Luận văn tốt nghiệp khoa Công nghệ Sinh học: Động vật

Nội dung text: Luận văn tốt nghiệp khoa Công nghệ Sinh học: Động vật

1. Công nghệ sinh học ĐộngVât LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Động Vật 1
2. Công nghệ sinh học ĐộngVât LỜI CẢM ƠN Với nhu cầu tìm tòi, học hỏi và trao đổi kinh nghiệm, nhóm chúng em đã cùng nhau thảo luận và hình thành nên một bài tiểu luận về đề tài thuộc Công nghệ sinh học động vật. Nhóm sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ cũng như sự hướng dẫn tận tình của thầy Quan Quốc Đăng – Thạc sĩ và cũng là giáo viên phụ trách bộ môn Công nghệ sinh học động vật. Đồng thời toàn thể nhóm cũng muốn gửi lời cảm ơn về phía trường Đại học Công nghiệp TpHCM đã hỗ trợ cho chúng em trong quá trình hoàn thành bài tiểu luận bằng cách cung cấp những kiến thức cơ bản thông qua sự trao đổi trực tiếp giúp chúng em định hướng được mình nên làm những gì. Tuy nhiên đây là lần đầu tiên chúng em được tiếp cận với môn học này cho nên việc mắc phải sai sót là không sao tránh khỏi. Vì vậy chúng em mong nhận được những ý kiến đóng góp để dần hoàn thiện hơn những kiến thức của mình đã có. Xin chân thành cảm ơn! Đại diện nhóm Ngọc Hương 2
3. Công nghệ sinh học ĐộngVât NỘI DUNG 2.3.4 Chuyển gen qua con đường tế bào 2.3.4.1 Việc sử dụng tế bào tế bào toàn năng và thế hệ của chimaerae 2.3.4.2 Cách sử dụng tế bào đã được biệt hóa và những dòng động vật vô tính 2.3.5 Vectơ dùng bổ sung gen 2.3.5.1 Những đoạn vectơ ngắn nhất 2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại 2.3.5.3 Vector transposon 2.3.5.4 Vectơ Retroviral 2.3.5.5 Vectơ bổ sung 3
4. Công nghệ sinh học ĐộngVât NỘI DUNG 2.3.4 Chuyển gen qua con đường tế bào Để tránh khó khăn trong quá trình vi tiêm, phương pháp này có thể được dùng để chuyển gen vào các tế bào và sử dụng chúng để tạo phôi. Phương pháp này được sử dụng khi thay thế gen bằng gen tương đồng tái kết hợp. Quá trình này rất hiếm và đòi hỏi sự lựa chọn chính xác các dòng tế bào xảy ra quá trình tái kết hợp tương đồng. Điều này gián tiếp tạo ra các dòng tế bào vô tính. Các tế bào này phải được giữ lại các đặc tính để tham gia vào sự phát triển của phôi. Hiện nay có hai hướng nghiên cứu chính. 2.3.4.1 Việc sử dụng các tế bào tế bào toàn năng(pluripoten) và thế hệ của chimaerae Các tế bào tế bào toàn năng có thể tạo ra tất cả các bộ phận cơ thể của một sinh vật (Hình 2,1).Phương pháp thu nhận các tế bào tế bào toàn năng đang được sử dụng là đưa nó vào phôi sớm khi đang ở giai đoạn cầu morula hoặc phôi nang, sau đó sẽ phát triển tới chimaeric. Cần nhớ lại rằng một Chimaera được hình thành bởi các tế bào hỗn hợp từ động vật khác nhau. Mỗi tế bào Chimaera, bao gồm các giao tử, bắt nguồn từ người cho hoặc người nhận phôi. Đây là những khác biệt cơ bản của cơ thể lai, do bộ gen từ hai sinh vật đang ở trong cùng một tế bào sau quá trình thụ tinh. Dòng tế bào tế bào toàn năng đã được thiết lập ở chuột. Các dòng tế bào có nguồn gốc từ phôi sớm được gọi là tế bào ES (tế bào gốc phôi thai). Các tế bào tế bào toàn năng thu được từ tuyến sinh dục của bào thai được gọi là các tế bào EG (tế bào phôi mầm). Các tế bào toàn năng là dòng tế bào đầu tiên được bắt nguồn từ một teratocarcinoma (một dạng u ác tính ở tinh hoàn) và do đó được gọi là EC (tế bào phôi ung thư biểu mô). Các tế bào EC có thể tham gia vào sự phát triển của phôi chimaeric nhưng không tham gia sự hình thành giao tử. Chỉ có một số lượng nhỏ dòng tế bào ES có thể sử dụng. Tất cả đều là tế bào gốc thu được từ một hay hai dòng chuột. Pluripotency có thời gian tồn tại rất ngắn. Các tế bào Tế bào toàn năng có công suất cao để nhân giống in vitro nhưng chúng tự 4
5. Công nghệ sinh học ĐộngVât phát sinh những điểm khác biệt và trở thành các tế bào multipotent (tế bào đa chức năng). Điểm khác biệt của các tế bào tế bào toàn năng lá ở chỗ có thể tham gia vào sự phát triển của phôi ở một mức độ nào đó nhưng không thể trở thành giao tử. Do đó các tế bào ES phải được duy trì ở trạng thái tế bào toàn năng trong suốt toàn bộ quá trình nhằm tạo ra các động vật chimaeric có khả năng di truyền gen của chúng cho con cháu. Các pluripotency của các tế bào ES được duy trì bằng cách thêm vào những nhân tố của môi trường tự nhiên. Đã có rất nhiều nỗ lực nhằm tạo ra dòng tế bào ES từ dòng chuột khác và từ các loài khác nhưng không thành công. Tốt nhất, nên thu nhận từ những động vật không phát sinh phôi. Hiện chưa rõ tại sao dòng tế bào ES chỉ có thể được bắt nguồn từ hai dòng chuột. Bất kỳ nguyên nhân nào, những dòng này xuất hiện hiếm khi xuất hiện những trường hợp ngoại lệ và thực tế là tế bào toàn năng tế bào không thể được duy trì trong quá trình này được coi là bình thường.Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây cho thấy những quan điểm này cần phải xem xét lại. Những tế bào Tế bào toàn năng có khả năng truyền các gen của chúng cho con cháu đã được mô tả trên gà và medaka. Vẫn còn quá sớm để khẳng định các tế bào này tương đương với dòng tế bào ES ở chuột. DNA bên ngoài có thể được bổ sung vào các tế bào ES và quá trình nuôi dưỡng các gen này có thể được thiết lập bằng cách sử dụng một gen lựa chọn. Các tế bào này có thể được được sử dụng để tạo ra chuột biến đổi gen chimaeric. Phương pháp này ít hơn nhiều khó khăn và kém hiệu quả hơn vi tiêm. Đó là lý do nó chỉ được sử dụng để thay thế bằng các gen tương đồng tái tổ hợp (hình 2,10) 5
6. Công nghệ sinh học ĐộngVât Hình 2.10 2.3.4.2 Cách sử dụng tế bào đã được biệt hóa và những dòng động vật vô tính Những DNA ngoại sẽ được thêm vào những tế bào khác bằng phương pháp chuyển vị. Những tế bào chứa gen cần quan tâm có thể được nhân giống vô tính bởi một gen được chọn. Những tế bào này sau đó có thể là nguồn nhân cho những dòng động vật vô tính sẽ được chuyển gen. ( Hình 2.11) Quá trình sinh sản của Dolly được theo dõi sớm bởi phương pháp chuyển gen vô tính trên cừu tên là Polly ( Schnieke và cộng sự, 1997 ). 6
7. Công nghệ sinh học ĐộngVât Hình 2.11 Ưu điểm của phương pháp nối gen là nó dễ dàng được nhân rộng. Có thể sử dụng số lượng cừu ít hơn từ 2 đến 5 lần so với phương pháp vi tiêm để tạo ra số lượng cừu chuyển gen tương ứng. Gen hợp nhất có thể được khảo sát trong tế bào trước khi chuyển nhân vào . Những tế bào có gen ngoại bị thay đổi hoặc có nhiều bản 7
8. Công nghệ sinh học ĐộngVât sao sẽ bị loại bỏ. Giới tính động vật hoặc kiểu hình của gen cho sẽ được chọn ra. Những động vật không thích hợp sẽ không được sử dụng cho quá trình chuyển gen. Mặc dù nhân dòng vô tính là kỹ thuật khó, nhưng nó đem đến tính linh hoạt trong các thí nghiệm. Những tế bào cho nhân có thể được làm đông và được sử dụng trong chuyển gen vô tính ở động vật. Đoạn gen thay thế được thu nhận từ cừu (McCreath và cộng sự, 2000) trên chuột (Rideout và cộng sự, 2000) và trên heo (Lai và cộng sự, 2002; Butler, 2002). Phương pháp này rất phức tạp và khó kiểm soát. Một nghiên cứu gần đây cho thấy rằng sự tái tổ hợp của hai gen đồng chức năng có thể được thu nhận từ tế bào cừu nhưng những động vật được sinh sản vô tính này thường bị chết (Denning và cộng sự, 2001). Sự thất bại của việc này có thể là do quá trình nuôi dưỡng và vì vậy cần có sự lựa chọn thích hợp hơn để quá trình tái tổ hợp tương đồng có thể xảy ra . Điều kiện môi trường nuôi dưỡng làm thay đổi trạng thái sinh lý của tế bào từ đó làm giảm khả năng sống của các dòng tế bào động vật mà vẫn chưa hiểu được nguyên nhân. Một sự hiểu biết tốt hơn về hiện tượng này là cần thiết trước khi có thể chuyển gen vào các động vật lớn với tỷ lệ thành công cao. Điều này cũng đúng với chuột. Mặc dù sự thay thế gen bởi chimaeric vẫn còn khó khăn nhưng nó vẫn còn đơn giản hơn phương pháp tạo dòng vô tính. 2.3.5 Vectơ dùng bổ sung gen 2.3.5.1 Những đoạn vectơ ngắn nhất Trong hầu hết các trường hợp, các nhà nghiên cứu sử dụng những mảnh vụn vectơ có chứa khoảng 1 hay 2 gen, hoặc chuẩn bị những gen chức năng được cấu tạo từ các thành tố khác nhau. Mảnh vụn của các vectơ mang trên mình những vùng được sao lại đúng thứ tự sau khi tách ra từ đoạn sớm. Thật vậy, cả 1 vòng vectơ kết hợp chậm hơn là 1 đoạn ngắn, không những thế, cả 1 chuỗi plasmid thường gây cản trở hoặc thậm chí là tiêu hủy quá trình kết hợp chuyển gen. Điều này đúng với cả 5 loại vectơ: plasmid, cosmid, thể thực khuẩn, BAC và YAC. Tuy nhiên, một số nghiên cứu của sinh viên lại cho kết quả trái ngược với BAC, loại vectơ mà cả vòng có khả năng kết hợp tốt hơn 1 mảnh thuộc vòng. Nói cách khác, vectơ tồn trữ 1 đoạn gen dài ít bị phá vỡ bởi các tác động tĩnh của chuỗi tế bào prokaryote. Điều này dễ dẫn tới việc 8
9. Công nghệ sinh học ĐộngVât xuất hiện các tác nhân cô lập trong những đoạn gen dài hoặc xảy ra các hiệu ứng khoảng cách. Những đoạn DNA không chứa các chuỗi vòng thực hiện liên kết tương đối chậm. Và vì một số nguyên nhân chưa được làm rõ, một số DNA được thêm vào mang đến cho chúng ta 1 số lượng lớn những loài động vật chuyển gen hơn là những DNA cùng loại khác. Một mặt, những DNA này có thể được sinh ra bởi sự xuất hiện của những chuỗi có khả năng nhận dạng các đoạn gen thường gặp trong đoạn thêm vào. Mặt khác, vài đoạn được nối có thể chứa những chuỗi thiên về sao chép, và sự hiện diện của chúng trong phôi hỗ trợ đáng kể cho quá trình liên kết. 2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại Cơ chế của quá trình tích hợp được mô tả ở mục 2.3. dẫn đến phát hiện sự lien quan giữa những trình tự của đoạn chêm vào và trong bộ gen. Sự kết hợp này thường nên được tối ưu hóa bằng sự có mặt của cả 2 bộ ba kết thúc, mà 1 nằm trong đoạn chêm được sao chép 1 cách gần như hoàn chỉnh từ bộ gen ban đầu, ngay cả khi chúng bị làm cho kém đi hoặc thoái hóa hơn.Từ một số thí nghiệm, ta thấy điều này là đúng. Ở bò, 1 trình tự xuất hiện nhiều lần tại trung đoạn và được gắn vào trung đoạn để thúc đẩy cho quá trình liên kết. Trong trường hợp cá biệt này, hoạt động chuyển gen vẫn ở dạng tĩnh. Điều này dẫn đến việc trung đoạn – vùng không xảy ra quá trình sao chép – cũng xuất hiện sự chuyển gen. Một số thử nghiệm đã được tiến hành trên chuột, nơi đoạn Alu được sử dụng làm vật chất sao chép. Đoạn Alu, chứa khoảng 200 – 300 nucleotide, có số lượng khá dồi dào trong bộ gien của động vật có vú, đặc biệt trong những khu vực hiếm hoặc không xảy ra sự sao chép. Một số đoạn Alu được sao mã bởi RNA polymerase III, làm tăng hoạt độ của những ARN có chức năng chưa rõ ràng hoặc vô hiệu. Nhiều thí nghiệm với sự tham gia của một nhóm các nhà nghiên cứu cho thấy rằng tần suất liên kết được gia tăng khi ta gắn vào đó trình tự có chứa đoạn Alu. Tuy nhiên, kết luận này lại không được một nhóm khác chấp nhận, vì họ cho rằng, hiệu quả trên có thể yếu đi phụ thuộc đoạn gắn vào 2.3.5.3 Vector transposon Transposons là những đoạn gen dài dưói 2 kb, mà nhiều bản sao của nó sẽ xuất hiện trong bộ gen ở những vị trí tùy ý. Những đoạn Transposon đựoc phiên mã thành RNAs, sau đó nó sẽ được phiên mã ngược để tạo thành mạch đôi DNAs rồi hòa nhập 9
10. Công nghệ sinh học ĐộngVât vào bộ gen với hiệu quả cao. Sự hòa nhập đó được điều khiển bởi một transpoase ( nó là 1 enzyme được đính vào cuối transposon và xúc tác sự di chuyển của transposon tới các phần khác của bộ gen bằng 1 quy trình cắt và dán hay là sự sao chép chuyển đổi) được mã hóa bởi transposon và còn được bằng ITRs( hình 2.12). Quy trình này cho phép transposon trải ra nhanh chóng và tỏa khắp bộ gen, nhưng đôi khi lại gây hiện tượng bất hoạt gen trong một số trưòng hợp. Sự lan tỏa của gen còn bị giới hạn bởi các quá trình của tế bào mà làm ức chế sự phiên mã của transposon. Hình 2.12 Transposon là vector có khả năng chuyển 1 gen lạ vào trong bộ gen. Để làm việc đó thì một phần lớn của vùng phiên mã của transposon được xóa đi. Việc này tạo ra 1 khoảng trống cho 1 gen lạ thay vào và đồng thời cũng ngăn cản được quá trình tự điều khiển trong việc gắn vào bộ gen của transposon. DNA tái tổ hợp chứa một gen lạ với dung lượng không xác định và có thể tự gắn vào bộ gen vật chủ . Sự hiện diện của transposase là cần thiết cho việc này.Sự đồng tiêm của transposon chứa một gen lạ và 1 phần của vòng plasmid có thể biểu hiện gen transposase cho phép transposon hòa nhập với hiệu suất cao, 1 – 5 % của phôi Quá trình này,ban đầu được xác định cho ruồi dấm bằng cách sử dụng transposon P,và được sử dụng rộng rãi để tạo ra gen chuyển. Còn đối với các loài khác thì người ta vẫn chưa có nhiều hiểu biết rõ ràng. Các mariner transposon đã chứng 10
11. Công nghệ sinh học ĐộngVât minh được hiệu quả trong tế bào cá medaka, tế bào gà , và những tế bào của động vật có vú. Những cách thiết kế khác nhau của transposon có thể thu được những vector an toàn và hiệu quả để sử dụng trong liệu pháp gen. (Hackett et al., 2001). Còn có các vector khác để tạo ra gen chuyển trong côn trùng như là Aedes, Aegypti hay con tằm. (Tamura et al., 1999). Trong tất cả các trưòng hợp thì transposon và plasmid mã hóa cho transposase phải được tiêm vào phôi dưới các điều kiện lệ thuộc vào từng loại sinh vật. Trong mối liên hệ này thì phôi gà được xem là khác biệt nhất so với các dạng sinh vật khác. Thật sự thì việc tiêm có thể thực hiện trong 1 phôi chỉ mới ở giai đoạn 1 tế bào mà không thể thực hiện được khi phôi đang phát triển như là ở các dộng vật có vú . Phôi đã được tiêm phải ở giai đoạn còn là lòng đỏ trứng và phải chưa có dự làm tổ. Sau vài tuần ủ trứng dưới các điều kiện thích hợp thì gà chuyển gen sẽ được ra đời với tỷ lệ thành công chấp nhận được. Do đó các vector transposon có thể cho phép tạo ra các gen chuyển đổi trong các sinh vật mà thường thì kĩ thuật vi tiêm không đạt được kết quả. Phương pháp này tương đối an toàn, bởi vì ngay cả khi thiếu gen transposase thì vector transposon vẫn có khả năng sao mã và hòa nhập vào bộ gen của tế bào chủ dù là với hiệu suất thấp , việc này có liên quan đến sự hiện diện của transposase nội sinh trong tế bào chủ và nó có thể hạn chế công dụng của transposon trong một số trường hợp. Trong khi đó transposon B A C ở lợn được dùng để tạo ra con tằm chuyển gen nhằm duy trì chất lượng ổn định qua nhiều thế hệ. Transposon chỉ có thể mang 1 mảnh DNA lạ với một độ dài nhất định. Điều này rõ ràng là một giới hạn nếu cấu trúc tinh vi được dùng để thể hiện cho 1 gen lạ. Hơn nữa cơ chế của tế bào để làm lu mờ transposons có thể làm ức chế sự biểu hiện của gen chuyển trong một số trường hợp. 2.3.5.4 Vector Retroviral Là những vector được sử dụng cho liệu pháp gen. Những vectơ virus retro khác nhau được thiết kế nhằm tạo ra động vật biến đổi gen và đặc biệt là gà (Ronfort, Legras và Verdier, 1997). Những vectơ này có lớp màng có khả năng nhận biết các tế bào phôi thai gà. Những vectơ có thể được đưa vào trứng mới đẻ. Ở giai đoạn này, các tế bào vẫn còn tế bào toàn năng và có thể tham gia trong một thế hệ giao tử, nhờ đó bộ 11
12. Công nghệ sinh học ĐộngVât gen của chúng có thể được chuyển cho các thế hệ con cháu. Cách tiếp cận này tỏ ra hiệu quả cao. Thật vậy, phôi ở giai đoạn này chứa khoảng 60.000 tế bào. Chỉ có một tỷ lệ nhỏ của các tế bào này có một cơ hội bị nhiễm bệnh do vectơ retroviral. Những con gà thu được từ thử nghiệm này có một tỉ lệ gen chuyển tương đối cao. Một sự thay thế được chứng minh là hiệu quả hơn. Những vector được thực hiện ở giai đoạn 16 của sự phát triển phôi trong vùng lân cận của các tế bào mầm nguyên thủy. Các tế bào này được ưu tiên để tiêm vào, cho các loài động vật có cơ hội được chấp nhận của sự truyền gene của họ cho con cháu. (Hình 2,13). Hình 2.13 Vectơ retroviral cũng được sử dụng để chuyển gen vào bò và noãn bào khỉ (Long et al, 1998, 2001.). Để làm điều này, hai trạng thái đặc biệt đã được yêu cầu.Lớp màng của véctơ là protein G của VSV (vesicular somatitis virus), được biết để nhận ra màng tế bào phospholipids và do đó cho phép sự nhiễm trùng ở nhiều loại tế bào. Các hạt siêu vi khuẩn đã được tiêm giữa vùng pellucida và màng noãn bào tại thời điểm các màng tế bào hạt nhân bị thiếu, bộ gen của virus là tốt nhất để có thể tìm gen vật chủ (Hình 2.13). Vectơ retroviral cũng đã được sử dụng để chuyển gen sinh sản ở thú. Gene của virus chứa gene lạ được nhập vào tế bào theo con đường vận chuyển bổ sung, tổng hợp nên protein muộn của virus. Một lượng nhỏ virus được dùng để truyền noãn bào động vật có vú (bò và khỉ), lớp tế bào gốc ở gà hoặc tế bào phôi chuột. 12
13. Công nghệ sinh học ĐộngVât Lentiviruses là một bộ phận được nhận diện của retroviruses, trong đó có khả năng tích hợp vào trong bộ gen của các tế bào ngủ đông. Điều này là do sự hiện diện của một tín hiệu ở một trong các protein virus, mà mục tiêu bộ gen của virus ở vùng hạt nhân. Vi rút AIDS (HIV) thuộc các chủng loại lentiviruses. Các vectơ lentiviral đang ngày càng được nghiên cứu để sử dụng khả năng của chúng trong liệu pháp gen. Các vectơ đã có thể điều khiển sự biểu hiện của gen EGFP ở chuột, cho bột huỳnh quang màu xanh lá cây trong tất cả các loại tế bào hoặc chỉ ở cơ bắp khi hoạt động quảng bá trong tất cả các loại tế bào trong cơ bắp hoặc chỉ được sử dụng tùy từng trường hợp. Cần những con chuột được sinh ra biến đổi gen. Khoảng 90 phần trăm của những con chuột bày tỏ sự chuyển gene của họ mà không cần bất cứ im lặng trong nhiều thế hệ. protein VSV đã được sử dụng như là một màng bao để cho phép nhiễm trùng hiệu quả của các tế bào phôi thai. Các tác giả của nghiên cứu này đã được xem xét những thuận lợi và các giới hạn của thực phẩm này. Những lợi thế lớn rõ ràng là tỷ lệ cao hiệu quả và thực tế là bị nhiễm trùng có thể được thực hiện bằng cách ủ phôi rỗng của vùng pellucida. Một thao tác tương đối đơn giản của phôi như vậy là đủ. Phương pháp này được mở rộng tới các động vật có vú khác không có vấn đề cụ thể. Nó sẽ đặc biệt thuận lợi ở chuột, nơi mà các phương pháp vi tiêm rất khó khăn để sử dụng. Các giới hạn của công cụ này nhiều càng tốt. Số lượng lớn của các hạt virus phải được chuẩn bị với một kiểm soát an toàn sinh học thích hợp. Bước này đã trở nên ngày càng được chuẩn hóa như là kết quả của việc sử dụng ngày càng tăng các loại véc tơ cho liệu pháp gen. Những đoạn DNA không quá 7-9 KB có thể được mở đầu cho các vector. Những biểu hiện của gen báo cáo là khá thấp trong trường hợp này. Mặt khác, tích hợp độc lập của vectơ xảy ra trong cùng một phôi, dẫn đến động vật biến đổi gen khảm. điều này có thể hơi phức tạp việc giải thích của dữ liệu. Rõ ràng, công cụ này xuất hiện có thể thay thế vi tiêm trong một số trường hợp, nhưng không phải trong tất cả. 2.3.5.5 Vectơ bổ sung Sự thuận lợi của quá trình kết hợp là DNA ngoại được truyền lại cho thế hệ con cháu một cách ổn định. Trở ngại chính của việc kết hợp là hiệu suất thấp và hiếm khi 13
14. Công nghệ sinh học ĐộngVât xảy ra. Một khó khăn khác, sẽ được thảo luận ở chương 2.3.11 đó là gene kết hợp chịu ảnh hưởng bởi hoạt động của môi trường nhiễm sắc thể của chính nó, điều này đã liên tục thay đổi sự biểu hiện của gene được biến đổi. Mặt khác, số lượng bản sao kết hợp rất ít, thông thường không vượt quá 10 và trong một số trường hợp nó cho thấy rằng không phải tất cả bản sao chép đều được phiên mã. Việc sử dụng vecto bổ sung được hi vọng sẽ loại trừ được những trở ngại này. Hệ gene tự điều khiển thứ cấp hay hệ gene bổ sung được tìm thấy rất nhiều ở những sinh vật sống. Trong trường hợp này là ở vi khuẩn nơi chứa đựng 1 số lượng plasmid rất đa dạng. Mẫu nhiễm sắc thể thu được từ sợi nhiễm sắc thể bị thoái biến đôi khi được tìm thấy trong nhiều tế bào. Đặc biệt là trong các khối u. Những mảnh nhiễm sắc thể này, đôi khi được gọi là nhiễm sắc thể vụn được tái bản một cách chủ động và chuyển cho các thế hệ tế bào sau. Những loại virus khác nhau có hệ gene tự tái tạo như những thực thể tự trị và đều được chuyển cho thế tệ tế bào sau. Đây là trường hợp của dòng virus herpes. Một hệ gene bổ sung cần có vài yếu tố kết hợp để trở nên bền vững. Gene bổ sung có thể ở dạng thẳng hoặc dạng vòng. Khi ở dạng vòng, những thành phần cấu thành tối thiểu của nó là vùng khởi đầu của quá trình sao chép DNA có chức năng khởi động sinh tổng hợp DNA cũng như chuyển thông tin di truyền cho thế hệ tế bào con cháu. Gene bổ sung dạng thẳng cần phải có telomeres tại 2 đầu tận cùng. Cấu trúc này hiện diện ở phần cuối của mỗi nhiễm sắc thể bình thường. Nó bị làm ngắn dần bởi tác dụng của exonucleases và được khôi phục bởi một phức hệ enzyme đặc biệt. Telomeres bảo vệ nhiễm sắc thể khỏi sự thoái biển bởi tác nhân exonucleases. Khi tế bào trở nên già hơn, sự tổng hợp telomere ít hiệu quả hơn, dẫn đến sự thoái hóa nhiễm sắc thể và làm chết tế bào. Các dạng vecto bổ sung khác nhau có thể được thiết kế nhằm tạo ra những động vật chuyển gene khác nhau. Các vecto có thể nhỏ, chỉ chứa đúng các yếu tố cần thiết cho sao chép và chuyển cho tế bào con. Một phương pháp khác là sử dụng những mảnh nhiễm sắc thể có chứa tất cả các yếu tố tự nhiên để chuyển gene cho thế hệ con cháu. Loại vecto bổ sung được biết nhiều nhất đồng thời được sử dụng nhiều nhất là plasmid, cosmid, phage, BAC và YAC. Không có loại vecto nào kể trên được sử dụng 14
15. Công nghệ sinh học ĐộngVât trong sinh vật nhân chuẩn bậc cao bởi vì chúng không hoạt động được trong tế bào động vật. Những vecto này được sử dụng chủ yếu cho kỹ thuật DNA và tái tổ hợp DNA nhằm mục đích nghiên cứu và đưa vào trong tế bào động vật. Những vecto vi khuẩn có thể chỉ chứa đúng đoạn khởi đầu cho sao chép. Số lượng bản sao có được sao mỗi lần sao chép DNA là đủ để thống kê được sự chuyển của vecto vào tế bào con cháu. Figure 2.14: Cấu trúc của 1 vecto YAC (nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo). Vecto này bao gồm vùng khởi đầu phiên mã DNA (ARS 1), vùng centromere (CEN 4), có chức năng truyền những vecto đã được sao mã đến các dòng tế bào con cháu, telomeres chức năng bảo vệ DNA khỏi tác dụng của exonucleases, 2 gene lựa chọn (TRP 1 và UR 3) và vùng nhân bản có khả năng chưa đoạn gene khoảng 1000kb Trong nấm men, một loại vecto mạch thẳng gọi là YAC đã được thiết kế (Figure 2.14). Chúng chứa đoạn telomeres, đoạn mở đầu sao chép (ARS 1), đoạn centromere (CEN 4), gene lựa chọn (Ura 3) và vùng nhân bản. Vecto này tương đối nhỏ gọn và dễ dàng thao tác. Điều này là do vùng mở đầu sao chép và vùng centromere tương đối ngắn. Vùng khởi đầu sao chép ở Saccharomyces cerevisiae chỉ chiếm một vị trí nhỏ trên chuỗi gene. Đối với Saccharomyces pombe thì ngược lại, vùng khởi đầu sao chép của nó kéo dài vài ngàn base. Những vecto YAC này có thể gắn những mảnh DNA dài khoảng 1000kb và có thể dược đưa vào nấm men do tái kết hợp tương đồng. Hạn chế lớn nhất của YAC là kém ổn định (Giraldo and Montoliu, 2001). Vecto BAC được thiết ké với mục đích sao chép trong E.coli và chỉ hiện diện một bản sao mỗi tế bào. Vecto BAC có thể gắn một DNA 250kb sau đó được đưa vào vi khuẩn bằng cách tái kết hợp tương đồng. việc này cho phép xóa và thêm mảnh DNA 15
16. Công nghệ sinh học ĐộngVât ngoại lai vào trong vecto. Vecto BAC hiện đang được dung làm cấu trúc chứa những mảnh DNA dài dùng trong tái tổ hợp gene vào động vật (Giraldo và Montoliu, 2001). Trong tế bào động vật, nó vẫn không thể tạo ra vecto dạng thẳng chứa các yếu tố tự nhiên được tìm thấy trong nhiễm sắc thể. Phần mở đầu sao chép trong hệ gene động vật vẫn là một vùng chưa được xac định rõ. Một vài vùng trong đó đã được xác định đặc điểm và sử dụng để sao chép DNA trong môi trường nuôi cấy tế bào và trong quá trình chuyển gene vào chuột. Nó cho thấy dường như mảnh DNA chứa khoảng vài ngàn base là luôn cần thiết để bắt đầu quá trình sao chép. Một cách tương đối khả thi là nhân dòng đoạn gene vào vecto và sau đó chọn ra những gene hoạt động tốt nhất để dung cho sao chép trong tế bào động vật. Thí nghiệm này đã cho thấy rằng có ít nhất một vùng mở đầu sao chép khoảng 40kb tồn tại trong đoạn DNA động vật (Kelleher et al, 1998.). Đoạn mở đầu sao chép này lại không đủ để chuyển vecto vòng vào các thế hệ tế bào sau một cách hiệu quả. Một nghiên cứu được thực hiền một vài năm trước đây cho thấy một vecto chứa hỗn hợp các đoạn mở đầu sao chép trong một plasmid mang lại hiệu quả cao hơn trong việc chuyển gene tái tổ hợp vào chuột. Loại vecto này có thể chuyển từ chuột sang vi khuẩn, từ vi khuẩn sang bào thai lợn và ngược trở về vi khuẩn (Attal et al., 1997). Tuy nhiên vecto này thường không ổn định khi gene được nạp vào nó. Hơn thế nữa, nó không được duy trì trong suốt quá trình sống của chuột và do đó không được truyền cho thế hệ con cháu. Do đó loại vecto này chỉ chứa đoạn mở đầu sao chép có tác dụng với những tế bào phân chia nhanh chóng còn dối với loại tế bào khả năng phân chia chậm thì kém hiệu quả. Nguyên nhân chính là do loại vecto này không chứa yếu tố đóng vai trò của một centomere. Nhiễm sắc thể ở sinh vật nhân chuẩn có chứa trình tự lặp đi lặp lại ở trung tâm của mình và bám vào các khung xương tế bào trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, điều đó cho phép các nhiễm sắc thể được phân bố vào tế bào con cháu một cách chính xác. Vùng centromeric đã được gắn vào các vecto bổ sung. Đoạn centromeric rất dài này cần phải được sử dụng và chúng đặc trưng cho từng loài. Vì những lý do đó không thê dung nó để thiết kể những vecto nhỏ gọn. 16
17. Công nghệ sinh học ĐộngVât Một số loại virus có hệ gene dạng vòng, có khả năng tái bản với hiệu suất cao trong tế bào động vật và được truyền cho thế hệ tế bào sau. Đó là trường hợp của virus SV 40. Nhiều nghiên cứu về đoạn mở đầu sao chép ở SV40 đã được nghiên cứu rộng rãi. Cấu trúc của nó tuy ngắn nhưng đòi hỏi sự mã hóa kháng nguyên T bởi các thành phần của tế bào và hệ gene SV 40 để có thể được sao chép. Vecto SV 40 chuyển vào tế bào con để tổng hợp kháng nguyên T (tế bào Cos) thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm để thể hiện gene ngoại lai với hiệu suất cao. Loại vecto này không sao chép được trong tế bào không phải linh trưởng (non-primate)do đó không thể sử dụng được trong việc tạo ra động vật biến đổi gene. Virus Herpes vẫn ở trạng thái tiềm ẩn trong các tế bào nhiêm bệnh. Mỗi tế bào chứa một hoặc vài bản sao của bộ gene virus và sau đó được chuyển cho dòng tế bào con cháu. Trong vài trường hợp nhất định, đặc biệt là khi các vi sinh vật bị nhiễm bệnh chúng sẽ bị suy giảm miễn dịch, lúc đó bộ gene của virus kí sinh có cơ hội tái bản với hiệu suất cao, dẫn đến trạng thái bệnh lý. Đó là trường hợp của virus Herpes đơn hình, cytomegalovirus , Epstein±Barr virus và một số giống khác. Các virus này có vùng khời điểm tái bản và một hệ thống tâm động giả. Hai yếu tố này được nghiên cứu kĩ ở virus Epstein-barr (Ebv) . Những vùng có kích thước tối thiểu cần thiết cho sự tái bản của gen EBV và sự di truyền của chúng cho tế bào con là vùng khởi điểm tái bản P (ori P)và gen EBNA 1. Vùng khởi điểm tái bản P chứa hai vùng có chức năng riêng biệt. Cả hai đều bám vào protein EBNA 1. Một vùng của khởi điểm tái bản P làm đúng chức năng khởi điểm tái bản. Vùng thứ hai là cần cho sự truyền gen của virus cho tế bào con. Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng khởi điềm tái bản của EBV chỉ hoạt động ở tế bào linh trưởng và chó. Nhiều thử nghiệm đã cho thấy vùng khởi điểm tái bản EVB có thể bị xóa và được thay thế bằng các đoạn DNA người và động vật có vú khác. Một số các đoạn DNA chứa vùng khởi điểm tái bản cho phép vecto được tái bản và truyền lại cho tế bào con ví dụ như ở ở chuột chuyển gen (Kelleher et al, 1998) tuy nhiên vẫn chưa chứng minh rằng vecto ổn định đã truyền lại cho thế hệ con. Trong tất cả trường hợp, vecto EBV phải mang gen EBNA 1, vùng khởi điểm tái bản P để cho protein này bám vào. Hệ thống EBV EBNA 1 –ori P không mang 17
18. Công nghệ sinh học ĐộngVât tính đặc hiệu loài. Nó chỉ hoạt động tốt trên nấm men. Các vecto chứa phức hợp EBNA 1-ori P bám không đặc hiệu vào nhiễm sắc thể trong các tế bào ekaryote khác nhau. Một nghiên cứu gần đây cho thấy, EBNA1 bám vào ori P và protein EBP 2 nhận ra các thành phần chưa biết được ở nhiễm sắc thể( hình 2.15). Một vecto vòng mang vùng ori P bám vào EBNA 1 và vùng khởi điểm tái bản nấm men được duy trì hoàn toàn hiệu quả ở nấm men biểu hiện cả gen EBNA 1 và EBP 2 của người (kapoor, shire và Frappier, 2001) Điều này cho ta đưa ra giả thuyết là vecto bổ sung mang vùng khởi điểm tái bản hoạt động ở tế bào chuột và các gen mã hóa cho protein EBNA 1 và EBP 2 có thể được duy trì như vecto vòng bổ sung trong suốt đời sống của động vật và truyền cho thế hệ con cháu. Gen EBV có kích thước 200kb và vecto EBV có thể mang DNA ngoại lai có kích thước trên 100kb. Vecto chứa vùng khởi điểm tái bản SV40 và một trình tự MAR cũng có khả năng duy trì ổn định như các thể bổ sung trong tế bào nuôi cấy, (Jenken et al, 2002) Các loại vecto này hiện được nghiên cứu ở các phòng thí nghiệm trên prokaryote và ekaryote. Hình 2.15 cấu trúc của vecto bổ sung dạng vòng dựa trên gen virus Epstein-Barr (EBV). Protein EBNA1, bám vào một vùng khác của gen EBV. Protein EBNA 1 bám vào một protein của tế bào. Protein EBP 2 liên kết với các yếu tố không đặc hiệu của 18
19. Công nghệ sinh học ĐộngVât chromatin. Hệ thống giống tâm động này cho phép truyền vecto cho tế bào con. Vùng khởi điểm tái bản của EBV hoạt động riêng lẻ trong tế bào linh trưởng Chúng có thể được truyền vào trong vi khuẩn đường ruột và phát tán ra ngoài môi trường. Điều này có thể tránh bằng cách bỏ các phần khởi điểm tái bản ở prokaryote Một cách khác tương đối khả thi trong việc tạo ra các vecto độc lập là sử dụng các đoạn DNA dài chứa các khởi điểm tái bản tự nhiên, một tâm động và các telomere. Các vecto này là nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HACs), chỉ có thể có sau khi xảy ra đột biến ngẫu nhiên loại bỏ 1 phần nhiễm sắc thể, giữ lại một vài yếu tố tối thiểu để tạo thành một hệ thống tự chủ (Vos, 1998; Voet et al 2001) Những thao tác này không dễ dàng điều khiển và đặc biệt khó khăn khi đưa các gen ngoaị lai vào chúng. Hơn nữa các đoạn gen dài chứa rất nhiều gen quan trọng có thể gây trở ngại đến hoạt động sinh lý của động vật hoặc với các gen quan tâm khi nó được bổ sung thêm vecto Một nhiễm sắc thể chuột kích thước 60Mb gồm DNA vệ tinh gần trung tâm từ chuột được tạo ra trong một dòng tế bào lai của động vật gặm nhấm/ người. Cấu trúc này tồn tại trong một thời gian dài trong các tế bào nuôi cấy, và đang được tìm hiểu để chuyển gen chuột vào cũng như duy trì qua các thế hệ sau (Co Et Al , 2000) Vài năm trước đây, một nghiên cứu cho rằng nhiễm sắc thể số 2 của người có thể chuyển vào bộ gen chuột, duy trì và chuyển cho thế hệ sau. Nhiễm sắc thể 2 của người được chuyển từ nguyên bào sợi của người sang tế bào gốc phôi chuột bằng dung hợp tế bào. Các tế bào gốc phôi mang nhiễm sắc thể của người đã được sử dụng để tạo ra chuột chuyển gen thể khảm. chuột chuyển gen thể khảm này đã biểu hiện gen globulin miễn dịch nằm trên Nhiễm sắc thể 2 vì vậy ta thu được kháng thể đơn dòng từ chuột này (tomizuka et al, 1997) Vecto thể bổ sung sẽ hữu ích cho các nhà nghiên cứu cho việc nghiên cứu gen trong tế bào bị nhiễm cũng như liệu pháp gen và tạo giống động vật biến đổi gen. Tuy chậm nhưng có tiến bộ đáng kể và đang được thực hiện trong lĩnh vực này. 19