 5,31 Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01. Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test.
57 Hình 3.12. nh hưng ca mt s ion kim loi đn hot tính chitinase các nng đ b sung khác nhau ca mi loi ion cũng nh hưng đn hot tính chitinase. Đi vi ion Mn 2+ , nng đ 3mM làm tăng hot tính khơng đáng k (4,9%) so vi đi chng. Tuy nhiên, khi tăng nng đ Mn 2+ ti 57mM, HTch tăng khá mnh (19,524,4%). S sai khác v HTch gia hai nghim thc Mn 2+ 5mMMn 2+ 7mM là khơng đáng k (cùng hng a), do đĩ nng đ Mn2+ nh nht cĩ th làm tăng hot tính chitinase mc ln nht là 5mM. Ion Mg 2+ làm gim HTch mnh nht và kt qu cũng cho thy khi tăng nng đ ion này thì hot tính emzyme gim càng mnh ti nng đ Mg 2+ 7mM làm gim ti hơn 80% HTch so vi đi chng. Tương t, ion Cu 2+ cũng làm gim khá mnh HTch so vi đi chng, gim gn 44% nghim thc Cu 2+ 7mM. Riêng ion Fe 2+ khi b sung vào phn ng, cĩ làm tăng HTch nhưng khơng đáng k so vi đi chng, ion này ch làm tăng t 2,44,9%HTch. Tĩm li, trong bn loi ion kim loi đưc kho sát, hai ion Mg 2+ và Cu 2+ cĩ tác dng làm gim hot tính chitinase so vi đi chng. Trong khi đĩ, hai ion Mn 2+ và Fe 2+ li cĩ tác dng hot hĩa làm tăng hot tính chitinase, tuy nhiên Fe 2+ ch làm tăng nh hot tính chitinase. Kt qu này cĩ trùng khp vi kt qu nghiên cu ca Nguyn Quang Nhân và cng s (2009) nghiên cu thu nhn chitinase t m cao su Hevea
58 brasilliensis. Nhĩm tác gi đã kho sát mưi ion kim loi và đã xác đnh đưc các ion Al 3+ , Cu 2+ , Fe 3+ , Hg +, Mg 2+ và Zn 2+ cĩ tác dng kìm hãm chitinase, các ion Co 2+ , Fe 2+ , Mn 2+ cĩ tác dng hot hĩa chitinase cịn ion Ca 2+ khơng cĩ tác đng rõ đn hot tính chitinase [13]. Tuy nhiên, kt qu nghiên cu này li rt khác bit so vi nghiên cu ca. Nguyn Bo Hưng và cng s (2010) khi đánh giá mt s đc tính ca chitinase t Trichoderma asperellum , nhĩm tác gi cũng kho sát trên 10 loi ion và kt lun các ion Al3+, Ca 2+ , Fe 2+ làm tăng mnh hot tính chitinase, ion Zn 2+ c ch mnh hot tính enzyme này cịn các ion Na +, Mg 2+ , Cu 2+ , Co 2+ , Fe 3+ nh hưng khơng đáng k đn hot tính chitinsae [7]. 3.5.5. Xác đnh thi gian phn ng ti ưu Tin hành phn ng thu phân huyn phù chitin điu kin ti ưu vi thi gian khác nhau t 17 ngày ri xác đnh hot tính chitinase. Kt qu thí nghim đưc ghi nhn trong Bng 3.11. Bng 3.11. nh hưng ca thi gian phn ng đn hot tính chitinase Thi gian phn ng 1 2 3 4 5 6 7 z Anova (ngày) (%)CV Nng đ đưng kh 2,48 e 3,73 d 4,72 c 5,21 b 5,74 a 5,69 a 5,79 a 3,46 (mg/ml) HTch (UI/ml) 3,45 a 1,73 b 1,38 c 0,72 d 0,18 e 3,41 Z* khác bit cĩ ý nghĩa mc P<0,01 HTch : chitinase đã mt hn hot tính Các tr s cĩ các ch cái ging nhau trong cùng mt hàng khơng cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng Ducan’s Multiple Rang test. Kt qu thí nghim cho thy hot tính chitinase gim dn theo thi gian. Ngày th nht HTch là 3,45 UI/ml ngày th hai HTch gim hơn 50%, đn ngày th sáu thì chitinase đã mt hồn tồn hot tính. Vy thi gian phn ng ti ưu đ thu sn phm là 5 ngày.
59 Hình 3.13. nh hưng ca thi gian phn ng đn hot tính chitinase Hitoshi Sashiwa và cng s (2002) nghiên cu sn xut NacetylD glucosamine t achitin s dng enzyme thơ ca Aeromonas hydrophila H 2330 , kt qu ghi nhn thi gian ti ưu đ thu nhn sn phm là 810 ngày [41]. Kt qu này cĩ khác bit so vi nghiên cu ca chúng tơi. S khác bit này cĩ th do các chitinase thu nhn t ngun gc khác nhau hoc do s khác bit v điu kin phn ng, 3.6. Tinh sch chitinase Emzyme thơ đưc tinh sch bng hai phương pháp ph bin: sc ký lc gel (gel sephadex G50) và sc ký ái lc dùng ct chitin (chitin column). Dch nuơi cy đưc ly tâm sau đĩ ta bng amonium sulfate ri hịa tan tr li đ cĩ dung dch cĩ nng đ protein khong 0,5 – 1 mg/ml sau đĩ tin hành thm tích. Dùng gel sephadex G50 đ tinh sch chitinase theo các bưc đã trình bày mc 2.3.8. Sau khi lc gel, các ng hng đưc đo OD bưc sĩng 280nm đ kim tra s cĩ mt ca protein sau đĩ dng đ th da trên giá tr OD đo đưc. T đ th, cĩ th xác đnh đưc các đnh (peak) thu đưc qua lc gel. Trn các phân đon thuc cùng mt peak ri xác đnh hot tính chitinase. Kt qu đưc th hin qua hình 3.14.
60 Hình 3.14. Kt qu đo mt đ quang dch protein sau lc gel Sephadex T đ th cho thy cĩ 3 peak tương ng vi 3 loi protein. Peak 1 và peak 2 phân tách khá rõ chng t phân t lưng ca chúng chênh lch nhau ln. Trong khi đĩ peak 2 và peak 3 li khá gn nhau. Kim tra hot tính chitinase thì ch cĩ peak 1 là cĩ hot tính chitinase, điu này cĩ nghĩa là các protein trong peak 2 và 3 là nhng protein khơng mong mun đưc to ra đng thi trong quá trình nuơi cy. Peak 1 tip tc đưc xác đnh hàm lưng protein theo phương pháp Braford. Kt qu phân tích hàm lưng protein, HTch và HTr trưc và sau khi lc gel đưc ghi nhn trong bng 3.12. Bng 3.12. Hàm lưng protein, HTch, HTr trưc và sau khi lc gel Hàm lưng HTch HTr protein (g/ml) Chitinase Chitinase (UI/ml) (UI/mg) Trưc khi lc gel 229 3,813 16,65 Sau khi lc gel 56 2,18 38,93 Như vy sau lc gel, HTch gim t 3,813UI/ml cịn 2,18UI/ml, trong khí đĩ HTr li tăng gp hơn 2,3 ln t 16,65UI/mg lên ti 38,93UI/mg.