Tài liệu Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm - Nguyễn Tiến Dũng

Nội dung text: Tài liệu Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm - Nguyễn Tiến Dũng

1. ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN oOo Thaïc só NGUYEÃN TIEÁN DUÕNG Taøi lieäu moân PHÖÔNG PHAÙP KIEÅM NGHEÄM VI SINH VAÄT TRONG THÖÏC PHAÅM (Taøi lieäu söû duïng noäi boä) Thaønh phoá Hoà Chí Minh - 2007
2. Chöông I CHÆ TIEÂU VI SINH VAÄT THÖÔØNG ÑÖÔÏC KIEÅM SOAÙT TRONG NÖÔÙC, THÖÏC PHAÅM VAØ MYÕ PHAÅM Coù raát nhieàu vuï ngoä ñoäc hay caùc beänh gaây ra do thöïc phaåm ñaõ vaø ñang diễn ra, maët duø coù caùc luaät veà an toaøn vệ sinh thöïc phaåm ñaõ ñöôïc ban haønh vaø ngaøy caøng chặt chẻ vaø ñöôïc söï quan taâm cuûa coäng ñoàng. Cho ñeán nay vaãn coøn coù nhöõng caùch hieåu vaø phaân bieät khoâng thoáng nhaát veà khaùi nieäm caùc beänh gaây ra do thöïc phaåm hay ngoä ñoäc thöïc phaåm. Song ñeå phaân bieät hai vaàn ñeà naøy thoâng thöôøng döïa vaøo caùc khaùi nieäm naøy nhö sau: - Ngoä ñoäc thöïc phaåm laø caùc bieåu hieän beänh do tieâu thuï thöïc phaåm coù chöùa soá löôïng lôùn vi sinh vaät, chuùng nhaân leân nhanh trong quaù trình cheá bieán hay baûo quaûn. Caùc vi sinh vaät coù theå hieän dieän moät soá löôïng raát ít ban ñaàu trong thöïc phaåm hay nhieãm vaøo do söï tieáp xuùc qua quaù trình cheá bieán. - Caùc beänh coù nguoàn goác töø thöïc phaåm do tieâu thuï nhöõng thöùc aên chöùa caùc vi sinh vaät hay saûn phaåm cuûa chuùng, khoâng phuï thuoäc vaøo soá löôïng nhieàu hay ít do ñoù khoâng phuï thuoäc vaøo söï cheá bieán hay baûo quaûn. 1. Ngoä ñoäc thöïc phaåm Ngoä ñoäc thöïc phaåm dieãn ra ôû nhieàu ngöôøi, coù cuøng moät trieäu chöùng vaø cuøng moät thôøi ñieåm sau khi tieâu thuï thöïc phaåm. Tuy nhieân möùc ñoä taùc ñoäng ñeán töøng ngöôøi seõ khaùc nhau bôûi vì khaû naêng ñaùp öùng vôùi ñoäc toá cuûa töøng ngöôùi khaùc nhau phuï thuoäc vaøo theå traïng vaø khaû naêng trung hoaø ñoäc toá cuûa töøng ngöôøi. Trieäu chöùng cuûa ngoä ñoäc thöïc phaåm thöôøng coù caùc bieåu hieän nhö tieâu chaûy, choùng maët, noân möõa, ñau nhöùc ngöôøi, soát, ñau ñaàu. Caùc bieåu hieän trieäu chöùng phuï thuoäc vaøo töøng loaøi vi sinh vaät gaây neân. Möùc ñoä nguy hieåm vaø trieäu chöùng cuûa beänh coù theå gaây neân do ñoäc toá cuûa chuùng tieát vaøo thöïc phaåm hay do chính teá baøo cuûa chuùng gaây neân. Ñeå coù theå gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm, vi sinh phaûi hieän dieän vôùi soá löôïng teá baøo lôùn vaø phuï thuoäc lieàu löôïng cuûa töøng chuûng loaïi nhieãm vaøo, thöïc phaåm phaûi coù caùc ñeàu kieän lyù hoaù thích hôïp cho vi sinh vaät ñoù phaùt trieån, nhieät ñoä vaø thôøi gian phaûi thích hôïp cho quaù trình taêng tröôûng cuûa chuùng töø khi chuùng nhieãm vaøo cho ñeán khi tieâu thuï ñeå vi sinh vaät nhaân leân ñeán ñuû lieàu löôïng hay saûn xuaát ñuû löôïng ñoäc toá gaây haïi. 2. Caùc vi sinh vaät coù theå gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm Salmonella Soá löôïng Salmonella ñuû ñeå gaây ngoä ñoäc laø khi chuùng hieän dieän caû trieäu teá baøo trong moät gam thöïc phaåm. Caùc trieäu chöùng do Salmonella gaây ra thöôøng laø tieâu chaûy, oùi möûa, buoàn noân. Thôøi gian uû beänh cho ñeán khi caùc trieäu chöùng bieåu hieän thöôøng sau 12-36 giôø keå töø khi tieâu thuï thöïc phaåm bò nhieãm. Trieäu chöùng thöôøng keùo daøi ít nhaát töø 2-7 ngaøy. Khoâng phaûi taát caû moïi ngöôøi khi tieâu thuï thöïc phaåm bò nhieãm Salmonella ñieàu coù bieåu hieän beänh, ngöôïc laïi moät soá ngöôøi khoâng coù trieäu chöùng laâm saøng khi tieâu thuï phaûi thöïc phaåm nhieãm vi sinh vaät naøy khi ñoù chuùng ñöôïc baøi tieát ra ngoaøi. Caùc loaïi thöïc phaåm coù nguy cô bò nhieãm Salmonella nhö thòt gia caàm, saûn phaåm thòt, tröùng vaø caùc saûn phaåm cuûa tröùng, thuûy saûn. Nguoàn nhieãm vi sinh vaät vaøo caùc loaïi thöïc phaåm thöôøng coù nguoàn goác töø ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø caùc loaøi ñoäng vaät, chuùng coù theå ñöôïc nhieãm giaùn tieáp hay tröïc tieáp. Salmonella gaây neân beänh soát thöông haøn thuoäc caùc serotype Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, B, C. caùc doøng naøy thöôøng khoâng gaây beänh cho caùc loaøi ñoäng vaät. Campylobacter Ñaây laø vi sinh vaät gaây neân beänh vieâm nhieãm ñöôøng ruoät, baèng caùc phöông phaùp phaân laäp ñaõ chöùng minh vi sinh vaät naøy hieän dieän khaép nôi. Campylobacters laø moät trong nhöõng heä vi 1
3. sinh vaät cuûa nhieàu loaïi ñoäng vaät vaø chim. Nhöng caùc doøng coù khaû naêng gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm khoâng theå phaùt trieån khi nhieät ñoä thaáp hôn 30oC, ñaây laø vi sinh vaät öa nhieät baét buoät. Saûn phaåm söõa vaø thòt gia caàm laø nhöõng nguoàn coù theå gaây neân ngoä ñoäc do vi sinh vaät naøy. Nöôùc cuõng laø moät trong nhöõng nguoàn mang beänh naøy. Campylobacters laø vi sinh vaät raát nhaïy vôùi nhieät ñoä, chuùng bò tieâu dieät hoaøn toaøn baèng phöông phaùp thanh truøng Pasteur, chuùng khoâng theå soáng soùt trong thöïc phaåm coù moâi tröôøng acid. Chuùng khoâng theå phaùt trieån trong thöïc phaåm baûo quaûn trong ñieàu kieän hieáu khí maø chæ phaùt trieån trong caùc loaïi thöïc phaåm huùt chaân khoâng. Khi xaâm nhieãm Campylobacter, thôøi gian uû beänh thöôøng töø 2-11 ngaøy. Caùc trieäu chöùng do vi sinh vaät naøy gaây neân nhö ñau nhöùc, tieâu chaûy, soát, ñau ñaàu, khoù chòu, chuoät ruùt, laïnh coùng, meâ saûn. Thænh thoaûng coù nhöõng bieåu hieän beänh gioáng nhö caûm cuùm. Clostridium perfringens Quan nieäm veà söï ngoä ñoäc thöïc phaåm do Clostridium perfringens gaây ra ñaõ coù nhöõng thay ñoåi trong nhöõng naêm gaàn ñaây. Theo nhöõng quan nieäm tröôùc ñaây cho raèng caùc doøng C.perfringens khaùng nhieät, taïo baøo töû vaø khoâng laøm tan maùu môùi coù theå gaây ngoä ñoä thöïc phaåm. Nhöng trong nhöõng naêm gaây ñaây caùc doøng nhaïy caûm vôùi nhieät, khoâng laøm tan maùu cuõng ñöôïc tìm thaáy trong caùc vuï ngoä ñoäc do vi sinh vaät naøy gaây neân. Vì caùc baøo töû cuûa C. perfringen khaùng nhieät neân chuùng thöôøng soáng soùt qua quaù trình naáu chín. Tuy nhieân cuõng phuï thuoäc vaøo thôøi gian tieáp xuùc vôùi nhieät. Neáu nhöõng baøo töû soáng soùt, khi gaëp ñieàu kieän thích hôïp chuùng seõ naåy maàm vaø nhaân leân. Khi ñun naáu thöùc aên ôû nhieät ñoä thaáp vaø thời gian ngaén coù theå laøm cho caùc doøng khaùng nhieät toàn taïi vì theá chuùng seõ gaây taùi nhiễm sau khi baûo quaûn. Caùc nguoàn thöïc phaåm coù theå gaây ngoä ñoäc vôùi caùc vi sinh vaät naøy thöôøng laø thòt gia caàm, nhaát laø caùc loaïi gia caàm lôùn ñoâng laïnh saâu, thòt trong caùc haàm chöùa. C. perfringens cuõng ñöôïc tìm thaáy trong ñaát, trong phaân ngöôøi vaø trong caùc loaïi thöïc phaåm khaùc. Caùc trieäu chöùng do vi sinh vaät naøy gaây ra thöôøng laø ñau thaét vuøng buïng, tieâu chaûy. Thôøi gian uû beänh töø 12-24 giôø. Caùc trieäu chöùng laâm saøng gaây neân do ñoäc toá cuûa chuùng. Clostridium botulinum. Ñaây laø vi sinh vaät phaân boá khaép nôùi trong ñaát, trong nöôùc vaø trong caùc gia suùc vaø caùc loaøi thuûy saûn. Vi sinh vaät naøy sinh ñoäc toá gaây beänh ngoä ñoäc thòt cho ngöôøi (botulism). Beänh bieåu hieän raát nghieâm troïng ôû ngöôøi. Beänh gaây ra do ñoäc toá ñöôïc hình thaønh bôûi C.botulinum nhieãm trong thöïc phaåm. Trieäu chöùng laâm saøng cuûa beänh laø oùi möûa, buoàn noân, sau ñoù coù nhöõng bieåu hieän roái loaïn thaønh kinh nhö choaùng vaùng, roái loaïn thò giaùc, roái loaïn caùc cô ôû coå vaø mieäng, ñau ôû vuøng ngöïc, khoù thôû vaø teâ lieät, coù theå daãn ñeán töû vong. Caùc trieäu chöùng treân bieåu hieän sau 12- 36 giôø sau khi tieâu thuï thuïc phaåm nhieãm ñoäc toá. Caùc trieäu chöùng thöôøng keùo daøi 2-6 ngaøy tuyø theo tình traïng nhieãm ñoäc vaø söùc khoeû cuûng töøng beänh nhaân. Caùc loaïi thöïc phaåm nhö thòt, rau quaû khoâng ñöôïc baûo quaûn ñuùng qui ñònh hay laây nhieãm töø ñaát, phaân ñoäng vaät hay do cheá bieán khoâng ñuû nhieät ñoä tröôùc khi duøng, caùc saûn phaåm ñoùng hoäp khoâng ñuùng qui caùch cuõng coù nguy cô nhieãm vi sinh vaät naøy raáy cao. Ñieàu kieän thích hôïp cho vieäc hình thaønh ñoäc toá cuûa vi sinh vaät naøy ñieäu kieän moâi tröôøng kî khí, pH trung tính, khoâng coù caùc vi sinh vaät khaùc caïnh tranh. Ñoäc toá botuline do C. botulinum tieát ra goàm moät soá loaïi khaùc nhau nhö A, B, C1, C2, D, E, F, G. caùc ñoäc toá naøy laø nhöõng protein coù troïng löôïng phaân töû lôùn khoaûng 1 trieäu danton. Nhöng nhöõng daïng coù taùc ñoäng maïnh ñeán con ngöôøi laø A, B, vaø E. ñaây cuõng laø moät trong nhöõng loaïi ñoäc toá sinh hoïc coù cöôøng ñoä maïnh nhaát. Trong nhöõng naêm gaày ñaây, caùc vuï ngoä ñoäc botulism gaây ra do C.botulinum doøng E thöôøng ñöôïc phaùt hieän khi tieâu thuï caù vaø caùc saûn phaåm thuûy saûn. Doøng vi sinh vaät naøy thöôøng xuyeân phaân laäp ñöôïc töø caùc maãu buøn ñaùy taïi caùc cöûa soâng. Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus laø VSV coù khaû naêng saûn sinh moät soá loaïi ñoäc toá ñöôøng ruoät beàn nhieät, khoâng bò phaân huyû khi ñun ôû 100oC trong khoaûng 30 phuùt. Khi vi sinh vaät naøy xaâm nhieãm 2
4. vaøo trong thöïc phaåm, chuùng tieát ñoäc toá vaøo trong saûn phaåm vaø gaây ñoäc. Khi con ngöôøi tieâu thuï loaïi thöïc phaåm coù chöùa ñoäc toá naøy, sau 4-6 giôø uû beänh seõ boäc phaùt caùc trieäu chöùng laâm saøng nhö tieâu chaûy, noân möõa, caùc trieäu chöùng naøy keùo daøi töø 6-8 giôø. Caùc loaïi thöïc phaåm coù chöùa haøm löôïng muoái cao thöôøng coù nguy cô nhieãm vi sinh vaät naøy nhö jambon, kem toång hôïp, nöôùc soup vì caùc loaïi thöïc phaåm naøy ít khi ñöôïc xöû lyù ôû nhieät ñoä cao hôn 40oC. Caùc loaïi thuyû saûn hay thöïc phaåm ñoùng hoäp cuõng thöôøng hay bò nhieãm loaøi vi sinh vaät naøy. Caùc nguoàn laây nhieãm vaøo thöïc phaåm chuû yeâu töø caùc khaâu cheá bieán trong nhaø beáp. Trong töï nhieân caùc vi sinh vaät naøy thöôøng tình thaáy treân da, muõi, toùc hay loâng cuûa caùc loaøi ñoäng vaät maùu noùng. Vibrio spp Caùc loaøi Vibrio coù nguoàn goác töø bieån, chuùng caàn ion Na+ ñeå phaùt trieån. Gioáng Vibrio coù moät soá loaøi coù khaû naêng gaây beänh cho ngöôøi nhö V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. hollisae, V. furnsii, V. mimicus, V. fluvialis, V. alginolyticus. V. cholerae laø taùc nhaân gaây neân caùc vuï dòch taû treân toaøn theá giôùi. Loaøi vi sinh vaät naøy ñöôïc chia thaønh hai kieåu huyeát thanh chính ñoù laø O1 vaø non-O1, kieåu huyeát thanh O1 bao goàm ba kieåu huyeát thanh phuï nhö sau: Ogawa; Inaba (hai kieåu naøy ñöôïc goïi chung laø kieåu coå ñieån – Classic) vaø kieåu Eltor (kieåu Eltor coøn ñöôïc goïi laø kieåu O139). Hai kieãu huyeát thanh Inaba vaø Ogawa ngaøy nay chæ coøn ñöôïc tìm thaáy taïi caùc nöôùc thuoäc khu vöïc chaâu Aù. Trong khi ñoù caùc vuï dòch taû treân khaép theå giôùi gaây ra do kieåu Eltor. Khi coù caùc traän dòch do V. cholerae gaây ra thöôøng lan truyeàn raát nhanh vaøo trong nöôùc, gaây nhieãm vaøo thöïc phaåm, neáu ñieàu kieän veä sinh keùm, vi khuaån seõ lan truyeàn qua con ngöôøi vaø dòch beänh caøng theâm nghieâm troïng. Vi sinh vaät naøy saûn sinh ñoäc toá cholaratoxin, ñaây laø loaïi ñoäc toá ñöôøng ruoät coù cöôøng ñoä maïnh, chæ caàn 5μg gaây nhieãm qua ñöôøng mieäng coù theå gaây tieâu chaûy cho ngöôøi tröôûng thaønh. Moät soá ñoäc toá khaùc cuõng ñöôïc vi sinh naøy tieát ra nhö hemolysine coù ñoäc tính töông töï tetrodotoxin (ñoäc toá caù noùc) hay ñoäc toá töông töï shiga-toxin. Caùc loaïi thöïc phaåm coù theå lan truyeàn V. cholerae nhö nöôùc uoáng, nöôùc traùi caây, rau quaû, söõa vaø caùc saûn phaåm söõa, thaäm chí bia cuõng coù khaû naêng nhieãm vi sinh vaät naøy. Caùc loaïi saûn phaåm thuyû saûn töôi soáng, khoâng qua gia nhieät, gia nhieät nheï hay do söï nhieãm cheùo sau khi gia nhieät cuõng ñöôïc khuyeán caùc laø coù nguy cô mang V.cholerae khaù nghieâm troïng. V. parahaemolyticus laø loaøi vi sinh vaät toàn taïi vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng coù haøm löôïng muoái cao, chuùng thöôøng xuyeân ñöôïc phaân laäp töø caùc saûn phaåm thuûy saûn, trong caùc vuøng nöôùc aám ven bôø bieån. Chuùng saûn sinh ñoäc toá hemolysine beàn nhieät, chaát naøy chòu traùch nhieäm cho ñaëc tính khaùng nguyeân Kanagawa. Nhöng trong nhöõng naêm gaàn ñaây caùc doøng V.parahaemolyticus coù phaûn öùng Kanagawa aâm tính cuõng coù theå gaây beänh. Trieäu chöùng bieåu hieän cuûa beänh coù theå xuaát hieän trong khoaûng 2-96 giôø sau khi tieâu thuï thöïc phaåm bò nhieãm, thôøi gian naøy phuï thuoäc vaøo lieàu löôïng xaâm nhieãm vaø theå traïng cuûa töøng beänh nhaân, loaïi thöïc phaåm tieâu thuï vaø haøm löôïng acid trong daï daøy. Caùc bieåu hieän beänh lyù khi vi sinh vaät naøy xaâm nhieãm vaø ñau thaét vuøng buïng, vieâm nhieãm ñöôøng ruoät vaø tieâu chaûy nheï. Caùc loaøi Vibrio khaùc khi xaâm nhieãm vaøo trong thöïc phaåm cuõng coù theå gaây neân caùc beänh ñöôïng ruoät vaø coù bieåu hieän beänh lyù töông töï nhö hai loaøi treân. Dó nhieân tuyø töøng loaøi vaø lieàu löôïng maø coù nhöõng bieàu hieän beänh naëng nheï khaùc nhau. Chæ rieâng loaøi V. vulnificus khoâng gaây caùc trieäu chöùng beänh ñöôøng ruoät maø chuùng gaây nhieãm truøng maùu cho ngöôøi. Escherichia coli E. coli laø vi sinh vaät hieáu khí phoå bieán trong ñöôøng tieâu hoaù cuûa ngöôøi vaø caùc loaøi ñoäng vaät maùu noùng. Haàu heát caùc doøng E. coli toàn taïi moät caùch töï nhieân vaø khoâng gaây haïi trong ñöôøng tieâu hoaù, ngöôïc laïi chuùng coøn ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc oån ñònh sinh lyù ñöôøng tieâu hoaù. Tuy nhieân coù ít nhaát 4 doøng sau ñaây coù theå gaây beänh cho ngöôøi vaø moät soá loaøi ñoäng vaät: Enterobathogenic E. coli (EPEC) Enterotocigenic E. coli (ETEC) 3
5. Enteroinvasive E. coli (EIEC) Enterohaemorrhagic E.coli (EHEC)/ verocytocin E.coli (VTEC) hay Ecoli O157: H7 Roõ raøng E.coli coù theå phaân laäp ñöôïc deã daøng ôû khaép nôi trong moâi tröôøng coù theå bò oâ nhieãm phaân hay chaát thaûi. Vi sinh vaät naøy coù theå phaùt trieån vaø toàn taïi raát laâu trong moâi tröôøng. Trong nhöõng naêm gaàn ñaây caùc nhaø nhieân cöùu cuõng chöùng minh raèng E. coli cuõng coù theå phaân laäp ñöôïc töø nhöõng vuøng nöôùc aám, khoâng bò oâ nhieãm höõu cô. Vôùi söï phaân boá roäng raõi nhö vaäy, E.coli cuõng deã daøng phaân laäp ñöôïc töø caùc maãu thöïc phaåm do nhieãm vaøo töø nguyeân lieäu hay thoâng qua nguoàn nöôùc. Caùc doøng E. coli gaây beänh khi chuùng xaâm nhieãm vaøo ngöôøi qua con ñöờng thöïc phaåm coù theå gaây neân caùc beänh roái loaïn ñöôøng tieâu hoaù, caùc bieåu hieän laâm saøng bieán ñoäng coù theå töø nheï ñeán raát naëng, coù theå ñe doaï maïng soáng cuûa con ngöôøi phuï thuoäc vaøo lieàu löôïng, doøng gaây nhieãm vaø khaû naêng ñaùp öùng cuûa töøng ngöôøi. Shigella Gioáng Shigella cuõng laø moät thaønh vieân cuûa hoï vi khuaån ñöôøng ruoät Enterobacteriacae, chuùng goàm coù 4 loaøi sau: S. dysenteriae, S. sonnei, S. plexneri, S. boydii. Ñaây laø gioáng vi sinh vaät coù teá baøo chuû ñaëc hieäu, chuùng chæ thích nghi vaø phaùt trieån trong teá baøo chuû laø ngöôøi vaø caùc loaøi linh tröôûng. Söï hieän dieän cuûa chuùng trong moâi tröôøng laø do söï nhieãm phaân cuûa ngöôøi vaø caùc loaøi mang vi sinh vaät naøy. Shigella coù theå toàn taïi hôn 6 thaùng trong moâi tröôøng nöôùc. Caùc vuï ngoä ñoäc thöïc phaåm do Shigella gaây ra chuû yeáu taäp trung ôû caùc nöôùc keùm phaùt trieån, cheá bieán thöïc phaåm trong ñieàu kieän keùm veä sinh. Beänh cuõng coù theå truyeàn tröïc tieáp töø ngöôøi qua ngöôøi. Shigella chuû yeáu gaây neân caùc beänh lò tröïc truøng. Thôøi gian uû beänh sau khi tieâu thuï thöïc phaåm bò nhieãm laø 1-7 ngaøy. Caùc bieåu hieän trieäu chöùng beänh coù theå nheï, bieåu hieän khoâng roõ, chæ thoaùng qua nhö tieâu chaûy nheï, nhöng ñoâi khi cuõng coù nhöõng bieåu hieän nghieâm troïng nhö ñi tieâu ra maùu, coù nhöõng maûnh nieâm maïc ruoät, maát nöôùc, soát cao vaø bò co ruùt thaønh buïng. Caùc trieäu chöùng treân coù theå keùo daøi 12-14 ngaøy hay laâu hôn. Ñoái vôùi ngöôøi lôùn, caùc tröôøng hôïp töû vong do Shigella hieám khi dieãn ra, nhöng beänh bieåu hieän raát nghieâm troïng ñoái vôùi trẻ em vaø ngöôøi giaø. Haøng naêm coù khoaûng nöûa trieäu ngöôøi töû vong do vi sinh vaät gaây ra treân khaép theá giôùi. Söï laây nhieãm vi khuaån Shigella chuû yeáu ñöôøng mieäng. Nöôùc laø moät moâi tröôøng truyeàn beänh quan troïng, ñaëc bieät ôû nhöõng nôi keùm veä sinh. Tuy nhieân caùc loaïi thöïc phaåm cuõng laø nguyeân nhaân gaây neân caùc beänh do Shigella. Vi sinh vaät naøy nhieãm vaøo thöïc phaåm qua nguyeân lieäu hay quaù trình cheá bieán. Đôi khi nhieãm beänh do veä sinh caù nhaân keùm. Listeria monocytogenes Trong nhöõng naêm gaàn ñaây L. monocytogenes noåi leân nhö moät moät taùc nhaân gaây beänh nguy hieåm. Ñoái töôïng gaây beänh cuûa vi sinh vaät naøy laø treû em, phuï nöõ mang thai hay nhöõng ngöôøi giaø. Ñoái vôùi nhöõng vi sinh vaät gaây beänh goä ñoäc thöùc phaåm khaùc, chuùng boäc phaùt beänh khi con ngöôøi haáp thu ñuû lieàu löôïng, sau thôøi gian uû beänh caùc trieäu chöùng laâm saøng bieåu hieän. Ngöôïc laïi L. monocytogenes hieän dieän vôùi moät soá löôïng nhoû trong thöïc phaåm, khi ñöôïc ñöa vaøo cô theå, chuùng toàn taïi vaø chô cô hoäi. Khi coù ñieàu kieän thuaän lôïi, chuùng nhaân leân xaâm nhieãm vaøo caùc moâ saâu vaø gaây beänh. Caùc beänh do vi sinh vaät naøy gaây neân baét ñaàu töø ñöôøng tieâu hoaù nhö tieâu chaûy, soát nheï. Sau ñoù chuùng xaâm nhieãm vaøo caùc ñaïi thöïc baøo gaây neân beänh nhieãm truøng maùu, taùc ñoäng leân heä thaàn kinh trung öông, tim maét, vaø coù theå xaâm nhaäp vaøo baøo thai gaây neân saåy thai, ñeû non hay nhieãm truøng thai nhi. L. monocytogenes thuoäc loaïi vi sinh vaät öa laïnh, chuùng coù theå phaùt trieån ôù nhieät ñoä töø 2- 44oC. Chuùng thöôøng ñöôïc phaân laäp töø caùc loaïi thöïc phaåm nhö phomat söõa, thòt caù rau quaû vaø thaäm chí phaân laäp ñöôïc töø trong nöôùc maët. Trong taát caû caùc coâng ñoạn cheá bieán thöïc phaåm, söõa hay rau quaû ñeàu coù khaû naêng xaâm nhieãm vi sinh vaät vaät naøy. Ñaët bieät trong coâng ñoaïn baûo quaûn caùc saûn phaåm ôù nhieät ñoä thaáp, vi sinh vaät naøy coù cô hoäi phaùt trieån thaønh soá löôïng lôùn. Caùc saûn 4
6. phaåm thanh truøng Pasteur vaø ñöôïc baûo quaûn ôù nhieät ñoä thaáp trong caùc tuû laïnh coù nguy cô nhieãm vi sinh vaät naøy raát cao. Caùc virus gaây beänh trong thöïc phaåm Caùc ñôït dòch beänh gaây ra töø thöïc phaåm do taùc nhaân virus cho ñeán nay vaãn laø vaán ñeà bí aån. Nhöng moät soá taùc giaû vaãn tin raèng virus trong thöïc phaãm laø taùc nhaân gaây neân caùc beänh hieãm ngheøo. Nhöõng tieán boä trong caùc nhieân cöùu veà virus thöc phaåm vaãn coøn haïn cheá. Cho deán nay caùc ñaëc ñieåm sinh lyù cuûa virus ñöôøng ruoät vaãn coøn bieát raát haïn cheá. Cho ñeán nay caùc phöông phaùp nuoâi caáy ñeå phaùt hieän virus trong thöïc phaåm cho ñeán nay vaãn chöa theå thöïc hieän ñöôïc. Nhöng vôùi caùc tieán boä veà kyõ thuaät sinh hoïc phaân töû nhö kyõ thuaät lai phaân töû, kyõ thuaät PCR coù theå phaùt hieän ñöôïc caùc virus coù haïi cho con ngöôøi trong thöïc phaåm. Söï lan truyeàn virus cho ngöôøi qua con ñöôøng thöïc phaåm ñöôïc bieát töø nhöõng naêm 1950. Caùc virus gaây beänh ñöôøng ruoät cho ngöôøi chuû yeáu coù nguoàn goác töø caùc saûn phaåm thuyû saûn. Cho ñeán nay ñöôïc bieát coù khoaûng hôn 100 loaïi virus ñöôøng ruoät. Nhöng chæ moät vaøi loaøi trong soá ñoù coù khaû naêng gaây beänh cho ngöôøi. Theo Kilgen vaø Cole (1991) caùc loaøi vieus sau ñaây coù theå gaây nguy hieåm cho ngöôøi. Hepatitis type A (HAV) Virus Norwalk Calicivirus Astrovirus Virus NonA vaø Non B. Virus toàn taïi ôû theå khoâng hoaït ñoäng khi ôû beân ngoaøi teá baøo, chuùng khoâng theå töï nhaân leân trong nöôùc hay trong caùc saûn phaåm thöïc phaåm cho duø ôû baát kyø ñieàu kieän hoaù lyù nhö theá naøo. Chuùng xaâm nhieãm vaøo thöïc phaåm hoaøn toaøn do quaù trình cheá bieán, töø nöôùc bò oâ nhieãm. Caùc loaøi nhuyeãn theå aên loïc coù khaû naêng tích luyõ nhieàu virus trong nöôùc. Haøng ngaøy moät con nguyeãn theå coù theå loïc 1500 lít nöôùc, theo ñoù moät soá löôïng lôùn virus coù theå vaøo cô theã cuûa con vaät naøy vaø tích luyõ taïi ñoù. Vì theá maät ñoä virus trong cô theå nhuyeãn theå cao hôn raát nhieàu so vôùi moâi tröôøng nöôùc chuùng ñang sinh soáng. Lieàu löôïng gaây beänh cuûa virus coù theå thaáp hôn raát nhieàu so vôùi vi khuaån khi con ngöôøi tieâu thuï thöïc phaåm bò nhieãm. Lieàu löôïng gaây nhieãm toái thieåu cuûa moät soá loaøi vurus ñöôøng ruoät töông ñöông vôùi soá löôïng hieän dieän trong thöïc phaåm maø caùc phoøng thí nghieän coù theå phaùt hieän ñöôïc baèng phöông phaùt nuoâi caáy. Cô theå ngöôøi vaø caùc loaøi ñoäng vaät laø nguoàn chöùa caùc virus ñöôøng ruoät. Virus ñöôïc tìm thaáy vôùi soá löôïng lôùn trong phaân cuûa nhöõng ngöôøi bò nhieãm vaø toàn taïi trong nhieàu ngaøy ñeán nhieàu tuaàn. Söï nhieãm phaân vaøo trong thöïc phaåm baèng con ñöôøng giaùn tieáp hay tröïc tieáp laø con ñöôøng xaâm nhieãm virus vaøo thöïc phaåm. Söï soáng soùt cuûa virus trong moâi tröôøng hay trong thöïc phaåm phuï thuoäc vaøo yeáu toá nhö nhieät ñoä, noàng ñoä muoái, cöôøng ñoä böùc xaï maët trôøi hay söï hieän dieän cuûa caùc thaønh phaàn höõu cô khaùc. Virus ñöôøng ruoät cuõng coù khaû naêng toàn taïi nhieàu thaùng trong nöôùc bieån ôû nhieät ñoä <10oC thaäm chí coù theå laâu hôn. Vì theá ñaây cuõng laø nhaân toá chæ thò oâ nhieãm phaân. Taát caû caùc virus ñöôøng ruoät ñeàu khaùng vôùi acid, caùc enzym thuûy giaûi, hay muoái maät coù trong ñöôøng tieâu hoaù. Moät soá virus coù theå khaùng nhieät nhö Hepatits type A, moät soá khaùc coù theå khaùng vôùi caùc chaát taåy ueá nhö phenolic, ethanol . Ozon vaø chlorine laø nhöõng taùc nhaân coù theå laøm baát hoaït moät vaøi loaïi virus ñöôøng ruoät. Ñeå ngaên ngöøa caùc beänh do virus töø thöïc phaåm, caùc loaïi thöùc aên phaûi ñöôïc naáu chín,khöû virus tröôùc khi tieâu thuï, caùc loaïi nhuyeãn theå aên loïc phaûi ñöôïc khai thaùc tronng nhöõng vuøng nöôùc khoâng nhieãm virus hay ñöôïc nuoâi trong caùc vuøng nöôùc saïch tröôùc khi tieâu thuï. Coliforms 5
7. Coliform vaø Feacal coliform ñöôïc xem laø vi sinh vaät chæ thò, bôûi vì soá löôïng cuûa chuùng hieän dieän trong maãu chæ thò khaû naêng coù söï hieän dieän cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc trong thöïc phaåm. Caùc nhaø nghieân cöùu cho raèng soá löôïng Coliform cao trong thöïc phaåm thì khaû naêng hieän dieän caùc vi sinh vaät gaây beänh khaùc cuõng raát lôùn. Tuy vaäy moái lieân heä giöõa soá löôïng vi sinh vaät chæ thò vaø vi sinh vaät gaây beänh coøn ñang ñöôïc tranh caûi veà khoa hoïc. Cho ñeán nay moái lieân heä naøy vaãn khoâng ñöôïc söï thoáng nhaát trong caùc hoäi ñoàng khoa hoïc. Theo ñònh nghóa, nhoùm Coliform bao goàm caû nhöõng vi sinh vaät hieáu khí vaø kî khí tuyø nghi, coù Gram aâm, khoâng sinh baøo töû, coø hình que, leân men ñöôøng lactose vaø sinh hôi trong moâi tröôøng nuoâi caáy loûng. Caên cöù vaøo nhieät ñoä vi sinh vaät coù theå phaùt trieån ñeå chia nhoùm Coliform thaønh hai nhoùm. Nhoùm Coliform coù nguoàn goác töø phaân cuûa caùc loaøi ñoäng vaät vaø, nhoùm naøy ñöôïc goïi laø Coliform phaân vaø nhoùm khoâng coù nguoàn goác töø phaân ñoäng vaät. Treân thöïc teá, caùc phöông phaùp kieåm nghieäm chæ xaùc ñònh Coliform phaân laø xaùc ñònh nhoùm coliform coù nguoàn ngoác töø ruoät ngöôøi vaø caùc ñoäng vaät maùu noùng bao goàm caùc gioáng nhö Escherichia; Klebsiella vaø Enterobater. Moät caâu hoûi ñöôïc ñaët ra laø coù phaûi taát caû caùc thaønh vieân cuûa nhoùm Coliform phaân coù yù nghóa chæ thò veä sinh nhö nhau hay khoâng? Cho ñeán nay vaán ñeà naøy vaãn coøn ñang ñöôïc baøn luaän, tuy nhieân trong caùc thaønh vieân cuûa nhoùm naøy thì E. coli laø loaøi ñöôïc söï quan taâm nhieàu nhaát cuûa vaàn ñeà veä sinh an toaøn thöïc phaåm. Baûng 1: Caùc loaïi beänh vaø caùc bieåu hieän laâm saøng do caùc vi sinh vaät trong thöïc phaåm gaây ra Thôøi gian uû Vi sinh vaät Noân Tieâu Ñau Soát Thôøi gian Caùc loaïi thöïc phaåm beänh möûa chaûy thaét keùo daøi thöôøng gaëp 30 phuùt–4 giôø B.cereus (emertic) +++ (+)a (+)a - Ngaén Gaïo 8-12 giôø B.cereus (diarrhoeal) - ++ ++ - 1-2 ngaøy Soup vaø caùc saûn phaåm söõa 4-6 giôø S. aureus ++ + ++ - 6-12 giôø Thòt laïnh Saûn phaåm söõa, salad, kem, tröùng, saûn phaåm leân men 8-22 giôø C. perfringens - ++ ++ - 12-24 giôø Saûn phaåm thòt qua gia nhieät 8-48 giôø V. paraheamolyticus - +++ - + 2-3 ngaøy Haûi saûn 12-48 giôø Salmonella (+) ++ - + 48giôø-7 ngaøy Gia caàm, thò vaø saûn phaåm tröùng 24-72 giôø C.botulinum - - - -b 3 ngaøy Ñoà, rau quaû ñoùng hoäp, thòt 2-11 ngaøy Campylobacter - +++ ++ ++ 3 ngaøy-3 tuaàn Söõa, öôùc uoáng, thòt gia caàm, thòt töôi, caù naám, söõa thanh truøng Pasteur a: Coù theå bieåu hieän hay khoâng, b: Bieåu hieän roái loaïn 6
8. Chöông II KYÕ THUAÄT TRUYEÀN THOÁNG TRONG PHAÂN TÍCH VI SINH VAÄT 1. Ñònh löôïng vi sinh vaät baèng phöông phaùp ñeám tröïc tieáp treân kính hieån vi Soá löôïng Vi sinh vaät trong maãu coù theå ñöôïc xaùc ñònh baèng caùch ñeám tröïc tieáp treân kính hieån vi. Qui trình ñeán tröïc tieáp cho pheùp xaùc ñònh ñöôïc soá löôïng vi sinh vaät vôùi keát quaû cao nhaát. Maët duø phöông phaùp ñeám tröïc tieáp baèng kính hieån vi cho pheùp öôùc löôïng nhanh choùng soá löôïng vi sinh vaät coù trong maãu. Tuy vaäy phöông phaùp naøy coù nhöõng ñieåm haïn cheá nhaát ñònh nhö khoâng phaân bieät ñöôïc soá löôïng teá baøo soáng vaø soá löôïng teá baøo cheát, deå nhaàm laãn teá baøo vi sinh vaät vôùi caùc maûnh vôû nhoû cuûa maãu vaø khoâng cho pheùp tìm hieåu caùc ñaëc ñieåm khaùc cuûa cuûa vi sinh vaät ñöôïc ñöôïc quan saùt. Ñoái vôùi caùc vi sinh vaät coù kích thöôùc lôùn nhö naám men, naám moác, taûo vaø protozoa, phöông phaùp ñeám tröïc tieáp deã daøng thöïc hieän vôùi caùc loaïi buoàng ñeám. Coù raát nhieàu loaïi buoàn ñeám vi sinh vaät khaùc nhau phuø hôïp vôùi töøng theå tích vaø kích thöôùc cuûa töøng nhoùm vi sinh vaät. Ví duï coù theå söû duïng buoàng ñeám hoàng caàu Petroff – Hauser ñeå ñeám vi khuaån. Ñoái vôùi caùc maãu nöôùc vaø caùc maãu khaùc, buoàng ñeám Holber ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát. Buoàng ñeán Holber laø moät lam kính daøy 2-3mm coù moät vuøng ñóa ñeám naèm giöõa lame kính vuøng naøy ñöôïc bao quanh bôûi moät raõnh. Ñóa ñeám thaáp hôn beà maët cuûa lame kính khoaûng 0,02mm, coù hình troøn vì theá khi phuû leân treân baèng kính ñaäy vaät thì ñoä saâu cuûa ñóa ñeám seõ ñoàng ñeàu nhau. Vuøng ñóa ñeám coù ñieän tích 1mm2 vaø ñöôïc chia thaønh 400 oâ vuoâng nhoû hôn, moãi oâ coù dieän tích 0.0025mm2. theå tích cuûa moãi oâ laø 0,02 x 0,0025 mm2, theå tích naøy töông ñöông vôùi 0,00005ml. Theâm vaøi gioït formalin vaøo trong nhöõng loï chöùa maãu, troän ñeàu. Pha loaõng maãu caàn ñeám sao cho trong moãi oâ nhoû cuûa buoàng ñeám coù khoaõng 5 - 10 teá baøo vi sinh vaät. Ñeå ñaït ñöôïc ñoä pha loaõng nhö vaäy caàn phaûi öôùc löôïng ñöôïc soá löôïng vi sinh vaät trong maãu, ñoàng thôøi phaûi thöû vaøi laàn trong quaù trình pha loaõng. Maãu phaûi ñöôïc pha loaõng baèng dung dòch pha loaõng chöùa 0,1% pepton vaø 0,1% laurylsulphat vaø 0,01% methyl blue. Taát caû caùc dung dòch pha loaõng ñeàu phaûi caàn loïc tröôùc khi söû duïng. Ñaët moät gòot maãu ñöôïc pha loaõng vaøo trong ñóa ñeám treân buoàng ñeám, ñaäy baèng kính ñaäy vaät. Taát caû caùc buoàng ñeám vaø kính ñaäy vaät phaûi ñöôïc lau thaät saïch. Theå tích maãu chöùa trong buoàng ñeám laø khoaûng khoâng gian giöõa ñóa ñeám vaø kính ñaäy vaät, khoâng ñeå maãu traøng ra beân ngoaøi raõnh cuûa ñóa. Sau khi ñaït maãu, ñeå yeân khoaûng 5 phuùt ñeå oån ñònh vị trí cuûa caùc teá baøo trong buoàng ñeám. Ñeám ngaãu nhieân khoaûng 50-100 oâ nhoû. Tính trung bình soá löôïng vi khuaån trong taát caû caùc oâ ñaõ ñeám. Sau ñoù nhaân vôùi 20 000 vaø vôùi ñoä pha loaõng maãu tröôùc khi ñeám ñeå coù ñöôïc soá löôïng teá baøo trong 1ml. Laëp laïi hai laàn hay nhieàu hôn ñeå laáy giaù trò soá ñeám trung bình. Ñoái vôùi caùc vi sinh vaät tuï thaønh töøng cuïm, khoâng theå phaân bieät töøng teá baøo thì moãi cuïm ñöôïc xem laø moät vi khuaån. Vôùi nhöõng kinh nghieäm cuûa moãi caù nhaân veà ñoä pha loaõng, thao taùc kyõ thuaät thaønh thaïo coù theå nhaän ñöôïc caùc soá ñeám chính xaùc. Tuy vaät keát quaû coù chính xaùc hay khoâng coøn phuï thuoäc vaøo söï saïch seõ cuûa buoàng ñeám, kính ñaäy vaät nhaèm ñaûm baûo khoâng coù vi khuaån khaùc khoâng phaûi töø maãu hieän dieän trong buoàng ñeám vaø trong kính ñaäy vaät. Kyõ thuaät ñeám Breed Kyõ thuaät naøy raát höõu ích trong vieäc xaùc ñònh toång soá vi sinh vaät baèng phöông phaùp ñeám tröïc tieáp. Lame kính Breed coù moät vuøng coù dieän tích 1cm2 ñöôïc ñaùnh daáu treân lame. Duøng bôm tieâm, hay que caáy voøng cho 0,01ml maãu caàn ñeám vaøo trong vuøng naøy, saáy khoâ baèng ngoïn löûa sau ñoù nhuoäm vôùi methyl blue. Khi ñeám, cho daàu nhuùng leân dieän tích vuøng caàn ñeám. Thoâng 7
9. thöôøng vuøng naøy coù ñöôøng kính 0,16 mm. Dieän tích vuøng ñeám laø πr2 hay 3,14 x 0,08 x 0,08 =0,02mm2. Vôùi dieän tích naøy chieám 1/5000 trong toång dieän tích ñaët maãu laø 100mm2 hay theå tích trong vuøng ñeám laø 1/5000 x 0,01ml. Nhö vaäy neáu coù 1 vi sinh vaät trong vuøng ñeám thì töông ñöông vôùi 5000/0,01ml hay 500 000 teá baøo/ml. Soá ñeám cuûa caùc vi sinh vaät trong caùc vuøng khaùc nhau cuûa vuøng qui öôùc ñöôïc tính baèng coâng thöùc nhö sau: N × 4×104 C = πd 2 d: ñöôøng kính vuûa vuøng ñeám N: soá löôïng teá baøo trong 1 vuøng C: soá teá baøo trong 1ml Khi söû duïng kính hieån vi huyønh quang vôùi caùc chaát nhuoäm khaùc nhö acridin cam (AODC), 4’,6-dianidino-2-phenyl-indol (DAPI), fluorescein isothiocyanate (FITC) cuõng ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå ñeám soá löôïng vi khuaån. Caùc nghieân cöùu cuûa K.G. Porter vaø Y.S. Feig cho thaáy raèng khi söû duïng DAPI ñeå ñeám soá löôïng vi khuaån trong nöôùc cho keát quaû toát hôn khi söû duïng chaát nhuoäm AODC khi trong maãu nöôùc coù nhieàu chaát dinh döôõng vaø nhieàu phieâu sinh vaät khaùc. Veà ñoä beàn tính phaùt huyønh quang cuûa DAPI cuõng cao hôn AODC. Hai taùc giaû treân cuõng chöùng minh raèng khi nhuoäm vôùi DAFI coù theå baûo quaûn trong toái ñeán 24 tuaàn maø cöôøng ñoä phaùt quan khoâng thay ñoåi. Trong khi ñoù AODC cöôøng ñoä vaø soá löôïng phaùt quang bò giaûm khi baûo quaûn trong voøng 1 tuaàn ôû cuûng ñieàu kieän. Moät kyõ thuaät khaùc döïa treân nguyeân taéc nhuoäm maøu ñaëc hieäu DNA ñöôïc goïi laø Hoechst 33258 cuõng ñöôïc söû duïng ñeå nhuoäm vaø ñeám soá löôïng vi sinh vaät treân kính hieån vi huyønh quang. Phöông phaùp naøy nhö sau: Bisbenzumide keát hôïp vôùi vuøng DNA giaøu adenine vaø thyamine sau khi gaén phöùc hôïp naøy seõ phaùt huyøng quang. Hoechst 33258 ñöôïc söû duïng nhieàu trong vieäc ñònh löôïng vi sinh vaät treân beà maët. Ñaët bieät treân beà maët coù gaén caùc acridine orange. Moät söï thuaän lôïi khaùc khi söû duïng phöông phaùp nhuoäm maøu bisbenzimide cho pheùp ñeám soá löôïng vi sinh vaät trong caùc duïng dòch chaát taåy röûa, trong muoái duøng cho caùc phoøng thí nhieäm hay trong caùc cheá phaåm sinh hoïc khaùc maø khoâng coù söï hieän dieän cuûa DNA. Phöông phaùp ñeám soá löôïng vi sinh vaät baèng phöông phaùp phaùt huyønh quang ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong vieäc phaân tích caùc maãu moâi tröôøng nhö nöôùc ñaát . Söû duïng daàu nhuùng phaùt quang thaáp laø moät phaùt minh quan troïng trong vieäc haïn cheá söï phaùt huyønh quang cuûa caùc maøng loïc. Maøng carbonate Nuclepore laø moät maøng cellulose cao caáp duøng trong vieäc ñeám tröïc tieáp vi khuaån bôûi vì chuùng coù kích thöôùc loå ñoàng nhaát vaø beà maët maøng phaúng, chuùng coù theå giöõ laïi taát caû caùc vi sinh vaät treân beå maët cuûa chuùng. Maøng Nuclepore coù theå nhuoäm vôùi thuoác nhuoäm Irgalan ñen hay caùc loaïi thuoác nhuoäm phuø hôïp khaùc ñeå taïo neân moät neàn maøu ñen töông phaûn vôùi maøu phaùt quang cuûa vi sinh vaät vì theá vieäc ñeám ñöôïc thöïc hieän deã daøng. Khi söû duïng thuoác nhuoäm laø acridine cam vi khuaån vaø caùc vi sinh vaät khaùc phaùt quang maøu xanh hay maøu cam. Maøu phaùt quang xanh hay cam laø phuï thuoäc vaøo tình traïng sinh lyù cuûa töøng vi sinh vaät. Nhöng khaû naêng phaân bieät teá baøo ñang soáng hay teá baøo ñaõ cheát bôûi maàu phaùt quang ñoâi khi ñöa ñeán söï nhaàm laãn. Söû duïng ADPI nhuoäm DNA cuûa teá baøo vi khuaån chuùng ñöa ñeán söï phaùt quang maøu xanh döông ñöôïc cho laø toái öu hôn so vôùi vieäc söû duïng acridin cam ñeå nhuoäm caùc vi khuaån coù kích thöôùc nhoû. Soá ñeám nhaän ñöôïc töø phöông phaùp ñeám tröïc tieáp treân kính hieån vi phaùt huyønh quang luoân cho keát quaû cao töông ñöông hai laàn so vôùi keát quaû nhaän ñöôïc baèng kyõ thuaät nuoâi caáy 8
10. khaùc. Nhöõng vi khuaån coù kích thöôùc nhoû, coù hình daïng baát thöôøng khaùc cuõng ñeàu coù theå nhìn thaáy baèng phöông phaùp phaùt huyønh quang. Moät soá daïng vi sinh vaät khoâng theå nuoâi caáy trong caùc moâi tröôøng toång hôïp trong phoøng thí nghieäm. Hieän töôïng khoâng theå nuoâi caáy cuûa caùc vi sinh vaät cho ñeán nay vaãn chöa roõ laø do chuùng thoaùi hoaù, khoâng theå nhaân leân trong caùc moâi tröôøng nhaân taïo hay do khoâng ñaùp öùng ñöôïc caùc ñieàu kieän sinh lyù caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa chuùng. Trong moät soá tröôøng hôïp, söï töông quan cao giöõa phöông phaùp ñeám tröïc tieáp baèng phöông phaùp phaùt huyønh quang vaø phöông phaùp ñeám khuaån. Tuy nhieân trong moät soá tröôøng hôïp khaùc söï töông quang naøy raát keùm. Söï khaùc bieät giöõa phöông phaùp ñeám tröïc tieáp vaø phöông phaùp ñeám khuaãn laïc phaûn aùnh söï choïn loïc cuûa moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy, moät phaàn teá baøo bò cheát hay bò thöông toån vaø soá loaøi cuï theå trong maãu. Baûng 2: Keát quaû toång soá vi khuaån nhaän ñöôïc töø phöông phaùp ñeám tröïc tieáp treân kính hieån vi vaø phöông phaùp ñeám khuaån laïc ôû 20oC vaø 4oC. Maãu Ñeám tröïc tieáp Ñeám khuaãn laïc 4oC 20oC Nöôùc bieån 9.9 x104 6.6 x101 4.5 x101 Nöôùc ñaù 8.2 x105 9.6 x103 7.3 x103 Nöôùc töï nhieân 1.8 x105 6.1 x102 1.1 x101 Nöôùc töø vònh 5.2 x105 5.0 x104 2.7 x104 Alaska 3.0 x105 1.0 x102 5.2 x102 Alaska 1.4 x105 1.3 x102 2.4 x102 Giaù trò cuûa soá ñeám tröïc tieáp baèng phöông phaùp phaùt huyønh quang treân kính hieån vi töông ñöông vôùi vôùi soá löôïng vi sinh vaät thaät söï coù theå coù vôùi taát caû caùc loaøi khaùc nhau. Ñieàu ñoù cho pheùp öôùc ñoaùn ñöôïc ñöôïc soá löôïng thaät söï trong nöôùc bieån, trong nöôùc töï nhieân, trong trong moät loaïi maãu naøo ñoù, maët duø caùc loaøi naøy coù söï khaùc bieät lôùn veà soá löôïng cuûa töøng chuûng loaøi, khaùc bieät veà ñaëc ñieåm sinh lyù dieån ra trong cuøng ñieàu kieän cuûa maãu. Soá ñeám tröïc tieáp thöôøng phaûn aùnh ñuùng vôùi sinh khoái, vì theá thöôøng ñöôïc duøng ñeå öôùc löôïng sinh khoái vi sinh vaät coù trong maãu. Tuy nhieân ñeå coù ñöôïc soá ñeám chính xaùc baèng kính hieån vi phaùt huyøng quang caàn phaûi ñeám nhieàu laàn vaø nhieàu vò trí khaùc nhau treân maãu. Theâm vaøo ñoù neáu ñeám nhieàu teá baøo ñang phaân chia coù theå cho pheùp öôùc ñoaùn toác ñoä phaùt trieån cuûa vi sinh vaät trong maãu. Taàn suaát cuûa teá baøo ñang phaân chia ñöôïc nhìn thaáy coù moái lieân heä vôùi chæ soá ño khaùc cuûa toác ñoä phaùt trieån vi sinh vaät nhö toác ñoä toång hôïp RNA ñöôïc ño bôûi söï phoøng thích cuûa adenine ñöôïc ñaùnh daáu. Taàng xuaát cuûa teá baøo ñang phaân chia ñöôïc tính baèng thôøi gian giöõa luùc baét ñaàu söï thaét cuûa teá baøo ñeán khi teá baøo phaân chia laø moät haèng soá. Con soá naøy khoâng phaûi laø baát bieán. Thaät khoù khaên ñeå nhaän ra söï phaân chia teá baøo khi söû duïng kính hieån vi quang hoïc maø khoâng söû duïng kính hieån vi phaùt huyønh quang. 2. Caùc kyõ thuaät ñònh löôïng vi sinh vaät trong maãu baèng phöông phaùp nuoâi caáy Coù hai caùch ñeå xaùc ñònh soá löôïng vi khuaån baèng phöông phaùp nuoâi caáy: phöông phaùp ñeám khuaån laïc vaø phöông phaùp öôùc ñoaùn soá löôïng vi khuaån (MPN – Most probable number). Taát caû caùc phöông phaùp ñònh löôïng vi khuaån trong maãu baèng phöông phaùp nuoâi caáy ñeàu yeâu caàu caùc teá baøo phaûi ñöôïc taùch rôøi nhau, qua quaù trình nuoâi caáy caùc teá baøo naøy phaùt trieån thaønh caùc doøng rieâng bieät. Taát caùc qui trình ñònh löôïng baèng phöông phaùp nuoâi caáy nhaèm choïn loïc moät hay nhieàu nhoùm vi khuaån nhaát ñònh naøo ñoù, möùc ñoä choïn loïc phuï thuoäc vaø töøng qui trình qui trình cuï theå. Ñeå xaùc ñònh toång soá vi sinh vaät trong maãu phaûi choïn qui trình giaûm toái thieåu khaû 9
11. naêng choïn loïc. Nhöng duø möùc ñoä choïn loïc ôû möùc toái thieåu cuõng chæ ñònh löôïng ñöôïc soá löôïng vi sinh vaät coù theå nuoâi caáy. Coøn moät soá löôïng lôùn vi sinh vaät khaùc khoâng theå phaùt trieån ñöôïc trong quaù trình nuoâi caáy thì khoâng theå ñònh löôïng ñöôïc baèng phöông phaùp naøy. Coù caùc phöông phaùp ñònh löôïng nuoâi caáy nhö sau nhö sau: 1.1 Phöông phaùp ñeám khuaån laïc Phöông phaùp ñeám khuaån laïc treân ñóa ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå ñònh löôïng vi sinh vaät, ñaëc bieät laø vi khuaån, nhöng phaùp naøy coù nhöõng khuyeát ñieåm vaø ñaõ coù nhöõng caùch nhìn nhaän khaùc nhau veà maët khoa hoïc. Khuyeát ñieåm cuûa phöông phaùp naøy naèm trong söï laïm duïng ñeå bieåu ñaït sai caùc keát quaû. Taát caû moïi ngöôøi ñeàu maéc sai laàm khi nhaän ra raèng phöông phaùp naøy khoâng theå duøng ñeå thu ñöôïc keát quaû toång soá vi sinh vaät. Phöông phaùp ñeám khuaån laïc söû duïng nhieàu loaïi moâi tröôøng vaø caùc ñieàu kieän nuoâi caáy khaùc nhau. Agar laø chaát thöôøng ñöôïc duøng ñeå laøm ñaëc caùc moâi tröôøng nuoâi caáy vì haàu heár caùc vi sinh vaät ñeàu maát caùc gen toång hôïp enzym phaân giaûi agar. Caùc maãu ñaõ ñöôïc pha loaõng ñeå traõi leân beà maët moâi tröôøng agar (phöông phaùp traõi) hay khuyeát taùn vaøo trong noâi tröôøng tröôùc khi laøm ñaëc (phöông phaùp ñoå ñóa). Moät vaán ñeà caàn phaûi caân nhaéc laø caùc vi sinh vaät caàn xaùc ñònh coù theå toàn taïi vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng agar hay khoâng. Moät soá vi sinh vaät coù theå bò cheát khi traõi treân beà maët moâi tröôøng trong qui trình caáy traûi beà maët. Moät soá loaøi vi khuaån khaùc khoâng theå soáng trong ñieàu kieän nhieät ñoä duy trì traïng thaùi loûng cuûa agar trong qui trình ñoå ñóa. Bôûi vì agar chæ laø taùc nhaân laøm raén moâi tröôøng nuoâi caáy trong qui trình ñònh löôïng vi sinh vaät vì theá trong moät soá tröôøng hôïp agar coù theå ñöôïc thay theá baèng caùc taùc nhaân laøm raén khaùc. Trong moät soá tröôøng hôïp caùc vi sinh vaät coù caùc nhu caàu dinh döôõng ñaëc bieät khaùc, caùc chaát nhö silicagel coù theå ñöôïc thay theá ñeå laøm raén moâi tröôøng. Nhö ng vì chuaån bò moâi tröôøng silicagel khoù khaên hôn chuaån bò moâi tröôøng agar neân chæ duøng moâi tröôøng silicagel khi khoâng theå thay theá ñöôïc moâi tröôøng agar. Phöông phaùp oáng cuoän ñöôïc duøng ñeå ñònh löôïng caùc vi sinh vaät kî khí baét buoäc. Ñaây laø moät phöông phaùp caûi bieân cuûa phöông phaùp ñoå ñóa. Caùc ñóa hay caùc oáng sau khi caáy vi khuaån ñöôïc uû trong ñieàu kieän nhieät ñoä ñaëc bieät trong moät thôùi gian nhaát ñònh ñeå cho sinh vaät phaùt trieån thaønh caùc khuaån laïc coù theå nhìn thaáy baèng maét tröôøng, soá löôïng khuaån laïc xuaát hieän treân ñóa seõ ñöôïc ñeám. Soá löôïng khuaån laïc seõ ñöôïc gaùn cho soá teá baøo ñôn leû trong maãu ban ñaàu. Ñeå soá löôïng khuaån laïc phaûn aùnh ñöôïc soá löôïng teá baøo vi khuaån, maãu phaûi ñöôïc phaân taùn ñeàu vaøo trong moâi tröôøng hay treân beà maët moâi trtöôøng raén. Nhöõng ñóa coù quaù nhieàu khuaån laïc xuaát hieän thì khoâng theå cho soá löôïng ñeám chính xaùc bôûi vì chuùng coù theå choàng laáp leân nhau. Nhöõng ñóa coù quaù ít khuaån laïc cuõng phaûi boû ñi vì theo nguyeân taéc cuûa xaùc suaát. Nhöõng vaán ñeà chính yeáu caàn xem xeùt trong qui trình ñeám khuaån laïc laø thaønh phaàn moâi tröôøng, ñieàu kieän vaø thôøi gian nuoâi uû. Moâi tröôøng ñeå ñònh löôïng caùc vi sinh vaät dò döôõng khoâng theå coáù ñònh nitô phaûi chöùa caùc nguoàn nitô, carbon, phosphate deã söû duïng vaø caùc cation, anion caàn thieát nhö saét, mangie, calci, natri, clo vaø sulphate. Thaønh phaàn cuûa caùc haøm löôïng khoâng nhaát ñònh, chuùng ñaët thuø cho töøng loaïi moâi tröôøng vaø töøng loaïi maãu nhaát ñònh ñeå coù theå nhaän ñöôïc soá löôïng vi sinh vaät muïc tieâu cao nhaát. Nhö vaäy moâi tröôøng nuoâi caáy phaûi coù caùc thaønh phaàn dinh döôõng phuø hôïp vôùi töøng yeâu caàu cuûa loaøi vi sinh vaät, bao goàm caû caùc nhaân toá caàn thieát khaùc cho söï phaùt trieån cuûa moät heä vi sinh vaät nhaát ñònh. Muïc ñích chung cuûa moâi tröôøng laø haøm löôïng dinh döôõng phaûi cao hôn caùc thaønh phaàn coù trong caùc maãu ñang phaân tích. Haøm löôïng dinh döôõng trong caùc loaïi moâi tröôøng ñeám toång soá vi sinh vaät phaûi ñuû cao, vaø ñoäc tính cuûa moâi tröôøng ñoái vôùi sinh vaät ôû möùc thaáp nhaát. Ñeå naâng cao hieäu quaû cuûa qui trình ñònh löôïng vi sinh vaät baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc, caùc ñieàu kieän caàn phaûi ñieàu chænh sao cho chæ coù caùc thaønh vieân vi sinh vaät caàn phaùt hieän 10
12. theo ñònh nghóa ñöôïc ñeám. Caùc moâi tröôøng ñeám ñóa ñöôïc choïn loïc hay phaân bieät vôùi caùc thaønh vieân vi sinh vaät khaùc. Qui trình ñeám ñóa choïn loïc ñöôïc thieát keá cho thích hôïp vôùi söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät mong muoán. Söï phaùt trieån cuûa caùc nhoùm vi sinh vaät khaùc ñöôïc loaïi boû bôûi caùc thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng hay ñieàu kieän nuoâi uû. Moâi tröôøng phaân bieät laø moâi tröôøng khoâng loaïi boû caùc nhoùm vi sinh vaät khoâng mong muoán maø ngöôïc laïi cho pheùp chuùng phaùt trieån cuõng treân moâi tröôøng ñoù nhöng coù theå bieät phaân bieät caùc nhoùm vi sinh vaät mong muoán vôùi caùc nhoùm khaùc baèng caùc ñaëc ñieåm nhaän daïng. Moâi tröôøng cuõng coù theå ñöôïc thieát laäp ñeå choïn loïc caùc loaøi naám moác. Maët duø kyõ thuaät ñeám khuaån laïc khoâng phaûi laø phöông phaùp ñöôïc choïn cho vieäc xaùc ñònh soá löôïng naám moác trong caùc maãu thöïc phaåm vaø trong moâi tröôøng. Bôûi vì kyõ thuaät naøy chæ thích hôïp cho vieäc ñònh löôïng caùc loaøi vi sinh vaät khoâng coù sôïi hay baøo töû. Dó nhieân phöông phaùp ñeám khuaån laïc cuõng thích hôïp cho vieäc ñònh löïông caùc loaøi naám men. Vì soá löôïng cuûa vi khuaån luoân nhieàu hôn soá löôïng cuûa naám moác neân ñeå ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa vi khuaån trong caùc khuaån laïc cuûa naám moác, caùc taùc nhaân öùc cheá vi khuaån ñöôïc theâm vaøo trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy. Caùc thuoác nhuoäm bengal rose vaø caùc khaùng sinh nhö streptomycine, neomycine thöôøng ñöôïc söû duïng laø nhöõng taùc nhaân öùc cheá vi khuaån. Moät bieän phaùp ñôn giaûn ñeå öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån laø haï thaáp pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy xuoáng khoaûng 4,5 - 5,5. Haàu heát caùc naám moác ñeàu khoâng bò taùc ñoäng khi phaùt trieån trong khoaûng pH naøy nhöng khi ñoù vi khuaån bò öùc cheá. Moâi tröôøng choïn ñöôïc xaùc laäp coâng thöùc ñeå öùc cheá söï phaùt trieån cuûa nhoùm vi sinh vaät vaø cho pheùp moät nhoùm vi sinh vaät khaùc phaùt trieån. Ví duï moâi tröôøng Saubouraud Dextrose Agar ñöôïc duøng ñeå ñònh löôïng naám moác döïa treân nguyeân taéc pH thaáp vaø nguoàn carbohydrate. Boå sung vaøo moâi tröôøng caùc chaát khaùng sinh khaùc nhö peniciline hay methyl bule laø nhöõng taùc nhaân öùc cheá vi khuaàn gram aâm. Caùc vi sinh vaät khaùng khaùng sinh cuõng coù theå ñöôïc ñònh löôïng treân moâi tröôøng baèng caùch theâm vaøo ñoù moät lieàu löôïng khaùng sinh. Moâi tröôøng phaân bieät ñöôïc thieát laäp döïa treân nhieàu caùch. Caùc thuoác thöû ñöôïc theâm vaøo trong moâi tröôøng ñeå cho pheùp nhaän ra caùc söï khaùc bieät cuûa nhöõng vi sinh vaät mong muoán. Coù theå theâm thuoác thöû vaøo moâi tröôøng sau khi nuoâi caáy ñeå nhaän ra caùc loaøi vi sinh vaät ñaëc tröng caàn tìm. Chìa khoaù naâng cao khaû naêng phaân bieät cuûa moâi tröôøng laø qui trình nuoâi caáy ñeå cho pheùp moâi tröôøng phaân bieät moät caùch toát nhaát vôùi vi sinh vaät caàn ñònh löôïng vaø caùc vi sinh vaät khaùc coù trong maãu. Moâi tröôøng Eosin methyl blue (EMB) vaø MacConkey agar laø nhöõng moâi tröôøng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong vieäc phaân tích vi sinh vaät trong nöôùc. Nhöõng moâi tröôøng naøy bao goàm tính choïn loïc vaø tính phaân bieät. Chuùng choïn loïc cho söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån gram aâm bôûi trong ñoù coù theâm vaøo caùc taùc nhaân öùc cheá caùc vi khuaån gram döông. Moâi tröôøng naøy coù theå phaân bieät caùc vi khuaån coù theå söû duïng lactose bôûi söï hình thaønh caùc khuaån laïc coù theå phaân bieät baèng maøu saéc. Treân moâi tröôøng EMB, vi khuaån thuoäc nhoùm coliforms laø nhoùm gram aâm taïo neân nhöõng khuaån laïc coù maøu tím aùnh kim. Ñònh löôïng soá löôïng coliform baèng caùch ñeám soá löôïng khuaån laïc coù caùc ñaëc ñieåm naøy. Caùch naøy thöôøng xuyeân ñöôïc söõ duïng trong vieäc phaân bieät caùc vi sinh vaät chæ thò trong nöôùc vaø trong thöïc phaåm. Vôùi kyõ thuaät ñeán khuaãn laïc, caùc maãu caàn phaân tích phaûi ñöôïc pha loaõng thaønh chuoåi pha loaõng lieân tieáp vaø ñöôïc xaùc ñònh moät vaøi noàng ñoä pha loaõng nhaát ñònh ñeå caáy vaøo caùc moâi tröôøng ñaõ choïn phuø hôïp vôùi caùc ñoái töôïng caàn xaùc ñònh. Moåi khuaãn laïc ñöôïc hình thaønh ñöôïc gaùn cho moät ñôn vò hình thaønh khuaån laïc (cfu-colony forming units). Kyõ thuaät thöôøng qua caùc böôùc nhö sau: Dung dòch pha loaõng: moät soá dung dòch duøng ñeå pha loaõng coù theå laøm cheát teá baøo nhö: nöôùc muoái, nöôùc caát. Caùc dung dòch pha loaõng khoâng ñöôïc duøng ngay khi laáy ra töø tuû laïnh coù 11
13. theå gaây soác vaø laøm cho vi sinh vaät khoâng theå phaùt trieån ñöôïc. Dung dòch pepton water laø dung ñòch pha loaõng ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát vaø ñöôïc xem laø dung dòch pha loaõng cho taát caû caùc loaïi maãu. Neáu trong maãu coøn coù moät ít caùc chaát khöû truøng thì phaûi theâm vaøo dung dòch pha loaõng taùc nhaân giaûm thieåu khaû naêng khöû truøng cuûa chuùng, ví duï: neáu trong maãu coøn dö löôïng cuûa caùc hôïp - chaát amonium (NH4 ) thì coù theå theâm vaøo ñoù Tween 80 hay lecithin. Ngöôïc laïi neáu trong maãu coù chöùa caùc hôïp chaát chlorin hay iodin thì caàn theâm vaøo ñoù caùc muoái nhö sodium thiosulphate. Chuaån bò caùc chuoåi pha loaõng maãu Bôm chính xaùc 9ml dung dòch pha loaõng vaøo trong oáng nghieäm coù naép ñaäy. Neáu söû duïng caùc oáng nghieäm coù naép khoâng ñoùng chaëc ñöôïc thì phaûi khöû truøng oáng nghieäm, sau ñoù bôm dung dòch pha loaõng vaøo, caùc thao taùc naøy phaûi ñöôïc thöïc hieän moät caùch voâ truøng. Phaân phoái dung dòch pha loaõng vaøo caùc oáng sau khi khöû truøng coøn coù yù nghóa ñaûm baûo theå tích dung dòch pha loaûng khoâng bò maát do quaù trình khöû truøng. Caùc thao taùc pha loaõng tuyø thuoäc vaøo töøng loaïi maãu. Cuï theå nhö sau: - Neáu pha loaûng caùc maãu laø chaát loûng, tröôùc khi pha loaõng maãu phaûi ñöôïc laéc kyõ, caém ñaàu pippette saâu vaøo trong maãu khoaûng 1” huùt ra 1ml, cho vaøo trong oáng chöùa dung dòch pha loaõng ñaàu tieân, laéc kyõ oáng nghieäm chöùa maãu, boû pippette vöøa söû duïng, duøng moät pipptte môùi thöïc hieän laïi thao taùc nhö treân vôùi caùc ñoä pha loaõng tieáp theo. Cöù tieáp tuïc nhö vaäy cho ñeán khi ñaït ñöôïc ñoä pha loaõng mong muoán. Moãi ñoä pha loaõng chæ ñöôïc pheùp söû duïng 1 pippette. Haøm löôïng maãu trong 1ml dung dòch caùc ñoä pha loaõng cuûa daõy nhö sau: Oáng soá 1 2 3 4 Tæ leä pha loaõng 1/10 1/100 1/1000 1/10000 Theå tích maãu 0,1 0,01 0,001 0,0001 ban ñaàu (ml) Ñoä pha loaõng 10-1 10-2 10-3 10-4 - Ñoái vôùi caùc maãu raén hay baùn loûng, caùc thao taùc ñöôïc tieán haønh nhö sau: caân 10 g maãu vaøo trong caùc bao daäp maãu hay caùc maùy xay voâ truøng, theâm 90ml dung dòch pha loaõng vaø ñoàng nhaát maãu, phaûi ñaûm baûo sao cho vi khuaån phaân taùn ñeàu vaøo trong dung dòch. Sau khi maãu vaø dung dòch pha loaõng ñöôïc ñoàng nhaát ta ñöôïc dung dòch pha loaõng 1/10. Caùc ñoä pha loaõng sau ñöôïc tieán haønh töông töï nhö phaàn pha loaõng maãu loûng. Trong 1ml caùc dung dòch pha loaõng chöùa haøm löôïng maãu nhö sau: Oáng soá 1 2 3 4 Tæ leä pha loaõng 1/10 1/100 1/1000 1/10000 Khoái löôïng maãu 0,1 0,01 0,001 0,0001 ban ñaàu (g) Ñoä pha loaõng 10-1 10-2 10-3 10-4 Caùc oáng nghieäm chöùa caùc ñoä pha loaõng khaùc nhau phaûi ñöôïc ñaùnh daáu ñeå traùnh nhaàm laãn. Caáy maãu baèng phöông phaùp ñoå ñóa Caùc moâi tröôøng agar ñöôïc ñun chaûy trong caùc chai hay trong caùc oáng nghieäm coù theå tích phuø hôïp. Ñöôïc laøm maùt trong caùc beå ñieàu nhieät ôû 45oC. Huùt 1ml moãi dung dòch pha loaõng cho vaøo trong ñóa petri voâ truøng. Moãi ñoä pha loaõng thöôøng ñöôïc caáy vaøo hai ñóa petri hay nhieàu hôn. Cuõng söõ duïng caùc pippette saïch cho moãi ñoä pha loaõng. Chæ choïn caáy vaøo ñóa petri nhöõng ñoä pha loaõng coù maät ñoä vi sinh vaät phuø hôïp, thöôøng 12
14. trong khoaûng 25-300 teá baøo/ml. Ñoã vaøo moãi ñóa ñaõ caáy 10-15ml moâi tröôøng ñaõ ñöôïc ñun chaûy vaø laøm nguoäi, laéc ñóa theo chieàu vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà khoaûng 5-6 laàn, ñaëc ñóa leân maët phaúng ngang vaø ñôïi cho ñeán khi moâi tröôøng trong ñóa ñoâng ñaëc. Laät ngöôïc ñóa vaø uû trong ñieàu kieän nhieät ñoä vaø thôøi gian xaùc ñònh. Caáy maãu treân beà maët Ñaây laø phöông phaùp thay theá cho phöông phaùp ñoå ñóa ñeå phaân tích caùc chæ tieâu vi sinh trong thöïc phaåm, nhaát laø caùc chæ tieâu vi sinh vaät nhaïy caûm vôùi nhieät ñoä nhö Pseudomonas, caùc vi sinh vaät naøy seõ bò suy yeáu khi tieáp xuùc vôùi nhieät ñoä cuûa moâi tröôøng agar ôû traïng thaùi loûng. Phöông phaùp naøy cuõng ñöôïc duøng ñeå phaân tích caùc chæ tieâu maø caùc doøng nhaän ñöôïc phaûi caáy chuyeàn ôû caùc böôùc tieáp theo. Caáy 0,1ml hay theå tích phuø hôïp leân beà maët baèng pipettes hay baèng que caáy leân ñóa moâi tröôøng ñaõ ñöôïc laøm khoâ vaø traûi ñeàu baèng que caáy trang hay que caáy voøng ñeå traõi maãu treân khaép beà maët moâi tröôøng. Uû caùc ñóa ñaõ caáy ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø thôøi gian xaùc ñònh tuyø theo töøng chæ tieâu phaân tích, ñeám caùc khuaån laïc ñaëc tröng hay taát caû caùc khuaån laïc xuaát hieän treân ñóa. Khi ñeám caùc khuaån laïc, trong moät soá tröôøng hôïp xuaát hieän caùc khuaån laïc moïc lan, thoâng thöôøng caùc khuaån laïc khaùc cuõng ñöôïc nhìn thaáy beân trong caùc veát khuaån laïc loang. Khi ñeám ta chæ coi khuaån laïc loang laø moät ñôn vò hình thaønh khuaån laïc vaø ñeán caùc khuaån laïc khaùc trong khuaån laïc loang. Caùc khuaån laïc loang naøy laø do caùc vi khuaån taäp trung thaønh töøng taäp ñoaøn trong quaù trình phaùt trieån. Ñeám khuaån laïc trong tröôøng hôïp caáy trang hay ñoå ñóa Ñeám taát caû caùc khuaãn laïc ñôn leû treân caùc ñóa caáy ñaõ choïn, thoâng thöôøng choïn caùc ñóa coù soá löôïng khuaån laïc trong khoaûng 30 - 300 khuaån laïc. Thöôøng duøng caùc buùt coù theå vieát leân thuyû tinh ñeå ñaùnh daáu caùc khuaån laïc ñaõ ñeám phía sau ñóa petri. Coù theå duøng caùc thieát bò hoå trôï trong quaù trình ñeám soá löôïng khuaån laïc nhö maùy ñeám hay kính luùp. Tính toaùn soá ñôn vò hính thaønh khuaån laïc theo caùc coâng thöùc thoáng keâ döïa treân theå tích maãu caáy, soá löôïng khuaån laïc treân caùc ñóa, ñoä pha loaõng ñaõ caáy vaø soá löôïng ñóa cuûa moãi ñoä pha loaûng. Thoâng thöôøng soá ñôn vò hình thaønh khuaån laïc trong moät gram maàu hay 1ml ñöôïc tính toaùn ít nhaát töø hai noäng ñoä pha loaõng lieân tieáp cuûa maãu. Caùc töôøng trình keát quaû ñöôïc bieåu dieãn döôùi daïng soá ñôn vò hình thaønh khuaån laïc/g (ml) (cfu/g). Khoâng bieåu dieãn keát quaû döôùi daïng soá vi khuaån/g(ml). Phöông phaùp ñeåm khuaån laïc treân oáng Thay vì duøng ñóa petri, coù theå duøng oáng nghieäm coù ñöôøng kính lôùn hay caùc chai nhoû coù naép ñeå thay theá. Caáy maãu vaøo, cho moâi tröôøng vaøo, laéc theo chieàu ngang cho ñeán khi moâi tröôøng trong chai hay oáng ñoáng ñaëc. Phaân phoái 2-4 ml moâi tröôøng coù haøm löôïng agar cao hôn caùc moâi tröôøng duøng cho ñoå ñóa khoaûng 0,5-1% vaøo oáng nghieäm coù naép vôùi theå tích 25ml, moâi tröôøng ñaõ ñöôïc laøm nguoäi ñeán 45oC, caáy vaøo oáng nghieäm 0,1ml maãu ñaõ ñöôïc pha loaõng. Laéc caùc oáng theo chieàu ngang trong nöôùc laïnh cho ñeán khi agar ñoäng ñaëc taïo thaønh moät maøng film ñoàng nhaát treân thaønh oáng nghieäm. Vì theá kyõ thuaät naøy caàn coù nhöõng kyõ naêng kheùo leùo. Moät phöông phaùp khaùc coù theå ñöôïc duøng laø söû duïng moät maãu nöôùc ñaù, ñaët leân treân moät maûnh vaûi vaø laøm moät ñöôøng raûnh baèng vôùi oáng nghieäm baèng caùc xoay troøn oáng nghieäm ñaët ngang treân mieáng baêng. Caùc oáng nghieäm ñaõ caáy maãu vaø moâi tröôøng ñöôïc xoay treân maûnh cuûa mieáng baêng. Vôùi phöông phaùp naøy, caùc ngöôøi thöïc hieän coù theå tieát nhieän ñöôïc nhieàu thôùi gian vaø söùc lao ñoäng. Caùc oáng sau khi caáy maãu ñöôïc laät ngöôïc ñeå traùnh söï ngöng tuï hôùi nöôùc gaây neân veát loang sau khi uû. Ñeám caùc khuaån laïc xuaát hieän trong lôùp maøng fiml agar xung quanh oáng, caùc khuaån laïc naèng saâu beân trong coù theå ñöôïc quan saùt baèng kính luùp. 13
15. Phöông phaùp duøng kyõ thuaät oáng xoay ñöôïc söû duïng nhieàu trong vieäc phaân tích caùc maãu söõa vaø caùc saûn phaåm cuûa söõa, caùc loaïi maãu thöïc phaåm coâng nghieäp. Cho ñeán nay ñaõ coù nhöõng thieát bò thay theå cho vieäc xoay oáng, ñaûm baûo caùc maøng film treân thaønh oáng ñoàng nhaát vaø tieát kieäm ñöôïc thôøi gian cuõng nhö coâng lao ñoäng. Phöông phaùp caáy theo ñöôøng xoaén oác Phöông phaùp naøy döïa treân söï hoå trôï cuûa moät thieát bò xoay. Thieát bò naøy coù theå hoaät ñoäng hoaøn toaøn töï ñoäng vaø cuõng coù theå hoaït ñoäng khoâng töï ñoäng. Thieát bò naøy seõ phaân phoái moät löôïng maãu xaùc ñònh leân beà maët ñóa ñang xoay troøn. Ñieåm tieáp xuùc cuûa maãu vaø ñóa moâi tröôøng baét ñaàu töø trung taâm ñóa vaø di chuyeån daàn ra beân ngoaøi theo ñöôøng xoaén oác. Sau khi laøm khoâ beà maët moâi tröôøng, ñóa ñöôïc uû trong ñieàu kieän xaùc ñònh, vi khuaån seõ phaùt trieån theo ñöôøng xoaén oác. Caøng xa taâm cuûa ñóa, maät ñoä vi sinh vaät seû giaûm daàn vaø seõ xuaát hieän caùc khuaån laïc rieâng bieät. Caên cöù vaøo toác ñoä xoay cuûa thieát bò, theå tích maãu phaân phoái vaø kích thöôùc cuûa ñóa, maät ñoä khuaån laïc xuaát hieän ôû voøng xoaén cuoái cuøng seõ tính ñöôïc maät ñoä vi sinh vaät trong maãu. Keát quaû toång soá ñôn vò hình thaønh khuaån laïc ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp naøy ñöôïc cho laø töông ñöông vôùi phöông phaùp ñoå ñóa hay caáy traûi treân beå maët. Caùc heä thoáng töï ñoäng ñöôïc thieát keá döïa treân nguyeân taéc caáy xoay ñöôïc thieát keá vôùi söï hoã trôï cuûa caùc maùy ñeám khuaån laïc baén tia laser ñaõ ñöôïc baùn ngoaøi thò tröôøng raát thuaän tieän cho vieäc phaân tích toång soá vi sinh vaät vaø cho keát quaû chính xaùc trong thôùi gian nuoâi caáy ngaén. Phöông phaùp ñeám khuaån laïc treân maøng loïc Phöông phaùp naøy thöôøng ñöôïc aùp duïng cho caùc maãu loûng nhö nöôùc, söõa vaø ñöôïc ñaùnh giaù laø cho keát quaû chính xaùc hôn so vôùi phöông phaùp öùôc ñoaùn MPN. Caùc maãu chaát loûng ñöôïc loïc qua maøng loïc coù kích thöôùc loå loïc nhoû hôn kích thöôùc cuûa vi sinh vaät. Vi sinh vaät ñöôïc giöõa laïi treân maøng loïc. Maøng ñöôïc ñaët treân moâi tröôøng agar hay treân giaáy thaám ñöôïc ngaám suûn moâi tröôøng nuoâi caáy loûng ñaõ choïn vaø uû trong ñieàu kieän xaùc ñònh. Sau khi uû, ñeám caùc khuaån laïc seõ xuaát hieän treân beà maët maøng loïc. Thieát bi loïc coù theå baèng thuûy tinh, baèng kim loaïi hay baèng nhöïa, bao goàm pheãu loïc giaù ñôû maøng loïc, boä thieát bò hoå trôï huùt chaân khoâng vaø bình chöùa. Maøng loïc ñöôïc laøm baèng cellulose ester coù loã loïc maèm trong khoaûng 0,1-1 μm, caùc loaïi maøng loïc duøng cho vieäc phaân tích toång soá vi sinh vaät thöôøng coù kích thöôùc loå loïc laø 0,47μm, ñöôøng kính maøng loïc coù nhieàu kích côû khaùc nhau phuø hôïp vôùi ñöôøng kính cuûa pheãu loïc, beà daøy cuûa maøng khoaûng 120μm. Khi loïc taát caû caùc vi khuaån ñeàu ñöôïc giöõ laïi treân maøng. Khi ñaëc maøng loïc sao cho beà treân cuûa maøng höôùng leân phía treân, vi khuaån khoâng tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi moâi tröôøng nhöng, caùc thaønh phaàn cuûa moâi tröôøng deã daøng thaám qua maøng vaø nuoâi vi khuaån phaùt trieån thaønh khuaån laïc. Moät soá loaïi maøng loïc coù gaén caùc löôùi kî nöôùc chæ cho pheùp khuaån laïc phaùt trieån trong moãi oâ cuûa löôùi vaø khoâng cho lan sang caùc oâ khaùc nhaèm taïo ñieàu kieän thuaän tieän khi ñeám. 1.2 Phöông phaùp öôùc ñoaùn soá löôïng vi sinh baèng kyõ thuaät MPN (Most Probable Number): Phöông phaùp MPN laø phöông phaùp coù theå thay theá phöông phaùp ñeám khuaån laïc ñeå xaùc ñònh maät ñoä vi sinh vaät trong maãu, phöông phaùp naøy ñöôïc döïa treân nguyeân taéc xaùc suaát thoáng keâ söï phaân phaân boá vi sinh vaät trong caùc ñoä pha loaõng khaùc nhau cuûa maãu. Moãi ñoä pha loaõng ñöôïc nuoâi caáy laëp laïi nhieàu laàn trong caùc moâi tröôøng loûng ñaõ ñöôïc choïn, thoâng thöôøng phaûi caáy laëp laïi töø 3-10 laàn taïi moãi noàng ñoä pha loaõng. Caùc ñoä pha loaûng ñöôïc tieán haønh sao cho trong caùc laàn laëp laïi coù moät soá laàn cho daàu hieäu döông tính vaø moät soá laàn cho daáu hieäu aâm tính. Soá laàn laëp laïi cho daáu hieäu döông tính vaø aâm tính ñöôïc ghi nhaän ñeå ñoái chieáu vôùi baûng thoáng keâ seõ ñöôïc giaù trò öôùc ñoaùn soá löôïng vi sinh vaät trong maãu. Qui trình MPN cho giaù trò soá löôïng vi sinh vaät trong maãu coù yù nghóa thoáng keâ theo xaùc suaát phaân boá vi sinh vaät trong maãu khi söû duïng moät soá 14
16. laàn laëp laïi, vì theá khoaûng tin caäy laø raát lôùn. Phöông phaùp MPN ñeå ñònh löôïng vi sinh vaät cho ñeán nay ñaõ coù nhieàu caûi tieán cho pheùp tieán haønh qui trình deã daøng vaø toán ít söùc lao ñoäng hôn vaø cho giaù trò chính xaùc cao hôn. Choïn noàng ñoä pha loaõng sao cho trong caùc laàn laëp laïi coù moät soá laàn cho keát quaû döông tính vaø moät soá laàn cho keát quaû aâm tính , söï löïa choïn naøy raát quan troïng. Trong nhieàu tröôøng hôïp qui trình MPN ñöôïc thieát laäp sao cho gia taêng soá löôïng laàn laëp cho keát quaû döông tính baèng tín hieäu phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Trong moät soá tröôøng hôïp khaùc, qui trình ñöôïc thieát laäp coù nhieàu thöû nghieäm khaúng ñònh sau khi caùc laàn laëp laïi ôû caùc ñoä pha loaõng cho tín hieäu phaùt trieån cuûa vi sinh vaät nhö phaùt hieän protein hay moät emzym naøo ñoù. Caùc thöû nghieäm sau naøy cho keát quaû döông tính thì caùc laàn laëp laïi ban ñaàu môùi ñöôïc khaúng ñònh laø döông tính. Cuõng gioáng nhö qui trình ñeám khuaån laïc, qui trình MPN cuõng ñöôïc söû duïng caùc moâi tröôøng choïn loïc, khoâng choïn loïc hay moâi tröôøng phaân bieät. Phöông phaùp MPN cuõng ñöôïc duøng ñeå ñònh löôïng virus ñöôøng ruoät. Trong phöông phaùp naøy, moät chuoãi pha loaõng cuûa maãu caàn kieåm tra ñöôïc cho vaøo trong caùc oáng nghieäm chöùa teá baøo chuû thích hôïp ñöôïc nuoâi caáy. Sau khi uû, caùc oáng nghieäm ñöôïc kieåm tra hieäu öùng cytopathic (CPE), ñoù laø caùc bieåu hieän laøm cheát teá baøo bò xaâm nhieãm. Soá löôïng virus trong maãu cuõng nhaän ñöôïc töø baûng MPN baèng söï tham chieáu soá löôïng caùc oâng nuoâi caáy cho hieäu öùng CPE döông tính. Soá löôïng cuûa virus cuõng coù theå ñöôïc ñònh löôïng baèng chæ soá TCID 50 (Tissue culture infectious dose 50%). Noàng ñoä pha loaõng thaáp nhaát coù söï hieän dieän cuûa virus ñoù laø noäng ñoä coù tæ soá CPE laø 50% trong caùc oáng nghieäm. Cuõng gioáng nhö qui trình ñeám ñóa, trong phöông phaùp MPN, moâi tröôøng vaø noàng ñoä nuoâi caáy cuõng ñöôïc ñieàu chænh ñeå choïn loïc cho moät nhoùm vi sinh vaät hay phaân bieät caùc nhoùm vi sinh vaät naøy vôùi caùc nhoùm vi sinh vaät khaùc vôùi caùc ñaëc ñieåm mong muoán, roû raøng raèng söï keát hôïp giöõa ñieàu kieän nuoâi caáy vaø moâi tröôøng cuõng coù theå ñònh löôïng nhöõng nhoùm vi sinh vaät ñaëc bieät naøo ñoù theo ñònh nghóa cuï theå. Moãi qui trình phaûi ñöôïc choïn loïc moät caùch cuï theå vaø caån thaän ñeå coù theå thu ñöôïc keát quaû moät caùch chính xaùc. Theo quan ñieåm cuûa C.H. Collins vaø Patricia M. Lyne thöïc chaát con soá MPN bieåu dieån soá löôïng vi sinh vaät trong maãu laø soá löôïng trung bình sau caùc laàn laëp laïi. Neáu soá löôïng vi sinh vaät trong maãu lôùn thì söï khaùc bieät cuûa caùc maãu giöõa caùc laàn laëp laïi laø nhoû, keát quaû rieâng leû cuûa taát caû caùc laàn laëp gaàn vôùi keát quaû trung bình. Neàu soá löôïng vi sinh vaät trong maãu nhoû, söï khaùc bieät naøy seõ lôùn. Neàu trong moät maãu chaát loûng chöùa 100 vi sinh vaät/100 ml, thì trong 10 ml maãu seõ chöùa trung bình 10 teá baøo. Dó nhieân coù moät soá phaàn maãu nhieàu hôn 10 teá baøo, thaäm chí coù nhöõng phaàn maãu coù theå chöùa 20 teá baøo trong 10ml maãu vaø moät soá phaàn maãu chöùa ít hôn. Neáu taát caû caùc phaàn maãu treân ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng vaø ñieàu kieän thích hôïp, caùc vi sinh vaät trong maãu seõ phaùt trieån vaø cho tín hieäu döông tính. Töông töï nhö vaäy, 1ml seõ chöùa trung bình 1 teá baøo vi sinh vaät, nhö vaäy coù nhöõng laàn laáy seõ coù 2 hay 3 teá baøo vaø coù nhöõng laàn laáy seõ khoâng coù teá baøo naøo. Neáu caùc laàn huùt naøy ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng vaø ñieàu kieän thích hôïp seõ thu ñöôïc nhöõng oáng nghieäm cho keát quaû döông tính vaø nhöõng oáng cho keát quaû aâm tính. Neáu huùt 0,1ml thì sau 10 laàn huùt môùi coù khaû naêng nhaän ñöôïc 1 laàn huùt coù 1 teá baøo, nhö vaäy haàu heát caùc laàn nuoâi caáy khi laáy 0,1ml thì ñeàu cho keát quaû aâm tính. Coù theå tính toaùn con soá chaéc chaén soá löôïng vi sinh vaät trong trong 100ml maãu baèng söï keát hôïp caùc keát quaû nhaän ñöôïc töø caùc chuoåi caáy nhö treân. Baûng giaù trò MPN khi söû duïng heä thoáng caáy vôùi caùc daõy 5 oáng 10ml, 5 oáng 1ml vaø 5 oáng 0.1ml ñaõ ñöôïc tính saün vaø duøng cho phaân tích caùc maãu nöôùc hay caùc maãu ñaõ pha loaõng. Cho ñeán nay coù raát nhieàu baûng giaù trò MPN ñöôïc 15
17. söû duïng vôùi ñoä chính xaùc vaø caùc khoaûng tin caäy khaùc nhau vaø ñöôïc söû duïng cho caùc muïc ñích khaùc nhau. Phöông phaùp MPN ñöôïc duøng chuû yeáu ñeå phaân tích Coliforms vaø caùc vi sinh vaät khaùc khi chuùng phaùt trieån trong moâi tröôøng nuoâi caáy loûng cho caùc tín hieäu deã daøng nhaän daïng nhö sinh hôi, laøm ñuïc moâi tröôøng choïn loïc, thay ñoåi pH moâi tröôøng Ví duï naám men vaø naám moác trong nöôùc traùi caây hay rau quaû, vi sinh vaät kî khí hay caùc baøo töû Clostridia. 1.3 Phöông phaùp lai khuaån laïc Lai khuaån laïc laø phöông phaùp keát hôïp giöõa phöông phaùp lai phaân töû vaø phöông phaùp nuoâi caáy truyeàn thoáng trong vieäc phaân tích caùc chæ tieâu vi sinh vaät trong caùc maãu. Sau thôøi gian nuoâi caáy treân beà maët moâi tröôøng thaïch, caùc khuaån laïc vi khuaån ñöôïc chuyeån leân maøng lai, caùc khuaån laïc naøy ñöôïc ly giaûi trong moâi tröôøng kieàm hay xöû lyù baèng emzym, sau ñoù tieán haønh lai phaân töû. Phöông phaùp naøy phuï thuoäc vaøo khaû naêng phaùt trieån cuûa vi sinh vaät muïc tieâu treân moâi tröôøng, chuùng khoâng phuï thuoäc söï phaùt trieån caùc caùc quaàn theå vi sinh vaät khaùc. Söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät muïc tieâu trong moâi tröôøng laøm gia taêng soá löôïng baûn sao cuûa caùc gen muïc tieâu, vì theá chuùng seõ gia taêng khaû naêng phaùt hieän cuûa caùc maãu doø. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp naøy ñöôïc phaùt trieån ñaàu tieân bôûi M. Grunstein vaø S.D. Hogness (1975) nhaèm muïc ñích saøng loïc treân ñóa coù maät ñoä cao cho caùc doøng nuoâi caáy thuaàn. Trong qui trình nuoâi caáy khuaån laïc vi khuaån phaùt trieån treân moâi tröôøng raén ñöôïc chuyeån leân moät giaù ñôû phuø hôïp nhö maøng nitrocellulose, ly giaûi ñeå taùch DNA vaø bieán tính chuùng sau ñoù coá ñònh chuùng treân maøng. Maøng loïc coá ñònh DNA ñöôïc uû vôùi maãu doø. Maãu doø ñöôïc taùch ra töø moät ñoaïn thoâng tin di truyeàn. Vaø ñöôïc ñaùnh daáu baèng caùc caùc ñoáng vò phoùng xaï nhö 32P hay caùc chaát phaùt quang khaùc nhö biotin. Hieän töôïng lai ñöôïc din ra neáu caùc trình töï base cuûa caùc teá baøo ñöôïc ly giaûi töông ñoàng vôùi caùc trình töï treân maãu doø ñeå hình thaønh caùc ñoaïn lai maïch ñoâi. Caùc ñoaïn lai naøy ñöôïc phaùt hieän baèng baèng caùc film phoùng xaï töï ghi khi caùc maãu doø ñöôïc ñaùnh daàu baèng caùc ñoàng vò phoùng xaï, hay caùc film nhaïy saùng khi caùc maãu doø ñöôïc ñaùnh daáu baèng biotin. Baèng phöông phaùp naøy, caùc ñaëc ñieåm di truyeàn ñaëc tröng ñöôïc phaùt hieän moät caùch chuyeân bieät. Neáu choïn maãu doø ñaëc tröng cho moät nhoùm vi sinh vaät, phöông phaùp naøy coù theå phaùt hieän vaø ñònh löôïng nhoùm vi sinh vaät ñoù trong maãu. Maãu doø ñöôïc lai vôùi caùc vi sinh vaät coù nguoàn goác töø maãu, hay caùc doøng thuaàn ñöôïc phaân laäp vaø nuoâi caáy thöù caáp. Baèng phöông phaùp naøy coù theå caûi thieän ñöôïc caùc baát tieän trong quaù trình phaân tích baèng phöông phaùp nuoâi caáy thuaàn tuyù nhö: - Traùnh ñöôïc nhöõng sai leäch trong quaù trình ñeám khuaån laïc treân moâi tröôøng nuoâi caáy choïn loïc. - Chaéc chaén phaùt hieän ñöôïc caùc doøng mang kieåu gen muïc tieâu caàn phaùt hieän duø caùc gen ñoù khoâng hay bieåu hieän raát keùm trong moät soá ñieàu kieän nuoâi caáy. - Coù theå phaân tích ñöôïc caùc vi sinh vaät bò tress hay khoâng theå nuoâi caáy ñöôïc treân caùc moâi tröôøng choïn loïc baèng caùch thay theá baèng moâi tröôøng khoâng choïn loïc hay moâi tröôøng dinh döôõng toái ña. - Giaûm ñöôïc thôøi gian phaân tích baèng caùch giaûm thôøi gian nuoâi caáy, quaù trình ñònh löôïng giaû ñònh vaø thôøi gian khaèng ñònh kieåu gen hay kieåu hình. Phöông phaùp lai khuaån laïc cuõng ñöôïc söû duïng ñeå khaúng ñònh caùc doøng vi sinh vaät nghi ngôø ñaõ ñöôïc laøm thuaàn. Öùùng duïng chuû yeâu cuûa phöông phaùp lai khuaån laïc laø phaùt hieän, ñònh löôïng vaø phaân laäp caùc vi sinh vaät coù kieåu hình vaø kieåu gen ñaëc tröng. Vaø ñöôïc söû duïng ñaëc bieät trong vieäc kieåm soaùt söï hieän dieän vaø hoaït ñoäng cuûa caùc doøng vi sinh vaät trong moâi tröôøng. Nghieân cöùu söï phaân 16
18. boá caùc vi sinh vaät khaùng khaùng sinh, khaùng kim loaïi naëng trong nöôùc trong caùc maãu moâi tröôøng vaø trong thöïc phaåm. 17
19. Chöông 3 CAÙC PHAÛN ÖÙNG SINH HOAÙ TRONG XAÙC ÑÒNH VI DINH VAÄT Ñeå xaùc ñònh vi sinh vaät döïa treân nhöõng ñaëc ñieåm veà kieåu hình thì nhöõng vi sinh caàn phaùt hieän trong maãu phaûi coù caùc ñaëc ñieåm ñeå nhaän ra chuùng vaø coù caùc bieåu hieän khaùc bieät veà kieåu hình trong suoát thôøi gian nuoâi caáy In vitro (Atlas 1991). Trong moät soá tröôøng hôïp, quan saùt moät ñaëc ñieåm rieâng bieät coù theå ñuû ñeå nhaän ra moät soá vi sinh vaät muïc tieâu. Trong nhöõng tröôøng hôïp khaùc, caàn thieát phaûi xaùc ñònh laàn löôïc nhieàu ñaëc ñieåm khaùc bieät nhau ñeå phaân bieät caùc vi sinh vaät muïc tieâu vôùi caùc vi sinh vaät khaùc. Vieäc xaùc ñònh roõ raøng moät vi sinh vaät treân cô sôû kieåu hình laø coâng vieäc khoù khaên bôûi vì ngay caû nhöõng vi sinh vaät coù moái quan heä hoï haøng xa cuõng coù theå coù kieåu hình töông töï ôû moät soá ñaëc ñieåm. Phöông phaùp coå ñieån ñeå xaùc ñònh vi sinh vaät laø caáy chuùng leân moâi tröôøng raén (qui trình caáy ñóa) hay trong moâi tröôøng canh (qui trình taêng sinh) chöùa taát caû caùc chaát dinh döôõng caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät muïc tieâu, uû moâi tröôøng ñaõ nuoâi caáy trong ñieàu kieän thích hôïp cho söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñoàng thôøi chuùng bieåu hieän kieåu hình coù theå nhaän ra. Quaù trình caáy leân ñóa nhaèm taùch bieät caùc teá baøo caùc vi sinh vaät ñeå cho chuùng rôøi nhau ôû nhöõng vò trí ñoäc laäp treân moâi tröôøng raén, khi teá baøo vi sinh vaät ôû nhöõng vò trí rieâng reû sinh saûn, chuùng hình thaønh nhöõng khuaån laïc rieâng bieät bao goàm nhöõng teá baøo coù nguoàn goác töø moät teá baøo khôûi ñaàu. Qui trình caáy ñóa bao goàm hai giai ñoaïn: 1. Phaân laäp caùc vi sinh vaät töø taäp hôïp caùc vi sinh vaät trong quaàn theå töï nhieân sao cho kieåu hình cuûa moãi vi sinh vaät ñöôïc xaùc ñònh treân cô sôû cuûa phöong phaùp nuoâi caáy thuaàn khieát cuûa vi sinh vaäy hoïc, 2. Chuùng phaùt trieån vaø theå hieän nhöõng daáu hieäu (kieåu hình) ñeå coù theå nhaän ra thoâng qua söï sinh saûn cuûa teá baøo. Ñaëc ñieåm kieåu hình cuûa haøng trieäu teá baøo ñöôïc cho laø gioáng nhau trong moät khuaån laïc coù theå ñöôïc quan saùt deå daøng hôn nhieàu so vôùi caùc vi sinh vaät rieâng leû. Phöông phaùp ñeám ñóa coù hieäu quaû trong vieäc xaùc ñònh moät vi sinh vaät cuï theå khi nhöõng vi sinh vaät muïc tieâu ñoù hieän dieän moät soá lôùn trong taäp hôïp vi sinh vaät, söï hieän dieän vôùi soá löôïng thaáp coù theå khoâng ñöôïc phaùt hieän trong phöông phaùp naøy. Trong tröôøng hôïp moät loaøi vi sinh vaät chæ chieám moät soá löôïng nhoû trong taäp hôïp ñoù, thì coù theå duøng moâi tröôøng nuoâi caáy loûng trong ñieàu kieän thích hôïp ñaët hieäu cho söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät ñoù ñeå taêng sinh chuùng. Vôùi söï ñieàu chænh caùc thaønh phaàn hoùa hoïc trong moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy, qui trình caáy ñóa vaø taêng sinh ñöôïc aùp duïng ñeå phaân bieät hay choïn loïc ñeå phaùt hieän caùc vi sinh vaät muïc tieâu. Khaû naêng phaùt trieån cuûa moät vi sinh vaät treân moät moâi tröôøng cuï theå döïa vaøo khaû naêng söû duïng caùc thaønh phaàn dinh döôõng höõu cô hay voâ cô ñaëc hieäu trong moâi tröôøng ñoù. Moâi tröôøng nuoâi caáy coù tính choïn loïc laø do caùc thaønh phaàn caáu thaønh neân chuùng (nhö laø ngöôøn carbon cuï theå, noàng ñoä muoái vaø caùc phaàn khaùc). Ñieàu kieän nuoâi caáy cuõng coù theå gaây choïn loïc bôûi söï ñieàu chænh ñieàu kieän sinh lyù taêng tröôûng (nhö nhieät ñoä, noàng ñoä oxygen ). Boå sung theâm caùc hôïp chaát gaây öùc cheá vaøo moâi tröôøng ñeå haïn cheá söï phaùt trieån cuûa moät soá lôùn caùc vi sinh vaät vaø kích thích söï phaùt trieån caùc loaøi khaùc mong muoán. Vì ñaëc ñieåm kieåu hình cuûa vi sinh vaät phuï thuoäc vaøo ñaëc ñieåm trao ñoåi chaát ñaëc hieäu vôùi thaønh phaàn dinh döôõng coù maët trong moâi tröôøng, thuoác nhuoäm, taùc nhaân oxy hoùa vaø nhieàu thaønh phaàn khaùc coù maët trong moâi tröôøng ñeå phaûn aùnh söï trao ñoåi chaát caùc chaát dinh döôõng ñaëc hieäu bôûi caùc quaàn theå khaùc nhau vaø töø ñoù ñöa ñeán söï bieåu hieän khaùc nhau giöõa caùc vi sinh vaät muïc tieâu. Phöông phaùp phaùt hieän vi sinh vaät baèng caùc duøng moâi tröôøng nuoâi caáy thöôøng theo moät qui trình coù heä thoáng nhaèm vaøo söï tieän lôïi cuûa nhöõng ñaëc ñieåm ñaëc hieäu cuûa vi sinh vaät nhö laø khaû naêng söû duïng dinh döôõng, tính khaùng vôùi caùc loaïi khaùng sinh, töø ñoù vi sinh vaät muïc tieâu coù 18
20. öu theá phaùt trieån hôn so vôùi caùc loaøi khaùc. Toùm laïi, ñaëc ñieåm coù theå nhaän thaáy (nhu laø saéc toá), khaû naêng söû duïng moät cô chaát ñaëc hieäu hay tính khaùng laïi caùc khaùng sinh hay kim loaïi naëng ñöôïc duøng ñeå phaân bieät caùc vi sinh vaät muïc tieâu töø taäp hôïp caùc vi sinh vaät. Trong kieåm nghieäm vi sinh vaät, caùc thöû nghieäm sau daây thöông xuyeân ñöôïc söû duïng: 1. Thöû nghieäm Bile esculin Nguyeân taéc: Nhaèm xaùc ñònh khaû naêng cuûa moät vi sinh vaät coù theå thuûy giaûi glucoside esculin thaønh escuiletin vaø glucose khi coù söï hieän dieän cuûa muoái maät. Cô sôû sinh hoaù: Esculin laø moät glucoside, ñaây chính laø daãn xuaát acetal cuûa moät monosaccharide. Khi moät goác khoâng phaûi laø moät hydratcarbon lieân keát vôùi moät ñöôøng taïo thaønh moït hôïp chaát goïi laø moät glycoside, phaàn khoâng phaûi ñöôøng ñöôïc goïi laø aglucon. Aglucon lieân keát vôùi ñöôøng qua nguyeân toá oxy (lieân keát glucoside). HO CH2OH CH2OH HO H OH H H OH H H HO HO+ H OH H H OH OH H H OH Esculine (C15H16O9) Esculetin (aglycone) β-D-glucose 6,β-Glucosido-7-hydroxycoumarin 6,7-dihydroxycoumarin Trong phaûn öùng naøy esculin bò thuûy giaûi taïi lieân keát ß vôùi goác acetal bò thuyû giaûi bôûi acid taïo thaønh esculetin vaø giaûi phoøng phaân töû glucose töï do. Esculetin ñöôïc phoùng thích phaûn öùng vôùi muoái saét taïo thaønh phöôùc hôïp maøu ñen hay maøu naâu ñen. Trong thöû nghieäm naøy muoái nitrat saét ñöôïc söû duïng trong moâi nhö laø cô chaát nhaän daïng esculetin ñöôïc hình thaønh. Sau khi caáy moâi tröôøng ñöôïc uû qua ñeâm, caùc vi sinh vaät cho phaûn öùng döông tính laø nhöõng vi sinh vaät phaân huyû ñöôïc esculin, chuyeån moâi tröôøng thaønh maøu ñen hay maøu naâm ñen. Caùc chuûng vi sinh vaät ñoái chöùng cho caùc thöû nghieäm naøy nhö sau: Ñoái chöùng döông: S. marcessens; ñoái chöùng aâm: E. tarda. 2. Thöû nghieäm khaû naêng leân men caùc nguoàn Carbonhydrate Nguyeân taéc: Nhaèm thöû nghieäm khaû naêng leân men moät nguoàn carbohydrate xaùc ñònh naøo ñoù trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå taïo acid vaø coù theå taïo hôi. Cô cheá sinh hoùa: Carbonhydrate ñöôïc chia thaønh caùc nhoùm nhö sau 1. monosaccharide, polyhydroxylic aldehyde hay ketone, 2. polysaccharide hay oligosaccharide, 3. polyhydric alcohol vaø caùc cyclitol, caùc saûn phaåm khöû cuûa monosacchride. Moät soá alcohol ñöôïc goïi laø ñöôøng nhö adonitol, mannitol, sorbitol, taát caû caùc saûn phaåm naøy laø keát quaû cuûa quaù trình khöû caùc monosaccharide. Caùc polysachcaride, trisaccharide vaø disaccharide laø nhöõng hôïp chaát phöôùc taïp, vi sinh vaät khoâng theå haáp thu moät caùch deã daøng cho quaù trình chuyeån hoaù. Ñeå chuùng coù theå söû duïng ñöôïc caùc carbonhydrate naøy, vi sinh vaät phaûi tôûng hôïp vaø tieát ra ngoaøi caùc emzym ngoaïi naøo nhaèm phaân huyû caùc caùc phaân töû naøy thaønh caùc phaân töû ñôn giaûn hôn, sau ñoù thaám qua thaønh teá baøo ñeå chuîeån hoaù beân trong. 19
21. Leân men laø moät quaù trình trao ñoåi chaát oxy hoaù khöû maø chaát nhaän ñieän töû cuoái cuøng khoâng phaûi laø oxy maø laø cô chaát höõu cô khaùc. Söï leân men cuûa caùc cô chaát höõu cô nhö carbohydrate thu ñuôïc hai saûn phaåm laø chaát khöû vaø chaát oxy hoaù. Caùc saûn phaåm cuoái cuøng nhaän ñöôïc töø söï leân men caùc cô chaát hydrate carbon naøy phuï dthuoäc vaøo caùc nhaân toá nhö: (1) doøng vi sinh vaät leân men; (2) cô chaát töï nhieân duøng ñeå leân men; (3) thôøi gian, nhieät ñoä vaø pH cuûa moâi tröôøng. Caùc saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình leân men caùc nguoàn hydrate carbon vaø caùc alcohol thöôøng laø caùc daïng khí (H2, CO2), caùc acid höõu cô, caùc alcohol vaø moät vaøi keton Ñoái vôùi nguoàn carbon laø glucose, moät soá vi sinh vaät coù theå leân men nguoàn cô chaát naøy trong ñieàu kieän kî khí, ngöôïc laïi, trong ñieàu kieän hieáu khí chuùng chuyeån hoaù theo con ñöôøng oxy hoaù. Moät soá doøng vi sinh vaät khaùc coù theå chuyeån hoaù cô chaát naøy baèng caû hai caùch. Söï khaùc bieät veà caùc con ñöôøng chuyeån hoaù caùc nguoàn cô chaát höûu cô phuï thuoäc vaøo nhoùm vi sinh vaät, gioáng hay loaøi, vì theá caên cöù vaøo caùc con ñöôøng khaùc bieät naøy cuõng coù theå phaân bieät ñöôïc caùc loaøi vôùi nhau. Caùc thöû nghieäm khaû naêng chuyeån hoaù caùc nguoàn hydrate carbon ñöôïc tieán haønh treân caùc moâi tröôøng loûng hay raén. Trong moâi tröôøng chöùa moät hay moät vaøi nguoàn hydratecarbon caàn tieán haønh thöû nghieäm vaø moät chaát chæ thò, thoâng thöôøng söû duïng chaát chæ thò pH ñeå phaùt hieän caùc saûn phaåm acid ñöôïc taïo ra trong quaù trình chuyeån hoaù. Ñeå phaùt hieän caùc chaát khí ñöôïc taïo ra, moät oáng nghieän coù kích thöôùc nhoû laät ngöôïc ñöôïc cho vaøo trong caùc moâi tröôøng loûng, caùc oáng naøy seõ giöõ caùc saûn phaåm khí taïo ra trong quaù trình nuoâi caáy. Trong caùc moâi tröôøng raén, phaùt hieän caùc saûn phaåm khí taïo ra baèng caùch caáy saâu vaøo trong phaàn thaïch ñöùng. Caùc saûn phaåm khí taïo ra seõ phaù vôû phaàn thaïch naøy. Thoâng thöôøng phaùt hieän söï taïo thaønh caùc saûn phaåm khí ñöôïc tieán haønh trong caùc phaûn öùng leân men caùc nguoàn mono hay disaccharide vaø ñöôïc thöïc hieän trong moâi tröôøng nuoâi caáy loûng. Ñeå gaây kî khí trong quaù trình nuoâi caáy thöû nghieäm caùc chaát khöû thöôøng ñöôïc theâm vaøo trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Moät löôïng nhoû muoái saét cuõng coù theå gaây neân moâi tröôøng kò khí. Caùc thöû nghieäm khaû naêng söû duïng caùc nguoàn Carbonhydrate ñöôïc tieán haønh treân moâi tröôøng raén phaûi theâm vaøo caùc chaát chæ thò pH, khi caùc vi sinh vaät phaùt trieån treân beà maët hay, caùc saûn phaåm acid ñöôïc taïo thaønh laøm thay ñoåi maøu caùc chaát chæ thò xung quanh khuaån laïc. 20
22. Carbonhydrate Disaccharide, trisaccharide, polysaccharide C6H12O6 Glucose CH3COCOOH Acid pyruvic CH3CHOHCOOH Acid lactic CH COOH + HOOCH CH COOH 3 HCOOH 2 2 Acid acetic Acid succinic Acid formic H + CO CH3CH2COOH + CO2 2 2 Acid propyonic CH3CHO + CO2 Acetaldehyde CH3COCHOHCH3 + CO2 CH3CH2OH Acetylmethylcarbinol Ethyl alchol CH CHOHCHOHCH 3 3 2,3-Butylence glycol CH3COOH Acid acetic CH COCH COOH 3 2 Acetoacetic acid CH CH CH COOH CH COCH 3 2 2 3 3 Butyric acid CO2 + acetone CH3CHOHCH2COOH β-hydroxybutyric acid CH3CHOHCH3 CH3CH2CH2COOH Isopropyl alcohol Butyl alcohol Caùc saûn phaåm taïo thaønh trong quaù trình chuyeån hoaù caùc carbonhydrate) 3. Thöû nghieäm catalase 21
23. Nguyeân taéc: thöû nghieäm nhaèm phaùt hieän söï hieän dieän cuûa enzym catalase ôû vi sinh vaät. Cô sôû sinh hoaù: Enzym catalase hieän dieän trong haàu heát caùc vi sinh vaät hieáu khí vaø kî khí coù heä thoáng cytochrom. Thoâng thöôøng nhöõng vi sinh vaät khoâng coù heä thoáng cytochrom thì cuõng khoâng coù enzym catelase, vì theá chuùng khoâng coù khaû naêng phaân huyû hydropeoxide. Nhöõng vi sinh vaät kyõ khí baét buoäc nhö Clostridium coù heä thoáng peroxydase thay cho enzym catalase. Tuy theá enzym catalase hoaït ñoäntg khoâng chuyeân bieät vaø chuùng coù theå can thieäp vaøo hoaït ñoäng cuûa enzym peroxydase. Caû hai enzym catalase vaø oxydase ñöôïc chia vaøo nhoùm enzym hydroperoxydase, ñaây laø hai nhoùpm enzym thöôùng ñöôïc tìm thaáy trong thöïc vaät (peroxydase) vaø trong ñoäng vaät (catalase). Catalase laø moät homoprotein bao goàm boán caáu töû protein vaø moät nhaân Fe3+. Nhöng theo Burrow vaø Moulder coù nhöõng baèng chöùng cho raèng moät soá vi khuaån coù nhöõng emzym catalase khoâng chöùa nhaân Fe3+, caùc nghieân cöùu cuûa Dacre vaø Sharpe cho thaáy hoaït tính catalase coù hai daïng maïnh vaø yeáu trong lactobacillus, caùc nghieân cöùu cuûa Whittenbury cho thaáy caùo hai daïng catalase trong vi khuaån lactic: nhoùm catalase phaân huyû hydroperoxyde, nhoùm naøy khoâng nhaïy vôùi ñieàu kieän moâi tröôøng acid; vaø nhoùm giaû catalase, nhoùm naøy bi maát hoaït tính trong moâi tröôøng acide. Moät soá nghieân cöùu khaùc cuõng chöùng minh raèng coù hai kieåu catalase. Catalase xuùc taùc phaûn öùng phaân huyû hôïp chaát hydroperoxide, trong phaûn öùng naøy moät phaân töû hydroperoxide ñoùng vao troø laø moät chaát cho ñieän töû vaø moät phaân töû ydroperoxide khaùc ñoùng vai troø laø moät chaát nhaän ñieän töû. Cô chaát bò khöû bôûi nhaân hydrogen cung caáp töø phaân töû cho ñieän töû, quaù trình dieãn ra giaûi phoùng oxy phaân töû. Cô cheá phaûn öùng nhö sau: Catalase H2O2 + H H2O + O2 H Cô chaát bò Chaát cho bò Cô chaát Chaát cho khöû oxy hoaù Cô cheá phaûn öùng phaân huyû hydropeoxyde bôûi catalase Phöông phaùp tieán haønh thöû nghieäm Caùch 1: Cho hoãn hôïp nuoâi caáy vi sinh vaät vaøo 0,5ml dung dòch Tween 80, taát caû cho vaøo trong oáng nghieäm coù naép ñaäy. Theâm vaøo 0,5ml dung dòch hydroperoxyde 20% vaøo, laéc vaø quan saùt. Neàu coù hieän töôïng suûi boït khí laø coù söï hieän dieän cuûa catalase. Caùch 2: Nhoû hoãn hôïp coù tæ leä 1:1 hydroperoxyde vaø Tween 80 leân caùc khuaån laïc vi sinh vaät phaùt trieån treân moâi tröôøng agar. Quan saùt sau 5 phuùt, neáu coù hieän töông suûi boït khí thì khuaån laïc vi khuaån coù catalase. Caùc chuûng vi sinh vaät ñoái chöùng: ñoái chöùng döông S. epidermidis, ñoái chöùng aâm: E. feacalis 4. Thöû nghieäm citrate Nguyeân taéc: Nhaèm xaùc ñònh khaû naêng vi sinh vaät söû duïng nguoàn citrat nhö laø nguoàn carbon duy nhaát. Cô sôû sinh hoaù: Naêng löôïng cung caáp cho vi sinh vaät khi trong moâi tröôøng khoâng coù nguoàn nguyeân lieäu söû duïng cho quaù trình leân men hay taïo caùc saûn phaåm lactic baèng caùch söû duïng citrate nhö laø nguoàn carbon duy nhaát. Trong thöôøng, söï trao ñoåi chaát citrate bao goàm caùc böôùc keát hôïp acetyl-CoA ñeå taïo thaønh oxalacacetate ñeå cho chuùng ñi vaøo chu trình Kreb. Con ñöôøng ñoàng hoaù citrate ôû caùc vi khuaån thöôøng raát nhanh qua chu trình tricarboxylic acid hay con ñöôøng leân men citrate. Ôû vi khuaån söï taùch citrate bao goàm moät heä thoáng enzym khoâng coù söï 22
24. tham gia cuûa enzym acetyl –CoA, enzym naøy ñöôïc ñöôïc goïi laø citratase (citrate axaloacetat – lyase) hay citate demolase. Enzym naøy ñoøi hoûi moät cation coù hoaùt trò 2 cho hoaït ñoäng cuûa chuùng , thoâng thöôøng caùc cation naøy laø magne ( Mg2+) hay mangan (Mn 2+). Böôùc ñaàu tieân vi sinh vaät taùch citrate thaønh oxaloacetate vaø acetate. Ñaây laø hai saûn phaåm trung gian trong quaù trình ñoàng hoaù citrate, coøn saûn phaåm nhaän ñöôïc töø quaù trình naøy phuï thuoäc vaøo pH cuûa moâi tröôøng. Neáu pH kieàm thì trong moâi tröôøng seû nhaän ñöôïc nhieàu acetate vaø formate, neáu pH acid thì saûn phaåm taïo ra laø lactate vaø CO2. pH treân 7,0 khoâng coù saûn phaåm lactate trong moâi tröôøng vaø saûn phaåm nhaän ñöôïc nhö sau: Citrate CO2 + Formic acid + 2 Acetic acide Ôû pH acid acetyl methycarbinol (acetoin) vaø latate laø saûn phaåm chính cuûa quaù trình söû duïng citate. Moâi tröôøng söû duïng cho quaù trình leân men citrate coøn chöùa muoái voâ cô amonium. Moät vi sinh vaät coù khaû naêng söû duïng citrate laø nguoàn carbon duy nhaát cuõng coù theå söû duïng ammonium nhö laø nguoàn nitô duy nhaát, amonium bò phaân huyû ñeå taïo thaønh amonia, chaát naøy seû laøm kieàm moâi tröôøng nuoâi caáy. Deffner vaø Franke thaønh laäp coâng thöùc cho moâi tröôøng citrate cho caùc vi sinh vaät ñöôøng ruoät, saûn phaåm thu ñöôïc sau quaù trình nuoâi caáy nhö sau: 4 Citrate -Æ 7 acetate + 5 CO2 + formate + Succinate Söï söû duïng caùc acid höõu cô ôû daïng muoái cuûa chuùng nhö laø nguoàn carbon taïo neân caùc carbonate hay bicarbonate kieàm tính. Ñeå söû duïng cho vieäc thöû nghieäm citrate, coù theå söû duïng moâi tröôøng Simmon citrate agar hay moâi tröôøng loûng Koser. Neân caáy moät löôïng vi sinh vaät vöøa phaûi, neáu caáy vôùi maät ñoä quaù daøy coù theå gaây neân hieän töôïng döông tính giaû. Sau khi caáy, uû ôû nhieät ñoä 30-37oC, quan saùt söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät vaø söï chuyeån sang kìm cuûa moâi tröôøng. Caùc chuûng vi sinh vaät ñoái chöùng: Ñoái chöùng döông: P. rettgeri; ñoái chöùng aâm: S. epidermidis. 5. Thöû nghieäm coagulase. Nguyeân taéc: Thöû nghieäm khaû naêng cuûa moät soá vi sinh vaät laøm ñoâng tuï huyeát töông bôûi hoaït ñoäng cuûa emzym coagulase. Cô sôù sinh hoaù: Coagulase laø emzym ñöôïc taïo ra bôûi S. aureus, laø moät enzym lieân quan ñeán khaû naêng beàn nhieät, coù theå beàn ñeán nhieät ñoä 60oc trong gian 30 phuùt. Enzym naøy laø moät protein töï nhieân, chuùng ñöôïc tieát ra beân ngoaøi teá baøo bôûi caùc vi sinh vaät S. aureus, chuùng cuõng deã daøng baát hoaït bôûi caùc protease. Coagulase laø enzym ñoùng vaøi troø ñoâng tuï huyeát töông, chuùng keát hôïp caùc caáu töû trong huyeát töông thaønh töøng khoái hay thaønh cuïc. Coagulase vi khuaån Huyeát töông khoái Fibrin Cô cheá thoâng thöôøng bieåu dieãn quaù trình ñoâng tuï huyeát töông nhö sau: Prothrombin Thrombokinase enzym (throboplastin) Ca++ Thrombin Fibrinogen Fibrin 23
25. Moâ hình cô cheá ñoâng tuï huyeát töông Oginsky vaø Umbreit cho raèng coù nhöõng baèng chöùng chöùng minh raèng coagulase coù moät cô cheá ngöng keát huyeát töông khaùc, chuùng laø nhöõng taùc nhaân hoaït hoaù caùc thaønh phaàn trong huyeát töông ñeå chuyeån fibrinogen thaønh khoái fibrin. Smith vaø caùc ñoàng söï cho raèng coagulase laø moät cô chaát gioáng priothrombin, chaát naøy phaûn öùng vôùi caùc huyeát töông taïo thaønh phöùc chaát gioáng thrombin vaø chaát naøy keát hôïp caùc fibrinogen thaønh khoái fibrin. Theo Burrow vaø Moulder, söï ñoâng tuï huyeát töông dieãn ra qua hai böôùc nhö sau: Böôùc I: Phaûn öùng giöõa enzym do vi khuaån tieát ra (proenzym) vôùi caùc nhaân toá hoaït ñoäng hieän dieän trong huyeát töông ñeå taïo thaønh coagulase. Böôùc II: Coagulase hoaït ñoäng ngöng keát caùc thaønh toá fibrinogen thaønh fibrin. Cuõng theo Burrow vaø Moulder nhaân toá do vi khuaån tieát ra laø procoagulase keát hôïp vôùi nhaän toá trong huyeát töông laø moät daïng globulin, nhöng chaát naøy khoâng ñöôïc chöùng minh coù phaûi laø prothrombin hay khoâng. Taùcgiaû Dithrie chöùng minh raèng enzym coagulase do Burrow vaø Moulder thaønh laäp chính laø procoagulase, chuùng hieän dieän dieän ôû hai daïng: daïng coagulase giôùi haïn beân trong teá baøo vaø daïng töï do. Trong caùc thöû nghieän cogulase ñöôïc tieán haønh treân lam kính chæ coù caùc coagulase giôùi haïn tham gia vaøo vieäc chuyeån fibrinogen thaønh fibrin coøn trong thöû nghieän coagulse treân oáng caû hai daïng giôùi haïn vaø töï do tham gia vaøo vieäc ngöng keát naøy Coøn theo caùc nghieân cöùu cuûa Soulier, Tager vaø Zajden keát luaän raèng, coagulase vaø prothrombin khoâng coù hoaït tính enzym, nhö söï tham gia cuûa chuùng taïo neân caùc phöùc hôùp beàn vôùi caùc hoaït ñoäng ly giaûi ñaëc hieäu goïi laø taphylothrombin, staphylocogulase khoâng coù hoaït tính ly giaûi, chuùng phaûn öùng moät caùch chuyeân bieät vôùi caùc prothrobin vaø hoaït hoaù hôïp chaát naøy ñeå ñöa ñeán söï keát hôïp caùc figrinogen thaønh caùc khoái fibrin. Sô ñoá hoaït ñoäng nhö sau: Staphylocoagulase Staphylothrombin Prothrombin Fibrinogen Fibrin Sô ñoà cô cheá taùc ñoä cuûa Staphylocoagulase leân söï ngöng keát huyeát töông Caùch tieán haønh: Ñeå phaùt hieän coagulase cuûa vi khuaån coù hai caùch tieán haønh nhö sau: Caùch I: Tieán haønh thöû nghieäm treân Lam kính Laáy 1 hay 2 khuaån laïc cuûa vi khuaån huyeàn phuø vaøo trong gòot nöôùc treân lam kính, quan saùt trong khoaûn 10 giaây, neáu khoâng coù hieän töïng ngöng keát, duøng que caáy ñöa huyeát töông thoû hay ngöôøi ñaõ ñöôïc coá ñònh baèng EDTA hoaø vaøo trong huyeàn phuø vi khuaån. Quan saùt trong sau 10 giaây. Hieän töông ngöng keát xaõy ra coù theå quan saùt ñöôïc baèng maét thöôøng. Tieán haønh kieåm chöùng song song vôùi caùc doøng vi sinh vaät coù coagulase döông tính ñaõ bieát. Caùch II: Tieán haønh thöû nghieäm treân oáng, ñaây laø phöông phaùp nhaèm khaèng ñònh caùc maãu ñaõ thöû nghieäm aâm tính treân lame. Cho 0,2ml huyeát töông vaøo 0,8ml moâi tröôøng Nutrient Broth ñaõ caáy vi khuaån khoâng coù glucose ñaët trong beå ñieàu nhieät ôû 37oC, quan saùt sau 3 giôø, neáu khoâng coù hieän töôïng ngöng keát dieãn ra, coù theå ñeå ôûù nhieät ñoä phoøng qua ñeâm vaø quan saùt trôû laïi. Treân thò tröôøng hieän nay coù caùc loaïi huyeát töông ñöôïc coá ñònh trong caùc giaù theå khaùc nhau nhö EDTA, citrate hay trong oxalate. Neáu söû duïng huyeát töông citrate coù theå gaây ngöng 24
26. keát bôûi caùc doøng vi sinh vaät söû duïng citrate hay fecal Streptococci. Vì theá ñeå kieåm tra Staphylocoagulase chæ neân söû duïng loaïi huyeát töông coá ñònh trong EDTA hay trong oxalate. Caùc thöû nghieäm treân lam chæ phaùt hieän caùc coagulase giôùi haïn, chuùng seõ hoaït ñoäng tröïc tieáp leân caùc fibrinogen. Thöû nghieäm treân caùc oáng nghieäm nhaèm phaùt hieän caû cogulase töï do vaø coagulase giôùi haïn, chuùng hoaït ñoäng laøm ngöng keát caùc thaønh phaàn trong huyeát töông. Hieän nay coù nhieàu kit ñaõ ñöôïc thöông maïi hoaù nhaèm phaùt hieän S. aureus nhö nhöïa ngöng keát (latex kit) nhö slidex (biomerieux); Staphylex (Oxoid); Staphynuclease (API) 6. Thöû nghieäm decarboxylase vaø dehydrolase cuûa caùc amino acid Nguyeân taéc: Thöû nghieäm dehydrolase vaø decarboxylase nhaém xaùc ñònh khaû naêng cuûa moät vi sinh coù theå toång hôïp caùc emzym khöû nhoùm carboxyl hay taùch hydrogen töø caùc acid amin nhö lysine, ornithin, hay arginine, qua ñoù chuùng laøm kieàm moâi tröôøng nuoâi caáy. Cô sôû simh hoaù: khöû nhoùm carboxyl cuûa moät acid amin laø quaù trình vi sinh vaät taùc ñoäng leân nhoùn carboxyl (-COOH) cuûa moät acid amin ñeå giaûi phoùng ra caùc amin, hay di amin vaø CO2. R-CH-NH2-COOH RCH2-NH2 + CO2 Amino acid amin Enzym decarboxylase coù nhaát nhieàu loaïi khaùc nhau, trong ñoù moät loaïi seõ taùc ñoäng leân moät cô chaát khaùc nhau. Trong caùc phoøng thí nghieäm nghieân cöùu vi sinh vaät gaây beänh ba nhoùm enzym decarboxylase quan troïng thöôøng hay söû duïng laø lisine, ornithine, arginine. Ñaây laø nhöõng enzym caûm öùng, chuùng chæ ñöôïc toång hôïp khi trong moâi tröôøng nuoâi caáy coù pH acid vaø coù cô chaát ñaëc hieäu. Caùc saûn phaåm cuûa chuùng seõ laøm cho moâi tröôøng chuyeån sang kieàm. Quaù trình naøy dieãn ra treân caùc aminoacid coù nhieàu hôn moät goác NH2 ngoaøi nhoùm NH2 ôû Cα. trong ñieàu kieän moâi tröôøng kî khí, vaø caàn coù moät coenzym, thoâng thöôøng coenzym naøy laø pyridoxal phosphate. Khi enzym lisine decarboxylase taùc ñoäng leân amino acid L-lisin vaø khöû nhoùm carboxyl, chuùng taïo thaønh moät ñi amin laø cadaverine vaø CO2, quaù trình dieån ra theo phaûn öùng nhö sau: NH2 NH2 CH2 CH2 (CH2)3 Lisine decarboxylase (CH2)2 + CO2 CH2 CH2 NH NH2 COOH L-lisine Cadaverine (diamin) Phaûn öùng khöû amin bôûi lysine decarboxylase NH2 NH2 CH2 Ornithine CH2 decarboxylase (CH2)2 (CH2)2 + CO2 -CO2 CH NH3 CH2 COOH NH2 L-Ornithine Putrescine (diamin) Phaûn öùng khöû amin bôûi Ornithine decarboxylase 25
27. Acid amin L-ornithine bò khöû nhoùm carboxyl bôûi enzym onithine decarboxylase seõ thu ñöôïc moät diamin laø putrescine vaø CO2. Caû hai chaát putrescine vaø cadaverine ñeàu beàn trong ñieàu kieän kî khí. Vì theá khi nuoâi caáy vi sinh ñeå thöû nghieäm, phaûi nuoâi trong ñieàu kieän kî khí, treân beà maët moâi tröôøng nuoâi caáy phaûi ñöôïc phuû moät môùi parafin hay daàu khoaùng ñeå ngaên caûn söï khueách taùn cuûa oxy. Sau quaù trình nuoâi caáy, pH cuûa moâi tröôøng seõ thay ñoåi veà phía kieàm, pH cuûa moâi tröôøng coù theå ñöôïc kieåm soaùt do ñoù coù theå nhaän bieát phaûn öùng trong moâi tröôøng nuoâi caáy bôûi caùc chaát chæ thò pH. Caùc chaát chæ thò pH thöôøng ñöôïc söû duïng trong thöû nghieäm naøy laø Bromcresol purple hay cresol red. Rieâng ñoái vôùi L-arginine coù theå ñöôïc trao ñoåi bôûi hai con ñöôøng trong quaù trình nuoâi caáy, thoâng qua hai enzym: arginine dehydrolase vaø Arginine decarboxylase. Hai con ñöôøng naøy coù theå dieån ra ñoàng thôøi trong quaù trình nuoâi caáy hay coù theå dieån ra rieâng leû: + Phaûn öùng arginine decarboxylase: quaù trình trao ñoåi arginine nhôø enzym arginine dehydrolase ñöôïc tieán haønh theo sô ñoà sau: NH CNH2 CH2 NH2 Decarboxylase NH (CH2)2 + CO2 (CH2)2 CH2 NH2 CH NH2 COOH L-Arginine Putrescine Hoaït ñoäng cuûa toaøn heä thoáng nhö sau Arginine dehydrolase L-Arg inine L-Agmatine + CO2 Agmatinase (agmatine Agmatinase (agmatine ureohydrolase) ureohydrolase) Putrescine + Urea NH3 + Monocarbaminyl- Urease putrescine 2 NH + CO 3 2 Putrescine + CO2 + 2 NH3 26
28. Theo heä thoáng naøy, saûn phaåm sau quaù trình trao ñoåi chaát nhaän ñöôïc agmatine vaø moät löôïng lôùn putrescine, nhöng chaát naøy khoâng phaûi laø saûn phaåm trao ñoåi chaát cuoái cuøng maø chuùng tham gia vaøo moät loaït caùc phaûn öùng khaùc, cuoái cuøng seõ thu ñöôïc caùc saûn phaåm laø CO2 vaø NH3. + Phaûn öùng arginine dehydrolase: quaù trình trao ñoåi chaát theo höôùng khöû hydro cuûa arginine dieån ra theo sô ñoà nhö sau: Arginase L-Arg inine Ornithine + Urea Urease 2 NH + CO Arginine dehydrolase 3 2 L-citruline + NH 3 Citrulline ureidase 2 NH3 + CO2 + L-ornithine Ornithine decarboxylase Putrescine + CO2 Heä thoáng hoaït ñoäng cuûa vi khuaån coù heä enzym arginine dehydrolase Böôùc ñaàu tieân cuûa quaù trình laø taùch hydro cuûa goác NH2 töø arginine bôûi enzym arginine dehydrolase ñeå taïo thaønh citrulline vaø NH3 vaø moät phosphate voâ cô. Böôùc tieáp theo citrulline döôùi taùc duïng cuûa enzym citrulline ureidase coù söï hieän dieän cuûa H3PO4 ñeå taïo thaønh ornithine vaø carbarmyl phosphate, chaát naøy seõ ñöôïc thuûy giaûi ñeå thu nhaän ATP. Nhö vaäy keát thuùc quaù trình seõ thu nhaän ñöôïc ATP cho caùc hoaït ñoäng khaùc cuûa vi sinh vaät. Saûn phaåm cuoái cuøng cuûa quaù trình phaân huûy arginine cuøng nhöõng saûn phaåm NH3 vaø CO2, ñaây laø nhöõng chaát laøm kieàm moâi tröôøng nuoâi caáy. Coù theå nhaän bieát phaûn öùng naøy qua caùc chaát chæ thò pH hieän dieän trong moâi tröôøng. Phöông phaùp thöû nghieäm cuûa Falkow ñöôïc söû duïng ñoái vôùi caùc vi sinh vaät coù hình que, gram aâm, nhöng phöông phaùp cuûa Moeller cho keát quaû toát hôn ñoái vôùi caùc vi sinh vaät thuoäc hoï Enterobacteriaceace. Moâi tröôøng Falkow ñöôïc söû duïng chæ cho thöû nghieäm Lisine Decarboxylase, trong khi ñoù moâi tröôøng Moeller ñöôïc söû duïng cho taát caû caùc thöû nghieäm ñoái vôùi Lysine, Arginine vaø Ornithine. Vi sinh vaät ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng Falkow, uû ôû 37oC trong 24 giôø, chaát chæ thò trong moâi tröôøng laø bromocresol purple. Neáu phaûn öùng döôùng tính, moâi tröôøng giöõ nguyeân maøu tím ban ñaàu, canh khuaån ñuïc, neáu phaûn öùng aâm tính, moâi tröôøng chuyeån töø maàu tím sang vaøng. Neáu söû duïng moâi tröôøng Moeller cho caùc thöû nghieäm naøy, phaûi nuoâi caáy vi sinh vaät trong ñieàu kieän kî khí vôùi daàu parafin hay daàu khoaùng treân beà maët, uû ôû 37oc trong thôøi gian 24-28 27
29. giôø. Trong moâi tröôøng coù hai chaát chæ thò pH: brommothymol blue vaø cresol red. Neáu sau khi nuoâi caáy moâi tröôøng chuyeån thaønh vaøng laø tín hieäu aâm tính, ngöôïc laïi moâi tröôøng giöõ nguyeân maøu ban ñaàu vaø ñuïc canh nuoâi caáy laø tín hieäu döông tính. Caùc vi sinh vaät ñoái chöùng: Lisin: döông tính: S.marcescens,aâm tính: P.rettgeri Arginine: döông tính: E.cloacae, aâm tính: E.aerogenes Ornithine: döông tính: S.marcescens, aâm tính: P.rettgeri 7. Thöû nghieän DNAse vaø thermonuclease Nguyeân taéc - thöû nghieäm DNAse nhaèm phaùt hieän khaû naêng toång hôïp enzym deoxyribonuclease (Dnase) ñeå phaân huyû DNA. - Thöû nghieäm thermonuclease nhaêm thöû nghieäm tính beàn nhieät cuûa Dnase töø Staphylococcus aureus khi vi sinh vaät ñöôïc ñun noùng. Cô sôû sinh hoaù Thöû nghieäm DNAse: Enzym nuclease laø enzym phaân huyû acid nucleic ñöôïc chia thaønh hai nhoùm nhö sau: Nhoùm 1. Endonuclease laø nhöõng enzym phaân huyû caùc noái phosphodiester ôû beân trong maïch DNA ñeå taïo ra caùc ñaàu 3’-hydroxyl vaø 5’-phosphoryl hay 5’-hydroxyl vaø 3’- phosphoprryl. Nhoùm 2. Exonuclease chæ phaân huyû caùc nucleotide ôû caùc ñaàu taän cuøng cuûa chuoãi DNA . Moät soá nuclease coù theå phaân huyû caû hai maïch treân sôïi DNA, moät soá khaùc chæ coù theå phaân huyû moät maïch ñôn. DNA coù caùc ñaëc tính vaät lyù vaø hoaù hoïc khaùc vôùi nucleotide vaø oligonucleotide. Söï khaùc bieät naøy ñöôïc duøng ñeå phaùt hieän söï ly giaûi DNA bôûi caùc enzym Dnase. Dnase laø moät enzym ngoaïi baøo, chuùng chæ phaân huyû caùc acid nucleic. Haàu heát taát caû caùc Dnase vi khuaån ñeàu caàn moät cation hoùa trò hai ñeå cho enzym naøy hoaït ñoäng. Cation thoâng thöôøng hieän dieän trong caùc pepton ñöôïc söû duïng trong moâi tröôøng nuoâi caáy thöû nghieäm. Hoaït ñoäng cuûa enzym xaûy ra trong khoaûng pH 5,5-8,5 nhöng thích hôïp nhaát taïi pH 7,2. Coù theå phaân bieät nhieàu loaïi DNAse baèng caùc khaùng theå hay baèng caùc taùc nhaân öùc cheá. Khi phaân giaûi, khoaûn ¼ soá noái phosphodiester hay noái hydrogen bò phaân huyû vaø thu ñöôïc moät hoãn hôïp caùc oligonucleotide trong moâi tröôøng nuoâi caáy. Trong hoãn hôïp naøy goàm coù caùc ñoaïn DNA coù taän cuøng laø 3’-hydroxyl vaø 3’-phosphoryl; 5’hydroxyl vaø 5’-phosphoryl. Khi DNA coøn laïi caùc maïch ngaén, naâng nhieät ñoä hay pH cao quaù bính thöôømg seõ laøm bieán tính caùc ñoaïn naøy. Khi coù hieän töôïng bieán tính, hoãn hôïp DNA seõ giaûm ñoä nhôùt vaø gia taêng möùc ñoä haáp thu UV ôù böôùc soùng 260nm. Hieäu öùng thay ñoåi naøy laø do coù noàng ñoä deoxyribonucleotide gia taêng trong dung dòch so vôùi cô chaát DNA ban ñaàu. DNA hieän dieän trong caùc dòch chieát vi sinh vaät. Nhöng DNAse ngoaïi baøo chæ hieän dieän ôû moät soá loaøi nhö S. aureus hay Streptococcus nhoùm A - Thermonuclease cuûa S. aureus: cuõng nhö taát caû caùc vi sinh vaät khaùc S. aureus ñeàu coù theå toång hôïp DNAse ngoaïi baøo, nhö coù ñieåm khaùc bieät so vôùi taát caû caùc loaøi vi sinh vaät khaùc, DNAse cuûa S. aureus beàn nhieät hôn vaø caàn ligand Ca2+ cho söï hoaït ñoäng cuûa chuùng, chuùng phaân huyû DNA maïnh ôû pH kieàm 8,6-9,0. Söï hieän dieän cuûa DNAse beàn nhieät ôû S. aureus coù lieân quan ñeán söï coù maët coagulase ôû loaøi vi sinh vaät naøy. DNAse cuûa S. aureus coù theå baûo toaøn hoaït tính khi naâng nhieät ñoä ñeán 100oC trong 15phuùt. 28
30. Phöông thaùp thöû nghieäm: traûi moät thaûm vi khuaån daøy leân moâi tröôøng Dnase agar, uû qua ñeâm. Cho acid gaäp treân beà maët moâi tröôøng sau khi uû. Quan saùt hieän töôïng tuûa cuûa caùc muoái coù trong moâi tröôøng. Neáu xung quanh khuaån laïc hay treân ñóa coù nhöng quaàng trong suoát do khoâng coù tuûa caùc caùc muoái trong moâi tröôøng laø phaûn öùng döông tính. 8. Thöû nghieäm khaû naêng sinh H2S Nguyeân taéc: Xaùc ñònh khaû naêng sinh H2S töø caùc hôïp chaát höõu cô vaø voâ cô chöùa löu huyønh trong quaù trình phaùt trieån cuûa vi khuaån taïo neân caùc veät maøu ñen treân moâi tröôøng nuoâi caáy, Cô sôû sinh hoaù: Khi phaân giaûi protein thu ñöôïc caùc aminoacid, caùc vi sinh vaät dò döôõng coù theå söû duïng caùc aminoacid ñeå trao ñoåi trong quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån vaø phoùng thích khí H2S töø nhöõng amonoacid chöùa löu huyønh. Caùc nguoàn pepton, cystein, cystine, sulphite, thiosulphate laø nhöõng nguoàn chöùa löu huyønh, nhöng caùc loaøi vi sinh vaät khaùc nhau chæ coù theå söû duïng moät soá hôïp chaát chöùa löu huyønh nhaát ñònh ñeå taïo H2S. Caùc enzym cuûa vi sinh vaät tham gia vaøo quaù trình naøy laø desulphohydrase. Moät vi sinh vaät taïo H2S khi nuoâi caáy trong moâi tröôøng chöùa caùc hôïp chaát löu huyønh maø chuùng coù khaû naêng ñoàng hoaù seõ khöû caùc hôïp chaát naøy ñeå taïo neân khí H2S. CH2 SH Cysteine desulfurase CH3 CH NH2 + H2O C = O + H2S + NH3 COOH COOH Cysteine Acid pyruvic Trong moâi tröôøng coù chöùa caùc ion kim loaïi nhö ion saét laø daáu hieäu ñeå nhaän bieát H2S. Caùc hôïp chaát coù theå nhaän bieát H2S nhö saét, FeSO4, ferric amonium sulphate, sodium thiosulphate, bismuth sulphite. Nguyeân taéc ñeå nhaän bieát H2S baèng caùc hôïp chaát treân nhö sau: 2+ + H2S + Fe = FeS + 2 H Caùc hôïp chaát sulphur kim loaïi ñeàu coù daáu hieäu maøu ñen. Trong caùc moâi tröôøng khaùc nhö Kligler Iron agar chaát chæ thò ñeå nhaän bieát H2S laø caùc muoái ferric ammonium citrate vaø moät chaát voâ cô sodium thiosulphate. Caû hai chaát chæ thò naøy ñeàu phaûi hieän dieän ngay töø ñaàu trong moâi tröôøng. Keát quaû nhaän bieät söï taïo thaønh H2S qua hai böôùc nhö sau: Böôùc I: Vi sinh vaät phaùt trieån trong moâi tröôøng seõ khöû hôïp chaát thiosulphate ñeå taïo thaønh sulpite vaø sulphate. Caùc nguoàn carbohydrate coù trong moâi tröôøng seõ taïo thaønh moâi tröôøng acid trong phaàn saâu cuûa moâi tröôøng KIA thoâng qua quaù trình hoâ haáp kî khí. Moâi tröôøng acid trong phaàn saâu cuûa oáng nghieäm seõ hoå trôï cho phaûn öùng khöû treân. Qua ñoù löu huyønh ñoùng vai troø laø chaát nhaän dieän töû cho quaù trình oxy hoùa-khöû caùc hôïp chaát höõu cô. Thiosulphate thay theá sulphate nhö laø chaát nhaät ñieän töû vaø laø nguoàn cung caáp sulphur cho vi sinh vaät. Thiosulphate + 2- 2- 4H + 4e + 3S2O3 2SO3 + 2 H2S Thiosulphate Reductase Sulphite Hydrogen sulphur H2S taïo thaønh laø moät chaát khí khoâng maøu. Moät chaát chæ thò thöù hai caàn thieát ñeå nhaän daïng chaát khí naøy. Böôùc II: Chaát khí khoâng maøu H2S phaûn öùng vôùi caùc muoái kim loaïi nhö ferric ammonium citrate ñeå hình thaønh caùc hôïp chaát keát tuûa coù maøu ñen FeS. Ferric Ammonium citrate ñöôïc söû 29