Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột - Đậu Thị Dung

pdf

98 trang huongle 2740

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột - Đậu Thị Dung", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

nghien_cuu_kha_nang_sinh_tong_hop_cellulase_cua_cac_chung_xa.pdf

Nội dung text: Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột - Đậu Thị Dung

B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN === === ĐU TH DUNG NGHIÊN CU KH NĂNG SINH TNG HP CELLULASE CA CÁC CHNG X KHUN ƯA NHIT THU THP TI BUƠN MA THUT LUN VĂN THC S SINH HC Buơn Ma Thut, năm 2010
B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN === === ĐU TH DUNG NGHIÊN CU KH NĂNG SINH TNG HP CELLULASE CA CÁC CHNG X KHUN ƯA NHIT THU THP TI BUƠN MA THUT Chuyên Ngành Sinh Hc Thc Nghim Mã S: 60.42.30 LUN VĂN THC S SINH HC Ngưi hưng dn: TS.Võ Th Phương Khanh Buơn Ma Thut, năm 2010
TÀI LIU THAM KHO [1]. Khưu Phương Yn Anh (2007), Nghiên cu kh năng enzyme cellulase ca mt s chng nm si phân lp t rng ngp mn cn gi , Lun văn thc sĩ sinh hc, Trưng Đi hc sư phm TP. H Chí Minh. [2]. Phm Th Trân Châu, Phan Tun Nghĩa (2007), Cơng ngh sinh hc , tp 3 : Enzyme và ng dng , Nxb Giáo dc, trang 45 – 94. [3]. Nguyn Th Kim Cúc, Phm Vit Cưng, Nguyn Th Tuyt Mai, Lê Văn Nhương (1999), Phân lp và đnh loi mt s tính cht ca chng vi nm, x khun cĩ tim năng ng dng trong quy trình x lý v cà phê , Báo cáo khoa hc Hi Ngh Cơng Ngh Sinh Hc Tồn Quc; NXB KHKT; tr 206213. [4]. Tăng Th Chính, Lý Kim Bng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cu sn xut enzyme cellulase ca mt s chng vi sinh vt ưa nhit phân lp t b rác thi, Báo cáo khoa hc Hi Ngh Cơng Ngh Sinh Hc Tồn Quc, NXB KHKT; tr 790796. [5]. Nguyn Lân Dũng, Nguyn Đình Quyn, Phm Văn Ty (1978), Mt s phương pháp nghiên cu vi sinh vt, tp 2,3, Nhà xut bn Khoa hc k thut. [6]. Nguyn Lân Dũng, Nguyn Đình Quyn, Phm Văn Ty (2007), Vi sinh vt hc, Nhà xut bn Giáo dc. [7]. Nguyn Lân Dũng, Đồn Xuân Mưu, Nguyn Phùng Tin, Đng Đc Trch, Phm Văn Ty (1972), Mt s phương pháp nghiên cu vi sinh vt hc, Nhà xut bn Khoa hc kĩ thut. [8]. Nguyn Lân Dũng (1976), Mt s phương pháp nghiên cu vi sinh vt hc, tp 2, NXB khoa hc và k thut. [9]. Lê Gia Hy, (1994), Nghiên cu x khun thuc chi streptomyces sinh cht kháng sinh chng nm gây bnh đo ơn và thi c r phân lp Vit Nam, Lun án Phĩ tin sĩ sinh hc.
[10]. Nguyn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hồng Đình Hồ (1999 ); Phân lp và hot hĩa vi sinh vt ưa nhit cĩ hot tính cellulase cao đ b sung li vào khi , rút ngn chu kỳ x lý rác thi sinh hot, Báo cáo khoa hc Hi Ngh Cơng Ngh Sinh Hc Tồn Quc, NXB KHKT, tr 531535. [11]. Phm Th Ngc Lan, Phm Th Hồ, Lý Kim Bng (1999), Tuyn chn mt s chng x khun cĩ kh năng phân gii cellulose t mùn rác , Báo cáo khoa hc Hi Ngh Cơng Ngh Sinh Hc Tồn Quc, NXB KHKT; tr 177182. [12]. Nguyn Đc Lưng, Đng Vũ Bích Hnh (1999), Kh năng sinh tng hp Cellulase ca Atinomyces griseus , Báo cáo khoa hc Hi Ngh Cơng Ngh Sinh Hc Tồn Quc, NXB KHKT; tr 804 809. [13]. Nguyn Đc Lưng, Đng Vũ Bích Hnh (1999), Mt s tính cht enzyme cellulase ca x khun Actinomyces griseus , Báo cáo khoa hc Hi Ngh Cơng Ngh Sinh Hc Tồn Quc, NXB KHKT, tr 580583. [14]. Đinh Th Kim Nhung (2005), nh hưng ca ngun cacbon và nitơ cho vic to thành xenlulase ca Acetobacter xylinum, Đi hc Sư Phm Hà Ni 2; Nhng vn đ nghiên cu cơ bn trong khoa hc s sng, NXB KHKT. [15]. Ngơ Đi Nghip (2009), Giáo trình enzyme hc , Trưng Đi hc Quc gia TP.H Chí Minh. [16]. Lê Ngc Tú, La Văn Ch, Phm Trân Châu, Nguyn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vt , Nxb KH&KT. [17]. Trn Cm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vt hc mơi trưng , NXB Đi hc Quc gia Hà Ni. [18]. Lê Th Thanh Xuân, Phan Th Tuyt Minh Vin Cơng Ngh Sinh Hc, Vin KH&CNVN. Trn Hà Ninh, Tăng Th Chính Vin Cơng Ngh Mơi Trưng, Vin KH&CNVN (2005), Phân lp và tuyn chn các chng x khun ưa nhit sinh tng hp xenlulaza cao , Nhng vn đ nghiên cu cơ bn trong khoa hc s sng, NXB KHKT; tr 872875.
[19]. Lương Đc Phm, H Sưng (1978), Vi sinh tng hp , NXB khoa hc và k thut Hà Ni. [20]. GS.TS Nguyn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vt hc cơng nghip, NXB Giáo dc . [21]. Trn Thanh Thy (1998), Hưng dn thc hành vi sinh vt hc , Nhà xut bn giáo dc. [22]. H Sĩ Tráng (2004), Cơ s hố hc g và cellulose tp 1,2, NXB khoa hc k thut Hà Ni. [23]. Allister J. Lyons, JR., and Thomas G. Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes , Journal of bacteriology, American Society for Microbiology, 89(1), pp. 159169. [24]. Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Vol. 4. [25]. Becker, B., M.P. Lechevalier and H.A.Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyce , .J.Appl. Microbiol., 13, pp. 236243. [26]. Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Stepmyces project , Inter.J. Syst. Bac., 3, pp.139148. [27]. Faiez Alani, William A. Anderson, Murray MooYoung (2007), New isolate of Streptomyces sp. with novel thermoalkalotolerant cellulases, Biotechnol Lett DOI 10.1007/s1052900795009 Original research paper. [28]. HungDer Jang and KuoShu Chen (2002), Production and characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T3 1, World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 263–268, 2003. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. [29]. John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H. A. Sneath, James T. Staley , Stanley T. Wikkiams, 1994, Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, Ninth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, p 605703.
[30]. Lechevalier, M. P. and H.A.Lechevalier (1970). Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes , Int. J. System. Bact., 20, pp. 435443. [31]. Sherling, E.B. and D.Gottlieb (1966), Methods for characterization of Streptomyces species , Intern. J. Syst. Bact., 16(3), pp .313340. [32]. Thomas G. Pridham (1965), Color and Streptomycetes Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes , Applied microbiology, American Society for Microbiology., 13(1), pp. 4361. TP.H Chí Minh. [33]. Tresner, H.D., E.J.Buckus (1963), System of color wheels for Streptomyces taxonomy , Appl.Microbiol, 11, pp. 335338. [34]. Waksman, S.A. (1961), The Actinomycetes, vol.2 Classification, idetification and description of the genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. [35]. Williams, S.T., M.Goodfellow, G.Alderson, E.M. Wellington, P.H.A.Sneath and M.J. Sackin (1983), Numerical classification of Streptomyces and related genera , J.Gen. Microbiol., 129, pp.17431813. [36]. Witt, D., W. Liesack and E. Stackebbandt (1989), Identification of Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes , Recent advances in microbial ecology, Tokyo, Japan Scientific Press. [37]. Witt, D. and E. Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443 , System.Appl. Microbiol., 13, pp. 361 371.
PH LC Ph lc 1: Đưng chun CMCase Nng đ 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 glucose (IU/ml) OD 540nm 0.103 0.224 0.365 0.451 0.604 0.7 Đưng chun CMCase y = 1.2317x - 0.0066 0.8 R2 = 0.9789 0.6 OD 540nm 0.4 Linear (OD O D 540nm 0.2 540nm) 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Nng đ glucose (mg/ml)
Ph lc 2: Tương quan hàm lưng glucose(mg/ml) và ch s OD 540n.m Nng đ glucose (IU/ml) Ch s OD Trung bình OD Sai s 0.100 0.103 0.103 0.00001 0.106 0.100 0.200 0.224 0.224 0.00029 0.226 0.222 0.300 0.368 0.365 0.0021 0.363 0.364 0.400 0.551 0.451 0.0114 0.550 0.552 0.500 0.606 0.604 0.0054 0.602 0.604 0.600 0.700 0.700 0.005 0.698 0.702
Ph lc 3: Đưng kính vịng phân gii và nng đ đưng kh trong mơi trưng nuơi cy 12 chng phân lp đưc. STT Chng Ch s Trung Nng đ Đưng kính vịng Mc đ OD bình đưng thy phân (mm) phân gii 540n.m OD kh(IU/ml) 1 C1 0.718 32.0 0.695 0.705 0.579 29.0 Mnh 0.702 26.0 2 C2 0.744 33.0 0.924 0.857 0.702 30.0 Mnh 0.903 30.0 3 C3 0.876 30.0 0.996 0.953 0.780 28.0 Mnh 0.987 29.0 4 C4 0.826 31.0 0.741 0.819 0.672 28.0 Mnh 0.891 30.0 5 C5 0.785 37.0 0.775 0.770 0.632 30.0 Mnh 0.750 25.0 6 C6 1.124 32.0 1.193 1.132 0.926 31.0 Mnh 1.081 30.0 7 C7 1.060 35.0 1.046 1.065 0.871 36.0 Mnh 1.090 31.0 8 C8 0.705 18.0 0.624 0.671 0.551 23.0 Khá 0.684 22.0 9 C9 0.905 20.0 0.980 0.948 0.776 22.0 Khá 0.960 20.0 10 C10 0.692 28.0 0.622 0.638 0.525 30.0 Mnh 0.602 25.0 11 C11 0.576 29.0 0.656 0.601 0.495 25.0 Mnh 0.568 20.0 12 C12 0.545 20.0 0.525 0.562 0.463 18.0 Mnh 0.616 20.0
Ph lc 4 : Kh năng chu nhit ca các chng x khun Ch s OD Nng đ đưng Chng Nhit đ Trung bình Sai s 540n.m kh(IU/ml) 0.858 45 0C 0.910 0.890 0.00110 0.729 0.920 0.775 50 0C 0.826 0.786 0.00131 0.645 0.756 0.536 0 A2 55 C 0.436 0.508 0.00390 0.419 0.551 0.379 60 0C 0.324 0.343 0.00100 0.285 0.327 0.392 65 0C 0.445 0.425 0.00080 0.352 0.438 0.750 45 0C 0.706 0.731 0.00052 0.600 0.739 0.920 50 0C 0.786 0.827 0.00647 0.678 0.776 0.773 0 C2 55 C 0.758 0.771 0.00015 0.633 0.782 0.611 60 0C 0.478 0.540 0.00448 0.445 0.531 0.781 65 0C 0.753 0.769 0.00021 0.631 0.774 0.903 45 0C 0.740 0.800 0.00803 0.656 0.757 0.756 50 0C 0.749 0.770 0.00093 0.632 0.805 C 3 0.532 55 0C 0.556 0.541 0.00017 0.446 0.536 0.365 60 0C 0.381 0.345 0.00236 0.287 0.290
0.344 65 0C 0.407 0.372 0.00102 0.309 0.365 0.935 45 0C 0.841 0.892 0.00225 0.731 0.899 0.803 50 0C 0.861 0.850 0.00391 0.697 0.928 0.715 0 C4 55 C 0.592 0.653 0.00378 0.537 0.653 0.541 60 0C 0.519 0.540 0.00042 0.445 0.560 0.601 65 0C 0.543 0.590 0.02383 0.486 0.628 1.231 45 0C 1.208 1.205 0.00079 0.985 1.175 1.029 50 0C 1.064 1.038 0.00051 0.849 1.022 0.928 0 C6 55 C 1.004 0.918 0.00836 0.752 0.822 0.389 60 0C 0.342 0.354 0.00097 0.294 0.330 0.449 65 0C 0.427 0.442 0.00016 0.365 0.449 1.001 45 0C 1.018 0.974 0.00385 0.797 0.903 0.729 50 0C 0.673 0.693 0.00099 0.569 0.676 C7 0.494 55 0C 0.553 0.530 0.00098 0.437 0.542 0.332 0.316 60 0C 0.326 0.00001 0.271 0.329
0.319 65 0C 0.328 0.321 0.00002 0.267 0.316 0.768 45 0C 0.689 0.735 0.00170 0.603 0.749 0.817 50 0C 0.906 0.861 000198 0.706 0.860 0.630 Ctm 55 0C 0.690 0.677 0.00177 0.556 0.711 0.548 60 0C 0.519 0.501 0.00331 0.413 0.437 0.290 65 0C 0.318 0.312 0.00040 0.200 0.329
Ph lc 5. pH thích hp đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun. Ch s OD Sai s Nng đ Chng pH 540n.m Trung bình đưng kh (IU/ml) 0.470 0.00198 55 0.381 0.425 0.352 0.425 0.440 0.00167 60 0.362 0.408 0.338 0.422 0.300 0.00016 65 0.318 0.310 0.258 0.286 A 2 0.178 0.00038 70 0.217 0.198 0.167 0.198 0.322 0.00043 75 0.296 0.318 0.265 0.337 0.176 0.00125 80 0.149 0.181 0.154 0.219 0.390 0.00069 55 0.339 0.368 0.305 0.376 0.430 0.00143 60 0.360 0.403 0.334 0.420 0.263 0.00037 65 0.259 0.250 0.210 0.228 C 2 0.357 0.00265 70 0.257 0.314 0.262 0.328 0.361 0.00188 75 0.292 0.342 0.284 0.372 0.143 0.00001 80 0.134 0.137 0.118 0.134
0.417 0.00496 55 0.305 0.404 0.335 0.435 0.326 0.00401 60 0.301 0.349 0.290 0.421 0.336 0.01413 65 0.304 0.388 0.322 0.524 C 3 0.345 0.00063 70 0.379 0.351 0.292 0.330 0.406 0.00201 75 0.352 0.400 0.331 0.441 0.302 0.00022 80 0.276 0.293 0.244 0.301 0.360 0.01160 55 0.232 0.346 0.288 0.446 0.334 0.00045 60 0.318 0.337 0.280 0.360 0.362 0.00106 65 0.319 0.355 0.295 0.383 C 4 0.278 0.00001 70 0.285 0.282 0.236 0.282 0.298 0.00059 75 0.345 0.325 0.270 0.332 0.232 0.00096 80 0.170 0.201 0.170 0.202
0.365 0.00453 55 0.479 0.401 0.332 0.360 0.426 0.00039 60 0.454 0.432 0.357 0.416 0.500 0.00053 65 0.546 0.522 0.430 0.521 C 6 0.586 0.00190 70 0.441 0.502 0.141 0.480 0.577 0.00435 75 0.576 0.551 0.454 0.501 0.557 0.00076 80 0.432 0.507 0.418 0.531 0.252 0.00180 55 0.284 0.281 0.235 0.307 0.328 0.00001 60 0.412 0.373 0.309 0.380 0.438 0.00025 65 0.428 0.435 0.360 0.439 C 7 0.454 0.00544 70 0.431 0.449 0.371 0.461 0.413 0.00375 75 0.343 0.415 0.344 0.490 0.412 0.00113 80 0.399 0.441 0.365 0.511
0.253 0.00001 55 0.186 0.221 0.186 0.224 0.262 0.00128 60 0.328 0.303 0.253 0.319 0.319 0.00093 65 0.259 0.286 0.239 0.280 Ctm 0.345 0.00050 70 0.317 0.341 0.283 0.361 0.292 0.00027 75 0.309 0.309 0.257 0.325 0.278 0.00160 80 0.317 0.277 0.231 0.237
Ph lc 6: nh hưng ca t l đưng b sung đn tc đ sinh trưng và kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun tuyn chn Ký hiu T l đưng b sung Đưng kính vịng thy Tc đ sinh chng (%) phân (mm) trưng sau 5 ngày nuơi cy (ln) 0 % 28.7 6.519 0.05%G 29.0 2.359 0.1%G 29.7 6.522 A2 0.15%G 32.7 3.508 0.05%S 29.0 4.931 0.1%S 30.7 2.279 0.15%S 28.7 2.757 0 % 34.3 2.082 0.05%G: 33.0 5.349 0.1%G: 34.2 12.633 C2 0.15%G 30.1 2.531 0.05%S 29.7 2.592 0.1%S 28.0 3.598 0.15%S 30.8 2.854 0 % 34.5 2.062 0.05%G: 32.0 3.653 0.1%G: 31.3 2.719 C3 0.15%G 34.8 7.385 0.05%S 36.7 1.986 0.1%S 30.7 3.974 0.15%S 33.5 3.812 0 % 34.5 5.400 0.05%G: 31.7 4.169 0.1%G: 32.7 5.016 C4 0.15%G 33.5 3.312 0.05%S 32.7 4.262 0.1%S 32.5 2.160 0.15%S 31.0 2.088 0 % 28.0 1.037 0.05%G: 27.2 3.712 0.1%G: 29.7 3.068 C6 0.15%G 29.5 6.316 0.05%S 27.3 2.465 0.1%S 31.0 2.653 0.15%S 31.7 2.438 0 % 27.3 2.720 0.05%G: 25.7 4.541 C7 0.1%G: 26.7 2.333 0.15%G 27.7 3.010
0.05%S 27.7 1.159 0.1%S 27.5 1.796 0.15%S 29.2 5.879 0% 34,3 17,000 0.05%G: 34.0 3.310 0.1%G: 21.3 2.267 Ctm 0.15%G 20.6 3.673 0.05%S 24.3 2.308 0.1%S 17.6 3.766 0.15%S 16.8 6.579
Ph lc 7. Bng phân tích nh hưng ca nhit đ Anova: Two Factor With Replication SUMMARY 45 50 55 60 65 Total A2 Count 3 3 3 3 3 15 Sum 2.688 2.357 1.523 1.03 1.275 8.873 Average 0.896 0.785667 0.507667 0.343333 0.425 0.591533 Variance 0.001108 0.00131 0.003908 0.000956 0.000829 0.04975 C2 Count 3 3 3 3 3 15 Sum 2.195 2.482 2.313 1.62 2.308 10.918 Average 0.731667 0.827333 0.771 0.54 0.769333 0.727867 Variance 0.000524 0.006465 0.000147 0.004483 0.000212 0.012144 C3 Count 3 3 3 3 3 15 Sum 2.4 2.31 1.624 1.036 1.116 8.486 Average 0.8 0.77 0.541333 0.345333 0.372 0.565733 Variance 0.008029 0.000931 0.000165 0.00236 0.001029 0.041068 C4 Count 3 3 3 3 3 15 Sum 2.675 2.592 1.96 1.62 1.772 10.619 Average 0.891667 0.864 0.653333 0.54 0.590667 0.707933 Variance 0.002249 0.003913 0.003782 0.000421 0.001886 0.023832 C6 Count 3 3 3 3 3 15 Sum 3.614 3.115 2.754 1.061 1.325 11.869 Average 1.204667 1.038333 0.918 0.353667 0.441667 0.791267 Variance 0.000792 0.000506 0.008356 0.000972 0.000161 0.121909 C7 Count 3 3 3 3 3 15 Sum 2.922 2.078 1.589 0.977 0.963 8.529 Average 0.974 0.692667 0.529667 0.325667 0.321 0.5686 Variance 0.003853 0.000992 0.000984 7.23E05 3.9E05 0.065473 Ctm Count 3 3 3 3 3 15 Sum 2.206 2.583 2.031 1.504 0.937 9.261 Average 0.735333 0.861 0.677 0.501333 0.312333 0.6174 Variance 0.0017 0.001981 0.001767 0.003314 0.000404 0. 040596
Total Count 21 21 21 21 21 Sum 18.7 17.517 13.794 8.848 9.696 Average 0.890476 0.834143 0.656857 0.421333 0.461714 Variance 0.026306 0.012085 0.021925 0.010281 0.024932 ANOVA Source of Variation SS df MS F Pvalue F crit Sample 0.71287 6 0.118812 58.89509 2.06E25 2.231192 Columns 3.769126 4 0.942281 467.0904 1.15E49 2.502656 Interaction 1.056476 24 0.04402 21.82069 1.12E23 1.673829 Within 0.141214 70 0.002017 Total 5.679685 104
Ph lc 8. Bng phân tích nh hưng ca pH Anova: TwoFactor With Replication SUMMARY 5.5 6 6.5 7 7.5 8 Total A2 Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 1.276 1.224 0.904 0.593 0.955 0.544 5.496 Average 0.425333 0.408 0.301333 0.197667 0.318333 0.181333 0.305333 Variance 0.00198 0.001668 0.000257 0.00038 0.00043 0.001246 0.009894 C2 Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 1.105 1.21 0.75 0.942 1.025 0.411 5.443 Average 0.368333 0.403333 0.25 0.314 0.341667 0.137 0.302389 Variance 0.000694 0.001433 0.000367 0.002647 0.00188 2.7E05 0.009002 C3 Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 1.157 1.048 1.164 1.054 1.199 0.879 6.501 Average 0.385667 0.349333 0.388 0.351333 0.399667 0.293 0.361167 Variance 0.004961 0.004008 0.014128 0.00063 0.00201 0.000217 0.00441 C4 Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 1.038 1.012 1.064 0.845 0.975 0.604 5.538 Average 0.346 0.337333 0.354667 0.281667 0.325 0.201333 0.307667 Variance 0.011596 0.000449 0.001064 1.23E05 0.000589 0.000961 0.004698 C6 Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 1.204 1.296 1.567 1.507 1.654 1.52 8.748 Average 0.401333 0.432 0.522333 0.502333 0.551333 0.506667 0.486 Variance 0.00453 0.000388 0.00053 0.00563 0.0019 0.00435 0.004927 C7 Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 0.843 1.12 1.305 1.346 1.246 1.322 7.182 Average 0.281 0.373333 0.435 0.448667 0.415333 0.440667 0.399 Variance 0.000763 0.001797 3.7E05 0.000246 0.005406 0.003752 0.005003 Ctm Count 3 3 3 3 3 3 18 Sum 0.663 0.909 0.858 1.023 0.926 0.832 5.211 Average 0.221 0.303 0.286 0.341 0.308667 0.277333 0.2895
Variance 0.001129 0.001281 0.000927 0.000496 0.000272 0.0016 0.002093 Total Count 21 21 21 21 21 21 Sum 7.286 7.819 7.612 7.31 7.98 6.112 Average 0.346952 0.372333 0.362476 0.348095 0.38 0.291048 Variance 0.007256 0.002956 0.009796 0.01033 0.007905 0.018148 ANOVA Source of Variation SS df MS F Pvalue F crit Sample 0.553245 6 0.092207 43.67214 8.27E24 2.208554 Columns 0.105895 5 0.021179 10.03094 1.5E07 2.323126 Interaction 0.397221 30 0.013241 6.271176 1.4E11 1.594962 Within 0.177354 84 0.002111 Total 1.233714 125
Ph lc 9. Phân tích nh hưng ca ngun cacbon Anova: TwoFactor With Replication SUMMARY 1%CMC 0.05%G:1%CMC 0.1%G:1%CMC 0.15%G:1%CMC 0.05%S:1%CMC 0.1%S:1%CMC 0.15%S:1%CMC Total A2 Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 0.265 0.374 0.742 1.277 0.149 0.327 0.397 3.5 Average 0.088 0.124666667 0.24733333 0.425666667 0.049666667 0.109 0.132333333 0.2 Variance 0.004 7.23333E05 0.00332033 0.001449333 0.001352333 0.001767 0.003282333 0 C2 Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 0.503 0.469 0.984 0.328 0.337 0.993 1.345 5 Average 0.168 0.156333333 0.328 0.109333333 0.112333333 0.331 0.448333333 0.2 Variance 0.007 0.000325333 0.019029 0.001336333 0.007765333 0.005059 0.002242333 0 C3 Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 0.676 0.712 1.021 1.368 0.384 1.017 0.832 6 Average 0.225 0.237333333 0.34033333 0.456 0.128 0.339 0.277333333 0.3 Variance 0.005 0.001170333 0.00484233 0.010612 0.001516 0.000189 0.000754333 0 C4 Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 0.293 0.475 0.557 0.608 0.457 0.433 0.332 3.2 Average 0.098 0.158333333 0.18566667 0.202666667 0.152333333 0.1443333 0.110666667 0.2 Variance 4E04 0.001210333 0.00059633 4.93333E05 3.23333E05 0.0002003 0.000677333 0
C6 Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 0.689 0.647 0.789 0.708 1.23 1.422 1.364 6.8 Average 0.23 0.215666667 0.263 0.236 0.41 0.474 0.454666667 0.3 Variance 0.008 0.007570333 0.015739 0.007141 0.080101 0.004548 0.041281333 0 C7 Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 0.721 0.406 0.412 0.518 0.439 0.412 0.26 3.2 Average 0.24 0.135333333 0.13733333 0.172666667 0.146333333 0.1373333 0.086666667 0.2 Variance 0.002 0.002725333 0.00047633 8.63333E05 0.003644333 2.233E05 8.13333E05 0 Ctm Count 3 3 3 3 3 3 3 21 Sum 1.058 0.787 1.35 0.274 2.216 1.462 0.829 8 Average 0.353 0.262333333 0.45 0.091333333 0.738666667 0.4873333 0.276333333 0.4 Variance 2E04 0.011797333 0.001612 0.001256333 0.005841333 0.0128363 0.006946333 0 Total Count 21 21 21 21 21 21 21 Sum 4.205 3.87 5.855 5.081 5.212 6.066 5.359 Average 0.2 0.184285714 0.27880952 0.241952381 0.248190476 0.2888571 0.255190476 Variance 0.01 0.005081514 0.01437796 0.021126148 0.063819362 0.0255856 0.026888562 ANOVA Source of Variation SS df MS F Pvalue F crit Sample 1.055 6 0.17583636 28.78098693 1.27118E19 2.1925178 Columns 0.186 6 0.03092624 5.062022297 0.000146009 2.1925178 Interaction 1.689 36 0.0469105 7.678334131 4.90832E16 1.5375303 Within 0.599 98 0.00610946 Total 3.528 146
i LI CAM ĐOAN Tơi tên là Đu Th Dung, hc viên lp cao hc Sinh Hc thc nghim khĩa II (20072010) trưng đi hc Tây Nguyên. Tơi xin cam đoan đây là lun văn tt nghip do chính bn thân tơi thc hin dưi s hưng dn ca TS. Võ Th Phương Khanh. Tơi xin hồn tồn chu trách nhim v li cam đoan trên. Ngưi thc hiên: Đu Th Dung
ii LLLIII CCCMMM ƠNNN Đ hồn thành b n lu n văn này, tơi xin bày t lịng bi t ơn chân thành và sâu sc t i: TS. Võ Th Ph ươ ng Khanh, giáo viên h ưng d n, ng ưi đã t n tình ch bo, t o m i đi u ki n, giúp đ tơi trong su t th i gian h c t p và th c hi n đ tài. Quý th y cơ giáo đã gi ng d y và trang b cho tơi nh ng kin th c quý báu trong 3 năm qua. Các Th y cơ, các anh ch trong B mơn Sinh, trong Khoa KHTN & CN, Phịng Đào t o Sau Đ i h c đã quan tâm giúp đ tơi trong th i gian h c t p và làm đ tài. Ban giám hi u cùng tồn th các phịng ban đã t o đi u ki n cho tơi đưc đào t o cao h c, chuyên ngành Sinh h c Th c nghi m. Cu i cùng, tơi xin g i l i cám ơn sâu s c đ n gia đình, b n bè, đc bi t là các b n trong l p Cao h c SHTN K2 đã đng viên, h tr tơi trong su t th i gian h c t p cũng nh ư hồn thành lu n văn t t nghi p này. Xin chân thành c m ơn! ĐăkLăk, tháng 01 năm 2011 Hc viên thc hin Đu Th Dung
iii MC LC Trang M đu 1 1. Đt vn đ 1 2. Mc tiêu ca đ tài 2 3. Ý nghĩa khoa hc và thc tin 2 4. Gii hn đ tài 2 Phn I. Tng quan tài liu nghiên cu 3 I. Vi sinh vt phân gii cellulose 3 1.1. Vi sinh vt phân gii cellulose hiu khí 3 1.2. Vi sinh vt phân gii cellulose k khí 4 II. Đi cương v x khun 5 2.1. Gii thiu chung v x khun 5 2.1.1. S phân b và ý nghĩa ca x khun trong t nhiên 5 2.1.2 V trí ca x khun trong sinh gii .6 2.2. Hình thái, kích thưc và cu to x khun 8 2.2.1 Đc đim hình thái, kích thưc 8 2.2.2 Cu to t bào 9 2.3. Sinh sn .11 2.4. Phân loi đnh tên x khun 12 2.4.1. Phân loi 12 2.4.1.1. Phương pháp phân loi truyn thng 13 2.4.1.1.1. Đc đim hình thái và tính cht nuơi câý 14 2.4.1.1.2. Đc đim hố phân loi (Chemotaxonomy) 15 2.4.1.1.3. Đc đim sinh lýsinh hố 16 2.4.1.2. Phương pháp phân loi sinh hc phân t 17 2.4.1.3. Phân loi s (Numerical taxonomy) 17 III. Cellulose và enzyme cellulase 18
iv 3.1. Cellulose 18 3.2. Enzyme cellulase 19 3.2.1. Cu trúc 19 3.2.2 .ng dng 21 IV. Tình hình nghiên cu và ng dng x khun trong và ngồi nưc 23 4.1. Trên th gii 24 4.2. Vit Nam 24 Phn II. Ni dung và phương pháp nghiên cu 27 I. Ni dung nghiên cu 27 II. Vt liu và đa đim nghiên cu 27 2.1. Vt liu 27 2.1.1. Đi tưng nghiên cu: 27 2.1.2. Hố cht 27 2.1.3. Thit b 27 2.2. Đa đim nghiên cu 28 III. Phương pháp nghiên cu 28 3.1. Phương pháp thu mu 28 3.2. Phương pháp phân lp x khun chu nhit phân gii cellulose 28 3.2.1. Mơi trưng phân lp 28 3.2.2. Pha lỗng và cy mu 28 3.3. Phương pháp mơ t mt s đc đim hình thái ca các chng x khun thu đưc 29 3.4. Phương pháp kho sát kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp 29 3.4.1. Phương pháp xác đnh hot tính enzyme cellulase ca chng x khun bng đưng kính vịng phân gii [21, 14] 29 3.4.1.1. Nguyên tc 29 3.4.1.2. Tin hành thí nghim 30 3.4.1.3. Đánh giá kt qu 30
v 3.4.2. Phương pháp xác đnh nng đ đưng kh ca dung dch nuơi cy x khun bng phương pháp DNS (dinitro salicylic acid) [1, 12] 31 3.4.2.1. Nguyên tc 31 3.4.2.2. Tin hành thí nghim 31 3.4.2.3. Tính kt qu 33 3.5. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca mt s yu t đn hot tính enzyme cellulose ca các chng x khun tuyn chn 33 3.5.1. Nghiên cu nh hưng ca nhit đ 33 3.5.2. Nghiên cu nh hưng ca pH 33 3.5.3 Nghiên cu nh hưng ca t l glucose và saccharose b sung .34 3.5.4. Nghiên cu tc đ sinh trưng ca các chng x khun trên mơi trưng cĩ b sung đưng .34 3.5.5. Nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy chng x khun C2 b sung glucose 1% đn hot tính enzyme cellulose 34 3.5.6. Đnh danh các chng x khun ưu th .35 Phn III. Kt qu và tho lun 36 3.1. Phân lp và tuyn chn các chng x khun chu nhit cĩ kh năng sinh tng hp cellulose 36 3.1.1. Đc đim hình thái các chng x khun phân lp 36 3.1.2. Tuyn chn các chng x khun cĩ kh năng phân gii cellulose .43 3.2. Nghiên cu nh hưng ca mt s yu t đn hot tính ca enzyme cellulase ca các chng x khun tuyn chn. 46 3.2.1. nh hưng ca nhit đ 46 3.2.2. nh hưng ca pH mơi trưng 48 3.2.3. nh hưng ca t l đưng b sung 49 3.3. Đnh danh các chng x khun ưu th 61
vi Phn IV. Kt lun và kin ngh 63 I. Kt lun 63 II. Kin ngh 64
vii DANH MC CÁC CH VIT TT S th t Ch vit tt Ch vit đy đ 01 CMCase Carboxymethyl cellulase 02 CMC Carboxymethyl cellulose 03 CBH Cellobiohydrolase 04 CBH I Cellobiohydrolase I 05 CBH II Cellobiohydrolase II 06 CFU/g Colony Forming Unit /gam 07 DNS Dinitro salisilic acid 08 ĐK Đưng kính 09 EG Endoglucanase 10 EG I Endoglucanase I 11 EG II Endoglucanase II 12 G Glucose 13 IU Imeasure Unit (đơn v hot tính) 14 MT Mơi trưng
viii DANH MC CÁC BNG BIU Trang Bng 1.1. Các nhĩm vi sinh vt tham gia phân gii cellulose hiu khí trong t nhiên 3 Bng 1.2. Các nhĩm vi sinh vt tham gia phân gii cellulose k khí trong t nhiên 4 Bng 3.1. Đc đim hình thái khun lc, khun ty ca các chng x khun chu nhit đưc phân lp 37 Bng 3.2. Đánh giá kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp 43 Bng 3.3. nh hưng ca nhit đ đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun tuyn chn 47 Bng 3.4. nh hưng ca pH đn hot tính enzyme ca các chng x khun 49 Bng 3.5. nh hưng ca t l đưng b sung đn tc đ sinh trưng và kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun tuyn chn sau 5 ngày nuơi cy 51 Bng 3.6. nh hưng ca t l b sung gluose đn s sinh trưng ca các chng x khun tuyn chn 56 Bng 3.7. nh hưng ca t l đưng b sung đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun 58 Bng 3.8. nh hưng ca thi gian nuơi cy vi t l b sung glucose 1% đn hot tính enzyme cellulase ca chng x khun C2 60
ix DANH MC HÌNH NH Trang Hình 1.1. Cu trúc ca phân t cellulose 19 Hình 1.2. Cơ ch tác đng ca enzyme cellulase 21 Hình 3.1. Kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp trên mơi trưng thch ca các chng C 1 , C 2 , C 3 39 Hình 3.2. Kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp trên mơi trưng thch C4 , C 5, C 6 40 Hình 3.3. Kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp trên mơi trưng thch C7 , C 8 , C 9 41 Hình 3.4. Kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp trên mơi trưng thch C10 , C 11 , C 12 42 Hình 3.5. Kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp trên mơi trưng thch 45 Hình 3.6. Kh năng phân gii cellulose trên đĩa thch ca các chng tuyn chn vi các t l ngun cacbon khác nhau 55
1 M ĐU 1. Đt vn đ Vit Nam là mt nưc nơng nghip, theo thng kê năm 2009 thì trên 70% dân s sng nơng thơn [31]. Hàng năm lưng nơng sn xut khu chim ti 50% kim ngch xut khun trong đĩ ch yu là lúa, cà phê, cao su, tiêu, điu .Vì vy các ph liu cha cellulose như rơm r, v đu, v cà phê, bã mía, mùn cưa k c trong rác thi sinh hot rt phong phú. Mt phn nh ngun ph liu này đưc s dng vi mc đích cung cp nhit năng, mt phn nh dùng làm thc ăn gia súc nhưng hiu qu rt thp, phn ln thi ra mơi trưng và gây ơ nhim mt cách nghiêm trng vì đĩ là nơi trú n ca nhiu loi sâu hi và mm bnh. X lí cht thi hu cơ bng vi sinh vt đ làm phân bĩn , bo v mơi trưng rt đưc nhà khoa hc, nhà sn xut, nơng dân quan tâm. ĐăkLăk là mt tnh cĩ nhiu ưu th v phát trin nơng lâm nghip,nên x lý ph thi ca nơng lâm nghip là vic làm ht sc cn thit. Trong thiên nhiên cĩ nhiu nhĩm vi sinh vt phân gii cellulose như vi khun, x khun, nm si.Trong đĩ x khun vi nhng đc tính ưu vit như phân gii các hp cht hu cơ phc tp và bn vng, to ra các cht kháng sinh, vitamin, chu đưc các bin đng bt li ca mơi trưng vi nhiu cơng trình đã và đang đưc nghiên cu. Như vy vic nghiên cu và tuyn chn x khun ưa nhit thích hp s giúp cho quá trình phân hy v, xác cà phê, rơm r, mùn cưa, nhanh chĩng và hiu qu, gĩp phn phát trin caphê bn vng, bo v mơi trưng xung quanh và khơng làm ơ nhim ngun nưc ngm. Đ gim nhim mơi trưng do ngun rác thi cha nhiu cellulose, ngun ph liu này cn tích cc x lý. Cĩ nhiu phương pháp khác nhau nhưng đáng chú ý vn là phương pháp sinh hc [11]. Trong phương pháp này các tác nhân sinh hc tng đưc s dng là x khun, vi khun, nm si đ
2 phân gii cellulose thành các ngun cacbon đơn gin mà cây trng d s dng. Tính chu nhit và kh năng sinh tng hp cellulase cao là hai yu t quyt đnh hiu qu ca kh năng phân gii cơ cht ca các vi sinh vt.Mt khác, quá trình d hố là quá trình to nhit nên thưng làm mơi trưng cơ cht nĩng lên. Điu đĩ càng địi hi tính chu nhit cao ca vi sinh vt phân gii. Trên cơ s đĩ, chúng tơi tin hành nghiên cu đ tài "Nghiên cu kh năng sinh tng hp cellulase ca các chng x khun ưa nhit thu thp ti Buơn Ma Thut" 2. Mc tiêu ca đ tài 1. Tuyn chn trong t nhiên Buơn Ma thut các chng x khun chu nhit cĩ kh năng sinh tng hp cellulase. 2. Đánh giá nh hưng ca mt s yu t ca mơi trưng nuơi cy đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun ưa nhit đã tuyn chn. 3. Ý nghĩa khoa hc và thc tin Ý nghĩa khoa hc Thu thp và tuyn chn các chng x khun ưa nhit phân gii cellulose đ bo tn ngun gen quý ca vi sinh vt trong t nhiên ti Buơn Ma thut. Ý nghĩa thc tin Các chng vi sinh vt cĩ kh năng phân gii các hp cht hu cơ phc tp t ph liu nơng lâm nghip thành các hp cht đơn gin d s dng đi vi cây trng s đưc s dng trong thành phn ca phân hu cơ vi sinh, đáp ng nhu cu phát trin bn vng ca nn nơng nghip đa phương. 4. Gii hn đ tài Do thi gian cĩ hn, chúng tơi ch phân lp và tuyn chn x khun hiu khí chu nhit trong t nhiên các đng v cà phê, mn cưa, rơm r.
3 PHN I . TNG QUAN TÀI LIU NGHIÊN CU I. Vi sinh vt phân gii cellulose Trong thiên nhiên cĩ nhiu nhĩm vi sinh vt cĩ kh năng phân hu cellulose nh cĩ h enzyme cellulase ngoi bào. Cellulose là thành phn cu to cơ bn ca thành t bào thc vt. Vic tng hp cellulose cĩ quy mơ phc tp hơn hn vic tng hp nhng cht khác. Do đĩ, vi sinh vt phân gii cellulose cĩ vai trị đc bit quan trng trong vịng tun hồn cacbon. S phân gii tin hành trong điu kin hiu khí ln k khí, mơi trưng kim hoc acid, đ m thp hoc cao và các nhit đ khác nhau. Tt c vi sinh vt tham gia vơ cơ hĩa cellulose đu thuc loi d dưng hĩa năng hu cơ, cĩ enzyme cellulase xúc tác vic phân gii cellulose thành cellobioase và glucose. Vi sinh vt dùng các hp cht sinh ra này làm ngun cacbon và ngun năng lưng. 1.1. Vi sinh vt phân gii cellulose hiu khí Cĩ rt nhiu nhĩm vi sinh vt trơng t nhiên cĩ kh năng tit ra enzyme đ phân hy cellulose như vi khun, x khun, nm mc, nm ln. Bng 1.1: Các nhĩm vi sinh vt tham gia phân gii cellulose hiu khí trong t nhiên [22]. Vi khun X khun Niêm vi khun Nm ln Vi nm Achromobacter Micromonospera Cytophaga Basidiomycetes Trichoderma Pseudomonas Proactinomyces Angiococus Meraluis Penicillum Cellulomonas Actinomyces Polyangium Fomes Cellvibrio Streptomyces Sorangium Bacillus Streptosporang Archangium
4 Trong các nhĩm vi sinh vt phân gii cellulose hiu khí trong t nhiên phi k đn các vi sinh vt trong nhĩm vi khun ưa nhit như: Cellulomonas, Cellvibrio, nhĩm x khun ưa nhit như: Streptomyces, Actinomyces, Ngưi ta thưng s dng x khun đc bit chi Streptomyces trong vic phân hu rác thi sinh hot, nơng nghip Nhng x khun này thưng thuc nhĩm chu nhit, sinh trưng, phát trin tt nht nhit đ 45 – 500C nên rt thích hp vi quá trình rác thi [17]. X khun đưc nghiên cu mt cách sâu sc vì nĩ cĩ vai trị ln trong quá trình hình thành đt và ci to đ phì nhiêu ca đt. X khun là sinh vt d dưng cĩ th s dng nhiu ngun dinh dưng khác nhau như: đưng, tinh bt, lipit, aminoaxit, protein, ngồi ra chúng cịn s dng cá ngun dinh dưng nitơ vơ cơ khác như; mui amon, urea, nitrat. 1.2. Vi sinh vt phân gii cellulose k khí Phân gii cellulose k khí cịn gi là s lên men cellulose đ to thành các sn phm như: ethanon, lactate, axetate, CO 2. Các vi sinh vt phân gii cellulose k khí ch yu sng trong d c ca các lồi đng vt nhai li đưc tĩm tt trong bng 1.2 [22]. Bng 1.2: Các nhĩm vi sinh vt tham gia phân gii cellulose k khí trong t nhiên Tên vi sinh vt Đc đim hình thái t bào Cĩ nhiu trong phân đng vt, cĩ dng hình que và chuyn thành dng un cong Clostridium thermocellum khi trưng thành, kích thưc khá dài, bào t sinh ra mt đu ca t bào. Clotridium omelianski Trc khun, kích thưc 0.5 x 4 – 9 m. Cu khun, sng trong d c đng vt Ruminococcus flavefaciens nhai li, gram âm, thưng xp to thành chui, cĩ kh năng sinh sc t vàng. Liên cu khun, sng trong d c đng Ruminococcus albus vt nhai li.
5 Cellobacterium cellulosovens Trc khun, khơng sinh bào t, gram âm, sng trong d c đng vt nhai li. II. Đi cương v x khun 2.1. Gii thiu chung v x khun X khun ( Actinomycetes ) thuc nhĩm Prokaryotes , chưa cĩ nhân ging như vi khun. Tuy vy, đa s t bào x khun li cĩ cu to dng si, phân nhánh phc tp và cĩ nhiu màu sc ging như nm mc. 2.1.1. S phân b và ý nghĩa ca x khun trong t nhiên X khun phân b rng rãi trong t nhiên, trong đt, trong nưc ao h, mt phn trong bùn và trong các cơ cht hu cơ khác, thm chí trong c cơ cht mà các vi khun khác và nm mc khơng phát trin đưc [17]. X khun cĩ nhiu nht trong lp đt b mt, s lưng x khun trong đt khơng ch ph thuc vào loi đt mà cịn ph thuc vào mc đ canh tác ca đt và kh năng bao ph ca thc vt. Đt giàu dinh dưng và lp đt trên b mt (40cm) thưng cĩ s lưng x khun ln. S đơn v hình thành khun lc (CFU) ca x khun trong 1g đt canh tác thưng đt ti hàng triu mm x khun, trong đt hoang hố ch khong 10.000100.000 . S lưng x khun trong đt cũng thay đi theo thi gian trong năm [1,19]. X khun cũng thưng sng trên các cây cht, rơm r, thưng hoi sinh nhưng cĩ th kí sinh thân cây, c và r cây. Mt s nghiên cu cũng cho thy s cĩ mt ca x khun trong trm tích bin như các lồi Actinomyces halophila , Actinomyces mortivalis và Actinomyces iraquensis [19], Streptomyces như Streptomyces antibioticus (MU106, MU107) và Streptomyces rimosus (MU114) hoc trong các mu nưc và bùn ao nuơi trng thy sn đc bit là lp bùn nơi xác các hp cht hu cơ lng đng nhiu. X khun đưc nghiên cu mt cách sâu sc vì chúng cĩ ý nghĩa quan trng trong t nhiên, tích cc tham gia vào các quá trình chuyn hố nhiu hp
6 cht trong đt, trong nưc, chúng cĩ vai trị rt quan trng trong chu trình tun hồn vt cht. Chúng s dng axit humic và các cht hu cơ khĩ phân gii khác trong đt . Bên cnh đĩ chúng cịn sn sinh nhiu sn phm trao đi cht quan trng nên đã đưc dùng đ sn xut nhiu loi enzim như proteaza, amilaza, xenlulaza, glucoizomeraza, vitamin và các axít hu cơ [6]. Do cĩ các loi enzim này nên chúng phân gii đưc các hp cht bn vng như kitin, xenluloza, lignin [23]. Mt đc đim quan trng ca x khun là kh năng sinh cht kháng sinh cĩ 6070% x khun phân lp đưc t đt cĩ kh năng này. Trong s khong 8000 cht kháng sinh hin đã đưc bit đn trên th gii thì trên 80% đưc to ra t x khun. Mt s x khun (thuc chi Frankia) cĩ th to nt sn trên r mt s cây khơng thuc b Đu và cĩ kh năng c đnh nitơ khơng khí thành dng d s dng cho cây [6]. Tuy nhiên, bên cnh nhng x khun cĩ ích thì mt s ít x khun k khí hoc vi hiu khí cĩ th gây bnh cho ngưi, cho đng vt và cho cây trng. Chúng sng trên r cây hoc c và gây bnh, nht là vùng đt kim, đt cát khi thi tit khơ hn, làm cho c l loét, sn sùi ngay t ngồi đng rung. Các chng Streptomyces spp. sinh đc t phytotoxin nh hưng ln ti mùa v, do chúng cĩ th tn ti trong đt trên 10 năm. 2.1.2 V trí ca x khun trong sinh gii Trưc đây, v trí phân loi ca x khun luơn là câu hi gây nhiu tranh lun gia các nhà vi sinh hc do nĩ cĩ nhng đc đim va ging vi khun, va ging nm. Trưc th k 19, x khun đưc xp vào nhĩm nm. V sau, khi đã nghiên cu sâu hơn ngưi ta đã tìm ra các bng chng v mi liên h gia x khun và vi khun như: 1. Mt s x khun như các lồi thuc chi Actinomyces và Nocardia rt ging vi các lồi vi khun thuc chi Lactobacillus và Corynebacterium. 2. X khun ging vi khun ch khơng cĩ nhân tht, chúng ch cha nhim sc cht phân b dc theo các si hoc các t bào.
7 3. Đưng kính ca si x khun và bào t ging vi vi khun. Đng thi x khun thưng khơng cha vách ngăn. 4. X khun là đích tn cơng ca các thc khun th ging như vi khun, trong khi đĩ, nm khơng b tn cơng bi thc khun th. 5. X khun thưng nhy cm vi các kháng sinh cĩ tác dng lên vi khun nhưng li thưng kháng vi nhng kháng sinh tác dng lên nm như các polyen. 6. X khun cha chitin, cht cĩ mt trong si và bào t ca nhiu nm, mà khơng cĩ vi khun. Đng thi ging như phn ln vi khun, x khun khơng cha xenluloza. 7. Tương t vi vi khun, x khun nhy cm vi phn ng axít ca mơi trưng, đc đim này khơng cĩ nm. 8. Các đc đim v si và nang bào t ln (sporangium) ca chi Actinoplanes cho thy cĩ th chi này là cu ni gia vi khun và các nm bc thp. T nhng đc đim trên, nên x khun đưc xp vào nhĩm vi khun tht Eubacteria [27]. V trí ca nhĩm vi khun tht (Eubacteria) đưc xác đnh như sau: Năm 1978, Gibbbens và Murray chia các vi khun nhân nguyên thu thành 4 ngành là ngành Gracilicutes (gm các vi khun Gram âm), ngành Tenericute (gm x khun và các vi khun Gram dương), ngành Mendosicutes gm các vi khun khơng cha Peptidoglican trong thành t bào, và ngành Mollicutes gm các vi khun chưa cĩ thành t bào. Năm 1980, Woese và cng s chia vi khun nhân nguyên thu thành 2 gii là gii vi khun tht (Eubacteria) (tương đương vi 3 ngành Gracilicutes, Tenericute, Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và gii vi khun c (Archaebacteria) (tương đương vi ngành Mendosicutes) [6]. X khun thuc v nhĩm vi khun tht (Eubacteria), lp Actinobacteria, b Actinomycetales, bao gm 10 dưi b, 35 h, 110 chi và 1000 lồi. Hin
8 nay, 478 lồi đã đưc cơng b thuc chi Streptomyces và hơn 500 lồi thuc tt c các chi cịn li đưc xp vào nhĩm x khun him [27]. 2.2 Hình thái, kích thưc và cu to ca x khun 2.2. 1 Đc đim hình thái, kích thưc Trên mơi trưng đc x khun phát trin thành nhng khun lc khơ, kích thưc khun lc thay cĩ b mt thơ nhám. Kích thưc khun lc đi tùy tng loi và điu mơi trưng. Khun lc x khun khơng trơn ưt như vi khun, nm men, cĩ các np to ra theo hình phĩng x vì vy mi cĩ tên gi là x khun (actinomycetes, ting Hi Lp: Aktis là “tia”, mykes là “nm”). Khun lc x khun thưng chc. Mt khun lc xù xì, cĩ dng da, dng vơi, dng nhung tơ hay dng màng do. Khun lc ca x khun khơng th ln vi khun lc ca nm vì khun ti ca x khun thưng mnh hơn ca nm mc (khun ty cơ cht 0,8 m; khun ty khí sinh 1,14 m), đưng kính khun ti nm cĩ th ln hơn 10 ln đưng kính khun ti ca x khun [20]. Đa s x khun cĩ cu to dng si, các si kt vi nhau to thành khun lc cĩ nhiu màu sc khác nhau: trng, vàng, nâu, tím, xám . X khun cĩ h khun ty phát trin tt, khun ty khơng cĩ vách ngăn và khơng t đt đon, bt màu gram dương, ho khí, hoi sinh, khơng hình thành nha bào, khơng cĩ lơng và giáp mơ, đa hình thái như dng hình chuỳ, dng phân nhánh hay dng si dài gi là khun ty (hipha) hay phân nhánh thành chùm, thành bĩ gi là khun ty th (mycelium), đưng kính khum ty t 0.2 – 2.5 m, kích thưc và khi lưng ca khun ty th thưng khơng n đnh, chúng ph thuc vào tng loi và tng điu kin nuơi cy. Các khun ty non và các khun ty cĩ mang bào t thưng ln hơn so vi các khun ty già và khơng mang bào t [20]. Khun lc x khun cĩ dng nhng vịng trịn đng tâm cách nhau mt khong nht đnh, nguyên nhân là do x khun sinh ra cht c ch sinh trưng, khi si mc qua vùng này chúng sinh trưng yu đi, qua đưc vùng
9 cĩ cht c ch chúng li sinh trưng mnh thành vịng tip theo, vịng này li sinh ra cht c ch sinh trưng khin khun ty li phát trin yu đi. C th to thành khun lc cĩ dng các vịng trịn đng tâm. Khun lc x khun thưng rn chc, xù xì, cĩ th cĩ dng da, dng phn, dng nhung, dng vơi ph thuc vào kích thưc bào t. Trưng hp khơng cĩ si khí sinh khun lc cĩ dng màng do. Khun lc x khun tuy cĩ dng si phân nhánh phc tp đan xen nhau nhưng tồn b h si ch là mt t bào cĩ nhiu nhân, khơng cĩ vách ngăn ngang. Ging như vi khun, nhân thuc loi đơn gin, khơng cĩ màng nhân. X khun cĩ nhiu hình dng khác nhau: chân chim, r cây, hình xon chùm qu, hình xon cành lá, hình xon c, hình đt thưa, hình đt dày, hình đt xon. Khi già x khun thay đi hình dng rõ rt, chúng tr nên giịn và d gãy thành tng đon nh cĩ kích thưc khác nhau [17, 6] Khun lc x khun thưng cĩ 3 lp: lp v ngồi là các si bn cht, lp trong tương đi xp và lp gia cĩ cu trúc t ong. Khun ti trong mi lp cĩ hot tính sinh hc khác nhau. Các sn phm trong qúa trình trao đi cht như: cht kháng sinh, đc t, enzym, vitamin, axit hu cơ đưc tích lũy trong mi lp khác nhau. Khun lc x khun cĩ màu sc khác nhau: đ, da cam, vàng, lam, tím tùy thuc vào loi và điu kin ngoi cnh. Cĩ loi x khun cĩ th to sc t tan trong mơi trưng nuơi cy, thưng gp các loi mang màu: xanh, tím, đ, da cam, vàng, lc, nâu và đơi khi màu đen [6]. Cĩ sc t tan trong nưc, cĩ sc t ch tan trong dung mơi hu cơ [20]. 2.2.2 Cu to t bào X khun thuc nhĩm Gram (+).Thành t bào x khun ging vi thành t bào vi khun gram dương. vi sinh vt khơng cĩ nhân thc khác như vi khun cĩ t l G + C khong 40% trong khi đĩ x khun t l này cao hơn hn, chim t l trên 70% [9].
10 Màng t bào cht x khun dày khong 50 nm và cĩ cu trúc tương t như màng t bào cht ca vi khun. Nhân khơng cĩ cu trúc đin hình, ch là nhng nhim sc th khơng cĩ màng. Khi cịn non, tồn b t bào ch cĩ mt nhim sc th sau đĩ hình thành nhiu ht ri rác trong tồn b h khun ty (gi là ht cromatin) [17, 6]. Màng t bào x khun khá phc tp, gm thành t bào và màng t bào Thành t bào x khun dng kt cu lưi, dày khong 1020nm, cĩ tác dng duy trì hình dáng ca khun ti và bo v t bào. Căn c vào kt cu hố hc ngưi ta chia thành t bào x khun thành 4 nhĩm: Nhĩm I: Cĩ cha L, LDAP và Glixin (Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides) Nhĩm II: cha mezoDAP và Glixin. Nhĩm III: cha mezoDAP. Nhĩm IV: cha mezo DAP, arbinozow và galactoza [6]. Thành t bào x khun ch yu chia thành 3 lp: lp ngồi dày 60120Å, khi già cĩ th dày ti 150Å; lp gia rn chc dy 50Å và lp trong dy 50Å. Thành t bào cu to ch yu t các lp glucopeptit gm các gc N axetylglucozamin liên kt vi Naxetylmuzamic bi liên kt 1,4glucozit. Khi x lý bng lizozyme các liên kt này b phá v, thành t bào b phá hu và màng nguyên sinh cht bao bc phn cịn li ca t bào to thành t bào trn (protoplast). Cu trúc si cũng mt đi khi x lý bng hn hp eter, cloroform và các dung mơi hồ tan lipit. Điu đĩ chng t lp ngồi thành t bào x khun cĩ cu to bng lipit. Thành t bào x khun khơng cha xenluloza hay kitin [6, 9, 25]. X khun phân lp t vùng ngp mn, cĩ thành t bào dày và đ bn cơ hc cao đ cĩ th chng chu vi mơi trưng khc nghit bên ngồi (nng đ mui trung bình 34%, pH 6,8 8,5 và nhit đ dao đng t 2035 0C). pH trung tính và kim như bin, so vi x khun trung tính, thành t bào
11 ca x khun chu kim ngồi peptitdoglycan cịn cha nhiu polyme axit như là axit galacturonic, axit gluconic, axit glutamic, axit asparic và axit photphoric. Vi đin tích âm to bi thành phn axit khơng thuc peptidoglican, b mt t bào cĩ th hp th đưc ion Na + và H + trong khi đy ion OH . Bên cnh đĩ, tuy cu trúc lp peptitdoglycan là ging nhau x khun trung tính và chu kim nhưng li khác nhau v thành phn các hp cht cu thành, x khun ưa kim cha nhiu hesosamin và axit amin. Mt trong nhng đc đim đáng lưu tâm ca x khun là khơng bn vng v di truyn, thưng xy ra s sp xp li trong phân t ADN. Điu này gây ra mt s hin tưng như to ra tính đa dng v hình thái tính kháng thuc do s xut hin các d vịng [6, 1]. Th trung gian (mezoxome) x khun nm phía trong màng t bào cht, cĩ hình phin, hình bng hay hình ng. Cơng dng ca th trung gian là làm tăng din tích tip xúc ca màng t bào cht và do đĩ tăng cưng hot tính enzyme, tăng kh năng chuyn đin t [6]. Các vt th n nhp nm trong t bào cht ca x khun gm cĩ các ht poliphotphat (hình cu, bt mu vi thuơc nhum Soudan III), các ht polisaccarit (bt màu vi dung dch Lugol) [6]. 2.3 Sinh sn X khun sinh sn sinh dưng bng bào t. Bào t đưc hình thành trên các nhánh phân hố t khun ty khí sinh gi là cung sinh bào t. Cung sinh bào t các lồi x khun cĩ kích thưc và hình dng khác nhau: Cĩ lồi dài 100 – 200 nm, cĩ lồi ch khong 20 – 30 nm, cĩ lồi cu trúc theo hình lưn sĩng, hình lị xo hay xon c. Sp xp ca các cung sinh bào t cũng khác nhau. Chúng cĩ th sp xp theo kiu mc đơn, mc đơi, mc vịng hoc tng chùm. Bào t đưc hình thành t cung sinh bào t theo kiu kt đon (fragmentation) hoc ct khúc (segmentation).
12 Kiu kt đon: ht cromatin trong cung sinh bào t đưc phân chia thành nhiu ht phân b đng đu dc theo si cung sinh bào t. Sau đĩ t bào cht tp trung bao bc quanh mi ht cromatin gi là tin bào t. Tin bào t hình thành màng to thành bào t nm trong cung sinh bào t. Bào t thưng cĩ hình cu hoc ơvan, đưc gii phĩng khi màng cung sinh bào t b phân gii hoc b tách ra. Kiu ct khúc: ht cromatin phân chia phân b đng đu dc theo cung sinh bào t. Sau đĩ gia các ht hình thành vách ngăn ngang, mi phn đu cĩ t bào cht. Bào t hình thành theo kiu này thưng cĩ hình viên tr hoc hình que. Ngồi hình thc sinh sn bng bào t, x khun cịn cĩ th sinh sn bng khun ty. Các đon khun ty gãy ra mơi trưng phát trin thành h khun ty. 2. 4 Phân loi, đnh tên x khun 2.4.1. Phân loi Theo bng phân loi ca Becgay (1984) thì x khun gm 11 h [17]: 1. Actinomycetaceae 2. Streptomycetaceae 3. Celluomonadaceae 4. Dermatophilaceae 5. Fankiaceae 6. Actinophanaceae 7. Micromonosporaceae 8. Caryophanaceae 9. Nocardiaceae 10. Pseudonocardiaceae 11. Mycobacteriaceae
13 Trong s x khun đã đưc phân loi, Actinomyces Hart (1970) là lồi lâu đi nht. Actinomyces israeli đưc coi là chng x khun k khí thun chng đu tiên (1889) vì trưc khi phát trin phương thc gi ging đơng khơ thì khĩ cĩ th bo qun vi sinh vt lâu dài và nhiu chng ging đã b tht lc. Do vy khơng cĩ chng x khun nào đưc tìm ra sm hơn các chng mà Waksman phát hin và lưu trong danh mc B sưu tp ging ca ơng (1916 1919) [9]. Cho đn nay, cĩ thêm rt nhiu chng x khun đưc lưu trong danh mc ging x khun. Ba phương pháp phân loi x khun là phương pháp phân loi truyn thng, phương pháp phân loi bng k thut phân t, và phân loi s. 2.4.1.1 . Phương pháp phân loi truyn thng Krainski (1914) ln đu tiên đ ra các ch tiêu v đc đim sinh lí và coi đĩ là mu cht trong nguyên tc phân loi đ sơ b phân loi 17 chng thuc chi Actinomyces. Waksman và Curtis (1916), Waksman (1919) đã đ cp đn nhng dng trung gian trong mơ t phân loi ca mình và coi đc đim hình thái ca bào t là đc tính quan trng ca các cá th. Do vy h đã đưa ra mt s lồi mi cĩ ý nghĩa. Tip đĩ Millard và Burr (1926) tìm ra 17 lồi, Jensen (19301931) – 2 lồi, Dunche (1934) – 13 lồi. Baldacci và cng s đã bt đu nghiên cu x khun t năm 1936 và đn năm 1953 cơng b mt khố phân loi chi Streptomyces da trên cơ s màu sc khun ty khí sinh, khun ty cơ cht và mt s đc đim trung gian khác nhau. Năm 1943, Waksman và Henrici đã đưa ra mt s h thng phân loi và đn năm 1961 cĩ sa đi [34]. Trong h thng này, x khun đưc xp thành nhĩm gm 3 h, chia nh thành 10 chi và mơ t chi tit hơn 250 lồi thuc chi Streptomyces. Krassilnikov là mt trong nhng chuyên gia ni ting v nghiên cu và phát trin khố phân loi x khun. T năm 1941 đn năm 1949 ơng đã phát trin 38 lồi mi. Năm 1970, ơng li cơng b h thng phân loi mi da trên h thng đã cơng b năm 1949 [9]. Trong đĩ x khun đưc phân chia thành 6 h, gm 26 chi.
14 Theo Krassilnikov Actinomyces đưc dùng như mt tên gi chung cho nhng lồi thuc chi Streptomyces mà Waksman và Henrici đã phác ho năm 1943. Mt s nhà nghiên cu ngưi Đc ,Flaig và cng s (1952) Flaig và Kutzner (1954) Kuster và Geiuz (1955) cho rng chi Streptomyces là mt nhĩm ln. Ln đu tiên h s dng kính hin vi đin t đ nghiên cu đc đim bào t ca chi này. Kutzner đã phát trin mt khố phân loi Streptomyces da trên cơ s hình dáng cung sinh bào t, cu trúc hin vi đin t ca bào t, s to thành sc t tan, hot ph kháng khun và mt s đc đim sinh lý khác [23]. Năm 1957, (Gauze) và cng s đã cơng b h thng phân loi mi. H thng này da vào màu sc khun ty khí sinh, khun ty cơ cht, hình dng bào t và cung sinh bo t. H thng này cũng đưc chnh lý và tái bn năm1983. S lưng h thng phân loi x khun ngày mt tăng trong nhng năm gn đây Praceser, (1968); Kuster,(1972); Pridham, (1974); Arai (1969); Nonomura, (1974); Szabĩ, (1965) . Đĩ là hình thc phân loi truyn thng da trên đc đim hính thái và tính cht nuơi cy. Hình thc này hin nay vn đang đưc s dng ph bin. 2.4.1.1.1. Đc đim hình thái và tính cht nuơi câý Trong phân loi ngưi ta thưng chia x khun thành 4 nhĩm chính da vào các du hiu v hình thái Nhĩm x khun mang bào t rõ rt. Đc trưng ca nhĩm này là sinh sn bng bào t và phân hố thành khun ty khí sinh, khun ty cơ cht. Nhĩm x khun cĩ các bào t nang. Đc trưng là khun ti phân chia theo các hưng vuơng gĩc vi nhau, to ra các cu trúc tương t nang bào t. Nhĩm x khun dng Nocardia sinh sn bng cách phân đt khun ti. Nhĩm x khun dng tương t Corynebacter và dng cu: t bào cĩ hình ch V, T hoc dng cu, thơng thưng khơng cĩ khun ti.
15 Hu ht các chi x khun đưc mơ t hin nay đưc phân chia tuỳ theo s khác nhau v đc đim hình thái và tính cht nuơi cy: như màu sc khun ty khí sinh, khun ty cơ cht, sc t hồ tan; s cĩ mt ca khun ty cơ cht, hình dng và kt cu mt bào t; đc đim cung sinh bào t và s phân đt ca khun ty. Tuy nhiên vic coi các đc đim hình thái, nuơi cy là d liu cơ bn dùng đ phân loi x khun khơng thành cơng, vì chính cùng mt lồi cĩ th biu hin khác nhau v hình thái do bin d t nhiên hay nhng lồi khác nhau cĩ th ging nhau v mt hình thái. Do vy ngày nay trong phân loi x khun phi dùng kt hp các ch tiêu khác như các đc đim sinh lý, sinh hố min dch hc hay sinh hc phân t [9]. 2.4.1.1.2. Đc đim hố phân loi (Chemotaxonomy) Năm 1965, Lechevalier đ ngh cĩ th tách x khun hiu khí thành tng nhĩm da trên các đc đim hình thái và thành phn hố hc ca t bào. Trong 20 năm tr li đây, vic s dng các thơng tin v thành phn hố hc ca t bào đã đưc áp dng rng rãi đ phân loi prokaryote. Nĩ đã tr thành mt phương pháp cơ bn và cĩ hiu qu thơng qua vic đnh tính và đnh lưng thành phn hố hc ca t bào vi sinh vt [24, 30, 23]. Đc bit hố phân loi là rt quan trng trong vic phân loi x khun, thm chí phân loi đn mc đ chi. Hố phân loi ch yu da vào các đc đim sau: Typ thành t bào: phân tích axit amin trong thành phn peptit và đưng trong thành t bào hay các polysacarit gn vào thành t bào. Typ peptidoglycan (PG): các thơng tin v thành phn, cu trúc mch tetrapeptit ca PG, ca cu ni peptit và cách liên kt gia các mt xích ca PG, Steiner (1974) đã chia PG thành 2 nhĩm cơ bn A và B. Nhĩm A: liên kt chéo gia hai mch tetrapeptit qua axit diaminopemilic (DAP) v trí th 3 và 4. Nhĩm B: hình thành liên kt chéo qua nhĩm cacboxyl ca Dglixin và alanin v trí 2 và 4. Ngồi ra cịn k đn s khác nhau v axit v trí th 3 ca chui và PG cĩ kí hiu A 1, A 2,
16 Axit mycolic: là các phân t cĩ mch dài phân nhánh thuc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Corynebacter. Đây là đc đim cơ bn phân loi cho các chi đĩ [9]. Axit béo: thưng đưc s dng trong phân loi là axit béo bão hồ mch thng và khơng bão hồ vi mch phân nhánh kiu iso và enteiso đưc metyl hố nguyên t cacbon th 10. S cĩ mt ca axit 10 metyloctadecanoit (axit tuberculostearinoic) là đc đim đ phân loi đn chi [24]. Menaquinon: x khun ging vi khun Gram dương, khác vi khun Gram âm ch tng hp menaquinon và dimetylmenaquinon, khơng tng hp ubiquinon. Phn ln các chi ca x khun cĩ thành phn menaquinon xác đnh [24]. Photpholipit: Năm 1977, Lechevalier đã s dng đc đim ca photpholipit đ phân loi x khun. Cĩ 5 typ photpholipit (P I, P II, P III, P IV và PV) cĩ thành phn đc trưng và cĩ ý nghĩa cho phân loi x khun [30]. 2.4.1.1.3. Đc đim sinh lýsinh hố Khi phân loi x khun đn lồi ngưi ta s dng hàng lot các đc đim sinh lý, sinh hố như kh năng đng hố các ngun cacbon và nitơ, nhu cu cht kích thích sinh trưng, kh năng bin đi các cht khác nhau nh h thng enzim. Các ch tiêu khác cũng đưc xác đnh như mi quan h vi pH, nhit đ, kh năng chu mui và các yu t khác ca mơi trưng; mi quan h vi các cht kìm hãm sinh trưng và phát trin khác nhau; tính cht đi kháng và nhy cm vi cht kháng sinh; kh năng to thành cht kháng sinh và các sn phm trao đi cht đc trưng khác ca x khun [31, 34]. Tuy nhiên, Hopwood (1975) khng đnh phn ln các đc đim sinh lí, sinh hố cùng đc đim nuơi cy d b bin đng và cĩ giá tr thp v mt phân loi. Do tính khơng n đnh và bin d cao ca x khun nên nguyên tc s dng các đc đim sinh lý, sinh hố đ phân loi x khun cũng phi thay đi.
17 2.4.1.2. Phương pháp phân loi sinh hc phân t Ngày nay nh s phát trin cao ca k thut, phương pháp phân loi phân t đã đưc s dng vào phân loi x khun. Trong h thng phân loi x khun hin nay ngưi ta vn dùng 3 phương pháp chính: lai ADN, lai ARN và phân tích rARN 16S [35,37]. Kt qu đưc biu hin bng s phn trăm s đng nht (homology). Hin nay, đi đa s các nhà khoa hc đng ý vi quan nim hai chng đưc coi là hai lồi riêng bit nu chúng ging nhau dưi 70% khi tin hành lai ADN. Phân tích rARN 16S đ lit kê th t các nucleotit đc trưng ca cá th và so sánh vi bng lit kê ca cơ th khác đ xác đnh mc đ ging nhau ca chúng. Keswani và cng s đã chng minh rng nu s tương đng gia hai trình t rADN 16S là 98.6% thì xác sut đ mc đ ging nhau trong phép lai ADN thp hơn 70% s là 99%. Vì th giá tr tương đng 98.6% ca trình t rADN 16S đưc coi là ngưng đ phân bit hai lồi khác nhau [27]. Bng phương pháp phân loi này, nhng kin thc v phân loi cũng cĩ nhiu thay đi. Ví d các nhà phân loi cho rng chi Nocardia d nhân (heterogeneous), nên v mt di truyn đã xp lồi Nocardia mediterranci sinh rifamixin vào chi Streptomyces và mang tên mi là Streptomyces mediterranci ; hp nht hai chi Streptomyces và Streptoverticillium vào mt chi Streptomyces [36] hoc chuyn lồi Nocardia erythropolis vào chi Mycobacterium (mang tên mi M.rodochroas ). Vì s lưng các lồi x khun mi đưc mơ t ngày càng nhiu và đ vic phân loi nhanh, chính xác v di truyn phân t ngưi ta đã s dng phương pháp phân loi s cũng như đưa thêm các đc đim phân loi và phát sinh chng loi. 2.4.1.3. Phân loi s (Numerical taxonomy) Phân loi s đã đưc Williams và cng s (1983) s dng đ phân loi chi Streptomyces và các chi cĩ quan h gn gũi [35]. Phương pháp này da
18 trên s đánh giá v s lưng mc đ ging nhau gia các vi sinh vt theo mt s ln các đc đim, ch yu là các đc đim hình thái, sinh lý – sinh hố. Đ so sánh các chng vi nhau tng đơi mt, Sneath (1973) [24] đ ngh tính h s ging nhau S(similarity) theo phương trình sau: N x100 %S = s N s + N d Trong đĩ: Ns – Tng s các đc đim dương tính ca 2 chng so sánh Nd – Tng s các đc đim dương tính ca chng này và âm tính ca chng kia. Kt qu phân tích s đưc biu din bng sơ đ nhánh mà trên đĩ các chng tuỳ theo mc đ ging nhau đưc nhĩm thành tng cm (Cluster) [8]. Bng phân loi s, ngưi ta chia x khun chi Streptomyces thành 21 nhĩm ln, 37 nhĩm nh và 13 cm vi nhng đi din duy nht. Trên cơ s nhn đưc, ngưi ta đưa ra thut tốn hc đ xác đnh nhng chng x khun chưa bit. Mc dù nguyên tc là gim s lưng các đc đim, nhưng cũng cịn ti 139 đc đim đã đưc s dng trong phân loi s. C ba phương pháp phân loi trên hin vn đang đưc s dng đc lp hoc kt hp vi nhau đ đnh tên lồi mt cách chính xác trong phân loi x khun hin nay. Mi phương pháp cĩ mt ưu đim nht đnh, tuy nhiên vì lí do thc dng, ngưi ta vn ch yu da vào phương pháp truyn thng là ch yu. III. Cellulose và enzyme cellulase 3.1. Cellulose Cellulose là polymer sinh hc phong phú nht trên trái đt (Murashima, 2002), đưc sinh tng hp ch yu bi thc vt vi tc đ 4.10 9 tn/năm. Hàng năm cĩ khong 232 t tn cht hu cơ đưc thc vt tng hp thành nh quá trình quang hp. Hàng ngày, hàng gi mt lưng ln cellulose đưc tích lu trong đt do các sn phm tng hp ca thc vt thi ra, cây ci cht đi, cành lá rng xung, mt phn do con ngưi thi ra dưi dng rác rưi,
19 giy vn, mùn cưa [5, 7]. Trong s này cĩ đn 30% là màng t bào thc vt mà thành phn ch yu là cellulose. Cellulose chim đn 89% trong bơng và 40 – 50% trong g [22]. Cellulose là polymer mch thng, mi đơn v là mt disaccharit gi là cellobiose cĩ cu trúc t hai phân t Dglucose đưc ni vi nhau qua liên kt βD1,4glucoside. Cellulose cu to dng si, các si liên kt to thành nhng bĩ nh gi là các microfibrin cĩ cu trúc khơng đng nht. Cĩ nhng phn đc gi là phn kt tinh và phn xp hơn gi là phn vơ đnh hình. Hình 1.1. Cu trúc ca phân t cellulozo 3.2. Enzyme cellulase 3.2.1. Cu trúc Trong thiên nhiên khơng gp cellulase dng tinh khit. Nĩ thưng tn ti dng kt hp vi các enzyme khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành h enzyme gi là Citolase [19]. Cellulase là mt phc h
20 enzyme bao gm các enzyme C1, Cx và βglucosidase tham gia nhng phn ng k tip nhau khi phân hu cellulose to thành glucose [13]. Enzyme C1: cĩ tác dng ct đt liên kt hydro bin cellulose t nhiên thành cellulose phn ng (cellulose vơ đnh hình). Enzyme Cx: cịn gi là enzyme β1,4glucanase, thu phân cellulose phn ng thành cellobiose. Enzyme này đưc chia thành hai loi: Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): cĩ tác dng thu phân liên kt β1,4glucozit ti các đim bt kỳ trên mch ca phân t cellulose. Đưc chia làm hai loi EGI, EGII. C hai loi enzyme này cĩ th hot đng nhit đ khá cao. Exocellulase hay Exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.9): phân gii chui trên thành disaccharit gi là cellobiose t đu khơng kh. Bao gm hai loi CBHI và CBHII: + CBHI cĩ trng lưng phân t khong 65KD, cha khong 496 acid amin. Enzyme này tác đng lên cellulose vơ đnh hình, ưu tiên liên kt vi vùng tinh th ca cellulose, khơng tác đng lên cellulose bin tính như CMC. + CBHII cĩ trng lưng phân t là 53KD, cha khong 471 acid amin. CBHII liên kt vi c vùng tinh th và vùng vơ đnh hình, khơng tác đng lên cellulose bin tính [22]. βglucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): thu phân cellobiose thành glucose. Là nhĩm enzyme khá phc tp, cĩ kh năng hot đng pH rt rng t 4.5 8.4. Trng lưng phân t t 5095KD, cĩ th hot đng nhit đ cao.
21 Hình 1.2. Cơ ch tác đng ca Enzyme Cellulase 3.2.2 ng dng Enzyme cellulase thu hút đưc s chú ý ca các nhà cơng ngh vì chúng cĩ th đưc ng dng rt nhiu trong các lĩnh vc sau: + X lý cht thi hu cơ cha cellulose Các cht thi hu cơ cha cellulose thưng là nhng cht rt khĩ phân hu. Trong điu kin t nhiên thi gian phân hu rt lâu (trên 6 tháng), điu kin khí hu nhit đi. Thi gian phân hu các cht thi này càng lâu càng gây ơ nhim đt, nưc, khơng khí. Các cht thi này cũng khĩ tham gia vào dây truyn chuyn hố vt cht ca thiên nhiên, gây mt cân bng sinh thái. Đ khc phc tình trng này các nhà khoa hc đã đưa vào khi ch phm vi
22 sinh vt giàu cellulase, kt qu là các cht thi b phân hu trong thi gian dưi mt tháng, gĩp phn hn ch ơ nhim mơi trưng [19]. + Sn xut sn phm thc phm, thc phm gia súc Các sn phm thc phm đưc sn xut t các nguyên liu thc vt cha nhiu cellulose gây ra hin tưng khĩ tiêu hố ngưi. Ngưi và nhng đng vt khơng nhai li thưng thiu vi sinh vt phân gii cellulose trong đưng tiêu hố. Do đĩ, vic ch bin thc phm nht là mt s sn phm đ hp bng ch phm cellulase cĩ ý nghĩa làm tăng hiu sut s dng thc ăn. Nhiu nghiên cu cho thy vic thêm ch phm cellulase vào thc phm gia súc làm tăng trng đàn ln và tăng cht lưng tht [19] + Phân bĩn vi sinh vt Các ch phm vi sinh vt cĩ kh năng tng hp cellulase mnh, khi đưc bĩn vào đt trng cĩ nhiu cht hu cơ cha nhiu cellulose s phân hu nhanh các cht hu cơ to thành mùn, giúp cây trng phát trin nhanh [13],[19]. + Trong k thut di truyn Enzyme cellulase s phá v thành t bào thc vt đ to t bào trn, rt cn thit trong quá trình chuyn gen ca t bào thc vt [19]. + Cơng ngh bt cellulose và giy, cơng ngh si dt, cơng nghip cht ty ra. Đây là hưng đưc các nhà sn xut quan tâm nhiu trong nhng năm gn đây. S dng enzyme cellulase đ tách mc khi giy báo và tp chí cũ, ci thin tính cht quang hc cũng như đ bn cơ lý ca giy sn xut t bt kh mc. M, hơn 40% tng lưng giy s dng là bt ngun t giy loi, Nht Bn khong 55%.
23 Trong cơng ngh si dt, enzyme này đưc s dng đ x lý qun áo bị, làm bĩng vi bơng, vi si nhân to giúp vi mm mi hơn, đ hút m tăng lên, b mt vi đp hơn. Trong cơng nghip cht ty ra, các cht ty ra cha enzyme cellulase làm sch các cht bn trong lịng xơ bơng tt hơn s dng phương pháp ty ra thơng thưng [15]. IV. Tình hình nghiên cu và ng dng x khun trong và ngồi nưc . 4.1 Trên th gii Waksman là ngưi nghiên cu phân loi x khun sm nht, đã phát trin chuyên đ “Kim đnh và mơ t phân loi ging và lồi x khun” (1961). Trong chuyên đ này ơng đã tng kt khá t m và đã mơ t 7 lồi x khun k khí (Actunomyces sensu Waksman et Henrici), 59 lồi Nocardia, 252 lồi Streptomyces, 9 lồi Miromonospora. Cĩ ba ging là Waksmania, Actinoplanes và Streptosporangium thì ch gii thiu mt cách t m nhng lồi đin hình. Đc bit Waksman cịn mơ t riêng x khun chu nhit đ cao ca Henssen [12]. Năm 1957, Gause, Preobrajenxkara, Cudrina, Blnov Riabova và Svesnicova đã cho xut bn khố phân loi x khun đi kháng [12]. Cellulose chim khong mt na lưng cacbon trên trái đt. Do đĩ, các vi sinh vt phân gii cellulose đưc nhiu nhà khoa hc trên th gii tp trung nghiên cu, trong đĩ cĩ x khun. Nhiu cơng trình nghiên cu đã cho thy hiu qu to ln ca các vi sinh vt phân gii cellulose nĩi chung và các chng x khun nĩi riêng. Sinva (2000) đã phân lp đưc 754 chng vi sinh vt bao gm nm si, x khun, vi khun trên v cà phê sau ch bin 2 năm. HungDer Jang và KuoShu Chen (2002) phân lp đưc 26 chng x khun chu nhit t rác thi hu cơ nơng nghip, sau đĩ chn chng cĩ kh năng chu nhit đ cao (50 0C) và sinh enzyme mnh đ chuyn gen vào các vi sinh vt
24 khác, t đĩ nâng cao s lưng cũng như cht lưng phân gii cellulose vi sinh vt trong t nhiên [27]. Faiez Alaniwilliam và A.A.Anderson.Murrray MooYoung (2007) phân lp đươc mt lồi Streptomyces sp cĩ hot tính enzyme cellulase chu nhit và chu kim, cho hot tính enzyme cao nht điu kin 50 0C và pH = 7.0 [26]. Ziad Jaradat, Ahlam Dawagreh, Qotaiba Ababneh, Ismail Saadoun (2008) đã nghiên cu nh hưng ca điu kin nuơi cy đên kh năng sinh tng hp enzyme cellulse ca Streptomyces sp, kt qu nghiên cu cho thy hot tính enzyme cellulase b gim mnh 45 0C và pH acid. Hot tính ca enzyme cũng b nh hưng bi ngun cacbon và nitơ s dng trong mơi trưng nuơi cy [28]. 4.2 . Vit Nam Vit Nam là mt nưc nơng nghip, theo thng kê năm 2009 thì trên 70% dân s sng nơng thơn [31]. Hàng năm lưng nơng sn xut khu chim ti 50% kim ngch xut khun trong đĩ ch yu là lúa, cà phê, cao su, tiêu, điu Vì vy các ph liu cha cellulose như rơm r, v đu, v cà phê, bã mía, mùn cưa rt phong phú và rt khĩ phân hu, cho nên phn ln ngưi dân đem đt gây lãng phí hoc khơng đưc x lý s gây ơ nhim mơi trưng và là nơi trú n ca nhiu loi sâu hi và mm bnh. Trong thiên nhiên cĩ nhiu nhĩm vi sinh vt phân gii cellulose, trong đĩ x khun vi nhng đc tính ưu vit như phân gii các hp cht hu cơ phc tp và bn vng, to ra các cht kháng sinh, vitamin, chu đưc các bin đng bt li ca mơi trưng đã đưc nghiên cu vi nhiu cơng trình: Theo Phm Th Ngc Lan, Phm Th Hồ, Lý Kim Bng nghiên cu tuyn chn mt s chng x khun cĩ kh năng phân gii cellulose t mùn rác. Kt qu đã phân lp và thun khit đưc 195 x khun ưa m, trong đĩ cĩ 192 chng cĩ kh năng phân gii bt cellulose và CMC [11]. Lê Gia Hy và các cng s nghiên cu cht kháng sinh chng nm ca chng x khun TC 54 phân lp Vit Nam và đã đưa ra kt lun: cht
25 kháng sinh TC 54 nng đ cao cĩ nh hưng đn kh năng ny nm ca ht và sinh trưng phát trin ca cây, nhưng nng đ thp (0.001mg/ml) li kích thích c kh năng ny nm ca ht và sinh trưng ca cây. Cĩ th s dng cht kháng sinh TC 54 phịng chng bnh thi c r do nm F. oxysporum gây ra đi vi thc vt, chng mt s nm gây bnh da và niêm mc ngưi. Nguyn Đc Lưng, Đng Vũ Bích Hnh nghiên cu kh năng sinh tng hp cellulase ca Actinomyces griseus và đã kt lun đây là mt x khun cĩ kh năng sinh tng hp cellulase cao [13]. Lê Th Thanh Xuân và cng s nghiên cu phân lp và tuyn chn các chng x khun ưa nhit sinh tng hp cellulase cao. Kt qu đã phân lp và tuyn chn đưc 6 chng cĩ hot tính cellulase mnh, các chng này đu thuc chi Streptomyces, chúng sinh trưng tt nht nhit đ 4555 0C [18]. Nguyn Th Kim Cúc và các cng s đã nghiên cu phân lp, đnh loi và mt s tính cht ca các chng vi nm, x khun cĩ tim năng ng dng trong quy trình x lý v cà phê. Kt qu đã tuyn chn đưc 7 chng vi nm và 2 chng x khun cĩ hot tính CMCase ≥ 20mm [3]. Đinh Th Kim Nhung, Đi hc Sư Phm Hà Ni 2, nh hưng cu ngun cacbon và nitơ cho vc to thành celulase ca Acetobacter xylinum . Nhng vn đ nghiên cu cơ bn trong khoa hc sng. Nguyn Đc Lưng, Đng Vũ Bích Hnh nghiên cu mt s tinh cht enzyme cellulase ca x khun Actinomyces griseus và đã kt lun enzyme cellulase hot đng điu kin ti ưu là pH = 7, nhit đ 55 0C. Nguyn Lan Hương và các cng s nghiên cu phân lp và hot hĩa vi sinh vt ưa nhit cĩ hot đ cellulase cao đ b sung li vào khi , rút ngn chu kỳ x lý rác thi sinh hot. Kt qu t khi rác trong điu kin t nhiên đã phân lp đưc 12 chng x khun và 30 chng vi khun ưa nhit và vic
26 b sung vi sinh vt ưa nhit t canh trưng trung gian vào các b s rút ngn chu kỳ sn xut 57 ngày [10]. Tăng Th Chính và các cng s nghiên cu sn xut enzyme cellulase ca mt s chng vi sinh vt ưa nhit phân lp t b rác thi. Kt qu đã phân lâp và tuyn chn đưc 3 chng x khun và 4 chng vi khun ưa nhit, cĩ kh năng chu 6580 0C, nhit đ hot đng ti thích là 55 0C [4]. Lương Bo Uyên, Phm Th Hng Ánh nghiên cu x lý mt da sau trng nm bào ngư bng x khun, kt qu mt da sau trng nm cĩ hàm lưng cellulose và lignhin gim so vi mt da ban đu và tip tc gim khi vi mt s chng x khun. Đào Th Lương, Phm Văn Ty, Trnh Thành Trung, Nguyn Th Anh Đào nghiên cu đc đim sinh hc ca x khun kháng Pseudomonas solanacearum gây héo cây trng và đã kt lun. Cht kháng sinh do chng x khun L30 sinh ra khơng nh hưng đn kh năng ny mm ca ht lc. Đ Thu Hà nghiên cu đng hc ca quá trình lên men sinh tng hp các cht kháng sinh ca 2 chng x khun QN29 và ĐN110 phân lp t đt khu vc Qung Nam – Đà Nng và đã thu đưc kt qu là cĩ th dùng dch nuơi cy ca hai chng QN29 và ĐN110 đ x lý ht ging cà chua, đu đ và lc trưc khi gieo trng [6].
27 PHN II. NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU I. Ni dung nghiên cu Đ đt đưc các mc tiêu đ ra chúng tơi tin hành nghiên cu các ni dung sau: 1. Phân lp và tuyn chn các chng x khun chu nhit trong t nhiên cĩ kh năng to cellulase ti Buơn Ma Thut. 2. Nghiên cu nh hưng ca mt s yu t mơi trưng nuơi cy đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun tuyn chn. nh hưng ca nhit đ. nh hưng ca pH. nh hưng ca t l đưng b sung trong mơi trng nuơi cy. 3. Đnh danh các chng x khun ưu th. II. Vt liu và đa đim nghiên cu: 2.1 Vt liu: 2.1.1. Đi tưng nghiên cu: Các chng x khun chu nhit đưc phân lp t đng v cà phê, mn cưa, rơm r. Chng vi sinh vt phân gii cellulose đi chng trong ch phm thương mi ca cơng ty TNHH SX&TM THIÊN SINH, đưc kí hiu là Ctm 2.1.2. Hố cht + Các hố cht Trung Quc: K 2HPO 4, Nacl, NaOH, KNO 3, MgSO 4.7H 2O, FeSO 4.7H 2O, Naacetate, lugol, xanh methylel, + Các hố cht Vit Nam: glucose, agar, cn đt, . + Các hố cht n đ : CMC. + Các hố cht Đc: thuc th DNS. 2.1.3. Thit b
28 Máy ct nưc; t cy vơ trùng; ni hp; t sy; máy lc gia nhit; t m; t lnh 24 0C và 4 0C; máy ly tâm lnh; máy đo OD, máy vortex (Heidolp Reax 2000); cân đin t; que cy, đĩa petri, ng nghim . 2.2. Đa đim nghiên cu Thí nghim đưc tin hành nghiên cu ti phịng thí nghim b mơn Sinh hc thc nghim, Khoa Khoa hc T Nhiên và Cơng ngh, Trưng Đi hc Tây Nguyên. III. Phương pháp nghiên cu 3.1. Phương pháp thu mu Thu mu v cà phê, mn cưa, rơm r trong đng ln trong các nơng h. 3.2. Phương pháp phân lp x khun chu nhit phân gii cellulose 3.2.1. Mơi trưng phân lp MT1(MT Gause I): Mơi trưng phân lp, tuyn chn và gi ging các chng x khun chu nhit cĩ kh năng to cellulase. CMC : 20g K2HPO 4 : 0.5g MgSO 4.7H 2O : 0.5g KNO 3 : 1.0g NaCl : 0.5g FeSO 4.7H 2O : 0.01g Agar : 10g Nưc máy : 1000ml pH : ; kh trùng 1atm/45 phút. 3.2.2. Pha lỗng và cy mu Mu đưc nghin mn trong ci s vơ trùng. Ly 1g mu cho vào ng nghim cha 9ml nưc mui sinh lý vơ trùng. Đng nht mu 10 phút.
29 Pha lỗng dung dch mu theo h s thp phân đn 10 6. Cho vào mi đĩa petri cha MT1 0.1ml dung dch mu các đ pha lỗng khác nhau, dàn đu bng que gt thu tinh. Mi đ pha lỗng thc hin 3 đĩa petri. các đĩa trên 45 0C trong 37 ngày, chn các khun lc riêng r cy truyn sang ng nghim thch nghiêng trong mơi trưng MT1. 3.3. Phương pháp mơ t mt s đc đim hình thái ca các chng x khun thu đưc X khun sau khi cy truyn sang ng thch nghiêng, tin hành to khun lc đơn đ thu dịng thun và gi ging trong ng nghim. Dùng kính lúp soi ni mơ t các đc đim khun lc: kích thưc, màu sc, dng, cu trúc, mép, mt ct ngang. S dng kính hin vi quan sát các khun ty và bào t ca các chng x khun tuyn chn. Đ quan sát khun ty và bào t đưc rõ, s dng dung dch xanh metylen. 3.4. Phương pháp kho sát kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp + MT2: Mơi trưng nuơi cy x khun chu nhit to enzyme cellulase. CMC : 10g K2HPO 4 : 0.5g MgSO 4.7H 2O : 0.5g KNO 3 : 1.0g NaCl : 0.5g FeSO 4.7H 2O : 0.01g Nưc máy : 1000ml pH : 7.2 – 7.4; kh trùng 1atm/45 phút. 3.4.1. Phương pháp xác đnh hot tính enzyme cellulase ca chng x khun bng đưng kính vịng phân gii [21, 14] 3.4.1.1. Nguyên tc
30 Cho enzyme tác dng lên cơ cht trong mơi trưng thch,cơ cht b phân hu, đ đc mơi trưng gim, mơi trưng tr nên trong sut. Đ ln ca phn mơi trưng trong sut phn ánh hot đng ca enzyme. 3.4.1.2. Tin hành thí nghim Thu dch nuơi cy: ly 15ml mơi trưng nuơi cy x khun trên MT2 đã 5 ngày 45 0C trong máy lc gia nhit, ly tâm 10 phút, tc đ quay 7000 vịng/phút. Thu đưc dch enzyme thơ. Hồ tan 15g thch và 2g CMC trong 1000ml nưc, pH 7.0. Thanh trùng 1atm, 45 phút. Phân mơi trưng vào các đĩa petri sao cho khi đơng li cĩ đ dày 3mm. Dùng khoan đc l vơ trùng vi đưng kính 9mm, đc 3 l thch cách đu nhau trên mi đĩa petri đưng kính 12cm. Dùng đu type vơ trùng ly 0.2ml dung dch enzyme cn th vào l đc trên mơi trưng thch, đ các đĩa petri này trong t lnh 4 0C trong 2h. Sau đĩ chuyn sang đ trong t m 40 0C. Sau 24h dùng thuc th lugol nh lên b mt thch và đo đưng kính vịng phân gii. 3.4.1.3. Đánh giá kt qu Nu x khun cĩ hot tính cellulase s to vịng trong sut quanh l đc cĩ cha dch enzyme.Vùng CMC chưa b phân gii cĩ màu tím ca lugol. Đt sp đĩa petri. Dùng thưc đo đưng kính vịng phân gii (mm). Da vào kt qu đưng kính vịng phân gii đánh giá hot tính enzyme ca các chng x khun phân lp đưc. Quy ưc: + d ≥ 25mm : hot tính enzyme rt mnh. + d ≥ 20mm : hot tính enzyme mnh. + d ≥ 15mm : hot tính enzyme khá. + d ≥ 5mm : hot tính enzyme trung bình. + d < 5mm : hot tính enzyme yu.
31 3.4.2. Phương pháp xác đnh nng đ đưng kh ca dung dch nuơi cy x khun bng phương pháp DNS (dinitro salicylic acid ) [1, 12]. 3.4.2.1. Nguyên tc Mt đơn v hot tính CMCase là lưng enzyme cn thit đ gii phĩng ra đưng kh (như glucose) khi thu phân CMC tc đ 1mol/phút dưi các điu kin phn ng. Phương pháp này da vào s thy gii cơ cht carboxymethyl cellulose (CMC) bng enzyme cellulase pH 5.0 và 40 0C. Enzyme cellulase sau phn ng phân gii cellulose s to ra mt lưng đưng kh, đưng kh s phn ng vi DNS to thành phc màu đ sm và đưc xác đnh bng máy đo mt đ quang bưc sĩng 540nm. 3.4.2.2 . Tin hành thí nghim + Các hố cht cn chun b: Dung dch cơ cht CMC 1%: cân chính xác 2.5g CMC khơ, hồ tan vào 200ml nưc, thêm vào 25ml acid acetic 1M, pH 5.0, chuyn qua bình đnh mc 250ml, thêm nưc đn vch và lc đu. Cách pha ch thuc th DNS ( dinitro salisilic acid ) [12]. Cân 10g DNS cho vào mt cc thu tinh 1000ml thêm vào khong 500ml nưc ct. Khuy trên bp khuy t. Hồ tan 16g NaOH vi 150ml nưc ct. Thêm dung dch NaOH va pha t t vào dung dch DNS trên. S dng máy khun t đ hồ tan nhưng nhit đ khơng đưc quá 50 0C. Tip tc cho thêm 300g potassium sodium tartrate tetrahydrate (C 4H4O6KNa.4H 2O). Khuy đu bng máy khuy t và gia nhit. Đ ngui v nhit đ phịng, chuyn dung dch sang bình đnh mưc 1000ml, thêm nưc ct đn vch và lc đu. Bo qun dung dch trong chai thu tinh màu ti cĩ np đy, cn phi tránh ánh sáng và CO 2.
32 Dung dch mu (dung dch enzyme): Pha lỗng nng đ thích hp. + Xây dng phương trình đưng chun ca glucose Pha glucose 1mg/ml, pha glucose này vi các nng đ pha lỗng: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 (mg/ml) theo bng sau: S th t ng nghim 1 2 3 4 5 6 7 Th tích glucose (1mg/ml)(ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nưc ct (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 Nng đ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 CMC 1% (ml) 1 1 1 1 1 1 1 DNS (ml) 2 2 2 2 2 2 2 OD 540nm Sau khi cho ht các thành phn vào ng nghim, dùng giy thic bt kín ng nghim, lc đu, đun cách thy 100 0C trong 15 phút, đ ngui, đo OD 540nm . T kt qu đo OD xây dng đưc phương trình đưng chun ca glucose. + Xác đnh nng đ đưng kh ca các dung dch mu nuơi cy x khun phân gii cellulose. Hút 1ml dung dch enzyme thu t dung dch nuơi cy x khun cho vào ng nghim, đ n đnh nhit 40 0C trong 5 phút và đ dung dch CMC 1% n đnh nhit đ này trong 5 phút. Sau đĩ thêm 1ml dung dch CMC 1% vào ng nghim cha enzyme và lc đu, đ phn ng xy ra 40 0C trong 10 phút. Thêm 2ml dung dch DNS, lc đu, dùng giy thic bt kín ming ng 0 nghim, đun cách thy 100 C trong 15 phút, đ ngui, đo OD 540nm ca các dung dch mu. Da theo đưng chun ca glucose tính đưc nng đ glucose ca mu thí nghim.
33 Dùng nưc ct làm đi chng. 3.4.2.3. Tính kt qu Giá tr h s glucose trung bình (F): F = (0.1/A G0.1 +0.2/A G0.2 + +0.6/A G0.6 )/6 + F: H s glucose (mg/ml). + A G: Đ hp thu OD ca dung dch glucose chun. 1000 1 1 Hot tính enzyme (IU/ml) = A .F. . . M 180 t v Trong đĩ: + A M: Đ hp thu OD ca dung dch mu. + 1.000: H s chuyn đi mg thành g. + 180: Trng lưng phân t ca glucose, đi t g sang mol. + t: Thi gian phn ng (phút) + v: Th tích dung dch enzyme (ml). 3.5. Phương pháp nghiên cu nh hưng ca mt s yu t đn hot tính enzyme cellulose ca các chng x khun tuyn chn. 3.5.1. Nghiên cu nh hưng ca nhit đ Đ xác đnh nh hưng ca nhit đ chúng tơi cũng tin hành nuơi trên mơi trưng MT2 và 5 mc nhit đ khác nhau: 45 0C, 50 0C, 55 0C, 60 0C, 65 0C. Sau 5 ngày ly tâm thu dch enzyme thơ, xác đnh nng đ đưng kh ca dung dch enzyme mu bng phương pháp DNS. 3.5.2. Nghiên cu nh hưng ca pH Xác đnh nh hưng ca pH đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun nghiên cu, chúng tơi tin hành nuơi trên mơi trưng MT2, các đ pH khác nhau: 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0. (dùng NaOH 5%, HCl 5% đ điu chnh pH ca mơi trưng). Sau 5 ngày ly tâm thu dch enzyme thơ, xác đnh nng đ đưng kh ca dung dch enzyme mu bng phương pháp DNS. 3.5.3 Nghiên cu nh hưng ca t l glucose và saccharose b sung
34 B sung glucose và saccharose vào mơi trưng MT2 nuơi cy x khun vi các lơ thí nghim sau: + Lơ thí nghim 1: Khơng b sung glucose, saccharose + Lơ thí nghim 2: B sung 0.05% Glucose + Lơ thí nghim 3: B sung 0.1% Glucose + Lơ thí nghim 4: B sung 0.15% Glucose + Lơ thí nghim 5: B sung 0.05% Sacchase + Lơ thí nghim 6: B sung 0.1% Sacchase + Lơ thí nghim 7: B sung 0.15% Sacchase Nhit đ, pH thích hp đưc la chn t kt qu ca các thí nghim trên. Nuơi cy sau 5 ngày, ly tâm. Xác đnh hot tính ca enzyme cellulase ca dung dch mu bng phương pháp DNS, đng thi tin hành đc l đ đo đưng kính vịng phân gii bng thuc th lugol 2 ngày sau đĩ. 3.5.4 Nghiên cu tc đ sinh trưng ca các chng x khun trên mơi trưng cĩ b sung đưng. B trí 7 lơ thí nghim như trên. Xác đnh tc đ sinh trưng ca các chng x khun theo thi gian, t 0 đn 5 ngày bng phương pháp đo OD dung dch nuơi cy. Nhit đ, pH thích hp đưc la chn t kt qu ca các thí nghim trên. Nuơi cy và đo OD 610n.m ln lưt t 0 ngày nuơi cy đn 5 ngày nuơi cy đ nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy đn tc đ sinh trưng ca các chng x khun đã tuyn chn. 3.5.5 Nghiên cu nh hưng ca thi gian nuơi cy chng x khun C 2 b sung glucose 1% đn hot tính enzyme cellulose. Mơi trưng nuơi cy x khun: MT2 b sung 1% Glucose Nhit đ, pH thích hp đưc la chn t kt qu ca các thí nghim trên. Xác đnh hot tính ca enzyme cellulase ca dung dch mu bng phương pháp DNS vào các ngày 0, 1, 2, 3, 4, 5.
35 3.5.6 Đinh danh các chng x khun ưu th Da vào khĩa phân loi ca Bergey, bưc đu đnh danh các chng x khun ưu th.
36 PHN III. KT QU VÀ THO LUN 3.1. Phân lp và tuyn chn các chng x khun chu nhit cĩ kh năng sinh tng hp cellulase Các cht thi hu cơ cha cellulose thưng là nhng cht rt khĩ phân hu. Trong điu kin t nhiên khí hu nhit đi, thi gian phân hu cellulose rt lâu, thưng trên 6 tháng, nên gây ơ nhim đt, nưc, khơng khí. Đ khc phc tình trng này các nhà khoa hc đã đưa vào khi ph thi nơng lâm nghip ch phm vi sinh vt cĩ kh năng sinh cellulase. Khi đưc bĩn vào đt trng, nhiu cht hu cơ cha cellulose s b enzyme ca vi sinh vt phân hu nhanh to thành mùn, giúp cây trng phát trin nhanh [23]. Nhiu lồi vi sinh vt cĩ kh năng sn sinh enzyme phân hũy cellulose, đĩ là nm Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Penicillium pinophilum, Trichoderma reesei, Coniophora puteana, Coriolus versicolor , các lồi vi khun như: Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Clostridium thermocellum, .các lồi x khun như Streptomyces lividans, Thermoactinomyces curvata [16]. Đ thu thp các chng x khun cĩ kh năng phân hũy cellulose trong t nhiên, thí nghim tin hành phân lp t các đng v cà phê, mn cưa, rơm r, cĩ nhit đ t 45 – 50 0C, dung dch mu đ phân lp x khun đưc cy trên mơi trưng ch cĩ ngun C là CMC và trong điu kin 45 0C. Kt qu thu đưc 12 chng x khun chu nhit cĩ kh năng phân gii cellulose đưc ký hiu: C1, C 2, C 3, C 4, C 5, C 6,C 7, C 8, C 9, C 10 , C 11 , C 12 . 3.1.1. Đc đim hình thái các chng x khun phân lp X khun là mt nhĩm vi sinh vt Prokaryota, cĩ cu to si như nm, nhưng li cĩ nhng đc đim ging vi khun như: + Kích thưc ca x khun nh bé tương t kích thưc ca vi khun. + Nhân ca x khun và vi khun là nhân khơng đin hình.
37 + Màng t bào ca x khun khơng cha cellulose hay kitin như vi khun. + S phân chia t bào ca x khun theo kiu ca vi khun. + X khun khơng cĩ gii tính. X khun cịn cĩ hình thái ging nm si như cĩ cu to si, phát trin bng cách phân nhánh thành nhng si nh, dài gi là khun ty, tp hp các khun ty này gi là h khun ty. Hình thái khun lc ca các chng x khun phân lp đưc đánh giá da trên 5 đc đim: dng, cu trúc, b mt, mt ct ngang, mép khun lc và màu sc. Hình thái khun ty và bào t đưc đánh gía trên các tiêu chí: màu sc, sc t to ra trong mơi trưng, hình dng và kích thưc ca bào t. Kt qu đánh giá đc đim khun lc và h khun ty, bào t ca các chng x khun đưc phân lp mơ t như sau: Bng 3.1. Đc đim hình thái khun lc, khun ty ca các chng x khun chu nhit đưc phân lp Kí Đc đim khun lc Đc đim h si hiu Hình Màu Mt ct Mép Cu trúc Kty cơ Kty khí chng dng sc ngang khun khun lc cht sinh lc Trịn cĩ Nâu Li Răng Đng Nâu tím Vàng C1 vành vàng cưa nht nâu mép C2 Trịn cĩ Xanh Xù xì Bng Dng r Vàng Vàng vành nâu phng đc nht mép Trịn Trng Xù xì Li Dng Trng Vàng C3 đng cam cành sa nâu tâm vàng
38 Trịn Vàng Xù xì Bng Dng Vàng Xanh cam phng cành rêu C4 Trịn Trng Gp np Bng Đng Trng Vàng đng đc phng nht sa nâu C5 tâm Trịn Vàng Nhn Dng Bng Trng Nâu đc lơì phng đc xám C6 cong Trịn Trng Gp np Li Dng Dng Trng C7 đng đc cành trong trong tâm Trịn Vàng G gh Li Dng Tím Nâu tím C8 đng nht cong cành nht tâm Trịn cĩ Vàng Xù xì Dng Bng Tím Vàng C9 vành nâu cong phng nâu mép Trịn Nâu Dng Dng Đng Vàng Nâu tím C10 đng cam bĩng răng nht tím tâm cưa Trịn Vàng Xù xì Li Bng Nâu Xanh C11 phng tím Trịn Nâu Xù xì Bng Cành Tím Vàng C12 đng vàng phng nâu tâm
39 (a) (b) (c) Chng C 1 (a) (b) (c) Chng C 2 (a) (b) (c) Chng C 3 Hình 3.1. Đc đim khun lc, khun ty, bào t ca các chng x khun: C 1, C 2, C 3 (a) Khun lc, (b) Khun ty, (c) Bào t
40 (a) (b) (c) Chng C 4 (a) (b) (c) Chng C 5 (a) (b) (c) Chng C 6 Hình 3.2. Đc đim khun lc, khun ty, bào t ca các chng x khun: C 4, C 5, C6
41 (a) (b) (c) Chng C 7 (a) (b) (c) Chng C 8 (a) (b) (c) Chng C 9 Hình 3.3.Đc đim khun lc, khun ty, bào t ca các chng x khun:C 7,C 8,C 9
42 (a) (b) (c) Chng C 10 (a) (b) (c) Chng C 11 (a) (b) (c) Chng C 12 Hình 3.4. Đc đim khun lc, khun ty và bào t ca các chng x khun: C 10 , C11 , C 12
43 3.1.2. Tuyn chn các chng x khun cĩ kh năng phân gii cellulose Tin hành nuơi cy 12 chng x khun đưc phân lp trên mơi trưng MT2. Sau 5 ngày, ly tâm thu dch enzyme đ xác đnh hot tính enzyme cellulase theo phương pháp khuch tán trên mơi trưng thch và CMC. Khi enzyme tác dng lên cơ cht cellulose trong mơi trưng thch, cơ cht b phân hũy, đ đc ca mơi trưng b gim, mơi trưng tr nên trong sut. Đ ln ca phn mơi trưng trong sut phn ánh hot đng ca enzyme. Hot tính ca enzyme đưc biu din bng milimet (mm) đưng kính vịng thy phân. Ngồi ra, hot tính ca enzyme cellulase cịn đưc xác đnh bng phương pháp so màu DNS đ xác đnh nng đ đưng kh. Cơ cht cha cellulose (CMC) s b enzyme cellulase ca vi sinh vt phân gii to đưng kh trong mơi trưng nuơi cy. Nng đ đưng kh trong mơi trưng th hin hot tính ca enzyme cellulase. Kt qu nghiên cu đưc ghi nhn qua bng 3.2 Bng 3.2. Đánh giá kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp Stt Chng x khun Đưng kính vịng Hot tính enzyme phân gii (mm) cellulase (IU/ml) 1 C1 29 0.343 2 C2 31 0.417 3 C3 29 0.464 4 C4 29.6 0.434 5 C5 30.6 0.375 6 C6 31 0.551 7 C7 34 0.518 8 C8 21 0.327 9 C9 21.5 0.461 10 C10 27.6 0.311 11 C11 27 0.297 12 C12 28.3 0.501
44 Phương pháp xác đnh hot tính ca enzyme qua đưng kính vịng phân gii ca dung dch nuơi cy các chng x khun trên mơi trưng thch CMC là phương pháp đnh tính. Sau 24 gi phn ng, đo đưng kính vịng phân gii ca các chng x khun phân lp, kt qu bin đng t 21mm đn 34mm. Da vào quy ưc ca phương pháp v đưng kính vịng phân gii và kt qu nghiên cu, chúng tơi cĩ kt qu sau: + Chng sinh enzyme rt mnh (≥ 25mm) : C1, C 2, C3, C 4, C 5, C 6, C7, C 10 , C 11, C12 (chim 83.33 %) + Chng sinh enzyme mnh (≥ 20mm) : C 8, C 9 (chi m 16.67 % ) + Chng sinh enzyme khá (≥ 15mm) : (chi m 0 %) + Chng sinh enzyme trung bình (≥ 5mm) : (chim 0 %) + Chng sinh enzyme yu (< 5mm) : (chim 0 %) Hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun đưc xác đnh bng phương pháp đnh lưng đưng kh bin đng t 0.290 IU/ml (chng C 11 ) đn 0.551 IU/ml (chng C 6). Hot đng ca enzyme đưc tính bng đơn v IU/ml mơi trưng. Đơn v hot đng là lưng enzyme mà nhng điu kin xác đnh 40 0C, pH = 5, sau 1 gi phân gii cơ cht to thành 1mg glucose. Kt qu cho thy, 5 chng x khun cĩ hot tính enzyme cao hơn c là C2 (0.417 IU/ml), C 3 (0.464 IU/ml), C 4 (0.434 IU/ml), C 6 (0.551 IU/ml), và C 7 (0.518 IU/ml). Đng thi đưng kính vịng phân gii ca 5 chng này cũng cho kt qa cao nht: C 2 (31mm), C 3(29mm), C 4(29.6 mm), C 6 (41mm) và C 7 (34mm). Da vào kt qu ca phương pháp đnh tính và đnh lưng enzyme cellulose trên, chúng tơi tuyn chn các chng x khun sau: C 2, C 3, C 4, C 6, C7.
45 Hình 3.5. Kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun phân lp trên mơi trưng thch
46 3.2. Nghiên cu nh hưng ca mt s yu t đn hot tính ca enzyme cellulase ca các chng x khun tuyn chn. Năm 1903, G.V. Interson là ngưi đu tiên phát hin kh năng phân gii cellulose ca vi khun hiu khí. Hot đng phân gii cellulose ca vi sinh vt ngày càng đưc nghiên cu nhiu hơn. Phn ng phân gii do enzyme xúc tác ph thuc vào nhiu yu t như: nng đ enzyme, đc tính và nng đ cơ cht, nhit đ, pH mơi trưng phn ng, các ion kim loi, các cht vơ cơ và hu cơ. Các yu t hĩa lý khơng ch nh hưng đn phn ng enzyme theo kiu như các phn ng hĩa hc bình thưng mà cịn nh hưng đn cu trúc khơng gian, đ bn cu trúc khơng gian, đ tích đin ca phân t enzyme làm thay đi hot đ xúc tác ca nĩ. Do điu kin ca phịng thí nghim, hơn na do đc thù ca thí nghim, chúng tơi ch kho sát các yu t nh hưng đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun phân lp gm nhit đ, pH, cơ cht và thi gian nuơi cy x khun. 3.2.1. nh hưng ca nhit đ Bn cht hĩa hc ca enzyme là protein nên khác vi các phn ng hĩa hc, vn tc phn ng do enzyme xúc tác ch tăng khi tăng nhit đ mt gii hn nht đnh, chưa nh hưng đn cu trúc ca enzyme. Đi vi vi sinh vt, nhit đ là mt trong nhng yu t nh hưng rt ln đn s sinh trưng, phát trin cũng như đi vi hot tính ca enzyme. Đi vi vi sinh vt phân gii cellulose ưa m, thích hp nhit đ 25 đn 30 0C. Các chng ưa nĩng, nhit đ tt nht cho s phát trin ca chúng là 60 đn 65 0C. Đa s x khun thuc loi ưa m, s x khun thuc loi ưa nhit ít gp hơn. Do đĩ đ phân lp các chng x khun ưa nhit, nhit đ ca mơi trưng phân lp đưc s dng là 45 0C. Đ tip tc xác đnh đc tính ưa nhit ca các chng phân lp, nhit đ mơi trưng nuơi cy đưc tăng dn lên: 50 0C, 55 0C, 60 0C, 65 0C.
47 Tin hành nuơi cy 5 chng x khun tuyn chn và 2 chng đi chng trên mơi trưng MT2, 5 mc nhit đ khác nhau. Sau 5 ngày nuơi cy, ly tâm thu enzyme và xác đnh hot tính theo phương pháp đnh lưng đưng kh DNS. Kt qu đưc ghi nhn bng 3.3 Bng 3.3: nh hưng ca nhit đ đn hot tính enzyme cellulase ca các chng x khun tuyn chn Chng Hot tính enzyme cellulase (IU/ml) x khun 45 0C 50 0C 55 0C 60 0C 65 0C A2 0.890 0.786 0.508 0.343 0.325 C2 0.731 0.827 0.771 0.540 0.569 C3 0.800 0.770 0.541 0.345 0.332 C4 0.892 0.850 0.653 0.540 0.550 C6 1.205 1.038 0.918 0.354 0.242 C7 0.974 0.693 0.530 0.326 0.321 Ctm 0.735 0.861 0.677 0.501 0.312 Kt qu bng 3.3 cho thy hot tính enzyme cellulase ca chng x khun 0 C3, C4, C6, C7 45 C cao hơn c so vi các nhit đ kho sát, bin đng t 0,800 IU/ml đn 1.205 IU/ml, đc bit là chng C 6. Chng thương mi Ctm cĩ nhit 0 0 đ ti thích là 50 C, tương ng 0,861 IU/ml. Riêng chng C 2, mc dù 50 C enzyme cĩ hot tính cao nht nhưng cĩ l nhit đ ti thích cịn bin đng do hot tính enzyme các điu kin nhit đ cao hơn như 650C, hot tính enzym chưa gim hn. chng A 2 ca tác gi L Hà, hot tính ezyme tương đương các chng C3, C 4, C 6, C 7. Theo các nhà nghiên cu, nhit đ hot đng thích hp ca nhiu enzyme vào khong 40 – 50 0C, trên 50 0C hot đ thưng gim mnh do cu trúc ca
48 enzyme b hng. Các enzyme cĩ ngun gc thc vt và mt s enzyme vi sinh vt cĩ nhit đ ti thích cao hơn. Mt s enzyme ca vi sinh vt ưa nhit vn hot đng nhit đ 90 0C hoc cao hơn [2]. Các kt qu này đưc x lý thng kê theo phương pháp ANOVA cho thy nhit đ nh hưng đn kh năng sinh tng hp enzyme cellulase cĩ ý nghĩa. Như vy, hot tính ca enzyme b chi phi rt nhiu bi đc thù ca chng ging 3.2.2. nh hưng ca pH mơi trưng. Hot đ ca enzyme ph thuc vào pH ca mơi trưng là vì pH nh hưng đn trng thái oxy hĩa gc R ca các gc acid amin trong phân t protein k c protein enzyme, ion hĩa các nhĩm chc trong trung tâm hot đng, ion hĩa cơ cht. Do đĩ yu t pH nh hưng ln đn s sinh trưng, phát trin cũng như kh năng tng hp enzyme ca x khun. Đ sinh trưng bình thưng, phn ln x khun cn mơi trưng cĩ pH trung tính hoc hơi kim. Tuy nhiên tùy mơi trưng sng, pH ti thích ca vi sinh vt cũng khác đi. Trong các loi đt chua ngưi ta tìm thy các x khun ưa acid, chúng sinh trưng tt nht pH 5.5 – 6.0 và khơng phát trin đưc pH khong 7.0 [32]. Đ xét nh hưng ca yu t này lên các chng x khun chu nhit phân lp trên đng v cà phê, chúng tơi tin hành nuơi cy 7 chng x khun trên mơi trưng MT2, dùng NaOH 5%, HCl 5% đ điu chnh pH ca mơi trưng v các đ pH: 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0. Sau 5 ngày nuơi cy, ly tâm thu enzyme và xác đnh hot tính enzyme cellulase theo phương pháp đnh lưng đưng kh DNS. Kt qu đưc ghi nhn bng 3.4
49 Bng 3.4. nh hưng ca pH đn hot tính enzyme ca các chng x khun pH Hot tính enzyme cellulase (IU/ml) Kí hiu 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 chng A2 0.201 0.193 0.146 0.114 0.115 0.085 C2 0.174 0.190 0.138 0.141 0.122 0.065 C3 0.191 0.165 0.183 0.176 0.181 0.138 C4 0.163 0.159 0.168 0.133 0.147 0.095 C6 0.189 0.204 0.227 0.237 0.260 0.239 C7 0.133 0.176 0.191 0.201 0.198 0.208 Ctm 0.104 0.143 0.135 0.161 0.146 0.131 T kt qu thu nhn đưc bng 3.4 nhn thy, pH ti ưu ca các chng nghiên cu là khác nhau: C 2 cĩ pH ti ưu là 6,0; ; C 3 là 5.5; C 4 là 6.5; C 6 là 7,5; C 7 là 8,0 và 2 chng đi chng Ctm là 7,0. A 2 là 5.5. Điu này mt ln na li th hin s đc thù ca chng ging. Chng C 4, C 6, C 7 cĩ hot tính ca enzyme cellulase cao pH khá cao so vi chng x khun phân gii cellulsose khác , t 6,5 đn 8,0. Đây là pH thích hp ca các chng x khun thuc chi Steptomyces và chi Streptoverticillium. Các kt qu này cĩ ý nghĩa thng kê theo phân tích ANOVA. Điu này cho thy pH cĩ nh hưng đn hot tính ca enzyme cellulase thơng qua tác đng lên các gc R ca acide amin trong phân t enzyme hoc tác đng lên trung tâm hot đng ca enzyme hoc tác đng lên cơ cht. 3.2.3. nh hưng ca t l đưng b sung Chu kì sng ca vi sinh vt cĩ bn pha. pha tăng trưng (pha lag), vi sinh vt làm quen vi mơi trưng nuơi cy, s dng các thành phn dinh dưng cĩ trong mơi trưng đ sinh tng hp các thành phn cn thit như: protein enzyme, nhân đơi ADN chun b cho quá trình phân chia t bào, tăng sinh khi. Thi kỳ này hu như khơng tăng sinh khi. Thi gian ca pha tăng trưng tuỳ thuc vào ging, tui ca ging và điu kin nuơi cy, đc bit là ngun dinh dưng cacbon. Sau đĩ là pha log, ti đây s
50 sinh trưng tăng mnh theo hàm s log. Tip theo là pha n đnh, khi đĩ tc đ sinh trưng khơng tăng do s t bào sinh ra bng s cht đi do ngun dinh dưng cn, điu kin sng thay đi, pH thay đi. Cui cùng là pha suy vong, ti đây s vi sinh vt đưc sinh ra ít hơn s cht nên đưng cong sinh trưng đi xung. Nu mơi trưng cĩ đng thi 2 ngun dinh dưng cacbon hoc nitơ, vi sinh vt s s dng ngun đơn gin trưc, ngun phc tp sau. Do đĩ đưng cong sinh trưng s cĩ 2 pha lag, 2 pha log theo th t: lag 1, log 1, lag 2, log 2. Đi vi vi sinh vt nĩi chung x khun nĩi riêng, glucose là ngun dinh dưng cacbon đưc s dng d dàng nht. Nu đng thi trong mơi trưng cĩ 2 ngun dinh dưng cacbon, vi sinh vt cũng như x khun s s dng ngun cacbon đơn gin nht trưc đ tăng sinh khi, tc xy ra pha lag 1 và log 1. Sau khi ht ngun cacbon th nht, x khun s dng ngun cacbon th 2 khĩ phân gii hơn là cellulose và li din ra pha lag 2 và log 2. Như vy vic b sung đưng vào mơi trưng đã cĩ cellulose vi mc đích giúp x khun tăng sinh khi nhanh giai đon pha log, trên cơ s đĩ hot đng phân gii cellulose ca enzyme hiu qu hơn [16]. Đ nghiên cu kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun tuyn chn trên mơi trưng b sung đưng vi t l thích hp, chúng tơi s dng mơi trưng MT2 cĩ 1% CMC và b sung đưng glucose, saccharose Sau 5 ngày nuơi cy, mi nghim thc đưc đo OD đ đánh giá mc đ sinh trưng; ly tâm dung dch nuơi cy thu dch enzyme thơ đ xác đnh hot tính enzyme cellulase bng phương pháp đo đưng kính vịng phân gii. Kt qu đưc ghi nhn bng 3.5.
51 Bng 3.5. nh hưng ca t l đưng b sung đn tc đ sinh trưng và kh năng phân gii cellulose ca các chng x khun tuyn chn sau 5 ngày nuơi cy. Ký hiu T l đưng b sung Đưng kính vịng thy Tc đ sinh trưng chng (%) phân (mm) sau 5 ngày nuơi cy (ln) 0 % 28.7 6.519 0.05%G 29.0 2.359 0.1%G 29.7 6.522 A2 0.15%G 32.7 3.508 0.05%S 29.0 4.931 0.1%S 30.7 2.279 0.15%S 28.7 2.757 0 % 34.3 2.082 0.05%G: 33.0 5.349 0.1%G: 34.2 12.633 C2 0.15%G 30.1 2.531 0.05%S 29.7 2.592 0.1%S 28.0 3.598 0.15%S 30.8 2.854 0 % 34.5 2.062 0.05%G: 32.0 3.653 0.1%G: 31.3 2.719 C3 0.15%G 34.8 7.385 0.05%S 36.7 1.986 0.1%S 30.7 3.974 0.15%S 33.5 3.812 0 % 34.5 5.400 0.05%G: 31.7 4.169 0.1%G: 32.7 5.016 C4 0.15%G 33.5 3.312 0.05%S 32.7 4.262 0.1%S 32.5 2.160 0.15%S 31.0 2.088 0 % 28.0 1.037 0.05%G: 27.2 3.712 0.1%G: 29.7 3.068 C6 0.15%G 29.5 6.316 0.05%S 27.3 2.465 0.1%S 31.0 2.653
52 0.15%S 31.7 2.438 0 % 27.3 2.720 0.05%G: 25.7 4.541 0.1%G: 26.7 2.333 C7 0.15%G 27.7 3.010 0.05%S 27.7 1.159 0.1%S 27.5 1.796 0.15%S 29.2 5.879 0% 34,3 17,000 0.05%G: 34.0 3.310 0.1%G: 21.3 2.267 Ctm 0.15%G 20.6 3.673 0.05%S 24.3 2.308 0.1%S 17.6 3.766 0.15%S 16.8 6.579 Kt qu bng 3.5 cho thy: Đi vi chng C 2, đưng kính vịng thy phân nghim thc b sung 0,1% glucose tương đương ( 30,1 – 34,2 mm) so vi trên mơi trưng khơng b sung (34,3mm). Nhưng tc đ sinh trưng ca x khun vưt tri, tăng 12,633 ln so vi mơi trưng khơng b sung ch tăng 5,068 ln. Khi b sung các nng đ saccharose, đưng kính vịng thy phân thp hơn (28,0 – 30,8mm). Tc đ sinh trưng tăng 0,371 ln so vi khơng b sung. chng C 3, đưng kính vịng thy phân là 34.8 mm mơi trưng b sung 0,15% glucose, cũng tương đương so vi mơi trưng khơng b sung (34.5mm). Tc đ sinh trưng ca x C 2 tăng 7.385 ln t l b sung này, so vi mơi trưng khơng b sung, s sinh trưng tăng 2.581 ln. Khi b sung các nng đ saccharose, đưng kính vịng thy phân bin đng t 30.7 – 36.7mm và tc đ sinh trưng tăng 0,927 ln so vi mc đ tăng ca mơi trưng khơng b sung. Chng C 6 cĩ đưng kính vịng thy phân là 29.5 mm nng đ đưng b sung 0,15% glucose, cao hơn so vi mơi trưng khơng b sung (28.0mm). Tc đ sinh trưng ca x khun tăng 6.316 ln t l b sung
53 này, cao gp 0,432 ln so vi mơi trưng khơng b sung. các nng đ saccharose b sung, đưng kính vịng thy phân bin đng nhiu (27.3 – 31.7mm), tc đ sinh trưng so vi khơng b sung tăng 1,558 ln. Đi vi chng C 7, mơi trưng b sung 0,05% glucose, đưng kính vịng thy phân 25,7 mm so vi mơi trưng khơng b sung 27.3mm. Nhưng tc đ sinh trưng ca C 7 so vi mơi trưng khơng b sung glucose tăng 0.669 ln. Khi b sung các nng đ saccharose, đưng kính vịng thy tương đương vi khơng b sung, nhưng tc đ sinh trưng tăng so vi khơng b sung là 1,161 ln. Ngồi ra, đi vi chng C tm đã thương mi hĩa, đưng kính vịng thy phân mơi trưng b sung 0,05% glucose là 34,0 mm ch tương đương vi mơi trưng khơng b sung (34,3mm). các nng đ b sung khác ca glucose và saccharose, đưng kính vịng thy phân đu thp hơn hn, bin đng t 16,8 – 24,3mm và tc đ sinh trưng cũng đu thp hn, bin đng t 2,267 – 6,579 ln sau 5 ngày nuơi cy. Trong khi đĩ, tc đ sinh trưng ca chng thương mi Ctm trên mơi trưng khơng b sung đưng tăng 17,0 ln sau 5 ngày. Nhìn chung, tr chng C 4, kh năng phân gii cellulose ca các chng C 2, C3, C 6, C 7 đu tương đương trên mơi trưng b sung và khơng b sung glucose t l 0,1 – 0,15% , nhưng tc đ sinh trưng khơng tương đương. Sau 5 ngày nuơi cy, s sinh trưng ca các chng hu ht đu cao hơn hn so vi mơi trưng khơng b sung. Điu này đã khng đnh vai trị ca glucose, ngun cacbon d s dng nht cho mi vi sinh vt. Các chng x khun đã s dng glucose đ tăng sinh khi. Sau khi ngun glucose cn kit, x khun mi s dng đn ngun cellulose t CMC. Do đĩ, trong thi gian nuơi cy 5 ngày, tc đ sinh trưng cao nhưng hot tính enzyme khơng cao, ch tương đương vi mơi trưng khơng b sung đưng.