Bài giảng Hóa mô miễn dịch - Hứa Thị Ngọc Hà

108 trang huongle 5981

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Hóa mô miễn dịch - Hứa Thị Ngọc Hà", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

bai_giang_hoa_mo_mien_dich_hua_thi_ngoc_ha.pdf

Nội dung text: Bài giảng Hóa mô miễn dịch - Hứa Thị Ngọc Hà

Bài giảng chứng chỉ sinh học phân tử Đối tượng: NCS, CKII, CH, CKI, BSNT HÓA MÔ MIỄN DỊCH PGS. TS. HỨA THỊ NGỌC HÀ
Mục tiêu • Biết được hĩa mơ miễn dịch là gì. • Biết được các ứng dụng trong chẩn đốn • Biết được các ứng dụng trong tiên lượng một số bệnh ung thư • Biết được các ứng dụng trong điều trị một số bệnh ung thư • Biết được các điều kiện đánh giá kết quả nhuộm và các hạn chế của phương pháp
HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY ‟ IHC) LÀ GÌ? • Là phương pháp xác định vị trí kháng nguyên đặc hiệu hiện diện trong mô hoặc tế bào (bào tương, màng tế bào, nhân) dựa trên phản ứng miễn dịch (kháng nguyên – kháng thể) kết hợp với hóa chất.
1. ĐẠI CƯƠNG
HÓA MÔ MIỄN DỊCH ‟ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  1940s: Coons (miễn dịch hùynh quang) Chất phát huỳnh quang Kháng thể Kháng nguyên - mô đông lạnh, - Kết quả không lưu trữ - cần trang bị kính hiển vi hùynh quang được lâu
HÓA MÔ MIỄN DỊCH ‟ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN  1974: Taylor et al: xác định một số kháng nguyên trong tế bào ở mô đã được xử lý thường quy tại các phòng xét nghiệm GPB. - kết quả lưu trữ được lâu - có thể sử dụng trên các khối nến lưu trữ từ trước - Không cần KHV hùynh quang  1990s: áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới.  Hiện nay: xét nghiệm thường quy ở các phòng XN GPB
Kháng nguyên Antigens  từ ngoài cơ thể: protein hay polysaccharide của vi khuẩn, độc tố, virus, flagella,
Kháng Nguyên • từ trong cơ thể: KN gồm: - các sợi trung gian (intermediate filaments), • - thụ thể hormon (ER, PR, AR ), • - các protein là sản phẩm của đột biến gen: c-kit, p53, Her2, EGFR
Antigen - Epitope: Là một phần nhỏ của kháng nguyên, nơi tiếp xúc với kháng thể. Một kháng nguyên có thể có vài epitope. Mỗi epitope được nhận biết bởi một kháng thể riêng biệt. Cần bộc lộ epitope trước khi cho tiếp xúc với kháng thể (trong quy trình nhuộm HMMD).
Kháng thể: Antibodies  Là các protein nhận biết và kết nối với kháng nguyên đặc hiệu.  Được sản xuất từ sự đáp ứng với biểu hiện của kháng nguyên.  Mỗi kháng thể có ít nhất hai vị trí kết nối kháng nguyên.
Cấu trúc của kháng thể Một phân tử hình chữ Y với 4 chuỗi protein: 2 chuỗi nhẹ 2 chuỗi nặng  Vùng thay đổi (Fab): hai phần đầu của nhánh chữ Y, chứa vị trí kết nối kháng nguyên. Vùng ổn định (vùng Fc): phần gốc của chữ Y, quan trọng vì có thể kết nối với bổ thể hay các tế bào.
Cấu trúc của kháng thể
Kháng Thể (KT) „ Kháng thể đa dòng: gây miễn dịch ở động vật với kháng nguyên đặc hiệu. „bất lợi: (1) chứa các KT không đặc hiệu „ (2) có khuynh hướng nhuộm nền cao. „ Kháng thể đơn dòng: sản xuất bằng kỹ thuật lai „ rất tinh khiết chỉ phản ứng với một kháng nguyên.
Nguyên tắc của kỹ thuật hóa mô miễn dịch Hệ thống phát hiện
Hệ thống phát hiện „ Men + Chất màu (DAB : màu vàng nâu) „ (EAC : màu đỏ)
CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN • 1. Miễn dịch men trực tiếp: „Kháng nguyên (mô) + kháng thể thứ nhất men + men „ đơn giản, nhanh, có tính Kháng thể I đặc hiệu . ít nhạy cảm do thiếu hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết. Kháng nguyên (mô)
CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN • 2. Miễn dịch men gián tiếp men Kháng thể II „Kháng nguyên (mô) + kháng thể thứ nhất + kháng thể thứ hai có gắn men đồng thời kháng Ig loài Kháng thể I của kháng thể thứ nhất. Kháng nguỵên (mô)
CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN • 3. KT men – chống men men (peroxidase- antiperoxidase : PAP) KT III „ đặc hiệu và nhạy cảm hơn 2 Kháng thể II phương pháp trên Kháng thể I Kháng nguỵên (mô)
4. Cầu nối Biotin – Streptavidin (LSAB) Streptavidin Màu (DAB, Kháng thể II AEC) Biotin Peroxidase Kháng thể II Kháng thể I Kháng nguyên
CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN • 4. Cầu nối Biotin – Streptavidin „ tính nhạy cảm cao và đặc hiệu cao. . hệ thống nhận biết được phóng đại lên 4 lần.
CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH MEN • 5. Chuỗi dextran . hệ thống nhận biết được phóng đại lên rất nhiều lần.
Đánh giá kết quả nhuộm • ÂM TÍNH
KẾT QUẢ NHUỘM DƯƠNG TÍNH (màu EAC: đỏ)
KẾT QUẢ NHUỘM • DƯƠNG TÍNH (DAB: vàng nâu)
Đánh giá kết quả nhuộm • Điều kiện: •- Có lam chứng âm và chứng dương •- Đối chiếu với tiêu bản nhuộm HE •- Biết rõ vị trí kháng nguyên ở nhân, bào tương hay màng bào tương.
2.1. Chẩn đoán 2. ỨNG DỤNG CỦA HMMD 2.2. Tiên lượng 2.3. Điều trị
1. Xác định nguồn gốc u Ứng dụng trong CHẨN ĐOÁN 3. Xác định 2. Phân biệt tác nhân u lành nhiễm khuẩn và ung thư
• 2.1.1. Xác định nguồn gốc u, đặc biệt là ung thư di căn Vì sao cần ?
- U hốc mũi - Sarcom mỡ ? - Carcinom tuyến biệt hóa kém ? HE Hình ảnh vi thể không đặc hiệu. Có nhiều chẩn đóan trên cùng tiêu bản.
• 2.1.1. Xác định nguồn gốc u, đặc biệt là ung thư di căn Vì sao cần ? -Cách điều trị khác nhau tùy lọai ung thư.
U chưa rõ nguồn gốc Vimentin Cytokeratin EMA LCA (-) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (+) Sarcôm Carcinôm Lymphôm U khác HMB45 S100 NSE (+) (+) (+) (+) Melanoma Mô bào Thần kinh
Sarcôm (Vimentin +) Actin Desmin CD 31, CD34, Myogenin, Factor VIII/ MyoD1, Myosin (+) (+) (+) (+) Sar. Cơ trơn Sar. cơ trơn/cơ Sar. mạch máu Sar. cơ vân vân
Carcinom (EMA/CK +) Thyro- AFP PSA CEA globulin (+) (+) (+) (+) Tuyến giáp Gan Tuyến tiền liệt Tuyến dạ dày, đại tràng
Tế bào ống Tuyến Trụ Gai Gai đáy Chẩn đoán đơn sừng không CK hóa sừng CK5/6 mesothelioma CK7 ++ ++ Oáng và tuyến CK8 ++ ++ âm tính Ovary, GIT, giáp, Gan, nội mạc, TK nội tiết thận, chuyển tiếp, CK10/13 dương tính CK17 dương CIN, car. tế bào gai phổi , CTC CK18 + + + âm tính Car. tuyến, tế bào đáy CK19 + + - + Đại tràng, Buồng trứng, chuyển tiếp, dạ dày, ông mật, tụy,
Nhuộm Dương tính trong Âm tính trong CK CK20 Đại tràng, ovary, chuyển Car. vú, phổi, nội mạc, u tiếp, dạ dày, ông mật, tụy, không chế nhầy của buồng trứng, car. tế bào nhỏ của phổi
Primary Tumor CK7 CK20 • Lung, Breast, Ovary, Thyroid + - • Salivary gland + - • Colon, Merkel-Cell - + • Stomach -/+ + • Pancreas + + • Adrenal, Renal, Hepatic, - - • Prostate - -
Melan A Melanôm ác HMB-45
U Carcinoid, u có nguồn gốc thần kinh nội tiết NSE Chromogranin, Synaptophysin
Rhabdomyosarcoma Desmin Myogenin
Sarcơm Ewing/PNET CD99
Lymphơm Hodgkin CD15 CD30
Mesothelioma Calretinin CK5/6
GastroIntestinal Stromal Tumor (GIST) CD117 - DOG1 CD34 Class II
CD1a - Langerhans cells
Các trường hợp minh họa
- U hốc mũi HE
CK Vimentin Kết luận: CHORDOMA EMA
- Hạch trên đòn + U trung thất - Lymphoma ? - Carcinom di căn hạch ? - U khác ?
LCA NSE Kết luận: U có nguồn gốc thần kinh nội tiết Chromogranin
HE U Amiđan - Lymphoma ? - Carcinom không biệt hóa ?
LCA CD20 Kết luận: Lymphoma
HE U AMIĐAN - Lymphoma ? - Carcinom không biệt hóa ?
HELCA CK Kết luận: CARCINOM không biệt hóa
HE HMB45 U Đại tràng Kết luận: Melanoma
HE HE HE Hạch góc hàm P 4 x 5 cm, dính vào mô sâu
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán 2.2.2. Chẩn đoán phân biệt u lành và ung thư: CEA Kappa, lambda / lymphoma ABH, Lewis Ki67
Ứng dụng của HMMD trong chẩn đóan CEA (-): tuyến bình thường CEA (+): tuyến ung thư
Ứng dụng HMMD trong chẩn đóan Kappa (+) Lymphoma Lambda (-)
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán tế bào vỏ thượng thận „Bình thường „Carcinôm „U lành (+) „(-) „(-) (+) (+) (+) cytokeratin „vimentin
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán „„biểubiểu mômô tuyếntuyến đạiđại tràngtràng „„niệuniệu mạcmạc „bình thường (-) „ung thư (+) „bình thường (+) „ ung thư ( - ) „ Kháng nguyên (KN) ABH
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán „„niệuniệu mạcmạc „bình thường (+) „ ung thư ( - ) „ KN Lewis (Lex và Ley) chẩn đoán và tầm soát carcinom niệu mạc
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán P63, actin (+): u nhú trong ống dẫn sữa (-): carcinôm vú dạng nhú
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán U tuyến núm vú P63 (+)
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán p63 (+) trong tuyến tiền liệt bình thường (hình trên, phải) PIN của tuyến tiền liệt p63 (-) ( )
P63 (-) carcinôm vú, tiểu thùy
Bệnh lý tuyến giáp galectin-3, HBME-1, CK19 Ret oncoprotein follicular carcinoma: galectin-3 dương tính mạnh, trong bào tương (400×). ÁC LÀNH hyperplastic colloid nodule: galectin-3 âm tính (100×). papillary thyroid carcinoma: galectin-3 dương tính mạnh, trong bào tương (400×)
Sensitivity, specificity, PPV and NPV of all Benign vs. Malignant Thyroid Lesions for each of the IHC markers Positive Negative Markers Sensitivity Specificity Predictive Predictive value value Galactin-3 0.852 0.724 0.630 0.899 Ret oncoprotein 0.833 0.694 0.600 0.883 HBME-1 0.870 0.643 0.573 0.900 CK-19 0.852 0.684 0.597 0.893 Saleh et al. Diagnostic Pathology 2010 5:9 doi:10.1186/1746-1596-5-9
ERBB-2 malignant pheochromocytoma paraganglioma benign pheochromocytoma negative control Yuan W et al. Endocr Relat Cancer 2008;15:343-350
Mesothelial cell
Bcl-2 dương tính : follicular lymphomas, Âm tính: normal or hyperplastic germinal centers
Ứng dụng HMMD trong chẩn đoán 2.1.3. Xác định tác nhân nhiễm khuẩn – Vi khuẩn: Helicobacter pylori, Tropheryma whipplei, – Virus: HBV, HCV, HPV, Adenovirus, Parvovirus, Cytomegalovirus, virus Dengue, Virus Epstein-Barr, virus Herpes simplex, HPV, HIV – Nhiễm nấm – Protozoa – .
Helicobacter pylori trong chất nhầy của dạ dày
Tropheryma whipplei trong thực bào của mô đệm ruột non
Tế bào bị nhiễm Cytomegalovirus Tế bào nhiễm HHV-8
2. Xác định 3. Họat động phân bào vi di căn (Ki67, PCNA) Ứng dụng trong TIÊN LƯỢNG ung thư 1. Xác định 4. Đột biến vi xâm nhập gen p53
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng 2.2.1. Xác định carcinôm vi xâm nhập „ Dùng kháng thể chống màng đáy: „ collagen typ IV, laminin „còn nguyên bị phá hủy hoàn toàn Mô lành tính Carcinôm vi xâm nhập
• Laminin: protein chính của màng đáy
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng 4. Xác định carcinôm vi xâm nhập „màng đáy + tế bào cơ biểu mô mô vú kháng thể chống actin mô tuyến tiền liệt tế bào đáy: tế bào lòng ống: CK trọng lượng CK trọng lượng phân tử cao phân tử thấp. Không có tế bào đáy -> ung thư
Xâm nhập mạch lymphô: Nhuộm D2-40 thấy rõ mạch lymphô bên trong có tế bào ung thư, dễ phân biệt với artifact do co rút mô đệm trên tiêu bản nhuộm HE (×200).
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng 2.2.2 Xác định carcinôm di căn “thầm lặng” (vi di căn) Xét nghiệm giải phẫu bệnh thường quy + không phát hiện được 8 – 30% ung thư vú di căn đến hạch + không phát hiện các ổ di căn nhỏ chỉ 3 tb
Pan CK Vi di căn hạch, một đám tế bào ung thư với ít tế bào trong hạch khó phát hiện trên tiêu bản HE, nhưng dễ nhận biết trên tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch với cytokeratin
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng •2.2.3 Họat động phân bào (Ki67, PCNA) Ki67: Dương tính: pha G1, S, G2, M Pha G0: âm tính
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng PCNA: Dương tính ở pha S
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng  Gen Ki-67 nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 10 (10q25). PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), protein được tìm thấy trong nhân tế bào trong pha tổng hợp DNA của chu trình tế bào. Dùng để phân độ mô học các lọai ung thư khác nhau Có giá trị trong chẩn đóan và tiên lượng Tỷ lệ Ki67 và PCNA dương tính trong tế bào u càng cao, tiên lượng càng xấu
Cách tính điểm Ki-67, PCNA • Định tính dựa vào: – Tỉ lệ % nhân tế bào bắt màu – Đậm độ bắt màu • Kết luận: – Âm tính: bắt màu 20%
Vi thể: biểu hiện của Ki-67, PCNA Âm tính Dương tính
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng p53
Ứng dụng của HMMD trong tiên lượng • p53 (protein 53) - một protein đè nén u (tumor suppressor), được mã hóa bởi gen TP53. – rất quan trọng trong sinh vật đa bào, – điều hòa chu trình tế bào – có chức năng đè nén u – và như vậy sẽ tránh được ung thư. – Tên gọi p53 do có trọng lượng phân tử 53 kilodalton. Nhưng theo tính tóan trên amino acid khối lượng thực sự chỉ có 43.7kDa
• p53: gen đè nén u, đảm nhận nhiều chức năng, đặc biệt là chận tiến trình phân bào. • Đột biến gen p53: tạo ra những phân tử protein không có chức năng, tích tụ trong nhân • p53 tích tụ càng nhiều tiên lượng càng xấu.
Cách tính điểm p53 • Định tính dựa vào: – Tỉ lệ % nhân tế bào bắt màu – Đậm độ bắt màu 0: không hoặc bắt màu nhạt 2(+): bắt màu trung bình >10% 3(+): bắt màu đậm >10% • Kết luận: Âm tính: 0 Dương tính: 1(+), 2(+), 3(+)
Vi thể: biểu hiện của p53 p53 (++) p53 (+++)
•Ứng dụng của HMMD •trong điều trị 1. Hormon 2. Liệu pháp liệu pháp nhắm trúng đích
Ứng dụng của HMMD trong điều trị 1 Dự đoán đáp ứng điều trị với hormon liệu pháp Xác định thụ thể Estrogen, Progesteron ở ung thư vú „ liên quan đến tiên lượng bệnh nhân „ độ mô học „ giai đoạn bệnh „ U biệt hóa cao, grad thấp: „ ER, PR dương tính „ „ đáp ứng tốt với hormon liệu pháp
2. Liệu pháp nhắm trúng đích (targeted therapy)
Ứng dụng của HMMD trong điều trị Her 2 +++ Điều trị Herceptin
GIST Ứng dụng của HMMD trong điều trị CD117 dương tính Điều trị Gleevec
Ứng dụng của HMMD trong điều trị LYMPHOMA CD20 dương tính Điều trị + Rituximab
MELANOMA Ứng dụng của HMMD trong điều trị Đột biến gen BRAF V600E (+) Điều trị Zelboraf vemurafenib FDA: August 17, 2011
•Các phân tử nhỏ Thuốc Đích phân tử Ung thư Imatinib mesylate c-kit* CML, GIST (Gleevec) dermatofibrosarcoma protuberans Gefitinib EGFR tyrosine lung and breast cancers (Iressa) kinase Erlotinib EGFR* lung cancer (Tarceva) Bortezomib apoptosis- multiple myeloma (Velcade) inducing drug Tamoxifen ER*, PR * breast cancer *phát hiện bằng hóa mô miễn dịch
•Điều trị kháng thể đơn dòng Thuốc Đích phân tử Ung thư Rituximab CD20* non Hodgkin lymphoma Trastuzumab Her2* breast cancers (Herceptin) (ErbB2) Cetuximab EGFR* colon cancer (Erbitux) non-small cell lung cancer Bevacizumab VEGF colon cancer, (Avastin) breast cancer, non-small cell lung cancer, sarcoma *phát hiện bằng hóa mô miễn dịch
Hạn chế của phương pháp • Đối với một số kháng thể, địi hỏi quy trình xử lý mơ nghiêm nhặt, đặc biệt là thời gian dung dịch cố định bệnh phẩm • Khơng giải quyết được tất cả các trường hợp • Chi phí tương đối cao so với xét nghiệm GPB thường quy vì phải nhuộm nhiều kháng thể cho một ca
KẾT LUẬN * Kỹ thuật hiện đại, khách quan * Giúp xác định nguồn gốc mô, chẩn đoán chính xác loại u, điều trị tốt các loại ung thư * Giúp tiên lượng và theo dõi điều trị ung thư