Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở ĐăkLăk

pdf

234 trang huongle 3120

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở ĐăkLăk", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_van_phan_lap_va_tuyen_chon_mot_so_chung_vi_khuan_co_din.pdf

Nội dung text: Luận văn Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định nitơ tự do Azotobacter sp. trên một số loại đất ở ĐăkLăk

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN LÊ QUANG DŨNG PHÂN LP VÀ TUYN CHN MT S CHNG VI KHUN C ĐNH NITƠ T DO Azotobacter sp. TRÊN MT S LOI ĐT ĐĂK LĂK LUN VĂN THC SĨ SINH HC BUƠN MA THUT, NĂM 2011
LI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cu ca riêng tơi, các s liu và kt qu nghiên cu trong lun văn là trung thc, đưc các đng tác gi cho phép s dng và chưa đưc cơng b trong bt kỳ mt cơng trình nào khác. H tên tác gi Lê Quang Dũng
LI CM ƠN Trong quá trình hc tp nghiên cu và đ hồn thành bn lun văn này, tơi xin bày t lịng bit ơn chân thành và kính trng đn: PGS.TS. Nguyn Anh Dũng, ngưi trc tip hưng dn khoa hc, đã tn tình ch dn tơi hồn thành lun văn tt nghip. PGS. TS. Nguyn Hu Hip, TS. Võ Th Phương Khanh, Thy cơ giáo trong b mơn sinh hc khoa KHTN&CN, cùng tp th các thy cơ giáo ca trưng đi hc Tây Nguyên đã giúp đ tơi trong sut quá trình hc tp nghiên cu và đĩng gĩp nhng ý kin quý báu cho tơi hồn thành lun văn này. Nhng anh ch lp cao hc Sinh Hc Thc Nghim khĩa 3, đã cùng tơi san s nhng bun vui, cùng nhau hc tp và trao đi kin thc trong quá trình làm đ tài. Các em sinh viên CN Sinh K07 và các anh ch làm vic trong b mơn sinh hc thc vt, b mơn khoa hc v đt, đã sn sàng giúp đ tơi trong quá trình thc hin đ tài. Cui cùng tơi xin chân thành cm ơn nhng nhà khoa hc trong ngành, các đng nghip, bn bè và ngưi thân đã đng viên giúp đ và to điu kin thun li cho tơi trong quá trình hc tp và nghiên cu làm lun văn tt nghip. Đăk Lăk, tháng 10 năm 2011. Tác gi Lê Quang Dũng
DANH MC CÁC BNG 2.1 Nng đ IAA thành lp đ th đưng chun 29 3.1 Ký hiu, đa đim phân lp các chng vi khun trên mơi trưng Ashby 34 3.2 Mơ t Hình thái khun lc ca 24 chng vi khun phân lp đưc 36 3.3 Kh năng c đnh nitơ ca các chng vi khun Azotobacter sp. 40 3.4 Kh năng sinh IAA ca các chng vi khun Azotobacter sp. 42 3.5 nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn s lá cây ci ngt 44 3.6 nh hưng các chng vi khun Azotobacter sp . đn chiu cao cây ci ngt 45 3.7. nh hưng ca các chng VK Azotobacter sp. đn khi lưng r cây ci 47 3.8. nh hưng ca các chng VK Azotobacter sp. đn năng sut cây ci ngt 48 3.9. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp . đn s lá cây ci ngt 50 3.10. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao cây ci ngt 52 3. 11. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn khi lưng r cây ci ngt 53 3.12. nh hưng ca mt đ vi khun lên din tích lá cây ci ngt 55 3.13. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp . đn năng sut cây ci ngt 56 3.14. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn nuơi cy t các ngun carbon khác nhau. 58 3.15. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn nuơi cy các nng đ glucose khác nhau 61 3.16. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca bn chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn nuơi cy trên các khon nhit đ khác nhau 63 3.17. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn đưc nuơi cy các pH khác nhau 65 3.18. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng vi khun Azotobacter sp . tuyn chn nuơi cy các thi gian khác nhau 67
M ĐU 1. Tính cp thit ca đ tài Gia đt, vi sinh vt và cây trng cĩ mi quan h tác đng qua li ln nhau. Quá trình hình thành đt và đ phì ca đt chu nh hưng ca các yu t vt lí, hĩa hc và vi sinh vt. Vi sinh vt tng hp và gii phĩng vào đt nhng cht hu cơ cn thit to đ phì cho đt, ngưc li đt là mơi trưng sng cn thit cho vi sinh vt, đt và vi sinh vt cùng tác đng rt ln đn cây trng, đc bit cung cp ngun dinh dưng, mt trong các ngun dinh dưng quan trng cho cây trng là ngun nitơ [8]. Ngưi ta nhn thy mun thu hoch 12 t ht trên mi hecta, cây trng ly đi khi đt khong 30 kg nitơ [3]. Theo thng kê hàng năm các sn phm nơng nghip trên th gii ly đi khi đt khong 100 – 110 triu tn nitơ (G. Colar và Greenland) [3]. Trong khi đĩ lưng phân nitơ hĩa hc hin nay ch bù đp đưc mt phn lưng nitơ mà cây ly đi khi đt. Lm dng quá mc vic s dng phân hĩa hc làm đt xu đi, mt cân đi các cht dinh dưng và làm gim h vi sinh vt cĩ ích, hơn na vic sn xut phân nitơ hĩa hc cịn gp nhiu khĩ khăn, giá thành khá cao. Vn đ đt ra là làm th nào đ b sung lưng dinh dưng nitơ cho đt mt cách cĩ hiu qu nht, va tit kim đưc chi phí sn xut, bo v đưc mơi trưng. Mt trong nhng gii pháp đang đưc áp dng đ ci to đt hin nay là s dng phân bĩn vi sinh vt. Nhĩm vi sinh vt trong phân cĩ tác dng ci thin đ phì, cân bng dinh dưng trong đt, ci thin các tính cht lý, hĩa ca đt, và đc bit hn ch ơ nhim mơi trưng, cũng như ơ nhim mơi trưng nưc do quá trình ra trơi [1]. Trong t nhiên, ngồi ngun nitơ đưc to ra cho đt t quá trình amon hĩa, quá trình nitrat hĩa, ngun nitơ cịn đưc to ra t quá trình c đnh nitơ phân t đưc thc hin bi các nhĩm vi sinh vt trong đt, trong đĩ cĩ s đĩng gĩp ca nhĩm vi khun c đnh nitơ t do Azotobacter sp. Các vi sinh vt thuc nhĩm
này cĩ kh năng chuyn hĩa nitơ phân t thành các hp cht cha nitơ mà cây trng cĩ kh năng hp th đưc [3]. Azotobacter sp. là mt loi vi khun hiu khí, sng t do trong đt, chúng cĩ kh năng c đnh đm cao và khơng ph thuc vào cây ch. Ngồi đc đim trên thì mt s chng thuc chi này cịn cĩ kh năng sinh tng hp nên IAA (cht kích thích sinh trưng thc vt). Chính nh đc đim quan trng đĩ vi khun Azotobacter sp. đưc ng dng rng rãi trong các ch phm phân bĩn vi sinh vt làm tăng năng sut cây trng. Vit Nam đã cĩ mt s cơng trình nghiên cu v vi sinh vt c đnh nitơ t do trên mt s loi đt đ làm phân vi sinh, nhưng hin nay chưa cĩ mt nghiên cu nào v thành phn lồi thuc chi Azotobacter sp. trên mt s loi đt Đăk Lăk. Xut phát t thc t đĩ, chúng tơi tin hành nghiên cu đ tài: “Phân lp và tuyn chn mt s chng vi khun c đnh nitơ t do Azotobacter sp. trên mt s loi đt Đăk Lăk”. 2. Mc tiêu ca đ tài Tuyn chn đưc mt s chng Azotobacter sp. c đnh đm cao trên mt s loi đt Đăk Lăk. Đánh giá hiu qu ca mt s chng vi khun Azotobacter sp. đi vi s sinh trưng ca cây ci ngt ( Brassica juncea ) 3. Ý nghĩa ca đ tài Ý nghĩa khoa hc Đ tài gĩp phn phân lp, tuyn chn mt s chng vi khun Azotobacter sp. bn đa cĩ kh năng c đnh đm cao trên mt s loi đt Đăk Lăk, gĩp phn vào cơng cơng tác bo tn đa dng vi sinh vt Đăk Lăk và Tây Nguyên. Ý nghĩa thc tin Đ tài là cơ s cho vic la chn các chng Azotobacter sp. trên mt s loi đt Đăk Lăk cĩ hot tính c đnh nitơ cao đ sn xut phân vi sinh cĩ hiu
qu, nâng cao đ phì nhiêu ca đt, hn ch bĩn phân hĩa hc, tăng năng sut cây trng và gĩp phn phát trin mt nn nơng nghip sinh thái bn vng.
Chương 1. TNG QUAN TÀI LIU 1.1. Ngun nitơ trong t nhiên + Trong nưc, nitơ ch yu dng hp cht ca NH 4 , NO 2 , NO 3 . Trong đt cĩ 2 dng nitơ tn ti đĩ là nitơ vơ cơ trong các mui khống và nitơ hu cơ trong xác, cht bài tit t sinh vt. Các hp cht cha nitơ trong xác, cht bài tit ca đng vt và thc vt b mt s loi nm và vi khun phân gii. Trong đt amon hu như chuyn hĩa tồn b thành hp cht nitrat. Phn ln hp cht nitrat đưc thc vt hp th, phn cịn li b mt đi do mưa ra trơi và tác dng ca phn nitrat hĩa. Hp cht đm mà thc vt hút t đt mt phn như gc r đưc tr li đt, phn cịn li đưc đng vt và thc vt d dưng tiêu th, li bin thành các cht bài tit tr li đt. Nhng cht hu cơ này dưi tác dng ca nhiu loi vi sinh vt, nm b kh thành đm dng hu hiu. Nitơ trong khơng khí tn ti ch yu dng nitơ phân t (N 2) chim khong 80%, dng nguyên t kép (N 2) đưc khĩa cht vi nhau thơng qua liên kt cng hĩa tr bn vng (N≡N). Mc dù rt cn nguyên t này, nhưng cây ch cĩ + th hp th đưc nitơ dng NO 3 và NH 4 [3]. Đ s dng đưc ngun nitơ ln t khơng khí cĩ 2 con đưng chính là hĩa hc và sinh hc. Hĩa hc: K t năm 1920, phương pháp cơng nghip Haber Bosch đã giúp con ngưi phá v liên kt ba này. Bin pháp này địi hi phi thc hin nhit đ rt cao (450 – 500 oC), áp sut là 125 atm và Fe 3+ là cht xúc tác. Các hp cht nitơ đưc tng hp hĩa hc trên cung cp cho cây trng mt ngun nitơ ln và n đnh. Tuy nhiên, bên cnh vic s dng phân đm tng hp hĩa hc cho nơng nghip cĩ th làm tăng năng sut cây trng thì cũng đem li nhng tác hi cũng khơng nh, vì trung bình ch cĩ 40 – 50 % lưng đm bĩn đưc cây hp thu, phn cịn li gây ơ nhim mơi trưng đt, nưc, khơng khí t đĩ gây hi thm chí là tiêu dit các sinh vt cĩ li. Các hp cht cha nitơ ca phân bĩn hĩa hc gây hi rt ln đi vi cá, đng vt thân mm và k c con ngưi.
Sinh hc: Nh các vi sinh vt cĩ th tit ra enzyme nitrogenase đ thc hin quá trình sinh hc đc bit quá trình c đnh nitơ. Nhĩm vi sinh vt cĩ kh năng thc hin quá trình này đưc gi là các vi sinh vt c đnh nitơ. Vic s dng phân bĩn vi sinh làm đt khơng b ơ nhim, kh năng gi m tt hơn, tăng cưng kh năng ci to đt do các h sinh vt cĩ ích hot đng mnh làm cho đt tơi xp hơn, cây d hút cht dinh dưng hơn. Ngồi ra, cịn cĩ các con đưng to nitơ khác như do sm chp hay cháy [12]. 1.2. Vai trị ca nitơ đi vi thc vt Nitơ là thành phn quan trng cu to nên các phân t hu cơ như protein, dip lc, ATP Hàm lưng nitơ trong thành phn các cht khơ ca thc vt dao đng t 1 – 3%. Tuy hàm lưng trong cây thp nhưng nitơ cĩ vai trị sinh lý đc bit quan trng trong đi sng sinh trưng phát trin và hình thành năng sut ca cây trng. Thiu nitơ, cây sinh trưng kém, chlorophyll khơng đưc tng hp đy đ, lá vàng, đ nhánh và phân cành kém, sút gim hot đng quang hp nên năng sut gim. Nu tha nitơ cũng s nh hưng nghiêm trng đn sinh trưng, phát trin và năng sut ca cây trng. như cây sinh trưng mnh thân lá tăng nhanh nên cây rt yu, d đ, thu hoch gp nhiu khĩ khăn. 1.3. Quá trình chuyn hĩa nitơ trong t nhiên 1.3.1. Quá trình khống hĩa Quá trình khống hĩa là quá trình phân hy xác hu cơ dưi tác đng ca qun th vi sinh vt thành các cht khống hịa tan hay các cht khí và ta nhit, tùy thuc vào điu kin khống hĩa mà cho các sn phm khác nhau. Giai đon này cĩ s tham gia ca các chng vi sinh vt nitrat hĩa như Nitrosomonas và Nitrobacter nhng vi khun tham gia vào quá trình oxy hĩa nhng hp cht cha nitơ thành nitrat (NO 3 ), mt dng thích hp đ cho cây trng hp thu.
Vi khun amon hĩa + Hp cht hu cơ NH 4 Vi khun nitrat hĩa NH + 4 NO 2 Nitrosomonas Nitrobacter NO 2 NO 3 1.3.2. Quá trình phn nitrat hĩa Là quá trình phân hy chuyn hĩa hp cht nitrat trong điu kin ym khí dưi tác dng ca vi sinh vt to thành nitơ. Vi khun phn nitrat hĩa NO N 3 2 1.3.3. Quá trình c đnh nitơ phân t Quá trình này đưc thc hin do các vi sinh vt c đnh nitơ như Rhizobium sng cng sinh r cây h đu hay Azotobacter sng t do, s bin đi N 2 trong khơng khí thành NH 3, t NH 3 s tng hp ra các hp cht cha nitơ khác cung cp cho cây trng và đng thi làm giàu thêm nitơ cho đt. Đ quá trình này xy ra thì phi cĩ lc kh mnh, ATP và thc hin điu kin k khí (do ch trong điu kin này enzyme nitrogenase mi hot đng). Nitrogenase H2O + N2 + H 2 NH 3 NH 4 Vi khun c đnh đm Cơ ch hĩa sinh ca quá trình c đnh nitơ ca vi khun sng t do trong đt.
Cơ ch hĩa sinh ca quá trình c đnh N 2 ca vi sinh vt cho đn nay vn chưa đưc sáng t hồn tồn, nhưng đa s các nhà nghiên cu đng ý vi gi thuyt cho rng NH 3 là sn phm đng hĩa sơ cp ca N 2 và cĩ th nêu ra gi thuyt v 2 con đưng c đnh N 2 ca vi khun sng t do trong đt như sau: Trong cơng nghip, nh các cht xúc tác nên năng lưng dùng cho phn ng c đnh N 2 đưc gim nhiu, ch vào khong 16 – 20 Kcal/M, song lưng năng lưng vn cịn ln so vi trong cơ th sinh vt. Tc đ phn ng nhanh chĩng trong t bào vi sinh vt nhit đ thp nh cĩ h thng hydrogenase hot hĩa H 2 và nitrogenase hot hĩa N 2. Năm 1961 – 1962, ngưi ta đã tách t Clostridium pasteurrianum hai tiu phn hot hĩa H 2 và N 2. Sau này ngưi ta tìm thy Azotobacter cũng cĩ các tiu phn đĩ. Trong quá trình hot hĩa này cĩ s tham gia ca 2 nguyên t khống Mo và Fe.
Ngun hydro đ kh N 2 cĩ th là hydro phân t (H 2). Trong trưng hp này thì dưi tác dng ca hydrogenase, đin t đưc chuyn theo h thng: Ngun cho đin t và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyn đin t cĩ s tham gia tích cc ca feredoxine (Fd). Fd là cu ni gia 2 h enzyme hydrogenase và nitrogenase đ c đnh N 2. S c đnh N 2 ca vi khun nt sn cĩ th xy ra theo sơ đ phc tp hơn. Trong các nt sn cĩ mt cht cĩ bn cht HEM rt ging vi hemoglobin trong máu gi là leghemoglobin. Nĩ d dàng liên kt vi O2 đ bin thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin ch đưc to nên khi vi khun sng cng sinh vi cây b đu, cịn khi nuơi cy tinh khit các Rhizobium s khơng to leghemoglobin và khơng c đnh đưc N 2. Nhng nghiên cu gn đây v quá trình c đnh N 2 cho thy quá trình c đnh này địi hi: Cĩ s tham gia ca enzyme nitrogenase. Cĩ th coi đây là nhân t chìa khĩa cho quá trình này. Enzyme này hot đng trong điu kin ym khí. Cĩ lc kh mnh vi th năng kh cao (NAD, NADP, )
Cĩ năng lưng ATP đ và cĩ s tham gia ca nguyên t vi lưng. Nhĩm hot đng ca enzyme nitrogenase cĩ cha Mo và Fe. Vì vy s dng Mo và Fe cho cây h đu thưng cĩ hiu qu rt cao. Tin hành trong điu kin ym khí. Các cht kh là NADH 2 và Fd cùng vi năng lưng do hơ hp, quang hp ca cây ch cung cp. S c đnh N 2 cn rt nhiu năng lưng, cn 16 ATP đ kh 1 N 2. NH 3 to thành trong quá trình c đnh N 2 đưc s dng d dàng vào quá trình amine hĩa các cetoacid đ tng hp mt cách nhanh chĩng các acid amine, t đĩ tham gia vào tng hp protein và nhiu quá trình trao đi cht khác. Phn ng c đnh nitơ đưc xúc tác bi enzyme nitrogenase theo phương trình sau: + N2 + 8 H + 8 e +16 ATP → 2 NH 3 + H 2 +16 ADP +16 Pi Như phương trình trên, nitrogenase xúc tác cho phn ng kh N 2 thành NH 3 trong s hin din ca ATP và cht kh như dithionite trong phịng thí nghim hay ferredoxin trong cơ th sng. Nitrogenase là mt phc h enzyme đưc cu to bi 2 thành phn, đĩ là protein cĩ phân t nh. Mt thành phn gi là protein st – molypden (Mo – Fe protein) cịn gi là thành phn I, thành phn kia gi là protein st (Fe protein), cịn gi là nitrogenase kh hay thành phn II. Thành phn I và thành phn II ca nitrogenase đu rt mn cm vi oxy, vì vy nên hot đng c đnh nitơ ca vi sinh vt din ra trong điu kin k khí [18]. 1.4 . Tng quan v vi khun c đnh Nitơ Ngưi ta nhn thy mun thu hoch 12 t ht trên mi hecta, cây trng ly đi khi đt khong 30 kg nitơ [3]. Theo thng kê hàng năm các sn phm nơng nghip trên th gii ly đi khi đt khong 100 – 110 triu tn nitơ (G. Colar và Greenland) [3]. Trong khi đĩ lưng phân nitơ hĩa hc hin nay ch bù đp đưc mt phn lưng nitơ mà cây ly đi khi đt, nhng tn tht v nitơ đưc bù đp bi mt quá trình sinh hc đc bit gi là quá trình c đnh nitơ do vi sinh vt thc hin, chúng cĩ kh năng chuyn hĩa nitơ phân t trong khơng khí thành các
hp cht cha nitơ và làm giàu thêm ngun đm trong đt, cĩ th xp chúng thành ba nhĩm ln: + Nhĩm vi sinh vt sng cng sinh vi thc vt. + Nhĩm vi khun sng t do. + Nhĩm vi khun lam. 1.4.1. Nhĩm Vi sinh vt sng cng sinh vi thc vt 1.4.1.1. Vi khun nt sn cng sinh vi cây b đu Nhà khoa hc Hà Lan M.W. Beijrinck đã phân lp đưc lồi vi khun sng cng sinh trong nt sn r mt cây thuc b đu và ơng đt tên là Bacillus radicicola , vi khun này đưc xp vào chi riêng Rhizodium . Trên mơi trưng đc, vi khun nt sn thưng cĩ khun lc trơn bĩng, nhy, vơ màu. Khi cịn non t bào ca chúng cĩ dng hình que hoc cu 0,5 – 0,9 x 1,2 – 3,0m, cĩ kh năng di đng nh tiêu mao; khi già t bào tr nên bt đng kích thưc ln phân nhánh gi là th gi khun [3], [8]. Đây là các lồi hiu khí, tuy nhiên vi khun nt sn vn cĩ th s dng đưc ngay c trong trưng hp ch cĩ mt áp lc oxy rt thp khong 0.01atm. đa s chúng thích hp pH = 6,5 – 7,5, b cn tr khi pH= 4,5 – 5,0 hoc ln hơn 8.0 nhit đ thích hp 24 – 26 oC, 37 oC s phát trin ca chúng b cn tr [6], [7]. Vi khun nt sn xâm nhim vào r cây b đu thơng qua lơng hút, đơi khi thơng qua vt thương v r. Ngưi ta nhn thy mun xâm nhim tt thì vi khun nt sn cn đt ti 104 t bào/gam đt. Dưi nh hưng ca vi khun, r tit ra enzyme polylacturonase phân hy thành lơng hút, to điu kin cho vi khun xâm nhp vào r. Hng năm vi khun nt sn cng sinh trong r cây b đu cĩ th làm giàu cho đt khong 50 – 600 kg nitơ/ha [3].
1.4.1.2. Vi sinh vt c đnh đm cng sinh trong mt s cây khơng thuc b đu Ngồi nhng loi cây thuc b đu thì nhng lồi cây khơng thuc b đu cũng cĩ kh năng to nt sn như: mt s thc vt thuc ngành ht trn: Bowenia, Cycas mt s thc vt hai lá mm: Coffee, Coriaria , Ngồi ra mt s thc vt cịn cĩ kh năng to nt sn trên lá. Qua nghiên cu cho thy, ngồi vi khun nt sn mt s lồi x khun thuc chi Frankia (cng sinh trong r lồi Casuarina ) nhiu lồi nm r (khun căn hay mycorhiza ) cũng cĩ kh năng c đnh nitơ phân t, to nt sn. Cĩ nhiu nghiên cu cho thy, nh tác dng ca nm r mà đt thơng Pinus radiala M hng năm làm giàu thêm khong 50 kg nitơ/ha [3]. Ngày nay, các nhà khoa hc cĩ th phân lp, nuơi cy vi khun c đnh nitơ cng sinh Rhizobium đ sn xut ch phm Nitragin đ x lý ht ging đu trưc khi gieo. Vi khun s đưc nuơi cy trên mơi trưng thích hp sau đĩ hp ph vào cht mang là đt, than bùn đ bo qun và s dng. 1.4.2. Nhĩm Vi khun c đnh nitơ t do 1.4.2.1. Vi khun c đnh nitơ t do k khí Clostridium Clostridium đưc phát hin ln đu tiên bi Vinogradxki (1893). T bào Clostridium hình que cĩ kích thưc 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 m, cĩ th đng riêng r hoc kp đơi thành chui ngn. Khi cịn non cĩ kh năng di đng, khi già mt kh năng di đng, bào t nm trung tâm, khun lc nhn và trng cĩ kh năng chu đưc nhit đ cao và khơ hn [5]. Vi khun Clostridium cĩ nhiu lồi cĩ kh năng c đnh nitơ phân t như: Cl. pasteurianum, Cl. butylicum nhưng lồi cĩ kh năng c đnh đm cao nht là Clostridium pasteurianum . Chúng cĩ kh năng c đnh đưc 5 – 10 mg nitơ khi tiêu th ht 1g carbon. Phm vi hot đng c đnh nitơ ca Clostridium trong khong pH khá rng 4,7 – 8,5, ti thích là 6,9 – 7,3.
1.4.2.2. Vi khun c đnh nitơ t do hiu khí Nhĩm này gm hai chi chính là Beijerinskia sp. và Azotobacter sp. 1.4.2.2.1. Nhĩm vi khun thuc chi Beijerinskia sp. Beijerinskia sp. là lồi vi khun hiu khí c đnh nitơ rt ging vi Azotobacter sp. Chúng đưc phân lp bi R. J. Starkey (1939), t bào cĩ hình dng thay đi như hình cu, hình que, hình bu dc. Beijerinski là vi khun gram âm, khơng sinh bào t và bào xác, đc đim chung ca vi khun thuc chi này là chu chua cao. Cĩ kh năng sng tt trong mơi trưng acid (pH=3), và nhit đ t 16 – 37 OC. Trên mơi trưng vơ đm, sau 3 ngày nuơi cy xut hin khun lc nhy. Li. Vi khun cĩ kh năng c đnh đưc 16 – 20 mg nitơ khi đng hĩa ht 1g dinh dưng carbon. Ngồi kh năng c đnh nitơ chúng cịn cĩ kh năng tng hp các cht kích thích sinh trưng cho cây trng. 1.4.2.2.2. Nhĩm vi khun thuc chi Azotobacter sp. Azotobacter sp. đuc phân lp ln đu tiên vào năm 1901 (M. Beijerinck). Chúng thuc vi khun hiu khí nhưng chúng cĩ th phát trin trong điu kin k khí. Hu ht các lồi Azotobacter sp. đu sng d dưng. Azotobacter sp. là vi khun gram âm, khơng sinh bào t cĩ kh năng c đnh nitơ t do. Khi chưa trưng thành t bào thưng cĩ hình que, kích thưc 2,0 – 7.0 x 1,0 – 2,5 m, sinh sn bng cách phân ct, di chuyn nh tiêm mao. Khi trưng thành mt kh năng di chuyn, kích thưc thu nh thành dng cu đưc bao bc bi mt lp nhy. Trong mơi trưng khơng cha nitơ, Khun lc ca Azotobacter sp . cĩ dng cu li, nhn bĩng, cĩ khi nhăn nheo. Khi nuơi cy trong mơi trưng đc. Khun lc cĩ màu hng hoc nâu đen, sinh sc t hình quang màu vàng lc hoc lam lc, sc t khuch tán vào mơi trưng [5], [16].
Azotbacter sp. rt nhy cm vi đ m ca đt và hàm lưng ca các nguyên t khống cĩ trong đt (P, K, MO, B, Cu ) Nhiu nghiên cu cho bit Azotobacter sp. cĩ th phát trin đươc trên mơi trưng cĩ pH trong khong 4,5 – 9. quá trình c đnh nitơ ch đưc thc hin trong khong pH 5,5 – 7,2. Nhit đ thích hp nht t 26 – 30 oC [6], [7]. Các chng phân lp t t nhiên cĩ kh năng c đnh 10 – 15 mg nitơ khi tiêu th ht 1g dinh dưng Carbon. Mt s nịi tuyn chn cĩ kh năng c đnh ti 30 mg/1 g dinh dưng Carbon. Trong đt, Azotobacter sp. tp trung vùng đt xung quanh r cây. Ngồi kh năng cung cp dinh dưng nitơ cho cây nĩ cịn cĩ kh năng kích thích ny mm, kích thích sinh trưngTrong đt, Azotobacter sp. thưng ph bin các chng sau: + Azotobacter chrococum: Kích thưc t bào 2,0 x 3,1 micromet, cĩ kh năng di đng khi cịn non. Khi già hình thành nang xác, khun lc cĩ màu nâu hoc đen khi v già, khơng khuch tán ra mơi trưng [24], [25]. + Azotobacter beijerinckii: Cĩ kích thưc 2,4 x 4,6 m. Khơng cĩ kh năng di đng và hình thành nang xác. Khun lc khi già cĩ màu nâu sáng, sc t khơng khuch tán ra mơi trưịng nuơi cy. + Azotobacter vinelandii: T bào cĩ kích thưc 1,5 x 3,4 m, cĩ kh năng di đng và hình thành nang xác. Khun lc màu lc huỳnh quang, sc t khuch tán vào mơi trưng [19], [26]. + Azotobacter agilis: T bào cĩ kích thưc 2,8 x 3,3 m, cĩ kh năng di đng, khơng hình thành nang xác, khun lc màu vàng lc huỳnh quang, sc t khuch tán vào mơi trưng [2].
1.4.3. Nhĩm vi khun lam Năm 1928, Drewes (Đc) ln đu tiên chng minh mt cách xác đáng kh năng c đnh nitơ ca ba loi khun lam và đã phân lp chúng mt cách thun khit. Đa s các lồi khun lam cĩ kh năng c đnh nitơ sng t do trong đt, trong nưc nhưng cũng cĩ mt s sng cng sinh trong thc vt. Đây là vi sinh vt hiu khí, chúng thích hp phát trin trong mơi trưng trung tính hoc kim. Nhit đ thích hp t 28 – 30oC. Chúng cĩ kh năng cung cp cho đt khong 50 kg nitơ/ha/năm [2]. Ngồi các nhĩm vi sinh vt c đnh nitơ ch yu nĩi trên ngưi ta cịn thy nhiu vi sinh vt thuc nhĩm khác cũng cĩ kh năng đng hĩa nitơ như: To xanh Lc, mt s đi din ca nm men và nm mc (Saccharomyces apiculatus, Oidium Lactic. ) Cĩ th nĩi vi sinh vt đĩng vai trị ht sc quan trng đi vi nơng nghip trong vic cung cp đm sinh hc cho đt. Vn đ đt ra cho các nhà khoa hc hin nay là nghiên cu phương pháp nuơi cy hiu qu nht đ tăng sinh khi t bào. T đĩ ng dng vào nơng nghip, hưng đn mt nn sn xut nơng nghip sinh thái vng bn trong c nưc nĩi chung và tnh Tây Nguyên nĩi riêng. 1.5. Tình hình nghiên cu ngồi nuc Hiu qu ca vic nhim ch phm Azotobacter sp. cho đt và ht ging, cây con đã đưc chng minh trên các thí nghim đng rung. Theo nghiên cu ca Puneet (1998) cho thy vic nhim Azotobacter sp. kích thích ny mm ca ht, kích thích ra r và sinh trưng, năng sut lúa mỳ, ngơ tăng 10 – 15 % so vi đi chng [27], [28] Tng kt các kt qu nghiên cu ca Nht Bn, Hoa Kỳ, Trung Quc, n Đ cho thy s dng ch phm Azotobacter cĩ th cung cp cho cây trng t 30 – 60 kg nitơ /ha/năm và tng lưng nitơ do vi sinh vt tng hp trên hành tinh cĩ th đt đn 240 triu tn/năm. Vi khun c đnh nitơ t do
Azotobacter cịn cĩ kh năng tng hp B1, giberellin, cytokinin, IAA kích thích tăng trưng cây trng. Theo Subba Rao (1988) cơng b n Đ tin hành bĩn ch phm Azotobacter cho lúa mì 3 ln trong năm: Ln 1: bĩn 20 kg ch phm Azotobacter /ha vào tháng 4 – 5. Ln 2: bĩn 15 kg/ha vào tháng 7. Ln 3: bĩn 15 kg/ha vào tháng 10. Vi qui trình bĩn như vy, cĩ th đáp ng đưc 30 % nhu cu nitơ ca cây trng đ gim lưng bĩn phân hĩa hc, gĩp phn phát trin bn vng nơng nghip. Bagyaraj và Menger (1978) đã nghiên cu tương tác gia Azotobacter chroococcum và các vi sinh vt vùng r và sinh trưng ca cà chua. Kt qu cho thy cà chua đưc vi chng c đnh nitơ Azotobacter s tăng sinh khi khơ ca cà chua lên 65 % so vi đi chng. Fulchieri (1994) nghiên cu s dng 3 chng Azospirillum đ x lý ht cho ngơ. Kt qu cho thy đã làm chiu cao cây, tăng sinh khi và tăng năng sut ngơ lên 59 % so vi đi chng [16]. Nghiên cu ca Puneet (1998) cũng cho thy nu bĩn phi hp Azotobacter sp. vi các chng phân gii photpho như Aspergillus niger s làm tăng năng sut lúa mì tăng 17,7 %, trong khi Azotobacter ch tăng 9 % [20]. Kapoor cũng cho kt qu tương t khi phi hp chng Azotobacter sp. vi các chng phân gii phosphat như Bacillus sp., Pseudomonas sp . Thí nghim làm tăng năng sut lúa, bơng vi lên 10 – 20 % [21]. El–Komy (2005) nghiên cu phi hp hai chng c đnh nitơ Azospirillum và phân gii lân Bacillus megaterium x lý cho lúa mì. Kt qu cho thy hàm lưng nitơ trong thân lúa mì ca các thí nghim cĩ x lý hai chng này tăng 37 – 53 %; hàm lưng photpho trong thân tăng 48,6 %; hàm lưng kali tăng
10 – 14,3 % so vi đi chng khơng x lý. Kt qu nghiên cu cũng cho thy x lý phi hp hai chng cĩ tác dng cng hưng, tt hơn x lý đơn chng [18]. Zemrany (2006) nghiên cu s dng chng A. lipoferum cho ngơ. Kt qu cho thy khi s dng chng này đã làm gim 50 % lưng nitơ cho cây mà năng sut vn đm bo. 1.6. Nghiên cu trong nưc Nhm mc tiêu phát trin nơng nghip sinh thái bn vng và ng dng cơng ngh sinh hc vào nơng nghip, trong nhng năm gn đây Vit Nam cĩ khá nhiu nghiên cu v Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh hc [5]. Phm Bích Hiên và cng s (2003) đã nghiên cu 10 chng Azotobacter ca Vit Nam và nhn thy rng ngồi kh năng c đnh nitơ chúng cịn cĩ kh năng sinh tng hp cht kích thích sinh trưng IAA. Nhit đ thích hp ca các chng này là 25 – 30 oC, pH thích nghi rng t 5,5 – 8,0 [8]. Phm Ngc Lan (1999) đã phân lp đưc 37 chng Azotobacter trên đt gị đi vùng Tha Thiên Hu. Nhĩm nghiên cu cũng tuyn chn đưc hai chng cĩ kh năng kháng sinh, tn ti đưc pH kim (pH=8). Kt qu th nghim gây nhim cây ging keo tai tưng trong vưn ươm đã làm tăng t l sng, sinh khi, chiu cao cây và hàm lưng nitơ trong lá cũng cao hơn so vi đi chng [12]. Nguyn Th Phương Chi (1999) nghiên cu bĩn th nghim chng c đnh nitơ t do Azotobacter và chng phân gii phosphate Archomobacter , Pseudomonas aeruginosa . Kt qu cho thy ch phm sinh hc làm tăng sinh trưng chiu cao m 7,47 – 16,93 %, và năng sut lúa tăng t 13,39 – 55,85 % [2]. Vũ Thúy Nga và Nguyn Ngc Quyên (2003) nghiên cu kh năng sinh tng hp IAA và phân gii phosphate khĩ tan ca vi khun Bradyrhizobium. Kt qu
cho thy nhiu chng cĩ kh năng tng hp 20 – 100 microgam/ml mơi trưng nuơi cy [13]. Lâm Minh Tú và Trn Văn Tuân (2003) nghiên cu sn xut mt s phân bĩn đơn chng, đa chng cho cây trng. Các chng s dng trong nghiên cu là Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa. Th nghim trên khoai tây làm tăng năng sut t 100 – 300 % so vi đi chng [17]. Phm Văn Ton (2003) s dng phân bĩn sinh hc gim đưc 20 % phân bĩn vơ cơ N, P, K nhưng năng sut khoai tây vn tăng so vi đi chng 15 – 50 %, cà chua tăng 12 – 34 %, lc tăng 30 % và gim đáng k bnh héo xanh [16]. Nguyn Ngc Dũng và H Th Kim Anh (1999) nghiên cu nh hưng ca các chng c đnh nitơ trong r lúa đn sinh trưng ca mm lúa CR 203. Nhĩm tác gi đã phân lp đưc 78 chng cng sinh vi r lúa. Các chng này cĩ đc đim ca chi Azospirillum. Các chng này kích thích s ny mm và ra r ca lúa CR 203 [5]
Chương 2. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Ni dung nghiên cu Đ đt đưc mc tiêu ca đ tài cn tin hành nghiên cu các ni dung sau: + Phân lp, mơ t mt s đc đim sinh hc và đnh danh các chng vi khun c đnh nitơ t do đã phân lp. + Tuyn chn mt s chng Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ và IAA cao. + Đánh giá hiu qu ca các chng Azobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao đn kh năng sinh trưng ca lồi cây ci ngt Brassica juncea. + Xây dng qui trình nuơi cy các chng Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao. + nh hưng ngun dinh dưng carbon đn sinh trưng ca Azotobacter sp. tuyn chn. + nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. + nh hưng pH mơi trưng nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. + nh hưng thi gian nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. 2.2. Đi tưng và đa đim nghiên cu 2.2.1. Đi tưng nghiên cu Các chng vi khun c đnh nitơ t do Azotobacter sp. đưc phân lp loi đt bazan nâu đ ti Tp. Buơn Ma Thut và huyn Krơng Ana, đt xám ti Huyn Ea Kar và huyn Buơn Đơn thuc đa bàn tnh Đăk Lăk. 2.2.2. Đa đim nghiên cu Thí nghim đưc thc hin ti: B mơn Sinh hc thc vt, Khoa Nơng Lâm Nghip, trưng Đi Hc Tây Nguyên.
Phịng thí nghim Cơng ngh Sinh hc & Mơi trưng, Trưng Đi hc Tây Nguyên. Tri thc nghim Khoa Nơng Lâm. 2.2.3. Thi gian nghiên cu Đ tài thc hin t tháng 09/2010 ti tháng 09/2011. 2.2.4 Thit b và hĩa cht nghiên cu Các hĩa cht: K2HPO 4, K 2SO 4, MgSO 4.7H 2O, NaCl, K 2SO 4, CaSO 4.2H 2O CaCO 3, Na 2MoO 4, FeCl 3 Agar, Glucose là các hĩa cht tinh khit. Thit b nghiên cu: + Đĩa petri, micropipette, ng nghim, que cy, + Box cy vơ trùng, + Máy quang ph spectrophotometer Plus 100 (Nht Bn) + T m. + Ni hp kh trùng. + Máy lc. 2.3. Phương pháp nghiên cu 2.3.1. Phương pháp phân lp 2.3.1.1. Phương pháp thu và bo qun mu. Phương pháp thu mu: mu đt đưc ly cách b mt đt khong 5cm bng dng c và túi đng vơ trùng, khong 100 g đt/1 mu. Mi loi hình đt nghiên cu đưc thu ti ba đa đim khác nhau mi đa đim thu 10 mu đt 10 v trí khác nhau, đng nht mu đ cĩ mt mu đt cn phân tích. Mu thu cn phân lp ngay hoc bo qun nhit đ 8 oC. 2.3.1.2. Phương pháp pha lỗng dung dch. Cân 10 g mu đt cho vào 90 ml nưc ct vơ trùng. Chun b năm ng nghim đánh s th t t 1 đn 5. ng 1: cha 10 ml nưc ct vơ trùng, 4 ng cịn li cha 9 ml nưc ct vơ trùng.
Dùng Micropipet hút 1ml dung dch t bình tam giác đã hịa 10g đt cho vào ng 1 lc đu. Sau đĩ hút 1ml t ng 1 cho vào ng 2, lc đu. C tip tc đn ng 5. như vy chúng ta tin hành pha lỗng dung dch các nng đ: 102, 103, 10 4, 10 5, 10 6. 2.3.1.3. Mơi trưng phân lp Ashby. Thành phn mơi trưng Ashby: Glucose : 20 g. K2HPO 4 : 0,2 g. MgSO 4.7H 20 : 0,2 g. NaCl : 0,2 g. K2SO 4 : 0,1 g. CaCO 3 : 5,0 g. Agar : 20 g. Nưc ct va đ :1000 ml pH = 7 Mơi trưng Ashby lng thì khơng b sung agar. Mơi trưng thch Ashby đưc hp kh trùng 1atm trong thi gian 30 phút. Sau đĩ, phân phi mơi trưng vào các đĩa petri. Khi mơi trưng đơng đc và ngui dùng micropipet hút 100 µl dung dch các nng đ pha lỗng khác nhau cho vào đĩa (3 đĩa/1 nng đ pha lỗng). Dùng que gt thy tinh dàn đu trên đĩa thch. Gĩi các đĩa đã cy và đt vào t m nhit đ 30 oC sau 3 – 7 ngày quan sát khun lc, mơ t và chp hình. 2.3.1.4. Bo qun và gi ging thí nghim.
Sau khi thu đúng khun lc theo tài liu mơ t, chn các khun lc đơn, cy dịng thun t 4 – 5 ln, sau đĩ cy vào ng thch nghiêng, đt vào t m nhit đ 30 oC. Sau 4 – 5 ngày làm tiêu bn, quan sát dưi kính hin vi đ xác đnh đúng đi tưng nghiên cu. Các ng ging cho vào t lnh, bo qun nhit đ 4 oC. Cy truyn đnh kì sau 1 – 2 tháng đ gi ging. 2.3.1.5. Phương pháp chun b ging thí nghim. Trưc khi tin hành mi thí nghim chun b 2 ng nghim cĩ cha 5 ml mơi trưng Ashby lng, dùng que cy ly vi khun Azotobacter sp . t các ng ging, hịa tan vào 2 ng nghim. Lc đu 2 ng nghim bng tay, hoc lc trên máy lc m nhit đ 30 oC trong t m. Sau 24 gi, dùng ging t 2 ng nghim này đ tin hành các thí nghim tip theo trong ni dung nghiên cu. 2.3.2. Phương pháp mơ t mt s đc đim sinh hc. Sau khi nuơi cy 4 ngày tin hành quan sát khun lc đơn dưi kính lúp đin đ phĩng đi 4 x 10 đ xác đnh hình dng, cu trúc, và b mt ct ngang ca khun lc và chp hình khun lc đ phĩng đi trên. Làm tiêu bn đ quan sát t bào và chp hình t bào đ phĩng đi 100 x 10. 2.3.3 Phương pháp đnh danh các chng vi khun đưc tuyn chn bng k thut PCR. + Nguyên tc: Đnh danh Azotobacter sp. da trên cp mi đc hiu cho khuch đi gene nif H (gene c đnh N) ca các chng Azotobacter sp. [23] Mi phát hin Azotobacter cĩ trình t như sau:
Mi (pimer) Trình t mi Kích thưc gene Nif Hf GGTTGTGACCCGAAAGCTGA Nif Hr CGATGCCCTTGGAGATGTTG 400bp + Phương pháp tách chit t bào thu nhn DNA tng s. Đ tách chit t bào thu nhn DNA tng s, s dng phương pháp ta trong phenol/chloroform mơ phng theo phương pháp ca Chomczynski và Sacchi (1987) cho tách chit mu. Quy trình tách chit đã đưc thương mi hĩa và cung cp t Cơng ty CP Cơng ngh Vit Á – Tp. H Chí Minh, quy trình bao gm các bưc sau: Hút 100 l sinh khi t bào cho vào các eppendorf vơ trùng cĩ cha sn 900 l dung dch 1. Vortex 30 giây, đ yên 10 phút. Thêm 200 l dung dch 2 (lc k trưc khi hút), trn đu, ly tâm 13000 vịng/phút trong 10 phút. Cn thn hút 600 l dch trong ni cĩ cha DNA (tránh làm xáo trn hai lp) và mt eppendorf khác cĩ cha sn 600 l dung dch 3 (trn đu trưc khi s dng). Trn đu hn hp, đ yên 10 phút nhit đ lnh, sau đĩ ly tâm 13000 vịng/phút trong 10 phút. Hn hp sau khi ly tâm s cĩ cn nm dưi đáy eppendorf. Cn thn loi b dch ni, thu cn. Cho t t 900 l dung dch 4 vào, ly tâm 13000 vịng/phút trong 5 phút. Tip tc loi b ht dch ni và thu cn. Đ khơ nhit đ 60°C trong 10 phút. Sau đĩ, thêm vào 50 l dung dch 5. Nu chưa đt phn ng PCR, bo qun mu tách chit 20°C. + Phn ng PCR. Thành phn cho mt phn ng 25 l bao gm: 2.5 l dung dch đm (buffer) 10X; 0,625 unit Taq DNA polymerase; 2,0 mM/L MgCl 2; 200 M/L dNTPs; Mi xuơi và mi ngưc: mi mi 500 nM/L; 5 l dch DNA. Thêm nưc ct hai ln cho đ 25 l. Thao tác đưc thc hin trong điu kin đá đang tan.
Cài đt chương trình luân nhit ca phn ng PCR: Bưc 1: 95 oC 5 phút 1 chu kỳ Bưc 2: 95 oC 30 giây 55 oC 30 giây 39 chu kỳ 72 oC 30 giây Bưc 3: 72 oC 6 phút 1 chu kỳ + Phương pháp đin di kim tra sn phm PCR. Nguyên tc: Nguyên tc ca phương pháp đin di da vào đc tính cu trúc ca các nucleic acid. Đĩ là các đi phân t tích đin âm nên khi chu tác đng ca mt đin trưng chúng s di chuyn v cc dương ca đin trưng. Khi nhum ethidium bromide, ethidium bromide s gn chèn vào phân t DNA và phân t DNA s phát màu dưi đèn UV nh Ethidium bromide. Pha hĩa cht và chun b gel agarose: Pha dch np mu. Thành phn ca dch np mu như sau: 600 l glycerol + 0,25 % xylene cyanol ff, thêm dung dch TAE 1X cho đ 1000 l. K thut rĩt gel agarose 2 %. Cân 2 g agarose, thêm 100 ml TAE 1X, đun cho tan hồn tồn, đ ngui 60 oC, rĩt vào giá nm ngang cĩ lp sn lưc, ch gel đơng, đt vào bn đin di cĩ cha dung dch TAE 1X, rút lưc khi gel. K thut đin di kim tra sn phm PCR. Thành phn đin di bao gm 7 l sn phm PCR hoc chng dương, chng âm và 3 l dch np mu, thang 100 bp. Cho hn hp này vào các ging trên gel agarose 1 %. Đin di đin th 50 V trong 5 phút. Sau đĩ tăng lên 80 V
trong 30 phút. Nhum gel trong dung dch TAE 1X cĩ ethidium bromide trong 15 phút. Quan sát kt qu đin di thơng qua thit b chp hình chuyên dng GelDoc XR cĩ kt ni phn mm chuyên dng (Biorad). Kích thưc các sn phm PCR đưc ghi nhn thơng qua chng dương, chng âm và so sánh vi thang chun 100 bp. 2.3.4. Tuyn chn chng Azotobacter sp. cĩ hot tính sinh hc 2.3.4.1. Tuyn chn mt s chng Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao bng phương pháp Kjeldahl [6]. a. Mc đích Xác đnh hàm lưng nitơ tng s trong dch nuơi cy vi khun phân lp đã đnh danh. T đĩ, làm cơ s đ chn lc nhng chng vi khun cĩ kh năng c đnh đm cao trong s các chng phân lp đ tin hành các thí nghim tip theo. b. Nguyên tc Cht đm đã đưc vơ cơ hĩa nm dưi dng (NH 4)2SO 4 đem cho tác dng vi dung dch NaOH 30 % s gii phĩng NH 3. (NH 4)2SO 4 + 2 NaOH Na 2SO 4 + 2 NH 3 + 2 H 2O Sau đĩ lưng NH 3 đưc hơi nưc lơi cun trong máy ParnasWargner và đưc dn đn mt bình tam giác cĩ cha mt lưng dư H 2SO 4. T đây cho phép xác đnh đưc lưng NH 3 phĩng thích ra, cĩ nghĩa là xác đnh đưc lưng đm cĩ trong mu nguyên liu. c. Thc hin Quá trình này gm 3 giai đon: Giai đon 1: Vơ cơ hĩa mu Nguyên tc: tt c các cht đm cĩ trong nguyên liu dù nm dng nào (hu cơ, vơ cơ, protein) chuyn thành hp cht vơ cơ (NH 4)2SO 4 bng cách đun sơi vi H 2SO 4 đm đc và cht xúc tác.
H2SO 4 đm đc Cht đm (NH 4)2SO 4 Xúc tác, t 0 Cách tin hành: hút 10 ml dch nuơi cy vi khun cho vào bình Kjeldahl. Thêm vào khong 200 mg cht xúc tác K 2SO 4/CuSO 4 (t l 3:1) và 10 ml H 2SO 4 đm đc. Đun sơi hn hp trong t hút khí đc cho đn khi dung dch cĩ màu xanh da tri nht và trong sut. Đ ngui và pha lỗng thành 100 ml vi nưc ct vơ đm. Thc hin hai ln th khơng (dch mơi trưng khơng cĩ VK) và ba ln th tht vi dch khun. a: Bình cu b: Bình ra c: Bình phn ng d: ng làm lnh e: Phu f: Bình đng mu Hình2.1 Cu trúc máy Parnas Wargner. Giai đon 2: Ct đm Đt bình cu a cho đn khi sơi, ra máy ct đm, tin hành ct đm bng cách sau: Đt bình tam giác f cĩ cha 10 ml dung dch H 2SO 4 0,01 N và hai git thuc th hn hp ri đt vào vịi ng sinh hàn d, sao cho đu nhn ng sinh hàn nhúng chìm trong dung dch. Hút 10 ml dung dch đm vơ cơ hĩa đã pha lỗng trên cho vào phu e ca máy ct đm, m khĩa cho vào bình c t t cho đn khi ht, tráng phu e ba ln, mi ln vi mt ít nưc ct ri cũng cho xung bình c.
Cho 10 ml dung dch NaOH 30 % và cũng cho xung bình c t t, tráng mt ít nưc ct (mi ln cn cha li mt ít đ h thng kín). Đ máy lơi cun trong vịng ba phút ri h bình tam giác xung, đ thêm hai phút na. Ra vịi bng mt tia nưc ct (nưc ra cho vào bình tam giác). Ri ly bình tam giác ra, đnh phân vi dung dch NaOH cĩ chun đ đúng là x.0,01 N cho đn khi cĩ màu vàng cam. Thc hin ba mu th tht, ba mu th khơng đ ly tr s trung bình. Phi xác đnh h s hiu chnh x ca dung dch NaOH 0,01 N bng dung dch H 2SO 4 0,01 N. Giai đon 3: Chun đ và tính tốn kt qu Lưng H 2SO 4 N/100 cịn tha đưc chun đ bng dung dch NaOH N/100. Quá trình chun đ kt thúc khi dung dch chuyn t tím đ sang vàng cam (hình 3.2). Trưc khi chun đ Sau khi chun đ Hình 2.2 S chuyn màu ca dung dch chun đ t tím đ sang vàng cam. Tính tốn kt qu Lưng nitơ tng s cĩ trong 1 lít dch nuơi cy vi khun nguyên liu:
Gi V o là th tích dung dch NaOH x.N/100 (tr s trung bình ca 3 ln th khơng). Gi V 1 là th tích dung dch NaOH x.N/100 (tr s trung bình ca 3 ln th tht). Vy ∆V = V o V1 là lưng NaOH tương đương vi lưng đm ammoniac phĩng thích bi 10 ml dung dch vơ cơ pha lỗng. X là h s hiu chnh X= V NaOH 0.01N/V H2SO4 0.01N 1 mol ammoniac tương đương vi 1 mol NaOH. Do đĩ s mol ammoniac phĩng thích bi 10 ml dch vơ cơ hĩa đã pha lỗng là: ∆V . x . (1/100) = ∆V.x.10 5 mol 1000 S g đm tng s cĩ trong 10 ml dch vơ cơ đã pha lỗng là: 14,2 . ∆V . x . 10 5 g S gam đm tng s cĩ trong 100 ml dung dch vơ cơ hĩa đã pha lỗng hay trong 10 ml nguyên liu: 14,2 . ∆V . x . 10 5. 100 = 14,2 . ∆V . x . 10 4 g 10 S gam đm tng cĩ trong mt lít nguyên liu: 14,2 . ∆V . x . 10 4. 1000 = 0,142 . ∆V . x (g/lít) 10
2.3.4.2. Xác đnh kh năng to IAA ca các chng Azotobacter sp. bng phương pháp so màu Salkowski Đ xác đnh hàm lưng IAA sinh ra bi các chng vi khun Aztobacter sp. thu thp đưc chúng tơi tin hành dng đưng chun v mi tương quan gia ch s OD 530nm và nng đ IAA Thc hin nuơi cy các chng Azotobacter sp. c đnh đm cao trên mơi trưng thun li nht chn ra t thí nghim trên. Chun b mơi trưng lng trong các ng nghim, mi ng nghim khong 10ml dch mơi trưng, hp kh trùng, đ ngui. Tin hành cy các chng Azotobacter sp. đưc tuyn chn vào các ng nghim cha mơi trưng đã kh trùng. Nuơi nhit đ 30oC, trên máy lc xoay vịng 150 vịng/phút. Sau 4 ngày Thu dch nuơi cy và ly tâm 5500 vịng/phút ly dch trong đ đo lưng IAA đưc vi khun tng hp và tit ra mơi trưng bng phương pháp so màu Salkowski bưc sĩng 530 nm. Thí nghim đưc lp li 3 ln. * Phương pháp xác đnh phương trình đưng chun ca mi tương quan gia ch s OD 530nm và nng đ IAA. Chun b dung dch đm phosphat (200 ml) A: KH 2PO 4 0,136 g/100 ml nưc ct B: K 2HPO 4 0,174 g/100 ml nưc ct Rĩt 39 ml A + 61 ml B cho thêm nưc ct va đ 200 ml, điu chnh pH = 7. Chun b thuc th Salkowski Rĩt 553 ml H 2SO 4 (98 %) cho vào nưc ct đ 1 lít, đ ngui sau 12 gi đưc dung dch H 2SO 4 đm đc 10,8 M. Cân 4,5 g FeCl 3 cho vào 1 lít H 2SO 4 10,8 M đã pha trên đ đưc thuc th Salkowski. Chun b đưng chun IAA Cân 1,6 mg IAA tng hp hịa tan vi 10 ml dung dch đm phosphat đưc nng đ là 160 mg/l. Sau đĩ tin hành pha lỗng ra các nng đ 0, 5,10, 16, 20, 40, 80 mg/l.
Rĩt 4 ml thuc th cho vào các ng nghim cĩ nng đ IAA khác nhau cĩ th tích 2 ml, mi nng đ lp li 3 ln. 10 phút nhit đ phịng đ phn ng xy ra hồn tồn, sau đĩ tin hành đo OD bưc sĩng 530 nm. T kt qu trên, chúng tơi xác đnh đưc phương trình đưng chun ca dung dch IAA thơng qua ch s OD 530nm . Da vào phương trình đưng chun đ xác đnh nng đ IAA (mg/l) do các vi khun to ra cĩ trong mơi trưng nuơi cy. Bng 2.1 Nng đ IAA thành lp đ th đưng chun ng nghim s 0 1 2 3 4 5 6 IAA 160 mg/l (ml) 0 1,00 0,50 0,25 0,20 0,125 0,0625 Dung dch đm (ml) 2,0 1,0 1,50 1,75 1,80 1,875 1,9375 Tng th tích (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 Nng đ IAA 0 80 40 20 16 10 5 (mg/l ) Thuc th 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 Salkowski (ml) OD (530 nm) 0 1,658 0,906 0,469 0,327 0,252 0,167 3 ln
T giá tr OD 530nm đo đưc trên chúng tơi xây dng đưng chun sau: y = 0.0205x + 0.0382 1.8 R2 = 0.9965 1.6 1.4 1.2 1 0.8 OD530nm 0.6 0.4 0.2 0 0 20 40 60 80 100 NngNng đ IAA(mg/l) đ IAA Biu đ 2.1 Phương trình đưng chun v mi tương quan gia ch s OD 530nm và nng đ IAA Da vào biu đ 1.1 cĩ phương trình đưng chun là: y = 0,0205x + 0,0382. 2.3.5. Phương pháp đánh giá hiu qu ca vic x lý các chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn đn sinh trưng cây ci ngt 2.3.5.1. nh hưng ca các chng vi khun c đnh nitơ Azotobacter sp. đn sinh trưng ca cây ci ngt Thí nghim cĩ 6 cơng thc, gm 4 chng đưc tuyn chn, 1 chng D6 (Vin cơng ngh sinh hc Vit Nam) làm đi chng 2 và 1 cơng thc khơng x lý chng làm đi chng 1. Mi cơng thc gm 3 khay (3 ln lp li). Ht ging ci sau khi x lý chng Azotobacter sp. s đưc gieo. Qui trình chăm sĩc theo hưng dn canh tác rau thơng thưng. Các ch tiêu theo dõi s lá/cây, chiu cao cây, khi lưng r, trng lưng tươi, sau 25 ngày gieo trng. 2.3.5.2. Thí nghim nghiên cu nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn sinh trưng ca rau ci ngt.
a) Phương pháp đm khun lc. + Azotobacter sp. sau 4 ngày nuơi cy đm lưng khun lc ca vi khun. Đm s lưng t bào (CFU/ml) theo Trn Linh Thưc (2001) [11]. Đm tt c các khun lc xut hin trên đĩa sau khi . Chn các đĩa cĩ s đm t 25 – 250 đ tính kt qu. Mt đ vi khun c đnh Nitơ đưc tính theo cơng thc: N A (CFU/ml) = n1Vf 1 + + n iVf i Trong đĩ: A: s t bào (đơn v hình thành khun lc) trong 1 ml mu. N: tng s khun lc đm trên các đĩa đã chn. ni: s lưng đĩa cy ti đ pha lỗng i. V: th tích dch mu (ml) cy vào trong mi đĩa. b) Phương pháp b trí thí nghim. Thí nghim đưc thc hin trong chu. Tưi sinh khi t bào Azotobacter sp. tuyn chn vi nng đ 5.10 5, 1.10 6, 5.10 6, 1.10 7, 5.10 7 CFU/ml lên các khay ci, tn sut tưi 2 ngày mt ln Thí nghim gm 6 lơ: 01 lơ đi chng khơng nhim Azotobacter sp.; 5 lơ thc nghim cĩ x lý nhim Azotobacter sp., thí nghim đưc lp li 3 ln, mi ln lp 3 khay. Các ch tiêu theo dõi sinh trưng ca cây ci sau 25 ngày tui: s lá/cây, chiu cao cây, din tích lá, khi lưng r, khi lưng tươi. Các ch tiêu đưc đo đm theo phương pháp thơng thưng. 2.3.6. Xây dng qui trình nuơi cy chng Azotobacter sp . cĩ hot tính c đnh nitơ cao 2.3.6.1. nh hưng ca ngun dinh dưng carbon đn sinh trưng ca Azotobacter sp. a) nh hưng ca ngun dinh dưng carbon Thành phn mơi trưng da trên mơi trưng Ashby cĩ ci tin. Các ngun carbon s dng là glucose, saccharose và tinh bt.
Tin hành tăng sinh các chng Azotobacter sp. chn lc trên mơi trưng Ashby thay th ngun carbon chính ca mơi trưng bng các ngun carbon sau: glucose, saccharose, tinh bt pH = 7 trên máy lc xoay 150 vịng/phút. Sau 5 ngày nuơi cy tin hành xác đnh hàm lưng nitơ tng s (mc 2.3.4.1). T đĩ, chn ra đưc ngun carbon thích hp nht cho s c đnh nitơ ca chng vi khun đã tuyn chn. b) nh hưng ca nng đ dinh dưng carbon Tăng sinh các chng chn lc Azotobacter sp. trên mơi trưng Ashby cha ngun carbon thích hp nht va đưc xác đnh, vi nng đ các ngun carbon khác nhau: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 % pH = 7 trên máy lc xoay 150 vịng/phút. Sau 4 ngày nuơi cy tin hành xác đnh hàm lưng nitơ tng s (mc 2.3.4.1). T đĩ, chn ra đưc nng đ carbon thích hp nht cho s c đnh nitơ ca chng tuyn chn. 2.3.6.2. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao Đ nghiên cu nh hưng ca nhit đ đn sinh khi Azotobacter sp. tin hành tăng sinh các chng Azotobacter sp. chn lc trên mơi trưng Ashby cha ngun carbon và nng đ carbon thích hp nht đi vi các chng đã chn lc các nhit đ khác nhau: 30 oC, 35 oC ,40 oC trên máy lc xoay 150 vịng/phút. Sau 4 ngày nuơi cy tin hành xác đnh hàm lưng nitơ tng s ( mc 2.3.4.1). T đĩ, chn ra đưc giá tr nhit đ thích hp nht cho s c đnh nitơ ca chng tuyn chn. 2.3.6.3. nh hưng ca pH nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao Đ nghiên cu nh hưng ca pH đn sinh khi Azotobacter sp. tin hành tăng sinh các chng Azotobacter sp. chn lc trên mơi trưng Ashby cha ngun carbon, nng đ carbon và nhit đ thích hp nht đi vi các chng đã chn lc các pH khác nhau: 6, 7, 8, 9 trên máy lc xoay 150 vịng/phút. Sau 4 ngày nuơi
cy tin hành xác đnh hàm lưng nitơ tng s (mc 2.3.4.1). T đĩ, chn ra đưc giá tr pH thích hp nht cho s c đnh nitơ ca chng tuyn chn. 2.3.6.4. nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao Đ nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy đn s sinh sinh khi Azotobacter sp. tin hành tăng sinh các chng chn lc trên mơi trưng Ashby cha ngun carbon, nng đ carbon, nhit đ và pH thích hp nht đi vi các chng vi khun các thi gian nuơi cy khác nhau: 2, 3, 4, 5 ngày trên máy lc xoay 150 vịng/phút. Sau 4 ngày nuơi cy tin hành xác đnh hàm lưng nitơ tng s (mc 2.3.4.1.). T đĩ, chn ra đưc thi gian nuơi cy thích hp nht cho s c đnh nitơ ca chng tuyn chn. 2.3.7. Phương pháp x lý s liu thng kê S liu đưc phân tích thng kê theo phn mm MSTATC version 2.10 ca Đi hc bang Michigan. Các s liu đưc phân tích ANOVA và đưc trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,05 và 0,01. Đ th tương quan và phương trình tương quan gia ch s mt đ quang OD đưc x lý trên phn mm EXCEL 2007 ca Microsoft, các biu đ khác cũng đưc x lý trên phn mm này.
Chương 3. KT QU VÀ THO LUN 3.1. Nghiên cu phân lp, mơ t và đnh danh mt s chng vi khun c đnh nitơ t do Azotobacter sp. trên mt s loi đt Đăk Lăk. 3.1.1. Kt qu phân lp chng vi khun c đnh N trên mt s loi đt Đăk Lăk Sau khi phân lp và làm thun, thu đưc 24 chng vi khun phát trin trên mơi trưng Ashby cĩ đc đim khun lc ging vi chng Azotobacter sp. trong các tài liu mơ t: khun lc trịn, li, cĩ màng bao nhy và bĩng, khi già khun lc sinh sc t vàng, đen. (hình nh 24 chng vi khun phân lp phn mc lc 1 hình 1.1). Các chng vi khun này đưc ký hiu theo Bng 3.1. Bng 3.1. Ký hiu, đa đim phân lp các chng VK trên mơi trưng Ashby Mơi trưng phân lp STT Ký hiu chng Ký kiu mu 1 Az 1.1 HT1 2 Az 2.1 EK2 3 Az 2.2 EK2 4 Az 3.1 HT3 5 Az 3.2 HT3 6 Az 4.1 EK4 7 Az 5.2 HT5 8 Az 7.2 HT7 Ashby 9 Az 8.1 HT8 10 Az 10.1 HT10 11 Az 10.2 EK10 12 Az 11.1 HT11 13 Az 12.1 HT12
14 Az 14.1 HT14 15 Az 15.2 EK15 16 Az 16 EC 17 Az 17 TH 18 Az 18 KX 29 Az 19 PX Ashby 20 Az 20 EV 21 Az 21 EH 22 Az 22 BT 23 Az 23 BĐ 24 Az 24 HĐ (Az: Chng vi khun cĩ khun lc nghi ng là Azotobacter sp. trên mơi trưng Ashby). HT: Hịa Thng; EK: Ea Kar; EC: Ea Cư Ny; TH: Tân Hịa; KX: Khánh Xuân; PX: Phú Xuân; EV: Ea Ven; EH: Ea Huê; BT: Buơn Trp; BĐ: Buơn Đơn; HĐ: Hịa Đơng. Hai mươi bn chng vi sinh vt cĩ kh năng sinh trưng trên mơi trưng Ashby vơ đm, trong đĩ cĩ 10 chng trên đt bazan nâu đ thuc Tp. Buơn Ma Thut và huyn Krơng Ana, 14 chng đưc phân lp t đt xám thuc đa bàn huyn Ea Kar và huyn Buơn Đơn tnh Đăk Lăk. 3.1.2. Kt qu mơ t mt s đc đim sinh hc các chng vi khun phân lp Quan sát mt s đc đim sinh hc ca các chng vi khn phân lp dưi kính hin vi, kt qu mơ t đưc ghi nhn bng 3.2.
Bng 3.2. Mơ t Hình thái khun lc ca 24 chng vi khun phân lp Mt s đc đim hình thái ca khun lc đơn Vịng s STT Ký hiu Hình Bìa khun B mt Màu sc dng chng dng lc CaCO 3 Trịn Bĩng Trng Bng 1 Az 1.1 Cĩ đu nhn trong phng Bng 2 Az 2.1 Trịn Bĩng Trng đc Khơng phng Trịn Bng 3 Az 2.2 khơng Nhn Trng đc Khơng phng đu Trịn Bĩng Bng 4 Az 3.1 khơng nhn, Trng đc Khơng phng đu nhày Bng 5 Az 3.2 Trịn Bĩng Trng đc Khơng phng Trịn Bng 6 Az 4.1 khơng Nhn Trng đc Khơng phng đu Trịn Bĩng Bng 7 Az 5.2 khơng nhn, Trng đc Khơng phng đu nhày
Bng 8 Az 7.2 Trịn Bĩng Trng nâu Khơng phng Trịn Bng 9 Az 8.1 khơng Nhn Trng đc Khơng phng đu Bĩng Trịn Trng Bng 10 Az 10.1 nhn, Khơng đu trong phng nhày Bng 11 Az 10.2 Trịn Bĩng Trng đc Khơng phng Trịn Bng 12 Az 11.1 khơng Nhn Trng đc Khơng phng đu Trịn Bĩng Trng Bng 13 Az 12.1 khơng nhn, Khơng trong phng đu nhày Bng 14 Az 14.1 Trịn Bĩng Trng đc Khơng phng Trịn Bng 15 Az 15.2 Nhn Trng đc Khơng đu phng Trịn Nhy Bng 16 Az 16 khơng Trng đc Cĩ nht li phng đu
Trịn Trng Bng 17 Az 17 khơng Bĩng li Khơng trong phng đu Trịn Trng Bng 18 Az 18 khơng Bĩng li Khơng trong phng đu Trịn Bĩng, Trng Bng 19 Az 19 khơng Khơng li cong trong phng đu Bĩng, Bng 20 Az 20 Trịn li Trng đc Khơng phng phng Trịn Bĩng li Bng 21 Az 21 Trng đc Cĩ đu cong phng Trịn Bĩng Trng Bng 22 Az22 khơng nhn, Khơng trong phng đu nhày Trịn Trng Bng 23 Az 23 Bĩng Khơng đu trong phng Trịn Bĩng Bng 24 Az 24 khơng Trng đc Cĩ nhn phng đu Trịn Bĩng Bng 25 D6 khơng nhn, Trng đc Khơng phng đu nhày * (Chng D6 là chng đi chng ca Vin cơng ngh sinh hc Vit Nam)
3.1.3. Kt qu đnh danh các chng vi khun phân lp bng k thut PCR. 24 chng đưc phân lp (Bng 3.1.) đưc nhân sinh khi, tách chit DNA và chy phn ng PCR vi cp mi đc trưng cho gene nif H ca vi khun Azotobacter. Kt qu đin di sn phm PCR đưc ghi nhn trong hình 3.1. A15.2 A 3.1 A 3.2 A1.1 A7.2 A2.2 A2.1 A4.1 A5.2 T () (+) A8.1 A10.2 A11.1 400bp 300bp 200bp 100bp A11.2 A14.1 A16 A17 A18 A19 A20 T + A21 A22 A23 A24 A.6 400bp 300bp 200bp 100bp Kt qu đnh danh các chng vi khun Azotobacter sp. như sau: Hình 3.1. Hình chp đin di trên gel agarose các sn phm PCR ca 24 chng T: Thang DNA 100bp; (): chng âm; (+): chng dương (chng D6); A: Az ký hiu ca các chng đnh danh. Các chng xut hin vch 400 bp, tương đương vi chng dương (+) là các chng cĩ gene nif H đc trưng ca Azotobacter sp . Kt qu đin di sn phm PCR ca 24 chng vi khun phân lp cho thy trong 24 chng đã đnh danh đưc 6 chng vi khun Azotobacter sp. là các chng cĩ ký hiu chng sau: Az 15.2; Az 3.1; Az 3.2; Az 7.2; Az 2.1 và Az 10.2.
3.2. Tuyn chn các chng Azotobacter sp. cĩ hot tính cao 3.2.1. Nghiên cu tuyn chn các chng Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao Sau khi đnh danh đưc 6 chng Azotobacter sp. các chng này đưc tin hành nghiên cu kh năng c đnh nitơ và kh năng sinh tng hp IAA đ tuyn chn. Kt qu đưc ghi nhn trong bng 3.3. Bng 3.3. Kh năng c đnh nitơ ca các chng vi khun Azotobacter sp. STT Ký hiu chng VK Hàm lưng N tng s (mg/l) 1 Az 2.1 119,49e 2 Az 3.1 217,90 b 3 Az 3.2 208,53 c 4 Az 7.2 194,47 d 5 Az 10.2 30,46 f 6 Az 15.2 236,64 a 7 D6 221,56 b CV,% 3,31 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0.01) D6: Là chng đi chng ca Vin Nghiên cu Cơng ngh sinh hc, Đi hc Cn Thơ. Kt qu bng 3.3 và biu đ 3.1 nhn thy s chênh lch v kh năng c đnh đm ca tng chng rt cao. Trong 6 chng phân lp đưc thì ch cĩ 1 chng thu đưc hàm lưng nitơ tng s là thp (< 50 mg/l).Trong 6 chng đã đnh danh, chng Az 15.2 cĩ kh năng c đnh đm tt nht (236,64 mg/l), k đn là chng Az 3.1 (217,90 mg/l), chng Az 3.2 (208,53 mg/l), chng Az 7.2 (194,47 mg/l). Các chng này cĩ kh năng c đnh đm cao nht ln lưc Az
15.2 là a, Az 3.1 là b, Az 3.2 là c, Az 7.2 là d. Đ thu đưc hàm lưng đm cao địi hi các chng này cĩ h nitrogenase cĩ hot tính cao. Mi mt chng vi khun to ra mt loi nitrogenase cĩ hot tính c đnh đm khác nhau, chng nào cĩ hot lc nitrogenase cao thì s là mt yu t giúp chúng c đnh đm tt trong mơi trưng vơ đm. Như vy, ngồi chng Az 15.2, Az 10.2 phân lp trên đt xám ti Ea Kar, cịn các chng cĩ kh năng c đnh nitơ cao là Az 3.1, Az 3.2 phân lp đưc huyn Krơng Ana và Az 7.2 phân lp đưc thành ph Buơn Ma Thut c 3 chng này đu phân lp t đt bazan nâu đ. Qua kt qu bng 3.3 và so sánh vi chng đi chng D6 cho thy cĩ chng Az 15.2 cĩ kh năng c đnh cao hơn chng đi chng D6 ca Vin cơng ngh sinh hc Vit Nam, s khác bit này là cĩ ý nghĩa thng kê. Chng Az 3.1 cĩ kh năng c đnh nitơ tương đương vi chng đi chng D6. Ngồi ra, các chng Az 3.2, Az 7.2 cĩ kh năng c đnh N khá cao (xp x 200 mg/l). T các kt qu thu đưc cĩ th tuyn chn đưc 4 chng cĩ kh năng c đnh nitơ cao là Az 3.1; Az 3.2; Az 7.2 và Az 15.2. Do đĩ chn bn chng này đ tip tc s dng cho các nghiên cu sau. a b c b d e f Biu đ 3.1. So sánh hàm lưng nitơ ca 7 chng vi khun Azotobacter sp.
3.2.2. Xác đnh kh năng to IAA ca các chng Azotobacter sp. Vi khun c đnh nitơ Azotobacter sp. ngồi kh năng c đnh nitơ t do đ cung cp cho cây, các chng này cịn cĩ kh năng sinh tng hp IAA đ kích thích s sinh trưng ca b r cây trng [3]. Bng 3.4. Kh năng to IAA ca các chng vi khun Azotobacter sp. Kí hiu Nng đ IAA OD 530nm Trung bình Chng (mg/l) Az15.2 0,035 0,040 0,037 0,0373 0,577 d Az 3.1 0,044 0,030 0,039 0,0376 0,591 d Az 3.2 0,121 0,120 0,100 0,1336 5,206 a Az 7.2 0,064 0,054 0,060 0,0593 1,634 b Az 2.1 0,038 0,047 0,045 0,0433 0,865 c Az 10.2 0,036 0,032 0,040 0,0360 0,514 d D6 0,060 0,058 0,064 0,0594 1,641 b CV % 8,01 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0.01) Da vào phương trình đưng chun (2.3.4.2) y = 0,0205x + 0,0382 xác đnh hàm lưng IAA theo bng 3.4. Kt qu bng 3.4. và biu đ 3.2. cho thy c 6 chng Azotobacter sp. phân lp và chng đi chng D6 đu cĩ kh năng sinh tng hp IAA. Tuy nhiên kh năng tng hp so sánh gia các chng là rt khác nhau. Chng đi chng D6 cĩ kh năng tng hp IAA khá 1,64 mg/lit, tương đương vi chng Az 7.2 do chúng tơi phân lp ti thành ph Buơn Ma Thut. Chng Az 15.2 cĩ kh năng c đnh nitơ t do cao nht nhưng li cĩ kh năng sinh tng hp IAA khơng cao so vi 6 chng cịn li. Các chng Az 2.1; Az 10.2; Az 3.1 cĩ kh năng sinh tng
hp IAA khá thp < 1,0 mg/lit. Riêng chng Az 3.2 cĩ kh năng sinh tng IAA đc bit cao, khong 5,20 mg/lit, cao gp 3 ln so vi chng đi chng D6 và các chng Az 7.2, Az 3.2 cũng là chng cĩ kh năng c đnh nitơ thuc nhĩm cao trong 07 chng so sánh. Đây là chng cĩ tim năng va c đnh nitơ t do cao, va cĩ kh năng sinh tng hp IAA cao, cn phi tip tc nghiên cu th nghim. a b b c d d d Biu đ 3.2. Kh năng sinh IAA ca các chng Azotobacter sp. 3.3. Hiu qu ca vic x lý các chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn đn sinh trưng cây ci ngt 3.3.1. Nghiên cu nh hưng ca các chng Azotobacter sp. tuyn chn đn sinh trưng ca rau ci X lý ht trưc khi gieo trng là mt trong bin pháp ht sc quan trng nhm mc đích thúc mm, kích thích mm mc nhanh, tăng s trao đi cht, thúc đy s sinh trưng, phát trin ca cây, rút ngn thi gian sinh trưng, tăng
kh năng chín sm, hn ch tác hi ca sâu bnh, gĩp phn tăng năng sut trên đơn v din tích. Vì vy, tin hành thc hin thí nghim đưc trình bày trong phn phương pháp. Kt qu nh hưng ca vic x lý chng vi khun Azotobacter sp. đn sinh trưng ca rau ci ngt sau 25 ngày tui thu đưc kt qu như sau. Bng 3.5. nh hưng các chng vi khun Azotobacter sp. đn s lá cây ci Đơn v: s lá/cây Tên chng L1 L2 L3 Trung bình ĐC 4,80 4,90 5,00 4,90 e Az 3.1 5,40 5,53 5,20 5,37 b Az 3.2 5,60 5,70 5,50 5,60 a Az 7.2 5,10 5,20 5,00 5,10 d Az 15.2 5,40 5,20 5,20 5,26 c D6 5,30 5,50 5,40 5,40 b CV,% 2,05 Mc ý nghĩa * (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0.01) Qua bng 3.5 Cho thy khi ngâm ht ging vi các chng vi khun Azotobacter sp. trưc khi gieo cho s lá trung bình cao hơn so vi đi chng, c th chng vi khun Az 3.2 cho s lá trung bình cao nht (5,6 lá/cây) so vi đi chng (4,9 lá/cây) cĩ s khác bit này cĩ th do ngồi vic cung cp đm cho cây thì vi khun Az 3.2 sinh nhiu IAA cũng nh hưng đn s sinh trưng cây trng. Chng Az 15.2 tuy cĩ kh năng c đnh nitơ cao nht nhưng kh năng tng hp IAA thp. nh hưng ca c đnh nitơ đn sinh trưng ca cây chm hơn tác đng ca IAA bi nitơ hu cơ ca vi sinh vt cn cĩ thi gian khống hĩa to thành NH 4 thì cây mi cĩ kh năng s dng. chng Az 3.1 cĩ kh năng
sinh trưng s lá tương đương vi chng đi chng D6. S khác bit v sinh trưng ca lá rau ci gia các cơng thc là ít ý nghĩa trong thng kê.vì s lá ca cây ph thuc chính vào đc đim di truyn là ch yu. a b b c d e Các chng vi khun Azotobacter sp. Biu đ 3.3. nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn s lá ca cây ci ngt Bng 3.6. nh hưng các chng vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao cây ci ngt L1 L2 L3 Trung bình Tên chng (cm/cây) (cm/cây) (cm/cây) (cm/cây) ĐC 16,50 16,96 17,20 16,88 e Az 3.1 18,11 18,99 19,88 18,99 b Az 3.2 19,56 19,41 20,00 19,65 a Az 7.2 18,66 18,51 19,09 18,75 c Az 15.2 18,56 18,41 18,99 18,65 d D6 18,66 18,51 19,09 18,75 c
CV,% 1,59 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0.01) Kt qu bng 3.6. cho thy khi x lý ht ging vi dch vi khun Azotobacter sp. thì chiu cao các cơng thc cĩ s thay đi so vi cơng thc đi chng và s khác bit này là cĩ ý nghĩa thng kê. C th là cơng thc x lý vi chng Az 3.2 cĩ chiu cao cao nht là (19,655 cm) so vi đi chng (16,889 cm) và chng đi chng D6 (18,75 cm), tip theo là cơng thc x lý chng Az 3.1 (18,99 cm) và các chng Az 7.2 tương đương vi chng D6. Kt qu cho thy rng chng Az 3.2 cĩ hiu qu kích thích tăng trưng chiu cao mnh nht trong các chng. Kt qu này cũng phn ánh tương quan v kh năng c đnh nitơ và sinh tng hp IAA ca chng này khá nht trong 6 chng tuyn chn nghiên cu.
a b c c d f Các chng vi khun Azotobacter sp. Biu đ 3.4. nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao cây ci ngt. Bng 3.7. nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn khi lưng r cây ci ngt L1 L2 L3 Trung bình Tên chng (g/cây) (g/cây) (g/cây) (g/cây) ĐC 0,171 0,167 0,174 0,171 d Az 3.1 0,280 0,300 0,245 0,275 c Az 3.2 0,403 0,410 0,377 0,397 a Az 7.2 0,320 0,305 0,275 0,300 b Az 15.2 0,300 0,313 0,277 0,297 b D6 0,290 0,303 0,327 0,307 b CV% 6,20 Mc ý nghĩa
(Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0.01) R là mt ch tiêu quan trng đ nghiên cu nh hưng ca các chng vi khun trên cây ci ngt. Sau 25 ngày gieo trng tin hành cân và thu kt qu đưc trình bày trong bng 3.7. Kt qu bng 3.7. cho thy nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn khi lưng r trung bình so vi đi chng cĩ s khác bit tương đi ln. Khi lưng trung bình r khi nhim chng vi khun Az 3.2 cao nht (0,397 g/cây) và vưt tri hơn rt nhiu so vi đi chng (0,171 g/cây). Các chng cịn li đu cho khi lưng r trung bình cao hơn nhiu so vi đi chng,vic tăng khi lưng r giúp cây tăng kh năng hút khống giúp cây tăng trng nhanh. Kt qu cho thy rng vic b sung vi khun Azotobacter sp. cĩ kh năng c đnh nitơ và sinh hp IAA cung cp cho cây ci ngt kích thích r phát trin mnh đc bit vi khun Az 3.2 sinh IAA nhiu thì kích thích r phát trin càng nhiu và mnh theo hưng lang rng ra xung quanh.
a b b b c d Các chng vi khun Azotobacter sp. Biu đ 3.5. nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn khi lưng r cây rau ci. Bng 3.8. nh hưng các chng vi khun Azotobacter sp. đn năng sut cây ci ngt L1 L2 L3 Trung bình Tên chng (kg/m 2) (kg/m2) (kg/m 2) (Kg/m2) ĐC 3,2 3,6 3,4 3,4e Az 3.1 4,2 4,1 4,3 4,2d Az 3.2 4,8 4,7 4,9 4,8a Az 7.2 4,5 4,2 4,1 4,3c Az 15.2 4,6 4,3 4,6 4,5b D6 4,6 4,7 4,2 4,5b CV (%) 4,63 Mc ý nghĩa
(Các tr s cĩ ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01). Kt qu bng 3.8. cho thy năng sut thu hoch trung bình ca cây rau ci khi x lí vi dch vi khun Azotobacter sp. đu tăng so vi đi chng là 4,8 kg/m 2, 4,5 kg/m 2, 4,5 kg/m 2, 4,3 kg/m 2, 4,2 kg/m 2, 3,4 kg/m 2 Kt qu x lý thng kê và phân hng trc nghim Duncan cũng cho kt qu sai khác rt rõ rt gia các cơng thc. Cơng thc b sung ch phm vi khun c đnh đm ( Azotobacter sp.) đã làm cho năng sut thu hoch tăng lên đáng k so vi đi chng, đáng chú ý nht là chng vi khun Az 3.2 làm tăng năng sut cao nht do các ch tiêu v s lá/cây, chiu cao cây, khi lưng r các thí nghim trưc đu cao nht. năng sut 6 a 5 b b d c 4 e 3 Series1 2 1 năng0 sut trung bình kg/m 2 ĐC Az 3.1 Az3.2 Az 7.2 Az 15.2 D6 Các chngtên vi chng khun Azotobacter Azotobacter sp. Biu đ 3.6. nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn năng sut cây ci ngt
3.3.2. nh hưng ca mt đ Azotobacter sp. đn sinh trưng và năng sut ca cây ci ngt Qua thí nghim so sánh nh hưng ca 4 chng Azotobacter sp. phân lp đưc Đn sinh trưng ca rau ci, chúng tơi đã tuyn chn đưc chng Az 3.2 va cĩ kh năng tng hp N, IAA cao và nh hưng mnh nht đn sinh trưng và năng sut ca rau ci. Chng này đưc la chn cho nghiên cu tip theo v nh hưng ca mt đ đn sinh trưng và năng sut ca cây ci. Rau ci đưc x lý vi mt đ chng t 5.10 5 , 10 6 , 5.10 6, 10 7 , 5.10 7 CFU/ml. Bng 3.9. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn s lá cây ci Đơn v: s lá/ cây Mt đ x Trung CT L1 L2 L3 lý bình CT 1 0 5,200 5,200 5,100 5,167 e Đi chng CT 2 5.10 5 6,233 6,333 6,133 6,233 c CT 3 1.10 6 6,400 6,400 6,335 6,378 b CT 4 5.10 6 6,633 6,565 6,400 6,533 a CT 5 1.10 7 6,243 6,433 6,333 6,336 b CT 6 5.10 7 5,533 5,647 5,746 5,642 d CV (%) 1,43 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghin phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01). các loi cây khác nhau, yêu cu v lưng phân bĩn cũng khác nhau. Đ bit đưc mt đ vi khun nào thì phù hp nht cho s sinh trưng và phát trin đng thi thu đưc năng sut cao nht ca cây rau ci. Tin hành thí nghim 5 mt đ khác nhau: 5.10 5 CFU/ml, 1.106 CFU/ml, 5.10 6 CFU/ml, 1.10 7
CFU/ml, 5.10 7 CFU/ml và ĐC. Sau khi gieo ci đưc 7 ngày, dch vi khun đưc pha lỗng đn nng đ cn thit, bt đu tưi cho rau vi tn sut 2 ngày tưi 1 ln. Sau 25 ngày thu đưc kt qu như bng 3.9. Theo bng s liu bng 3.9. và biu đ 3.7. cho thy mt đ x lý 5.10 6CFU/ml cho s lá trung bình/cây là 6,533 lá cao hơn so vi các mt đ cịn li, cũng như so vi cây đi chng (5,167/cây). Như vy, vic bĩn dch vi khun đã cĩ nh hưng tích cc đn s sinh trưng và phát trin ca cây rau làm cho s lưng lá ca rau tăng lên đáng k. Tuy nhiên, nu s dng nng đ quá cao cĩ th nh hưng đn khu h vi sinh vt trong đt và nh hưng đn hp thu dinh dưng và sinh trưng ca cây. b a c b d e Biu đ 3.7. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn s lá cây ci.
Bng 3.10. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao cây ci. CT Phương L1 L2 L3 Trung bình pháp (cm/cây) (cm/cây) (cm/cây) (cm/cây) CT 1 0 16,50 16,96 17,20 16,88 f Đi chng CT 2 5.10 5 19,92 19,71 18,92 19,52 e CT 3 1.10 6 22,04 20,48 20,92 21,15 c CT 4 5.10 6 24,04 23,46 23,30 23,60 a CT 5 1.10 7 21,38 22,58 20,98 21,64 b CT 6 5.10 7 20,47 19,16 19,86 19,83d CV,% 3,01 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01). Chiu cao ca cây cũng là mt yu t quan trng đ đánh giá kh năng sinh trưng ca mt s loi rau. Cùng vi s ra lá thì s tăng trưng chiu cao đng thi xy ra. Tăng trưng chiu cao nhanh hay chm là tùy thuc vào các giai đon khác nhau, nng đ dung dch dinh dưng cũng nh hưng sut quá trình sinh trưng và chiu cao ca cây. nh hưng ca cách x lý ht ging các mt đ khác nhau cĩ s khác bit ý nghĩa v mt thng kê chiu cao cây dao đng t 19,52 – 23,6 cm/cây, đng thi tt hơn so vi đi chng (16,889 cm/cây). Tuy nhiên x lý ht ging mt đ 5.10 6 CFU/ml cĩ nh hưng tt nht đn chiu cao cây.Theo T Thu Cúc và cng s (2000) đm làm cho cây chĩng xanh, thúc đy quá trình quang hp ca cây, kích thích thân lá phát trin, kéo dài thi gian sinh trưng và tui ca lá
D a c b e d f Biu đ 3.8. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao ca cây rau ci. Bng 3. 11: nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. lên khi lưng r cây ci Mt đ L1 L2 L3 Trung bình Cơng thc x lý (g/cây) (g/cây) (g/cây) (g/cây) CT1 0 0,171 0,167 0,174 0,171 d Đi chng CT2 5.10 5 0,181 0,181 0,181 0,181 d CT3 1.10 6 0,501 0,529 0,493 0,508 c CT4 5.10 6 1,000 0,986 0,950 0,979 b CT5 1.10 7 1,207 1,021 1,138 1,122 a CT6 5.10 7 0,455 0,455 0,499 0,470 c CV % 7,50 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01).
R là mt ch tiêu quan trng đ nghiên cu nh hưng ca mt đ vi khun trên cây rau ci. Sau 25 ngày chúng tơi tin hành cân và thu kt qu đưc trình bày trong bng 3.11. Kt qu bng 3.11. cho thy nh hưng ca cách x lý các mt đ khác nhau cĩ s khác bit ý nghĩa v mt thng kê khi lưng r cây. Đi vi khi lưng trung bình r thì mt đ 10 7 CFU/ml (1,122 g/cây) cao nht và vưt tri hơn rt nhiu so vi đi chng (0,171 g/cây) và mt đ 5.10 5 (0,181 g/cây). Kt qu cho thy rng b sung vi khun Azotobacter sp. cĩ kh năng c đnh nitơ cung cp cho cây và tng hp IAA trong đt đã kích thích sinh trưng b r cây rau ci. a b c c d d Biu đ 3.9. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. lên khi lưng r ca cây ci. Đ đánh giá nh hưng ca mt đ vi khun đn s phát trin din tích lá ca cây rau ci, chúng tơi tin hành thí nghim và theo dõi. Kt qu thu đưc bng 3.12. cho thy cĩ s khác bit rõ rt v din tích lá gia các cơng thc. Din tích lá trung bình thp nht là cơng thc đi chng (31,884 cm 2), cịn
CT 4 là din tích lá trung bình cao nht (73,752 cm2), CT2, CT3 ,CT5 , CT6 cũng cĩ s gia tăng v din tích lá so vi CT1 đi chng ln lưt là 39,089 cm 2, 58,520 cm 2, 61,940 cm 2, 48,665 cm 2. Như vy mt đ vi khun nh hưng rt ln đn din tích lá ca rau, đc bit quan tâm là mt đ vi khun 5.10 6 CFU/ml. Bng 3.12. nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. lên din tích lá cây ci Cơng Phương pháp L1 L2 L3 Trung bình thc x lý (cm 2/cây) (cm 2/cây) (cm 2/cây) (cm 2/cây) CT1 0.0 33,110 30,031 32,510 31,884 f CT2 5.10 5 37,399 38,763 41,104 39,089 e CT3 1.10 6 60,154 62,850 52,556 58,520 c CT4 5.10 6 71,335 73,856 76,065 73,752 a CT5 1.10 7 60,813 66,282 58,725 61,940 b CT6 5.10 7 50,164 48,300 47,532 48,665 d CV (%) 6,14 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01). V mt cm quan, khi bĩn mt đ vi khn 5.10 6 CFU/ml thì cây rau sinh trưng và phát trin tt hơn. Lá to, dày và xanh hơn so vi các mt đ khác và cây cơng thc đi chng. Vic bĩn nhiu hay ít vi khun thì đu nh hưng khơng tt đn năng sut và cht lưng cây rau. Khi bĩn tha s kéo dài thi kỳ sinh trưng thân lá, thân lá non mm, t bào cha nhiu nưc làm gim kh năng chng chu vi điu kin bt li như sâu bnh, khơ hn, Khi bĩn thiu, cây rau tăng trưng chm, lá xanh chuyn sang màu vàng, gân chính b mt màu, thân khơ héo làm gim năng sut thu hoch.
a b c d e f Biu đ 3.10. nh hưng mt đ vi khun Azotobacter sp . lên din tích lá ci Bng 3.13. nh hưng ca mt đ VK Azotobacter sp. đn năng sut cây ci Mt đ x L1 L2 L3 Trung bình CT lý (kg/m2) (kg/m2) (kg/ m2) (kg/m 2) CT 1 O 3,3 3,4 3,2 3,300 f Đi chng CT 2 5.10 5 4,1 4,3 4,3 4,233 e CT 3 1.10 6 4,7 4,7 4,8 4,733 d CT 4 5.10 6 5,7 5,4 5,4 5,500 a CT 5 1.10 7 5,6 5,4 5,4 5,467 b CT 6 5.10 7 5,0 4,4 5,2 5,200 c CV (%) 3,07 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01).
Qua kt qu bng 3.13. cho thy năng sut thu hoch trung bình ca cây rau ci khi x lí vi dch vi khun đu tăng so vi đi chng, phân hng trc nghim cũng cho kt qu sai khác rt rõ rt gia các cơng thc mc sai khác cĩ ý nghĩa P< 0.01. Năng sut bình quân tăng 25 – 60 % so vi đi chng. Mt đ x lý thích hp là 5.10 6 CFU/ml. Khi gia tăng mt đ thì năng sut cũng khơng cĩ s gia tăng. Nguyên nhân cĩ th là do mt đ quá cao cĩ th nh hưng ti cân bng h vi sinh vt trong đt. a b c d e f Biu đ 3.11 . nh hưng ca mt đ vi khun Azotobacter sp. đn năng sut ca cây ci ngt 3.4. Xây dng quy trình nuơi cy các chng Azotobacter sp. tuyn chn Qua kt qu tuyn chn trên thc t đng rung cho thy chng Az 3.2 cĩ hiu qu cao nht đn sinh trưng chiu cao cây, din tích lá, khi lưng r và năng sut ca cây ci trong thí nghim. Vì vy, chng Az 3.2 đưc chn đ nghiên cu quy trình nuơi cy th nghim vi 3 chng tim năng đ so sánh là Az 3.1; Az 7.2 và Az 15.2. Quy trình nuơi cy chng Az 3.2 và 3 chng Az 3.1; Az 7.2 và Az 15.2
đưc s dng mơi trưng Ashby ci tin, thay th các ngun Carbon khác nhau, tìm hiu nhit đ, pH, thi gian nuơi cy đn sinh trưng ca các chng vi khun này. 3.4.1. nh hưng ca ngun carbon lên s sinh trưng ca các chng vi khun Vi khun c đnh đm cĩ th s dng carbon t nhiu ngun khác nhau. Tuy nhiên, khơng phi ngun carbon nào cũng thích hp cho chúng c đnh đm cao. Vì vy, xác đnh ngun carbon thích hp cho nuơi cy vi khun là rt cn thit. Tin hành nuơi cy 4 chng vi khun chn lc trên mơi trưng vơ đm Ashby vi s thay th các ngun carbon khác nhau. Sau 5 ngày nuơi cy xác đnh hàm lưng nitơ tng s (mc 2.3.4.1). Kt qu đưc trình bày trong bng 3.14 và biu đ 3.12 Bng 3.14. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn đưc nuơi cy t các ngun carbon khác nhau. Ngun carbon Glucose Saccharose Tinh bt Az 15.2 241,33 a 185,10 c 72,63 de Az 3.1 222,59 ab 91,38 d 39,83 f Chng Az 3.2 213,21 abc 100,75 d 31,56 g Az 7.2 203,84 bc 96,06 d 53,89 ef CV % 9,28 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) Theo bng 3.14. cho thy sau khi nuơi cy 4 chung này tin hành xác đnh hàm lưng nitơ t do thì mi chng đu thu đưc mt hàm lưng nht đnh. C th chng Az 3.2 khi s dng ngun carbon là glucose thì hàm lưng nitơ tng s thu đưc là 213,21 (mg/l), hàm lưng nitơ tng s thu đưc t các chng
Az 3.1, Az 15.2, Az 7.2 tương ng là 222,59 (mg/l), 241,33 (mg/l), 203,84 (m/l) khi s dng ngun carbon là glucose, vi hàm lưng thu đưc như vy thì mc phân hng tương ng là a, ab, abc, bc. Đi vi ngun tinh bt thì s hàm lưng nitơ tng s thu đưc thp. T bng 3.14. thì s c đnh nitơ ca chng vi khun Az 3.2 khi s dng ngun carbon là tinh bt thì hàm lưng đm thu đưc thp nht là 31,56 (mg/l), chng Az 3.1 là 39,83 (mg/l), chng Az 7.2 là 53,89 (mg/l) vi mc phân hng tương ng là de, f, g, ef. Cịn khi s dng ngun carbon là saccharose thì hàm lưng đm thu đưc thp nht là ca chng Az 3.1 là 91,38 (mg/l), chng Az 7.2 là 96,06 (mg/l), chng Az 3.2 là 100,75 (mg/l), chng Az 15.2 là 185,10 (mg/l) vi mc phân hng tương ng là c, d, d, d. Vi s liu và mc phân hng nh ư trên cho thy cùng mt ngun carbon thì gia các chng khơng cĩ s chênh lch v hàm lưng nitơ. Tuy nhiên cùng mt chng nhưng vi các ngun carbon khác nhau thì cĩ s khác bit rt ln v hàm lưng nitơ, điu này th hin rõ trong biu đ 3.12. Hàm lưng nitơ tng s ca các chng VK tuyn chn các ngun carbon khác nhau 300 a 250 ab abc bc 200 c Glucose 150 Saccharose Tinh bt d 100 d d de ef (mg/l) s Hàmtng nitơ lưng 50 f g 0 Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 Az 7.2 Các chngChng vi VKkhun Azotobacter sp. Biu đ 3.12. nh hưng ca ngun carbon đn kh năng c đnh đm ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. đưc tuyn chn
Mi lồi cĩ kh năng s dng ngun carbon khác nhau, cĩ lồi thích hp ngun carbon này mà khơng thích hp ngun carbon kia. Biu đ 3.12. cho thy tt c chng vi khun tuyn chn đu cĩ kh năng c đnh nitơ t do và hàm lưng thu đưc rt cao ngun carbon là glucose. Điu này đưc gii thích do glucose là đưng đơn, vi sinh vt d dàng s dng làm ngun dinh dưng cho mình. Vì vy khơng cĩ s khác bit ln v hàm lưng nitơ tng s thu đưc khi s dng ngun glucose. Cũng cĩ th thay th ngun saccharose tuy nhiên hàm lưng đm thu đưc cũng khơng cao. Khi s dng ngun carbon là tinh bt thì hàm lưng nitơ tng s thu đưc li rt thp, chng t đưng này khơng phi là ngun carbon thích hp cho chúng c đnh đm. Azotobacter sp. khơng cĩ h enzyme amylase hoc cĩ hot tính rt thp đ thy phân tinh bt thành đưng glucose. Tĩm li glucose là ngun carbon thích hp cho s c đnh đm ca bn chng vi khun Azotobacte sp. 3.4.2. nh hưng ca nng đ ngun dinh dưng carbon Nuơi cy các chng chn lc trên các mơi trưng Ashby ci tin (mt đ t bào ban đu là 10 6 t bào/ml) vi s thay đi nng đ glucose. Sau thi gian nuơi cy, tin hành xác đnh hàm lưng đm tng s cho chúng tơi các kt qu như sau.
Bng 3.15. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca bn chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn đưc nuơi cy các nng đ glucose khác nhau Nng đ glucose (%) 1 2 3 4 Az 15.2 44,52 g 246,0a 241,3a 213,2bc Az 3.1 100,8f 157,0e 222,6b 213,2bc Chng Az 3.2 39,83 g 100,8f 199,2cd 194,5d Az 7.2 16,40 h 185,1d 180,4d 194,5cd CV% 4,82 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) T s liu này cho thy khi nng đ glucose càng tăng thì s c đnh đm s càng tăng theo tng chng. Tuy nhiên khơng phi nng đ glucose càng tăng thì hàm lưng đm thu đưc càng tăng mà nĩ ch tăng trong mt mc gii hn nào đĩ. C th Az 15.2 cho hàm lưng nitơ tng s là 44,52 (mg/l) nng đ glucose 1 % nhưng khi tăng nng đ lên 2 % thì s c đnh nitơ vưt lên rt mnh vi hàm lưng là 246,0 (mg/l). Khi tip tc tăng thì hàm lưng đm thu đưc cĩ xu th n đnh và cĩ th gim. Như vy Az 15.2 c đinh mnh khi nng đ glucose 2 %. Cịn đi vi chng Az 3.1, Az 3.2 thì s c đnh đm li din ra mnh nng đ glucose 3 %. Chng Az 7.2 thì s c đnh đm din ra mnh glucose 2 % và n đnh các nng đ tip theo. Tuy nhiên nng đ glucose nm trong khong 2 % – 3 % thì hàm lưng đm thu đưc cao. Cĩ th thy rõ s điu này qua biu đ 3.13.
Hàm lưng nitơ tng s ca các chng VK các nng đ carbon khác nhau 300 a 250 a b bc bc d c cd 200 d d glucose 1% e glucose 2% 150 glucose 3% f f glucose 4% 100 g Hàm lưng nitow tng s (mg/l) s tng nitow lưng Hàm 50 g h 0 Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 Az 7.2 Chng VK Các chng vi khun Azotobacter sp. Biu đ 3.13. nh hưng ca nng đ carbon đn kh năng c đnh đm ca 4 chng vi khun Azotbacter sp. tuyn chn Nhìn vào biu đ cho thy nng đ carbon t 2 % đn 4 % thì s c đnh đm din ra mnh và đng đu các chng. Cịn nng đ glucose 1 % thì s c đnh đm din ra yu điu này chng t khi nng đ thp thì lưng dinh dưng cn thit cho s sinh trưng phát trin ca vi khun thiu do đĩ s c đnh đm cũng din ra thp. Vì vy cn cung cp lưng carbon thích hp nht đ thu đưc hàm lưng nitơ tng s là ti ưu nht. 3.4.3. nh hưng ca nhit đ nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. tuyn chn Mi cơ th vi sinh vt đu chu tác đng ca nhit đ ba gii hn khác nhau: Nhit đ thp nht, nhit đ ti thích và nhit đ cao nht. Chính vì vy nghiên cu nh hưng ca nhit đ đn kh năng c đnh nitơ ca các chng vi sinh vt là cn thit. Chúng tơi tin hành nuơi cy vi sinh vt trên mơi trưng Ashby ba mc nhit đ khác nhau: nhit đ phịng, 30 oC, 35 oC ,40 oC trên máy lc 150 vịng/phút. Sau 4 ngày nuơi cy, tin hành xác đnh hàm lưng nitơ tng s (mc 2.3.4.1). Kt qu đưc trình bày trong bng 3.16. và biu đ 3.14.
Bng 3.16. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca bn chng VK Azotobacter sp. tuyn chn nuơi cy trên các khon nhit đ khác nhau Nhit đ ( oC) 30 35 40 Az 15.2 255,39 a 194,47 cd 77,32 f Az 3.1 202,59 b 227,27 b 30,46 g Chng Az 3.2 185,10 d 208,53 bc 91,38 f Az 7.2 185,10 d 128,87 e 25,77 g CV % 5,42 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01) T bng 3.16 cho thy đi vi chng Az 15.2, Az 7.2 hàm lưng nitơ tng s thu đưc tt nhit đ 30 oC, đi vi chng Az 3.1, Az 3.2 thì c đnh đm tt nhit đ 35 oC, nhit đ 40 oC thì hàm lưng đm c đnh thu đưc thp. C th 30 oC thì chng Az 15.2, chng Az 7.2, thu đưc hàm lưng nitơ tng s cao nht ln lưt là 255,39 (mg/l), 185,10 (mg/l), vi mc phân hng ln lưt là a, d. nhit đ 35 oC thì chng Az 3.1 và Az 3.2 thu đưc hàm lưng đm cao là 227,27 (mg/l), 208,53 (mg/l). T mc phân hng trên cho thy trong cùng nhit đ thì s c đnh đm ca các chng cĩ s khác bit nhau rõ rt. Tương t mi chng nuơi cy trong các nhit đ khác nhau thì hàm lưng nitơ tng s thu đưc cũng cĩ s chênh lch rt ln, điu này th hin rõ trong biu đ 3.14.
Hàm lưng nitơ tng s các nhit đ khác nhau ca 4 chng VK 300 a 250 b b bc cd 200 d d 30 đ C 150 35 đ C e 40 đ C f 100 f hàm lưng nitơ tng s (mg/l) s tng nitơ lưng hàm 50 g g 0 Az15.2 Az 3.1 Az 3.2 Az 7.2 Chng VK Biu đ 3.14. nh hưng ca nhit đ khác nhau đn kh năng c đnh đm ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn. Tc đ phn ng hĩa hc trong t bào đưc quyt đnh bi hot tính enzyme. Nhit đ tăng trưng ti ưu ca mt vi sinh vt phn ánh nhit đ ti ưu cho hot tính ca các enzyme tham gia bin dưng trong t bào. Trong phm vi gii hn nhit đ ca mt enzyme, s tăng 10 0C s làm tăng gp đơi hot tính enzyme. nhit đ quá thp, các phân t ngng di đng và hot tính ca các enzyme b ngng, cịn nhit đ quá cao s làm bin tính enzyme. Qua biu đ 3.14 cho thy c bn chng vi sinh vt các mc nhit đ khác nhau thì đu cĩ s khác bit rõ v kh năng c đnh đm. Kh năng c đnh đm ca bn chng vi sinh vt mnh nhit đ 30 oC – 35 oC. Nhit đ càng cao đn 40 oC thì kh năng c đinh đm ca các chng đu gim dn. Điu này cho thy các vi sinh vt thuc chng Azotobacter sp. đu c đnh đm nhit đ tt nht trong khong t 30 – 35 oC. Chng Az 15.2, chng Az 7.2 c đnh tt nht nhit đ 30 oC. Chng Az 3.2 cịn li thu đưc hàm lưng đm cao 35 oC.
3.4.4. nh hưng ca pH nuơi cy đn sinh khi Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao đã phân lp đưc như sau Đ xác đnh đ pH cho tng chng trong nghiên cu kho xác nh hưng ca pH đn kh năng c đnh đm ca các chng vi sinh vt 4 giá tr pH khác nhau: 6, 7, 8 và 9. Sau 4 ngày nuơi cy trên mơi trưng Ashby, ti mi giá tr pH trên máy lc 150 vịng/phút đem đi xác đnh hàm lưng đm tng s (mc 2.3.4.1). Kt qu đưc trình bày trong bng 3.17 và biu đ 3.15. Qua bng 3.17. Đã xác đnh: các pH khác nhau thì kh năng c đnh đm ca các chng này cĩ s khác bit rõ rt. Chng Az 15.2 pH = 8,0 thì hàm lưng đm thu đưc là 236,64 (mg/l) nhưng pH = 6 thì hàm lưng đm thu đưc ch cĩ 49,2 (mg/l) vi mc phân hng tương ng là a, f. Như vy trong cùng mt chng thì cĩ s chênh lch ln v hàm lưng nitơ tng s khi nuơi cy các pH khác nhau. pH = 9 thì s c đnh đm din ra rt thp đi vi hai chng Az 3.2 và Az 7.2 mc c đnh thp nht là f. Điu đĩ th hin biu đ 3.15. Bng 3.17. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng VK Azotobacter sp. tuyn chn đưc nuơi cy các pH khác nhau pH 6,0 7,0 8,0 9,0 Az 15.2 49.20 f 227.27 ab 236.64 a 114.81 de Az 3.1 25.77 f 105.44 de 222.59 ab 100.75 e Chng Az 3.2 82.01 e 208.53 abc 138.24 d 25.77 f Az 7.2 185.10 c 199.16 bc 110.12 de 30.46 f CV % 9.97 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim phân hng LSD vi mc ý nghĩa 0,01)
Da trên nhng s liu thu đưc, nhn thy rng bn chng vi sinh vt tuyn chn đu cĩ kh năng c đnh đm trong dãy pH nghiên cu (pH 5 – 9,5). Tuy nhiên quá trình c đnh đm cao vùng (pH 7 8). Đi vi chng Az 3.2 quan tâm và Az 7.2 thì s c đnh đm mnh pH =7. Hai chng cịn li là Az 15.2 và chng Az 3.1 c đnh đm mnh pH = 8. Như vy hu ht các chng vi sinh vt đu c đnh đm tt pH hơi kim. Tuy nhiên chng Az 3.2 c đnh đm mnh PH = 7 Hàm lưng nitơ tng s ca các chng VK pH khác nhau 250 a ab ab abc 200 bc c 150 pH=6 d pH=7 de de de e pH=8 100 pH=9 e f (mg/l) s Hàmtng nitơ lưng 50 f f f 0 Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 Az 7.2 Chng VK Biu đ 3.15. nh hưng ca các giá tr pH khác nhau lên kh năng c đnh nitơ ca bn chng vi khun Azotobacter sp. đưc tuyn chn 3.4.5 nh hưng ca thi gian nuơi cy đn sinh khi ca các chng Azotobacter sp. Nuơi cy bn chng chn lc trên mơi trưng Ashby vi các điu kin thích hp đã xác đnh trên vi thi gian nuơi cy khác nhau. Xác đnh hàm lưng
đm tng s thu đưc (mc 2.3.4.1). Các kt qu đưc trình bày bng 3.18 và biu đ 3.16 Bng 3.18. Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn nuơi cy các thi gian khác nhau Thi gian nuơi cy 2 3 4 5 (ngày) Az 15.2 44,52 hi 67,95 gh 194,5d 241,3a Az 3.1 82,01 fg 152,3e 227,3ab 222,6abc Chng Az 3.2 25,78 i 58,57 gh 152,3e 208,5bcd Az 7.2 96,07 f 194,5d 199,2cd 199,2cd CV,% 6,80 Mc ý nghĩa (Các tr s cĩ các ch cái ging nhau cùng mt ct cĩ s khác bit theo trc nghim Biu đ 3.16. nh hưng v thi gian nuơi cy lên kh năng c đnh nitơ ca 4 chng vi khun khun Azotbacter sp. tuyn chn Kt qu bng 3.18. cho thy nu thi gian nuơi cy càng tăng thì hàm lưng nitơ tng s thu đưc càng tăng cao. Đi vi chng Az 15.2 hàm lưng đm thu đưc cao nht là 241,3 (mg/l) ngày th 5, cịn thp nht là 44,52 (mg/l) ngày th 2. Đi vi chng Az 3.2 hàm lưng đm thu đưc cao nht là 208,53 (mg/l) ngày th 5, tương t các chng cịn li hàm lưng đm cũng tăng dn theo thi gian nuơi cy. T biu đ 3.16. cho thy mt đ t bào và kh năng c đnh đm tăng dn theo thi gian nuơi cy t ngày th hai đn ngày th năm và đt giá tr cc đi ti ngày th 5. Các chng đu cĩ s c đnh nitơ tăng theo thi gian nuơi cy đn mt gii hn nht đnh chúng s dng li. Đi vi chng Az 15.2 thì s c đnh nitơ tăng liên tc và cĩ s nhy vt t ngày th ba và ngày th tư, đn ngày th
năm thì s c đnh nitơ cũng cĩ tăng nhưng chm. Cịn đi vi chng Az 3.1 thì hàm lưng nitơ tng s tăng t ngày th hai đn ngày th 4 nhưng qua ngày th năm thì hàm lưng nitơ li gim xung tương t các chng cịn li cũng tăng mnh đn ngày th tư và n đnh. Điu này chng t khơng phi thi gian nuơi cy càng dài thì s c đnh nitơ ca các chng vi khun càng cao. S c đnh đm ca các chng vi khun din ra mnh trong gii hn thi gian ca chúng nu thi gian ngn thì s c đnh đm thp nu thi gian vưt qua gii hn ti ưu thì s c đnh đm khơng tăng na thm chí cĩ th gim. Đ cĩ th ng dng đưc các chng trên vào trong thc tin chúng tơi tin hành xác đnh điu kin nuơi cy thích hp cho s tăng sinh ca các chng tuyn chn và s nh hưng ca mt vài yu t như ngun carbon, nng đ carbon, nhit đ, giá tr pH và thi gian nuơi cy lên kh năng c đnh đm. Sau quá trình nghiên cu, nhn thy bn chng tuyn chn cĩ nhng đim tương đng vi nhng tài liu trưc đĩ v vi khun c đnh đm Azotobacter sp. 300 a 250 a abc bcd cd cd 200 d d 2 ngày e e 3 ngày 150 4 ngày f 5 ngày 100 fg gh gh Hàm lưng nitơ tng s (mg/l) nitơtng s lưng Hàm 50 hi i 0 Az 15.2 Az 3.1 Az 3.2 Az 7.2 Chng VK Biu đ 3.16. nh hưng v thi gian nuơi cy lên kh năng c đnh nitơ ca 4 chng vi khun Azotobacter sp. tuyn chn
KT LUN VÀ KIN NGH 4.1 Kt lun Qua quá trình thc hin đ tài, bưc đu cĩ nhng kt lun sau: + Phân lp và mơ t đưc 24 chng vi khun sinh trưng trên mơi trưng vơ đm Ashby, trong đĩ cĩ 10 chng vi khun loi đt Bazan nâu đ (Buơn Ma Thut, Krơng Ana), 14 chng vi khun Đt xám (Ea kar, Buơn Đơn) thuc đa bàn tnh Đăk Lăk. + S dng k thut PCR phát hin đon gene nif H vi kích thưc 400 bps đc trưng cho vi khun c đnh nitơ Azotobacter 24 chng phân lp và đnh danh đưc 6 chng là vi khun Azotobacter sp. là Az 15.2; Az 3.1; Az 3.2; Az 7.2; Az 2.1 và Az 10.2. + Tuyn chn đưc 4 chng Azotobacter sp. cĩ kh năng c đnh nitơ cao là Az 15.2; Az 3.1; Az 3.2 và Az 7.2, trong đĩ chng Az 15.2 cĩ hàm lưng nitơ tng s cao nht là 236.64 (mg/l). Tuyn chn đưc chng Azotobacter sp. Az3.2 cĩ kh năng sinh tng hp IAA cao, trong đĩ kh năng tng hp IAA ca chng Az.3.2 là 5.2 mg/lit và kh năng tng hp nitơ khá cao. + Các chng vi khun c đnh nitơ Azotobacter sp. tuyn chn cĩ nh hưng tt làm gia tăng năng sut ca rau ci ngt t 3060% so vi đi chng. Chng Az 3.2 cĩ hot tính tăng cưng sinh trưng ca rau ci ngt mnh nht. + Xây dng đưc qui trình nuơi cy các chng vi khun c đnh nitơ t do Azotobacter sp . trong đĩ chng Az 3.2 tuyn chn vi các thơng s như: mơi trưng thích hp là Ashby vi ngun Carbon là Glucose 3%; nhit đ ti ưu cho nuơi cy các chng tuyn chn là 3035 OC; pH ti ưu cho nuơi cy là t pH 7.0 8.0; thi gian nuơi cy ti ưu là 45 ngày.
4.2 Kin ngh 1. Tip tc nghiên cu hiu qu ca các chng Azotobacter sp. cĩ hot tính c đnh nitơ cao đn s sinh trưng , phát trin và kh năng ny mm ca mt s loi cây cơng nghip Tây Nguyên. 2. Tip tc nghiên cu s tác đng qua li gia các chng Azobacter sp . vi các chng vi sinh vt cĩ ích khác khu trú trong đt và sng cng sinh vi cây h đu đn sinh trưng, phát trin và năng sut ca mt s lồi cây cơng nơng nghiêp đa bàn tnh Đăk Lăk, t đĩ cĩ bin pháp hp lý đ sn xut phân vi sinh chuyên dùng cho mt s lồi cây nơng nghip.
TÀI LIU THAM KHO Tài liu ting Vit 1. Nguyn Thi Phương Chi, Phm Thanh Hà, Nguyn Th Thi, H Kim Anhvà Nguyn Thi Quỳnh Mai (1999), Phi hp các chng Vi Khun c đnh Nitơ và Vi Khun hồ tan Pht phát đ nâng cao hiu qu ch phm phân Vi sinh, Nhà xut bn Khoa hc K thut. 2 Nguyn Lân Dũng (1972), Mt s phương pháp nghiên cu vi sinh vt hc , nhà xut bn khoa hc và k thut Hà Ni. 3. Nguyn Lân Dũng, Nguyn Đình Quyn và Phm Văn Ty (2009), Vi sinh vt hc . Nhà xut bn Giáo dc. 4. Nguyn Lân Dũng, Phm Th Trân Châu, Nguyn Thanh Hin, Lê Đình Lương, Đinh Xuân Mưu và Phm Văn Ty (1977), Mt s phương pháp nghiên cu vi sinh vt (tp 3). Nhà xut bn Khoa hc K thut. 5. Phm Bích Hiên và Phm văn Ton (2003), Nghiên cu tuyn chn mt s chng Azotobacter đa hot tính sinh hc s dng cho sn xut phân bĩn vi sinh vt chc năng , Vin khoa hc k thut Nơng NghipVit Nam. 6. Phm Th Ngc Lan vàTrương Văn Lung (1999), Bưc đu nghiên cu vi khun Azotobacter trong đt vùng gị đi tnh Tha Thiên – Hu. Đi Hc Khoa Hc –Đi Hc Hu. 7. Phm Th Ngc Lan vàVõ Th Mai Hương (1999), Gĩp phn nghiên cu vi khun c đnh Nitơ sng t do trong đt hoa màu Tha Thiên Hu. Đi hc Khoa hc, Đi hc Hu. 8. Nguyn Th Hng Minh (2005), Nghiên cu hiu qu ca vic c đnh t bào vi khun c đnh đm t do Azotobacter trong khuơn gel Chitosan.
9. Đồn Th Như (2010), Kho sát vi sinh vt c đnh đm trên đt trng cà phê ti xã EakaoThành Ph Buơn Ma Thut , Đi Hc Tây Nguyên. 10. Phm Văn Ton (1999), Kt qu nghiên cu trin khai cơng ngh sn xut phân bĩn vi sinh vt dng tim sinh , vin khoa hc k thut nơng nghip. 11. Trn Linh Thưc, Nguyn Đc Hồng, Phan Th Phưng Trang và Phm Th Hng Tươi (2001), Thc tp vi sinh vt hc, nhà xut bn đi hc quc gia TP. H Chí Minh 12. Bch Văn Tương (2006 ), Đánh giá bin đng dinh dưng đt & vi sinh vt đt trên mt s h thng cây trng chính Đăk Lăk. 13. Trn Linh Thưc (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vt trong nưc, thc phm, m phm. NXB Giáo dc. 14. Trn Cm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vt hc mơi trưng , Nxb Đi hc quc gia Hà Ni. 15. Nguyn Kim Vũ, Nguyn Ngc Quyên, Nguyn Thu Hà, Phm Văn Ton, và Trn Tú Thy (1999), Mt s phương pháp lưu gi chng Vi sinh vt c đnh Nitơ. Nhà xut bn Khoa hc K thut. Tài liu ting Anh 16. Abdel Wahap, A. M., and P. F. Wareing (1980). Nitrogenase activity associated with the rhizosphere of inoculation of seedlings with Azotobacter . New Phytol, 84, 711721 17. Bagyaraj, D. J. (1979), Interaction between a va mycorrhiza and Azotobacter and their effectts on rhizosphere microelora anh plant growth. New Phytol, 80, 567573. 18. Elkomy (2005), Coimmobilization of Azospirillum lipoferum and Bacillus megaterium for successful phosphorous and nitrogen nutrition of wheat plants, Food Technol. Biotechnol . 43(1) 1927.
19. Huub Haaker anh Cees Veeger (1976). Ivolvement of the cytoplasmic membrane in Nitrogen Fixation by Azotobacter vinelandii , Eur. J. Biochem . 77, 110. 20. Nikaido, H. (1999), Mircobial Biotechnology, California University, Berkeley, USA. 21. Puneet, K.;and Sohal R.P (1998). Effect of innoculation of Azotobacter and PSN on fertilizer economy, plant growth and yield of winter maize, Nitrogen fixation with non legumes, Kluwer Academic Publisher , p. 271273. 22. Puneet K.Sohal, R.P. Gupta, M.S Pandher (1998) Effect of inoculation, os Azotobacter and PSN on fertiliziar economy, plant growth & yield of winter maier. Nitrogen fixation with non – legumes, Kluwer Academ publishers, 271 – 273. 23. Rajeswari K and Mangai kasthuri G,(2009), “Molecular characterization of Azotobacter ssp nifH from marine source” Afican journal of Biotechnology vol 8(24), pp 68506855. 24. Shabave V. P., Smolin V. Y., Strekozova V. I, (1991), The effects of Azotobacter brasilense sp7 and Azotobacter chroococcum on nitrogen blance in soil under cropping with oats. Biology and Fertility of Soils , pp 290 292. 25. Vivek Kuman, Rishi Kumar Behl and Narula (2001). Establishment of phosphat solubilizing strains of Az otobacter chroococcum in the rhizosphere and their effect on wheat cultivars under green house conditions. Microbiol.Res. 156, 87 93 26. Vermani, M. V., S.M. Kelkar and M.Y.Kamat (1997)Studies in polysaccharide production and grounth of Azotobacter Vinelandii MTCC 2459, a plant rhizosphere isolate , Letters in applied Microbiology,24,379383 27. Vera Lucia, D. Baldani and Johanna Dobereiner (1979), “Hostplant specificity in the infection of cereals with Azospirillum spp”, Soil Biol Biochem , Vol 26, pp 433 439.
PH LC 1. Các hình nh ca đ tài. Az 2.2 Az 1.1 Az 4.1 Az 5.2 Az 10.1 AzAz 2.1 3.1
Az 5.2 Az 11.1 Az 8.1 Az 12.1 Az 16 Az 14.1
Az 3.1 Az 20 Az 7.2 Az 3.2 Az 22 Az 21
Az 23 Az 10.2 Az 15.2 Az 24 Az 17 Az 18 Hình 1.1 hình nh 24 chun vi khun nghi ng là Azotobacter sp. đưc phân lp trên mơi trưng Ashby đã thun ging
Az 3.1 Az 3.2 Az 7.2 Az 15.2 Hình 1.2. Hình nh nhum gram ca 4 chng vi khun đưc tuyn chn trong 24 chng phân lp trên mơi trưng Ashby
1.4. Mt s hình nh cây ci ngt sau khi đưc x lý các chng vi khun Azotobacter sp. Hình 1.3.1 nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn s lá ca cây ci ngt.
Hình 1.3.2 nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao ca cây ci ngt.
Hình 1.3.3. nh hưng ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn khi lưng r ca cây ci ngt.
1.4 Mt s hình nh cây ci ngt sau khi đưc x lý mt đ ca các chng vi khun Azotobacter sp. Hình 1.4.1 nh hưng mt đ ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn s lưng lá ca cây ci ngt.
Hình 1.4.2. nh hưng mt đ ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn chiu cao ca cây ci ngt.
Hình 1.4.3. nh hưng mt đ ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn din tích lá ca cây ci ngt.
Hình 1.4.4nh hưng các mt đ ca các chng vi khun Azotobacter sp. đn khi lưng r ca cây ci ngt.
2. Các bng ph Bng 3.1:Hàm lưng đm ca 7 chng vi khun Azotobacter sp S ln đo Ln 1 Ln 2 Lân 3 Trung bình Chng VK Az 2.1 118.75 119.42 120.25 119.49 Az 3.1 217.15 217.85 216.90 217.90 Az 3.2 206.12 210.35 209.12 208.53 Az 7.2 185.12 211.08 187.21 194.47 Az15.2 237.03 237.27 235.62 236.64 A10.2 29.83 30.54 31.01 30.46 D6 221.56 230.10 213.02 221.56 Data file: HÀM LƯNG ĐM CA 7 CHNG VK Azotobacter sp Title: Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 21 Factorial ANOVA for the factors: Replication (Var 1: lanlaplai) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: chungvk) with values from 1 to 7 Variable 3: dam Grand Mean = 175.490 Grand Sum = 3685.300 Total Count = 21 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total 1 * 173.651 1215.560 2 * 179.516 1256.610
3 * 173.304 1213.130 * 1 119.473 358.420 * 2 217.300 651.900 * 3 208.530 625.590 * 4 194.470 583.410 * 5 236.640 709.920 * 6 30.460 91.380 * 7 221.560 664.680 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob 1 Replication 2 170.549 85.274 2.5284 0.1213 2 Factor A 6 99699.880 16616.647 492.6919 0.0000 3 Error 12 404.715 33.726 Total 20 100275.143 Coefficient of Variation: 3.31% s_ for means group 1: 2.1950 Number of Observations: 7 y s_ for means group 2: 3.3529 Number of Observations: 3 y Trc nghim phân hng kh năng c đnh N ca 6 chng vi khun Azotobacter sp phân lp đưcvà 1 chng D6 làm đi chng Data File :Keyboard Function : RANGE Error Mean Square = 33.67 Error Degrees of Freedom = 6 No. of observations to calculate a mean = 21 Duncan's Multiple Range Test
LSD value = 6.639 s_ = 1.266 at alpha = 0.010 x Original Order Ranked Order Mean 1 = 119.5 E Mean 5 = 236.7 A Mean 2 = 217.3 B Mean 7 = 221.6 B Mean 3 = 208.5 C Mean 2 = 217.3 B Mean 4 = 194.5 D Mean 3 = 208.5 C Mean 5 = 236.7 A Mean 4 = 194.5 D Mean 6 = 30.46 F Mean 1 = 119.5 E Mean 7 = 221.6 B Mean 6 = 30.46 F Bng 3.2:HÀM LƯNG IAA CA 7 CHNG VK Azotobacter sp S ln đo Ln 1 Ln2 Lân 3 Trung bình Chng VK Az 15.2 0.572 0.661 0.498 0.577 Az 3.1 0.52 0.542 0.711 0.591 Az 3.2 5.078 4.982 5.558 5.206 Az 7.2 1.502 1.658 1.742 1.634 Az15.2 0.923 0.729 0.943 0.865 A10.2 0.423 0.478 0.641 0.514 D6 1.653 1.545 1.725 1.641 Data file: IAA Title: Function: FACTOR Experiment Model Number 7: One Factor Randomized Complete Block Design Data case no. 1 to 21. Factorial ANOVA for the factors:
Replication (Var 1: SO LAN LAP LAI) with values from 1 to 3 Factor A (Var 2: CHUNG VI KHUAN) with values from 1 to 7 Variable 3: IAA Grand Mean = 1.575 Grand Sum = 33.084 Total Count = 21 T A B L E O F M E A N S 1 2 3 Total 1 * 1.524 10.671 2 * 1.514 10.595 3 * 1.688 11.818 * 1 0.577 1.731 * 2 0.591 1.773 * 3 5.206 15.618 * 4 1.634 4.902 * 5 0.865 2.595 * 6 0.514 1.542 * 7 1.641 4.923 A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E K Degrees of Sum of Mean F Value Source Freedom Squares Square Value Prob 1 Replication 2 0.134 0.067 4.2095 0.0412 2 Factor A 6 50.358 8.393 526.7328 0.0000 3 Error 12 0.191 0.016 Total 20 50.684 Coefficient of Variation: 8.01%