Giáo trình Công nghệ sinh học thực phẩm 2 thời lượng 45 tiết
56 trang
2710
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Công nghệ sinh học thực phẩm 2 thời lượng 45 tiết", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Tài liệu đính kèm:
- giao_trinh_cong_nghe_sinh_hoc_thuc_pham_2_thoi_luong_45_tiet.pdf
Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học thực phẩm 2 thời lượng 45 tiết
- ð I H C ðÀ N NG TRƯ NG ð I H C BÁCH KHOA KHOA HỐ K THU T B MƠN CƠNG NGH TH C PH M GIÁO TRÌNH CƠNG NGH SINH H C TH C PH M II TH I LƯ NG 45 TI T ðÀ N NG 2007
- M ð U Cơng ngh sinh h c là m t ngành khoa h c đang đư c th gi i quan tâm. Giá tr c a cơng ngh sinh h c là ch đĩ là m t cơng c cĩ th áp d ng cho nhi u ngành kinh t như s n xu t lương th c th c ph m, chăn nuơi thú y, cơng nghi p dư c và cơng nghi p hố h c, chuy n hố sinh kh i thành năng lư ng, x lý ph li u và ph li u cơng nơng nghi p, phịng ch ng ơ nhi m và v sinh mơi trư ng Cơng ngh sinh h c đã giúp cho các chương trình c i thi n nơng nghi p, ngh vư n và ngh r ng tăng năng su t cây tr ng, tăng ch t lư ng dinh dư ng c a nơng ph m, ch n gi ng ch ng ch u v i sâu b nh và v i th i ti t đ t đai khơng thu n l i và t o ra các gi ng thích nghi v i các đi u ki n th như ng và khí h u nh t đ nh. ð ng th i nĩ cũng t o đi u ki n đ duy trì m t s đa d ng di truy n đ r ng gi a các gi ng cây tr ng và gi gìn các ngu n gen đã đư c t o nên t các h hàng hoang d i c a chúng. Tính đa d ng di truy n đư c th hi n thơng qua m t s lư ng c c l n các ki u k t h p gen cĩ trong m t s cá th c a m t lồi và thơng qua s khác nhau v các tính tr ng c a các gi ng trong cùng m t lồi: ki u sinh trư ng, tính kháng sâu b nh, tính kháng v i ngo i c nh (sương mu i, h n, nĩng ) và năng su t. Sau khi nghiên c u k t qu c a nhi u t h p lai m t cách c n th n và nghiêm túc, các nhà ch n gi ng d a và tính đa d ng di truy n đ ch n ra các dịng cĩ tính tr ng mong mu n. ð thành cơng, nhà ch n gi ng ph i cĩ đư c trong tay v n di truy n càng l n càng t t. V n di truy n này bao g m các gi ng cây tr ng, các gi ng ch ng ch u, các gi ng đ a phương (các gi ng này thư ng b b quên vì do năng su t th p nhưng nĩ r t quý vì cĩ tính ch ng sâu b nh và các đi u ki n ngo i c nh khơng thu n l i). Trong v n di truy n cịn ph i k đ n các cây hoang d i cĩ tác d ng tăng s c s ng cho các cây gi ng tr ng. Tính đa đ ng di truy n là nhân t b o đ m cây tr ng khơng b các tai bi n khí h u ho c sâu b nh tiêu di t hồn tồn. Cây tr ng càng thu n nh t thì càng d b h i khi cĩ tai ho . Cơng ngh sinh h c cũng đư c ng d ng r ng rãi trong lĩnh v c th c ph m và dinh dư ng. Ngành cơng ngh lên men là m t b ph n c a cơng ngh sinh h c đã s n xu t ra nhi u s n ph m r t thú v cho ngành th c ph m. Ho c vi c s n xu t n m men cũng cĩ m t nghĩa r t quan tr ng. Ngư i ta cĩ th s d ng m t lư ng nh n m men đ b sung protein, vitamin và các ch t khống cho th c ph m. Ngồi ra, sinh kh i n m men là ngu n th c ăn b sung trong chăn nuơi r t cĩ hi u qu . Cơng ngh sinh h c giúp cho chăn nuơi và thú y t o ra đư c nh ng gi ng nuơi mong mu n và s n xu t ra các lo i vacxin đ phịng ch ng b nh t t cho các v t nuơi. Ví d : vi c c y chuy n h p t bị đã t o ra đư c gi ng bị t t, cĩ s c ch u đ ng cao. K thu t c y chuy n đư c th c hi n như sau: gây s r ng tr ng m t con bị cái cĩ các đ c đi m mà ngành chăn nuơi c n đ n và đem th tinh nhân t o b ng tinh trùng c a m t con bị đ c cĩ nh ng đ c đi m như ngư i ta mong mu n. Các h p t hay phơi đư c thu nh n b ng cách r a d con. Làm đơng l nh phơi trong nitơ l ng
- 179 oC và cĩ th v n chuy n tr ng thái này: 1000 phơi đơng l nh khơng n ng quá 50kg. Phơi đư c c y vào bị cái ch a đ h . Bê con phát tri n lên t các phơi này s ra đ i trong mơi trư ng s ng sau này c a chúng và khơng ph i đương đ u v i nh ng s b t l i c a mơi trư ng mà các súc v t nh p hay g p ph i. S b o v b ng các kháng th c a bị m và nh bú s a c a bị m mà sau khi ra đ i bê sơ sinh cĩ th ch u đ ng t t hơn đ i v i các lo i b nh t t thơng thư ng. Cơng ngh sinh h c cịn tích c c giúp đ ngành y t đ b o v s c kho c a c ng đ ng. Ngư i ta nĩi r ng y h c d phịng (và lâu dài hơn là y h c d báo d a trên hi u bi t v đ c đi m di truy n m i cá th ) s mang l i l i ích nhi u hơn các phương pháp đi u tr . M t lĩnh v c c a cơng ngh sinh h c cĩ th gĩp ph n quan tr ng trong gi i quy t các v n đ y t , trong khuơn kh m t chính sách ưu tiên cho y h c d phịng, đĩ là c i ti n các vacxin hi n cĩ và ch t o ra các vacxin m i. ð ng th i nĩ cịn giúp ích trong vi c s n xu t các lo i kháng sinh, vitamin và các thu c ch a b nh khác. Nh ng năm g n đây, nh vào k thu t di truy n ngư i ta đã tìm cách tách chi t các ho t ch t c a th c v t b c cao đ làm v t li u xu t phát cho hàng lo t lo i thu c. Cơng ngh sinh h c cịn gĩp ph n trong vi c s n xu t ra năng lư ng như: s n xu t c n b ng con đư ng lên men, chương trình biogas và chính các ngu n năng lư ng này l i đi ph c v cho các quá trình s n xu t khác. Cơng ngh sinh h c cịn tham gia vào vi c chuy n hố các ch t và ngăn ch n s ơ nhi m mơi trư ng. S n ph m ph và các ch t th i ch a hydratcacbon cĩ th đư c chuy n hố b ng cách lên men nh các vi sinh v t thơng thư ng hay b ng các qui trình cơng ngh sinh h c. Ho c các k thu t tái t h p AND cũng s gĩp ph n tích c c đ tách đư c các gi ng vi khu n thích h p nh t cho vi c t i ưu hố nh ng s chuy n hố đĩ. Ví d : chuy n gen mã hố các enzym xenluloza và hemixenluloza c a Clostridium thermocellum thành nh ng lồi Clostridium khác cĩ th đi u khi n đư c s chuy n hố xenluloza và hemixenluloza thành etanol, axeton, butanol, axít axetic o o và axít lactic. Dùng m t vài gi ng ưa nhi t Clostridium (t op= 65 75 C) cĩ l i là c t gi m đư c chi phí trong vi c chưng c t và s h đư c giá thành s n ph m. ð ngăn ch n s ơ nhi m mơi trư ng ngư i ta cĩ th dùng các lo i vi sinh v t khác nhau. Các k thu t tái t h p AND đã t o ra nh ng ch ng vi khu n cĩ th phân hu và h p th m t s l n các ch t do cơng nghi p hố ch t th i ra. Như v y cơng ngh sinh h c cĩ liên quan đ n nhi u lĩnh v c và bao g m các ngành như: Cơng ngh di truy n Cơng ngh nuơi c y mơ và t bào Cơng ngh enzyme Cơng ngh vi sinh v t Trong h c ph n này s nghiên c u v m t s ph n c a cơng ngh vi sinh v t. Các quá trình vi sinh đư c s d ng r ng rãi trong các lĩnh v c khác nhau c a n n kinh t . Nh ng thành t u khoa h c k thu t và sinh hố cho phép t o ra nh ng quá trình s n xu t cĩ năng su t cao d a trên các phương pháp cơng ngh đã đư c đi u ch nh đ cĩ m t s s n ph m th c ph m, chăn nuơi, thu c ch a b nh và các ch t h u cơ.
- CHƯƠNG I: NH NG NGUYÊN T C HỐ SINH TRONG CƠNG NGH VI SINH V T ð t o ra b t kì m t s n ph m lên men nào đ u ph i qua các bư c sau: Chu n b mơi trư ng Chu n b gi ng Lên men Thu h i và tinh ch s n ph m ð t o ra s n ph m cĩ ch t lư ng t t và năng su t cao thì c n hi u rõ các v n đ sau. 1.1 Phân lo i s n ph m c a cơng ngh vi sinh v t Các s n ph m lên men cơng nghi p đư c phân lo i theo các tiêu chu n sinh lí trao đ i ch t. S phân lo i này d a vào s n ph m chính c a quá trình lên men vì các quá trình s n xu t nh vi sinh v t luơn luơn t o thành nhi u s n ph m. 1.1.1 V t ch t bào (sinh kh i) Cơ ch t t bào Ví d : + protein đơn bào (tr ng thái ch t) + vi khu n c đ nh đ m (s ng): Rhizobium, Azotobacter , VK tr sâu Bacillus thuringiensis Vi c t ng h p sinh kh i hay v t ch t t bào đ ng nh t v i sinh trư ng c a vi sinh v t. Sinh trư ng và sinh s n g n li n v i nhau. Sinh trư ng là tăng kh i lư ng, cịn sinh s n là tăng s lư ng. 1.1.2 Các s n ph m trao đ i ch t Cơ ch t s n ph m + t bào 1. Các s n ph m cu i cùng c a s trao đ i năng lư ng (các s n ph m lên men) Ví d : etanol, axít lactic, axeton butanol Lên men là quá trình y m khí c a s thu nh n năng lư ng, trong đĩ hydro tách ra đư c chuy n đ n các ch t nh n h u cơ (nĩ khơng đ ng nghĩa v i s lên men trong ngơn ng qu c t nĩ đư c hi u là các quá trình s n xu t cơng nghi p nh vi sinh v t) M t s cơ th ti n hành lên men khi khơng cĩ oxy làm ch t nh n hydro cu i cùng (k khí tuỳ ti n), nh ng nhĩm cơ th lên men b t bu c thì khơng ch a các enzym hơ h p. Các h p ch t h u cơ nh n hydro là nh ng h p ch t đư c hinh thành trong quá trình trao đ i ch t d hố. Sau khi nh n hydro, các h p ch t này th i ra ngồi t bào gi ng như các s n ph m cu i cùng c a s hơ h p. T đĩ n y ra v n đ là trong s n xu t c n ch n các đi u ki n nuơi sao cho càng nhi u cơ ch t đư c chuy n thành các s n ph m lên men càng t t. Ví d : trong s n xu t rư u đ tăng hàm lư ng rư u thì c n tăng hàm lư ng đư ng và gi m các y u t quan tr ng cho sinh trư ng.
- 2. Các ch t trao đ i b c 1 Ví d : axít amin, nucleotit, vitamin, axít xitric. Các ch t trao đ i b c m t là nh ng viên g ch c u trúc cĩ tr ng lư ng phân t th p c a các cao phân t sinh h c c a t bào ch t: axít amin, nucleotit, nucleozit, đư ng, axít béo, vitamin Ngồi ra các s n ph m trung gian c a quá trình trao đ i ch t (các axít h u cơ trong chu trình ATC) cũng là các ch t trao đ i b c 1. Các cơ ch đi u hồ phát tri n trong quá trình ti n hố b o đ m sao cho các ch t trao đ i b c 1 ch đư c t ng h p đ n m c đ c n thi t. 3. Các ch t trao đ i b c 2 Ví d : kháng sinh, alcaloit Các ch t trao đ i b c 2 là nh ng ch t trao đ i cĩ tr ng lư ng phân t th p, khơng g p m i cơ th , s phân b c a chúng ch gi i h n nh ng đơn v phân lo i nh t đ nh. Chúng khơng cĩ ch c năng chung trong trao đ i ch t c a t bào và t bào cũng cĩ th t n t i mà khơng c n đ n chúng. Tuy nhiên, các ch t trao đ i b c 2 cĩ th cĩ ý nghĩa v i s sinh trư ng và các cơ th s n sinh ra chúng. Ch ng h n m t s ch t trao đ i b c 2 cĩ vai trị trong s h p th s t khi thi u nguyên t này. Thư ng các ch t b c 2 đư c t o thành khi s sinh trư ng đã k t thúc. Các ch ng t n t i trong t nhiên thư ng ch t o thành r t ít ch t trao đ i b c 2, nh ng ch t này đư c tích lu trong t bào ho c th i ra ngồi. 4.Các enzym Ví d : enzym ngo i bào: proteaza, amylaza enzym n i bào : asparaginaza, penixilinaza. T bào vi sinh v t ch a kho ng 1000 enzym khác nhau. M t s enzyme ch cĩ m t v i s lư ng vài phân t nhưng nhi u enzym cĩ m t v i s lư ng l n. Ch nh ng enzym ch u trách nhi m phân hu các cơ ch t khơng hồ tan như tinh b t, xenlulo, protein m i đư c ti t t t bào vào mơi trư ng. Vi sinh v t cĩ kh năng s d ng các cơ ch t khác nhau cho sinh trư ng và thích ng v i các đi u ki n sinh trư ng r t khác nhau. Trong s gi i h n c a th tích t bào ch t ng h p nh ng enzym mà nĩ c n. Trong cơng ngh s n xu t enzym c n ph i đi u khi n trao đ i ch t sao cho enzym mà ta mong mu n đư c t ng h p càng nhi u càng t t. 1.1.3 Các s n ph m c a s chuy n hố ch t Ví d : s oxy hố khơng hồn tồn đ t o thành axit axetic soboza. Trong quá trình chuy n hố các t bào ho t đ ng như nh ng h th ng xúc tác cho m t ho c nhi u bư c chuy n hố ch t. V m t lí thuy t nh ng ph n ng này cũng x y ra nh các enzym cơ l p, tuy nhiên con đư ng này khơng th th c hi n đư c ho c khơng kinh t (ví d v i các ph n ng enzym ph thu c năng lư ng). Các enzym chuy n hố các ch t theo cách r t đ c hi u. Ví d : s
- chuy n hố ho c tách hydro x y ra nh phân t steroid khơng cĩ ý nghĩa đ i v i t bào (cũng cĩ th đĩ là nh ng ph n ng kh đ c). Trong s chuy n hố đ t o axít axetic g n li n v i sinh trư ng, nĩ g n li n v i s thu nh n năng lư ng. 1.2 ð ng h c c a sinh trư ng và c a s t o thành s n ph m Sinh trư ng c a m t qu n th vi sinh v t di n ra qua các giai đo n khác nhau. S sinh s n c a t bào b t đ u sau m t giai đo n ti m phát. Trong giai đo n log ti p theo x y ra s sinh s n theo hàm s mũ. Sau m t th i gian sinh trư ng ng ng l i vì thi u ch t dinh dư ng cơ b n và vì tích lu các ch t c ch . Các t bào chuy n vào giai đo n cân b ng. Trong giai đo n này khơng di n ra sinh trư ng n a nhưng t bào v n cịn ho t đ ng trao đ i ch t. Tồn b quá trình nuơi g n li n v i s thay đ i kéo dài c a các đi u ki n nuơi. Ch t dinh dư ng gi m đi, s lư ng t bào tăng lên. ð ng th i ho t tính trao đ i ch t cũng thay đ i. V phương di n ch c năng c a các s n ph m trao đ i ch t đ i v i t bào cĩ th phân bi t 2 nhĩm: Các s n ph m mà s hình thành c a chúng g n li n v i s sinh trư ng. Ví d : các s n ph m lên men, các ch t trao đ i b c 1, các enzym. S t ng h p nh ng s n ph m này x y ra trong th i gian sinh trư ng và cịn cĩ th ti p di n sau khi sinh trư ng đã k t thúc. Các s n ph m mà s hình thành c a chúng x y ra sau khi sinh trư ng đã k t thúc; ví d các s n ph m trao đ i ch t b c 2. ð ng th i Th i gian Khơng đ ng th i Th i gian Hình 1: ð ng h c c a quá trình sinh trư ng và t o thành s n ph m Nhi u s n ph m chi m m t v trí trung gian. Ví d s t ng h p axít amin m c dù di n ra trong th i gian sinh trư ng nhưng v n ti p di n sau khi sinh trư ng đã k t thúc, vì quá trình t ng h p ti p di n trên cơ s c a m t sai h ng
- di truy n. S t ng h p c a nhi u enzym x y ra khơng song song v i sinh trư ng mà g n li n v i m t tr ng thái sinh lí nh t đ nh c a t bào cho nên trong lên men cơng nghi p c n ph i tìm ra tr ng thái sinh lí c a năng su t cao nh t và duy trì nĩ trong th i gian dài. 1.3 S t ng h p th a Vi sinh v t t n t i trong t nhiên sinh ra các s n ph m trao đ i ch t và các thành ph n t bào ch m c đ c n thi t cho s sinh s n t i ưu và cho s duy trì lồi. S trao đ i ch t như v y đư c b o đ m nh các cơ ch đi u hồ. Ví d : các cơ ch này c n ho t đ ng sao cho các axit amin khơng đư c t ng h p quá nhu c u c a s t ng h p protein. Như v y, trong đi u ki n t nhiên khơng cĩ s s n sinh dư th a các s n ph m trao đ i ch t b c 1, b c 2 và các enzym. N u trong t nhiên cơ ch đi u hồ này b r i lo n, ví d do k t qu đ t bi n thì các th đ t bi n sai h ng trao đ i ch t thư ng cĩ h i đ t v i ch ng ban đ u. 1.3.1 Nh ng nguyên t c đi u hồ trao đ i ch t Cĩ 3 cơ ch ch u trách nhi m đi u hồ trao đ i ch t: 1. ði u hồ ho t tính enzym nh s c ch b ng s n ph m cu i cùng hay cịn g i là s kìm hãm theo liên k t ngư c. 2. ði u hồ t ng h p enzym nh s ki m ch b ng s n ph m cu i cùng và s gi i ki m ch . 3. ði u hồ t ng h p enzym nh s ki m ch d hố. Các enzym c u trúc 1 2 3 4 Glucoza Ki m ch d hố Ki m ch b ng s n ph m cu i cùng A E.1 B E.2 CDE.3 E.4 S.ph m cu i cùng c ch b ng s n ph m cu i cùng Sơ đ 1: Các nguyên t c c a s đi u hồ enzyme * Trong cơ ch 1 s n ph m cu i cùng c a 1 quá trình sinh t ng h p gây ra s c ch quá trình t ng h p c a chính nĩ. đây, s n ph m cu i cùng dù đư c hình thành trong t bào hay đư c thu nh n t mơi trư ng dinh dư ng, đi u đĩ cùng ý nghĩa. Trong cơ ch này, s n ph m cu i cùng nĩi chung nh hư ng đ n enzyme đ u tiên c a chu i sinh t ng h p. Enzym cĩ tính quy t đ nh này là 1 protein d l p th . Nĩ cĩ đ c đi m là thay đ i c u hình khơng gian khi
- cĩ m t s n ph m cu i cùng nh m gi m b t ho t tính xúc tác. S c ch này x y ra nhanh và r t cĩ hi u qu . * Trong cơ ch 2, s n ph m cu i cùng c ch s t ng h p enzym c n cho s t o thành s n ph m y, trong đĩ vi c đ c thơng tin di truy n c n cho s t ng h p enzym (s phiên âm) b phong to . n ng đ cao c a s n ph m cu i cùng s t ng h p c a các enzym tham gia vào chu i ph n ng b ng ng ho c b kéo dài m t cách đáng k . N u n ng đ c a s n ph m cu i cùng gi m xu ng dư i 1 m c nào đĩ thì x y ra s gi i ki m ch , nghĩa là các enzym đư c t o thành v i t c đ cao hơn. S đi u hồ theo ki u này x y ra t t vì nĩ g n li n v i s t ng h p enzym. Ho t đ ng Ch t nh hư ng d l p th Ch t nh hư ng d l p th Th đ t bi n Khơng ho t đ ng D ng hoang d i Hình 2: Mơ hình c a s c ch b ng s n ph m cu i cùng *S ki m ch d hố đi u hồ quá trình t ng h p các enzym d hố xúc tác s phân hu cơ ch t. Các enzym này đư c t ng h p nh s c m ng enzym. Cơ ch này tương t cơ ch ki m ch t c là cũng x y ra m c đ phiên âm. Trong s c m ng enzym, m t ch t dinh dư ng đĩng vai trị ch t c m ng kích thích s t ng h p enzym xúc tác cho s phân hu chính nĩ, nghĩa là ch t này c m ng s t ng h p. Do đĩ, vi c t ng h p các enzym c m ng ch x y ra khi cĩ m t cơ ch t tương ng trong mơi trư ng.
- * S ki m ch d hố đi u hồ quá trình t ng h p các enzym d hố xúc tác s phân hu cơ ch t. Các enzym này đư c t ng h p nh s c m ng enzym. Cơ ch này tương t cơ ch ki m ch t c là cũng x y ra m c đ phiên âm. Trong s c m ng enzym, m t ch t dinh dư ng đĩng vai trị ch t c m ng kích thích s t ng h p enzym xúc tác cho s phân hu chính nĩ, nghĩa là ch t này c m ng s t ng h p. Do đĩ, vi c t ng h p các enzym c m ng ch x y ra khi cĩ m t cơ ch t tương ng trong mơi trư ng. Gen đi u ch t ki m ch khơng ch t ki m ch khơng ho t đ ng vì khi n ho t đ ng vì khơng b sai h ng (ngay c khi khơng cĩ cĩ s n ph m cu i cùng s n ph m cu i cùng ) khơng phong to s khơng phong t a s truy n truy n thơng tin t ng thơng tin t ng h p enzym h p enzym ch t ki m ch Các ho t đ ng ch t ki m ch khơng ho t đ ng gen S n ph m c u cu i cùng trúc Ch t ki m ch ho t đ ng khơng phong t a s truy n thơng tin t ng h p enzym Khơng cĩ s truy n thơng tin khơng t ng h p enzym D ng hoang d i Th đ t bi n Hình 3: Mơ hình ki m ch b ng s n ph m cu i cùng
- N u trong mơi trư ng cĩ m t nhi u cơ ch t thì trư c h t x y ra s t ng h p c a enzym nào xúc tác phân hu cơ ch t d s d ng nh t. S t ng h p c a các enzym khác b c ch b i s ki m ch d hố. Thơng thư ng thì glucoza là cơ ch t thích h p nh t. 1.3.2 Nh ng sai h ng di truy n c a đi u hồ trao đ i ch t Các cơ ch đi u hồ trao đ i ch t cĩ th b thay đ i do nh ng đ t bi n d n t i s t ng h p th a các ch t trao đ i ch t. Nh ng enzyme d l p th ngồi v trí ph n ng v i cơ ch t, chúng cịn m t v trí khác đ i v i s n ph m cu i cùng (hình 2). V trí th 2 này g i là trung tâm d l p th . Hai v trí này tách bi t nhau v khơng gian và khác nhau v c u trúc. M t đ t bi n cĩ th d n đ n k t qu làm protein enzyme d l p th b thay đ i b ng cách m t đi kh năng ph n ng v i ch t hi u ng nhưng v n cịn ho t tính xúc tác. M t protein b bi n đ i như v y v n cịn ho t đ ng ngay c khi cĩ m t s n ph m cu i cùng nĩ d n đ n s t ng h p th a c a s n ph m cu i cùng tương ng (hình 2 phía bên ph i). Trong s ki m ch t ng h p enzym x y ra nh ng ph n ng quy t li t trong ph m vi thơng tin di truy n, s phiên âm (hình 3). S đi u hồ t ng h p enzym cĩ th b r i lo n do nh ng đ t bi n khác nhau. Nh ng đ t bi n cĩ th đ ng ch m đ n gen ki m ch d n t i m t sai h ng c a ch t ki m ch ho c làm bi n m t nĩ; hay đ ng ch m đ n gen đi u khi n và làm cho gen này m t kh năng tác d ng v i ch t ki m ch (bên ph i hình 3). Tồn b nh ng sai h ng tương ng cũng cĩ th bi u hi n s c m ng enzyme. Nh nh ng s sai h ng y mà các enzyme c m ng tr thành các enzyme c u trúc, nghĩa là chúng t n t i trong t bào khơng ph thu c vào cơ ch t s ki m ch d hố b m t đi. CHƯƠNG II: NH NG V N ð K THU T VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG TRONG CƠNG NGH VI SINH V T S n xu t sinh kh i và các s n ph m trao đ i ch t trong quá trình lên men cĩ nhi u đi m gi ng nhau v phương pháp và k thu t. Vi c áp d ng k thu t và phương pháp tuỳ t ng đ i tư ng vi sinh v t và m c tiêu s n ph m cu i cùng. Trên cơ s đĩ cĩ th áp d ng nh ng m c tiêu và phương pháp riêng. Chính vì th khơng th cĩ m t phương pháp chung cho t t c các s n ph m. Vi c áp d ng k thu t và phương pháp ch cĩ th trên cơ s nh ng nguyên t c chung c a các k thu t và phương pháp đã trình bày. Vì th , trong chương này s gi i thi u nh ng nguyên t c chung c a k thu t và phương pháp đư c áp d ng r ng rãi trong các ngành vi sinh cơng nghi p. Các nguyên t c chung đĩ bao g m vi c tuy n ch n gi ng vi sinh v t, gi gi ng vi sinh v t, các quá trình và thi t b
- N u trong mơi trư ng cĩ m t nhi u cơ ch t thì trư c h t x y ra s t ng h p c a enzym nào xúc tác phân hu cơ ch t d s d ng nh t. S t ng h p c a các enzym khác b c ch b i s ki m ch d hố. Thơng thư ng thì glucoza là cơ ch t thích h p nh t. 1.3.2 Nh ng sai h ng di truy n c a đi u hồ trao đ i ch t Các cơ ch đi u hồ trao đ i ch t cĩ th b thay đ i do nh ng đ t bi n d n t i s t ng h p th a các ch t trao đ i ch t. Nh ng enzyme d l p th ngồi v trí ph n ng v i cơ ch t, chúng cịn m t v trí khác đ i v i s n ph m cu i cùng (hình 2). V trí th 2 này g i là trung tâm d l p th . Hai v trí này tách bi t nhau v khơng gian và khác nhau v c u trúc. M t đ t bi n cĩ th d n đ n k t qu làm protein enzyme d l p th b thay đ i b ng cách m t đi kh năng ph n ng v i ch t hi u ng nhưng v n cịn ho t tính xúc tác. M t protein b bi n đ i như v y v n cịn ho t đ ng ngay c khi cĩ m t s n ph m cu i cùng nĩ d n đ n s t ng h p th a c a s n ph m cu i cùng tương ng (hình 2 phía bên ph i). Trong s ki m ch t ng h p enzym x y ra nh ng ph n ng quy t li t trong ph m vi thơng tin di truy n, s phiên âm (hình 3). S đi u hồ t ng h p enzym cĩ th b r i lo n do nh ng đ t bi n khác nhau. Nh ng đ t bi n cĩ th đ ng ch m đ n gen ki m ch d n t i m t sai h ng c a ch t ki m ch ho c làm bi n m t nĩ; hay đ ng ch m đ n gen đi u khi n và làm cho gen này m t kh năng tác d ng v i ch t ki m ch (bên ph i hình 3). Tồn b nh ng sai h ng tương ng cũng cĩ th bi u hi n s c m ng enzyme. Nh nh ng s sai h ng y mà các enzyme c m ng tr thành các enzyme c u trúc, nghĩa là chúng t n t i trong t bào khơng ph thu c vào cơ ch t s ki m ch d hố b m t đi. CHƯƠNG II: NH NG V N ð K THU T VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG TRONG CƠNG NGH VI SINH V T S n xu t sinh kh i và các s n ph m trao đ i ch t trong quá trình lên men cĩ nhi u đi m gi ng nhau v phương pháp và k thu t. Vi c áp d ng k thu t và phương pháp tuỳ t ng đ i tư ng vi sinh v t và m c tiêu s n ph m cu i cùng. Trên cơ s đĩ cĩ th áp d ng nh ng m c tiêu và phương pháp riêng. Chính vì th khơng th cĩ m t phương pháp chung cho t t c các s n ph m. Vi c áp d ng k thu t và phương pháp ch cĩ th trên cơ s nh ng nguyên t c chung c a các k thu t và phương pháp đã trình bày. Vì th , trong chương này s gi i thi u nh ng nguyên t c chung c a k thu t và phương pháp đư c áp d ng r ng rãi trong các ngành vi sinh cơng nghi p. Các nguyên t c chung đĩ bao g m vi c tuy n ch n gi ng vi sinh v t, gi gi ng vi sinh v t, các quá trình và thi t b
- lên men cơ b n, m t s k thu t và phương pháp chính đ thu nh n s n ph m lên men. 2.1 Gi ng vi sinh v t 2.1.1 Yêu c u v gi ng vi sinh v t cơng nghi p Các ch ng vi sinh v t mu n đem vào s n xu t l n ph i b o đ m các tiêu chu n sau đây: Ph i cho s n ph m mong mu n v i năng su t cao, ch t lư ng t t, cĩ ý nghĩa kinh t trong s n xu t và ít s n ph m ph khơng mong mu n. S d ng nguyên li u s n cĩ, r ti n Th i gian lên men ng n. D tách sinh kh i hay s n ph m sau lên men. Vi sinh v t ph i thu n ch ng, khơng ch a vi sinh v t l , đ c bi t khơng ch a bacteriophage ký sinh. Ch ng vi sinh v t ph i kho , phát tri n d dàng và nhanh chĩng, cho nhi u t bào dinh dư ng ho c các bào t ho c các hình th c tái sinh khác. Cĩ kh năng ch ng, ch u các đi u ki n b t l i c a mơi trư ng. D b o qu n, t n t i và n đ nh các đ c tính sinh lí, sinh hĩa su t trong th i gian s d ng. Cĩ kh năng thay đ i các đ c tính b ng các k thu t đ t bi n, k thu t gen đ khơng ng ng nâng cao năng su t và ch t lư ng s n ph m. 2.1.2 Ngu n gi ng vi sinh v t 2.1.2.1 Phân l p trong t nhiên Thiên nhiên là ngu n cung c p gi ng vơ t n cho cơng nghi p vi sinh v t. Các vi sinh v t s d ng trong cơng nghi p th c ph m cĩ th d dàng phân l p chúng t các lo i th c ăn, nư c u ng s n xu t theo phương pháp c truy n: t bánh men thu c b c, m c tương, s a chua Vi sinh v t s d ng trong cơng nghi p s n xu t kháng sinh thư ng đư c phân l p trong đ t, nư c nh ng vùng khác nhau. ð phân l p đư c m t ch ng vi sinh v t mong mu n t m t qu n th h n h p vi sinh v t trong t nhiên chúng ta ph i th c hi n các bư c sau: thu m u, hồ lỗng, c y lên mơi trư ng, nuơi, thu n khi t, ki m tra Các cơng vi c này đ u gi ng nhau khi nghiên c u trên các đ i tư ng vi rút, vi khu n, n m, t o, nguyên sinh đ ng v t, các đ ng v t khơng xương s ng lo i nh . ð hồ lỗng m u ngư i ta thư ng s d ng nư c mu i sinh lí (0,85% dung d ch NaCl) ho c nư c c t. ð i v i m t s lồi d ch t trong nư c c t ho c nư c mu i sinh lí như Pseudomonas thì dùng dung d ch peptone 0,1% đ làm lỗng. Sau khi pha lỗng thì đem c y r a trên mơi trư ng th ch r i đem nuơi trong t m 1 3 ngày. Ti p theo tách các khu n l c đi n hình và làm tinh khi t m t s l n trên mơi trư ng th ch đ tách riêng t ng khu n l c.
- ð i v i nhĩm vi sinh v t y m khí n u c y trên mơi trư ng th ch trong h p Petri ngư i ta ph i cho thêm các ch t kh hay g n kín b ng parafin ho c nuơi trong mơi trư ng khơng cĩ oxy. ð phân l p các ch ng s n xu t kháng sinh ho c kháng kháng sinh ngư i ta thư ng dùng phương pháp nhanh: hồ lỗng m u 10 ho c 100 l n, sau đĩ l y 1ml dung d ch hồ lỗng c y lên mơi trư ng th ch đã cĩ s n vi sinh v t c n tiêu di t ho c cơ ch t c n phân gi i. Sau khi nuơi 1 3 ngày trong t m thì đem xem xét nh ng khu n l c nào cĩ đ c tính mà chúng ta mong mu n thì ti n hành phân l p và thu n khi t nh ng ch ng cĩ ho t l c cao. ð phân l p đư c ch ng vi sinh v t mong mu n thì ph i ti n hành làm giàu s lư ng vi sinh v t đĩ, t c là ph i s d ng nh ng mơi trư ng và đi u ki n nuơi c y đ ch n l c các ch ng mong mu n và c ch các ch ng khơng mong mu n. 2.1.2.2 Thu nh n t các trung tâm gi gi ng Ngày nay cĩ nhi u trung tâm gi gi ng gi ng trên th gi i cĩ th cung c p cho chúng ta các gi ng vi sinh v t ph c v cho cơng tác nghiên c u, gi ng d y, s n xu t. M t s trung tâm gi gi ng như: M : ABBOTT, ATCC, NRRL Canada: CANAD 212 Nh t: FERM, HIR Úc: CC Trung qu c: IMASP 2.1.3 C i t o gi ng vi sinh v t Tr m t s ngành c a cơng ngh th c ph m ngư i ta cĩ th cĩ s d ng vi sinh v t ki u d i cịn h u h t các ngành cơng nghi p khác như s n xu t kháng sinh, vitamin, enzyme v.v. ngư i ta đ u dùng các bi n ch ng. 2.1.3.1 Ưu như c đi m khi s d ng bi n ch ng * Ưu đi m: Cho năng su t cao Th i gian lên men ng n và ít t o b t trong khi lên men Ít t o s n ph m ph trong quá trình lên men T o đư c nhi u s n ph m quí mà ch ng ki u d i khơng cĩ đư c, ví d như: insulin, kháng nguyên Hbs (ch ng vim gan B) v.v. Kh năng ch ng, ch u các đi u ki n b t l i c a mơi trư ng cao. * Như c: ðịi h i cơng ngh cao Trong quá trình s n xu t cĩ th xu t hi n hi n tư ng h i bi n 2.1.3.2 Phương pháp t o gi ng m i ð t o ra gi ng vi sinh v t m i ngư i ta cĩ th s d ng nhi u phương pháp khác nhau:
- ð t bi n nhân t o và ch n l a: đây là cơng vi c c a các phịng thí nghi m ho c các trung tâm nghiên c u nh m tìm ra các ch ng vi sinh v t cĩ năng su t cao ho c s n xu t đư c nh ng s n ph m mà mình mong mu n. Tái t h p gen: s d ng các kh năng bi n n p, ti p h p, t i n p, lai t bào ch t vi sinh v t và các k thu t gen đ th c hi n vi c t o ra các cá th m i v i nh ng b gen theo ý mu n. L a ch n thư ng xuyên: cơng vi c này thư ng th c hi n các phịng thí nghi m c a các nhà máy nh m gi đư c các cá th t t trong qu n th vi sinh v t. Khi ki m tra lo i b các đ t bi n ng u nhiên khơng cho năng su t cao ho c cĩ nh ng bi u hi n b t l i và gi nh ng cá th thích nghi t t trong đi u ki n s n xu t. 2.1.4 Gi gi ng vi sinh v t 2.1.4.1 Ý nghĩa và nhi m v c a cơng tác gi gi ng Gi gi ng vi sinh v t là m t cơng vi c cĩ ý nghĩa vơ cùng l n. Nĩ giúp cho chúng ta gi đư c các đ c tính quí (khơng b thối hố) c a vi sinh v t và b o đ m cung c p gi ng cho các quá trình s n xu t. Nhi m v c a cơng tác gi gi ng là s d ng các k thu t c n thi t đ gi cho vi sinh v t cĩ t l s ng cao, các đ c tính di truy n khơng b bi n đ i và khơng b t p nhi m b i vi sinh v t l . 2.1.4.2 Các phương pháp gi gi ng Cĩ r t nhi u phương pháp gi gi ng vi sinh v t. Tuỳ theo trang thi t b và lo i vi sinh v t c n gi mà chúng ta cĩ th s d ng m t trong các phương pháp sau: Gi gi ng trên mơi trư ng th ch nghiêng Gi gi ng dư i l p d u khống Gi gi ng trong cát Gi gi ng trong đ t Gi gi ng trên silicagen Gi gi ng trên các lo i h t ngũ c c (lúa, ngơ, kê ) Gi gi ng trên gi y l c Gi gi ng trên các mi ng gelatin Gi gi ng b ng phương pháp l nh đơng Gi gi ng b ng phương pháp đơng khơ 2.2 Dinh dư ng và mơi trư ng nuơi c y vi sinh v t 2.2.1 Quá trình và nhu c u dinh dư ng t bào vi sinh v t Trong quá trình s ng t bào vi sinh v t khơng ng ng trao đ i ch t v i mơi trư ng xung quanh. T bào vi sinh v t tuy r t nh nhưng vì h p thu các ch t dinh dư ng và th i các s n ph m trao đ i ch t qua tồn b b m t t bào cho nên cư ng đ trao đ i ch t c a chúng là r t l n. Các ch t dinh dư ng qua màng vào t bào và đư c chuy n hố đ t o thành nh ng ch t riêng bi t c n
- thi t cho vi c xây d ng t bào. Nh quá trình đ ng hố các t bào m i cĩ th sinh trư ng, phát tri n tăng sinh kh i, đ ng th i sinh ra các s n ph m trao đ i ch t. S bi n đ i các ch t dinh dư ng bao g m nhi u ph n ng hố sinh khác nhau nh h enzym theo con đư ng trao đ i ch t đ : 1. T o ra nh ng ch t cĩ trong thành ph n c a t bào 2. S n ra năng lư ng sinh h c c n thi t cho ho t đ ng s ng Nh ng ch t dinh dư ng khi đã là nh ng h p ch t cĩ phân t nh cĩ th đi qua màng t bào vi sinh v t và tham gia vào 2 loai ph n ng: Bi n đ i d hố làm xu t hi n nh ng s n ph m cĩ c u trúc đơn gi n hơn. Nh ng bi n đ i d hố này cung c p cho vi sinh v t năng lư ng chuy n hố d ng ATP ho c nh ng h p ch t giàu năng lư ng khác. M t s nh ng s n ph m d hố th i đi, m t s khác làm v t li u ho c làm ti n ch t cho các ph n ng đ ng hố. Bi n đ i đ ng hố, đ m b o s t ng h p c a thành ph n m i cĩ c u trúc ph c t p hơn và phân t lư ng cao hơn g i là quá trình sinh t ng h p. Các ch t dinh dư ng c a vi sinh v t ch y u l y mơi trư ng xung quanh. Cho nên thành ph n c a mơi trư ng dinh dư ng b o đ m cung c p các nguyên t C, H, O, N, P, S, Ca, Fe và các nguyên t vi lư ng. 2.2.2 Mơi trư ng nuơi c y vi sinh v t 2.2.2.1 Phân lo i mơi trư ng 1. Phân lo i theo thành ph n cĩ trong mơi trư ng : + Mơi trư ng t nhiên: cĩ thành ph n khơng xác đ nh, đư c ch t o t đ ng hay th c v t. + Mơi trư ng t ng h p: g m nh ng ch t hố h c tinh khi t và đư c l y v i n ng đ cho trư c. + Mơi trư ng bán t ng h p. 2. Phân lo i theo tr ng thái v t lí: + Mơi trư ng l ng: dùng đ tăng sinh, tích lu các s n ph m trao đ i ch t, phát hi n các đ c tính sinh lí, sinh hố, đ gi gi ng và b o qu n nhi u lo i vi sinh v t khơng phát tri n đư c trên mơi trư ng đ c. + Mơi trư ng đ c: dùng đ phân l p thu khu n l c r i, nghiên c u đ nh danh, gi gi ng, đ m s lư ng vi sinh v t. + Mơi trư ng x p: dùng trong cơng ngh vi sinh v t. 2.2.2.2 Nguyên li u dùng chu n b mơi trư ng trong cơng ngh vi sinh v t 1. Nguyên li u cung c p ngu n cacbon Cacbon chi m m t ph n r t l n trong t bào vi sinh v t, chính vì v y nh ng h p ch t ch a cacbon cĩ ý nghĩa hàng đ u trong s s ng c a vi sinh v t. Ngu n th c ăn cacbon ch y u c a vi sinh v t là hydratcacbon. Các h p ch t cĩ phân t th p như m t s đư ng thì vi sinh v t cĩ th đ ng hố tr c ti p.
- Cịn các h p ch t cao phân t (tinh b t, xenlulo ) s đư c phân hu nh các enzyme do vi sinh v t ti t ra. Trong các hydratcacbon thi glucose là m t ngu n cacbon v n năng đ i v i vi sinh v t. Quá trình bi n đ i glucose trong t bào vi sinh v t cĩ th di n ra b ng 3 con đư ng: chu trình Embden Meyerhof Parnas (EMP); pentoza; Entner Dondoroff. T t c đ u d n t i t o thành axít pyruvic r i t đĩ đi vào các quá trình khác nhau. Các enzym CO 2, rư u, các s n ph m k khí khác Tinh b t amylaza → glucose CO , H O, các axít h u cơ và các s n ph m trao Các enzym 2 2 Qt. ngo i bào đ i hi u khí Ngồi ra vi sinh v t cĩ th đ ng hố m t s các cacbuahydro: CH 3 (CH 2)n CH 3 CH 3 (CH 2)n CH 2OH CH 3 (CH 2)n CHO CH 3 (CH 2)n COOH Ankan alkanol alkanal axít béo Axetyl CoA. ð i v i ch t béo: Ch t béo triglycerit axít béo palmityl CoA axetyl CoA 2. Nguyên li u cung c p ngu n nitơ Vi sinh v t c n nitơ đ xây d ng t bào vì t t c các thành ph n quan tr ng c a t bào đ u cĩ ch a nitơ (protein, axít nucleic, enzym ). Axít amin t o ra protein. Các axit amin trong t bào vi sinh v t đư c t o thành do quá trình trao đ i cacbon và nitơ. Nitơ trong khơng khí r t phong phú nhưng nĩ b n v ng v m t hố h c và ch cĩ các vi sinh v t c đ nh nitơ m i cĩ kh năng đ ng hố chúng. Cịn các ngu n nitơ dùng trong lên men c a cơng ngh vi sinh v t là các h p ch t nitơ vơ cơ và h u cơ. Các axit amin thư ng khơng đư c vi sinh v t s d ng tr c ti p ngay mà ph i qua 2 lo i ph n ng: ho c kh amin ho c kh cacboxil. Kh amin: E.deza min aza R CH COOH + O 2 → R C COOH + NH 3 NH 2 O Như v y, ch cĩ nh ng vi sinh v t nào cĩ kh năng kh amin m i cĩ kh năng s d ng axit amin. Quá trình này thư ng x y ra nh ng vùng pH=6,5 ÷ 7,5. Khi pH vùng axít thì x y ra ph n ng kh cacboxyl:
- E. R CH COOH → R CH2 NH 2 + CO 2 NH 2 (S n ph m decacboxyl c a m t s các axit amin cĩ đ c t , ví d : t lizin cadaverin). Ngu n nitơ h u cơ thư ng là các h p ch t ph c t p nên đ u tiên vi sinh v t ph i ti t vào mơi trư ng enzym proteaza đ thu phân. Các ngu n nitơ vơ cơ ureaza Urê: (NH 2)2CO + H 2O → 2NH 3 + CO 2 HNO3: 4AH 2 + HNO 3 NH 3 + 3H 2O AH 2 ch t kh cĩ trong mơi trư ng. Ho c : HNO 3 HNO 2 (HNO) 2 NH 2OH NH 3 Quá trình này nh h enzym nitratreductaza T t c các lo i vi sinh v t đ u đ ng hố đư c mu i amơn. Nhưng đ s d ng đư c nitơ vi sinh v t đ u ph i tách NH 3. 3. Nguyên li u cung c p các ch t khống * Các h p ch t photpho: nh hư ng l n quá trình trao đ i ch t c a t bào vi sinh v t. Trong t bào vi sinh v t thư ng g p các h p ch t polyphotphat, chúng cĩ ch c năng tham gia v n chuy n glucose qua màng t bào d n đ n quá trình photphoril hố glucose. Ngu n photpho cĩ th là vơ cơ ho c cĩ trong các lo i nguyên li u h u cơ. Vi sinh v t s d ng nhanh nh t là các h p ch t photpho vơ cơ hồ tan, cịn photpho h u cơ s d ng ít và ch m. Tuy nhiên nhu c u v photpho ph thu c vào ch ng vi sinh v t, dư cũng nh hư ng x u. * Các ch t khống khác: Mg, Na, Fe, K, Al, Li, Rb, Mn l y t mơi trư ng dinh dư ng. Các ch t này cĩ ý nghĩa khác nhau đ i v i vi sinh v t: cĩ m t s kim lo i tham gia vào c u t o phân t ho c làm thay đ i ho t l c enzym. Tuy nhiên n ng đ các ch t này cũng n m trong m t gi i h n. 4. Các ch t kích thích sinh trư ng: Cao ngơ Cao n m men D ch ép trái cây 5. Ch t béo trong cơng ngh vi sinh v t D u béo (l c, đ u tương, ngơ, lanh ): thư ng dùng làm c t phá b t. M t khác n u vi sinh v t cĩ kh năng ti t ra enzym lypaza s phân hu ch t béo đ n axetyl CoA và đ ng hố ti p. Chú ý: khơng dùng quá nhi u d u phá b t cĩ th nh hư ng x u đ n quá trình lên men: đ nh t l n, t o nhũ tương c a các h t xà phịng. 6. Nư c
- Trong cơng ngh vi sinh v t nư c đư c s d ng nhi u và v i nhi u m c đích khác nhau. Ch t lư ng c a nư c cĩ nh hư ng đ n ti n trình cơng ngh và ch t lư ng c a s n ph m. Do đĩ, tuỳ vào m c đích s d ng mà ph i b o đ m yêu c u v các ch tiêu ch t lư ng c a nư c như: đ c ng, đ oxy hố, vi sinh 2.3 Các phương pháp lên men Cĩ nhi u cách đ phân lo i các phương pháp lên men. D a vào cách n p li u và thu h i bán thành ph m sau lên men ngư i ta chia ra lên men gián đo n, liên t c và bán liên t c. Lên men gián đo n th c hi n theo t ng m nên thư ng cĩ năng su t th p và chu kì s n xu t b kéo dài. Lên men liên t c thì ngư c l i, nguyên li u liên t c vào và s n ph m sau lên men liên t c đi ra. Lên men bán liên t c là hình th c k t h p gi a hai phương pháp trên. D a vào thành ph n đ ng nh t hay khơng đ ng nh t c a canh trư ng ngư i ta chia ra lên men b m t (n i), lên men b sâu (chìm) và bán r n. Trong lên men b m t, vi sinh v t phát tri n trên b m t c a mơi trư ng nuơi c y và l y khơng khí t m t thống c a mơi trư ng. Phương pháp này thư ng s d ng đ s n xu t axit citric và m t s enzyme. Như c đi m l n nh t c a phương pháp này là t n kém b m t. Tuy nhiên, do đ u tư ít nên ch ng m c nào đĩ v n đư c s d ng. Lên men bán r n là phương pháp trung gian gi a lên men b m t và b sâu. Hàm lư ng nư c trong mơi trư ng chi m kho ng 70% ch t khơ. M t s enzyme hi n nay đư c s n xu t theo phương pháp này. Ngư i ta c i ti n phương pháp này b ng thi t b thùng quay nh m cung c p đ oxy cho quá trình lên men và th c hi n luơn khâu s y khơ sau lên men. ði u khĩ khăn là do s truy n nhi t kém c a các ch t đ n nên khĩ th c hi n t t khâu thanh trùng. Lên men chìm là phương pháp đư c s d ng nhi u nh t. Nĩ cĩ th cho phép ki m sốt đư c tồn b quá trình lên men m t cách thu n l i, ít t n kém m t b ng. Do h th ng khu y tr n t t nên tồn b mơi trư ng nuơi c y là m t h th ng nh t. 2.4 Thu h i s n ph m ð thu h i s n ph m ph i qua nhi u bư c. S lư ng các bư c ph thu c vào nguyên li u ban đ u, n ng đ ban đ u, s n đ nh v m t sinh h c c a s n ph m và m c đ yêu c u v đ tinh khi t c a s n ph m. Bư c đ u c a vi c thu h i s n ph m là tách t bào và các s n ph m khơng hồ tan ra kh i d ch lên men b ng cách l c ho c l ng. ð trích li các s n ph m bên trong t bào thì ph i phá v t bào b ng các phương pháp v t lí (siêu âm, ép, l nh đơng r i tan giá ) ho c các phương pháp hố h c (x lí b ng axit, trích li b ng axeton ) ho c b ng phương pháp sinh h c (dùng enzyme). N u s d ng axit thì s n ph m ph i b n v ng trong mơi trư ng axit.
- Các s n ph m lên men cĩ trong mơi trư ng ít thì ph i làm đ m đ c. Các phương pháp thư ng dùng đ tách s n ph m như: l c, ly tâm, l ng, trích li, s c kí, cơ đ c, k t t a, k t tinh, tuy n n i, s y khơ, nghi n . CHƯƠNG III : S N XU T SINH KH I VI SINH V T 3.1 S n xu t protein đơn bào 3.1.1 Ưu, như c đi m c a s n xu t protein đơn bào 1. Ưu: Ít t n di n tích T c đ sinh trư ng cao: g p 100 ÷ 1000 l n so v i đ i gia súc Ví d : đ s n xu t 1t protein c n: + Tr ng 4ha đ u trong 3 tháng + Nuơi 4 con bị trong 15 ÷18 tháng + Nuơi 300m 3 vi sinh v t trong 24h Khơng ph thu c vào khí h u Thành ph n và giá tr dinh dư ng c a sinh kh i cĩ th đi u ch nh b ng cách thay đ i thành ph n mơi trư ng, đi u ki n nu i c y ho c t o gi ng m i. S d ng nguyên li u s n cĩ, r ti n. 2. Như c: Trong sinh kh i c a vi sinh v t ch a nhi u axít nucleic (10 ÷ 20%) khơng cĩ l i cho s c kho c a con ngư i . Protein vi sinh v t cĩ hương v chưa cao. 3.1.2 Các yêu c u cơ b n c a vi c s n xu t protein đơn bào ð đ t đư c hi u qu kinh t cao trong vi c s n xu t sinh kh i vi sinh v t c n ph i b o đ m các yêu c u sau: 1. S d ng nguyên li u r ti n v i thu ho ch cao. ð đ t đư c năng su t cao c n lưu ý đ n hi u su t chuy n hố nguyên li u c a vi sinh v t. Các d ng nguyên li u đư c quan tâm nhi u: Cacbuahydro: vi sinh v t cĩ kh năng chuy n hố 100% đ t o thành sinh kh i. Hydratcacbon (r đư ng, d ch ki m sunfit, xenluloza, tinh b t, c n s a ): vi sinh v t cĩ kh năng chuy n hố 50% v t ch t khơ này sang sinh kh i. 2. T c đ sinh trư ng cao: nĩi chung t c đ sinh trư ng c a vi sinh v t r t l n, th i gian nhân đơi c a chúng ng n. Vi khu n 0,3 2 gi N m men và t o 2 6 gi N m s i kho ng 10 gi
- Các s n ph m lên men cĩ trong mơi trư ng ít thì ph i làm đ m đ c. Các phương pháp thư ng dùng đ tách s n ph m như: l c, ly tâm, l ng, trích li, s c kí, cơ đ c, k t t a, k t tinh, tuy n n i, s y khơ, nghi n . CHƯƠNG III : S N XU T SINH KH I VI SINH V T 3.1 S n xu t protein đơn bào 3.1.1 Ưu, như c đi m c a s n xu t protein đơn bào 1. Ưu: Ít t n di n tích T c đ sinh trư ng cao: g p 100 ÷ 1000 l n so v i đ i gia súc Ví d : đ s n xu t 1t protein c n: + Tr ng 4ha đ u trong 3 tháng + Nuơi 4 con bị trong 15 ÷18 tháng + Nuơi 300m 3 vi sinh v t trong 24h Khơng ph thu c vào khí h u Thành ph n và giá tr dinh dư ng c a sinh kh i cĩ th đi u ch nh b ng cách thay đ i thành ph n mơi trư ng, đi u ki n nu i c y ho c t o gi ng m i. S d ng nguyên li u s n cĩ, r ti n. 2. Như c: Trong sinh kh i c a vi sinh v t ch a nhi u axít nucleic (10 ÷ 20%) khơng cĩ l i cho s c kho c a con ngư i . Protein vi sinh v t cĩ hương v chưa cao. 3.1.2 Các yêu c u cơ b n c a vi c s n xu t protein đơn bào ð đ t đư c hi u qu kinh t cao trong vi c s n xu t sinh kh i vi sinh v t c n ph i b o đ m các yêu c u sau: 1. S d ng nguyên li u r ti n v i thu ho ch cao. ð đ t đư c năng su t cao c n lưu ý đ n hi u su t chuy n hố nguyên li u c a vi sinh v t. Các d ng nguyên li u đư c quan tâm nhi u: Cacbuahydro: vi sinh v t cĩ kh năng chuy n hố 100% đ t o thành sinh kh i. Hydratcacbon (r đư ng, d ch ki m sunfit, xenluloza, tinh b t, c n s a ): vi sinh v t cĩ kh năng chuy n hố 50% v t ch t khơ này sang sinh kh i. 2. T c đ sinh trư ng cao: nĩi chung t c đ sinh trư ng c a vi sinh v t r t l n, th i gian nhân đơi c a chúng ng n. Vi khu n 0,3 2 gi N m men và t o 2 6 gi N m s i kho ng 10 gi
- Gà mái 500 gi Heo 1000 gi Trâu bị 2000 gi Như v y trong cùng m t th i gian n u nuơi c y vi sinh v t đ thu nh n sinh kh i s thu đư c m t kh i lư ng cao hơn r t nhi u so v i các sinh v t khác. 3. Hàm lư ng protein cao: Hàm lư ng protein ph thu c vào ch ng và ch u nh hư ng nhi u đi u ki n nu i c y. Nĩi chung hàm lư ng protein vi sinh v t đ t 50 60%. 4. Ch t lư ng protein cao: ðánh giá ch t lư ng protein ngư i ta hay quan tâm đ n hàm lư ng axit amin khơng thay th . Tiêu chu n này cũng mang tính ch t lồi. Thành ph n axit amin c a protein vi sinh v t gi ng như trong th t và s a. Protein vi sinh v t giàu lizin nhưng các axit amin ch a lưu huỳnh l i th p. 5. Kh năng tiêu hố c a protein: Kh năng tiêu hố protein vi sinh v t b h n ch b i các thành ph n nitơ phi protein (như axít nucleic, peptit c a thành t bào). Tuy nhiên n u protein đư c tách kh i t bào thì kh i quan tâm. Do đĩ b n ch t thành t bào là tiêu chu n đ l a ch n vi sinh v t dùng trong s n xu t protein vi sinh v t. 6. S an tồn v đ c t : Các vi sinh v t gây b nh ho c cĩ ch a các thành ph n gây đ c nghi ng thì khơng đư c dùng đ s n xu t protein. Yêu c u hàm lư ng axít nucleic ph i th p, hàm lư ng c a nĩ càng cao thì càng làm gi m giá tr c a protein. Khi tiêu hố các axít nucleic s phân hu ti p thành các nucleotit, sau đĩ l i đư c phân hu ti p thành ademin ho c guanin và cu i cùng thành axít uric. Trong cơ th ngư i khơng cĩ enzym urinaza do đĩ uric khơng chuy n hố ti p. S tích t axít uric s gây nên b nh th p kh p, t o ra s i th n, s i bàng quang do đ hồ tan th p c a axít này. Lư ng axít nucleic h p th qua dinh dư ng khơng đư c qua 2g/ngày. đ ng v t v n đ này khơng quan tr ng vì chúng cĩ kh năng đ ng hố axít uric. Ta cĩ th làm gi m l ơng nucleic b ng nh ng bi n pháp sau: Gi m m nh t c đ sinh trư ng. Chi t rút ARN=dung d ch NaCl 10% nĩng. Thu phân ARN b ng ki m và tách protein hồ tan trong đĩ b ng k t t a. Phân hu ARN b i enzym nucleaza đưa vào ho c c a b n thân t bào. Dùng phương pháp gây chống nhi t theo 3 bư c: đ u tiên các t bào đư c đun nĩng lên 68 oC trong 5 giây. Sau đĩ 52,5 oC trong 2gi và cu i cùng 55 56 oC trong 1h. Vi c x lí này làm bi n tính riboxom và ho t hố các ribonucleaza. Các s n ph m thu phân đư c tách kh i t bào, hàm lư ng
- protein khơng b nh hư ng, hàm lư ng axít nucleic gi m t 1 2% lư ng v t ch t khơ c a t bào. 7. Nh ng v n đ k thu t: Vi sinh v t ph i d tách và d x lí. Các t bào l n như n m men đư c tách ra b ng li tâm t t hơn t bào vi khu n. Ch n các ch ng cĩ kh năng ch u nhi t s làm gi m chi phí cho vi c làm ngu i. Tính khơng m n c m v i s t p nhi m là ti n đ cho vi c làm ngu i s n xu t protein khơng vơ trùng. Ngồi ra ngư i ta cịn chú ý đ n kh năng đ ng hố đ ng th i nhi u ngu n cacbon khác nhau. 3.1.3 Vi sinh v t dùng trong s n xu t protein đơn bào 3.1.3.1 N m men Trong các đ i tư ng vi sinh v t đư c s d ng đ thu nh n protein thì n m men là lo i đư c nghiên c u s m nh t và đ n nay đã đư c áp d ng r ng rãi trên nhi u nư c. N m men giàu protein, vitamin (nh t là nhĩm B). Hàm lư ng protein dao đ ng 40 60% kh i lư ng ch t khơ. Protein c a n m men g n gi ng protein ngu n g c đ ng v t, ch a kho ng 20 lo i aminoacid, trong đĩ đ y đ các axit amin khơng thay th . Thành ph n các aminoacid c a n m men cân đ i hơn lúa mì, kém chút ít so v i s a, b t cá và s n ph m đ ng v t nĩi chung. S d ng r ng rãi: Candida, Torulopsis, Saccharomyces vì cacs lo i này kh năng chuy n hố các ch t cao, đa d ng và qui trình cơng ngh đơn gi n. 3.1.3.2 N m s i Khi dùng nguyên li u là tinh b t và xenlulo thì khơng th s d ng n m men đư c vì b n than n m men khơng ch a enzyme amylaza và xenlulaza, do dĩ ph i dùng n m s i. N m s i cĩ như c đi m là th i gian nhân đơi dài và hàm lư ng protein th p (kho ng 30%). Nhưng n m s i l i cĩ ưu đi m là r t d tách sinh kh i và t o hương v đ c bi t. ð dùng trong th c ph m ngư i ta s d ng các lồi Morchella . Lồi này cĩ v ngon, phù h p cho ch bi n th c ph m. Tuy nhiên, khĩ khăn nh t là nuơi c y Morchella r t t n kém và d b nhi m. Hi n nay nhi u nơi s d ng h n h p gi ng Trichoderma virid và n m men Sacch. Cerevisiae đ s n xu t protein. Ngồi ra, ngư i ta cịn s d ng h n h p Trichoderma virid v i Candida utilis ho c Endomycopsis fibuliger v i Candida utilis . 3.1.3.3 Vi khu n Vi khu n dùng đ s n xu t protein đơn bào thư ng đư c nuơi trên cacbuahydro. Ngư i ta thư ng s d ng các gi ng Pseudomonas, Flavobacterium , Mycobacterium, Nocardia . Các gi ng vi khu n này cĩ kh năng đ ng hố các ankal, cacbuahydro béo và thơm.
- ð i v i nguyên li u là metan ngư ita s d ng các gi ng Methylomonas methanica, Methylococens capsulatus . 3.1.3.4 Vi khu n lam và vi t o T t c m i lồi t o cĩ kích thư c nh bé và cĩ th thích h p v i vi c s d ng các phương pháp nuơi c y đ i v i vi sinh v t đ u g i là vi t o. Cịn vi khu n lam trư c đây g i là t o lam. V qui trình cơng ngh s n xu t thu sinh kh i c a 2 lo i này v cơ b n là gi ng nhau. Hàm lư ng protein chi m 40 60% lư ng ch t khơ, th m chí đ i v i Spirulina cịn lên đ n 60 70%. Hàm lư ng các aminoacid c a 2 lo i này khá cân đ i, g n v i protein tiêu chu n. Ngồi ra trong sinh kh i c a các lồi t o cịn ch a nhi u lo i vitamin: A, B, K, pantothenic và d ng tươi cịn ch a vitamin C. Spirulina ch a nhi u B 12 nên dùng làm th c ph m, m ph m, TAGS (gà cho tr ng đ , da vàng). Trong sinh kh i vi khu n lam cịn ch a kháng sinh nên b o qu n t t. 3.1.4 Qui trình cơng ngh s n xu t protein đơn bào 3.1.4.1 S n xu t protein đơn bào t vi sinh v t 1.Qui trình cơng ngh : Nguyên li u x lí chu n b mơi trư ng dinh dư ng Vi sinh v t thu n khi t nuơi c y vi sinh v t S n ph m hồn thi n x lítách sinh kh i lên men 2. Nguyên li u: Thư ng s d ng các lo i nguyên li u như: r đư ng, nư c th i c a nhà máy s a, d ch ki m sunfit, d ch th y phân g , tinh b t, dextrin, cacbuahydro 3. X lí: bao g m nhi u cơng đo n khác nhau ph thu c vào lo i nguyên li u và ch ng vi sinh v t s d ng: + Làm s ch: (tách t p ch t, lo i b các ph n khơng c n thi t, làm s ch vi sinh v t). + Làm nh nguyên li u + Thu phân nguyên li u (tinh b t, xenlulo ) 4. Chu n b mơi trư ng dinh dư ng: Ngồi cơ ch t chính là cacbon thì trong mơi trư ng c n ph i b sung thêm các ch t dinh dư ng ngu n nitơ, photpho, kali, magie, các nguyên t vi lư ng và các ch t sinh trư ng như cao ngơ, cao n m men S d ng các hố ch t đ đi u ch nh pH c a mơi trư ng đ n giá tr thích h p. 5. Chu n b gi ng: Nuơi c y nhân gi ng đ u tiên đư c th c hi n trong phịng thí nghi m, sau đĩ đư c nuơi c y ti p phân xư ng s n xu t. T l ti p gi ng chuy n c p là 1:10. Th i gian nuơi m i c p kho ng 15h. Trong quá trình
- nhân gi ng dùng nư c amoniac đ gi pH và ph i s c khí vơ trùng liên t c. Trong giai đo n này chú ý b o đ m vi c kh trùng mơi trư ng nuơi c y. 6. Lên men: Thư ng s d ng phương pháp lên men chìm và cĩ th ti n hành lên men gián đo n, liên t c ho c bán liên t c. Khi lên men chú ý đi u ch nh các o y u t : t , pH, mơi trư ng dinh dư ng, O 2, phá b t. 7.Tách sinh kh i: Tuỳ vào đi u ki n c th mà cĩ th s d ng các phương pháp khác nhau đ tách sinh kh i như l c, l ng, li tâm 8. X lí sinh kh i: Tuỳ vào m c đích s d ng mà quá trình x lí sinh kh i g m các cơng đo n sau: + R a + Chi t rút protein (lo i b t ARN b ng các phương pháp khác nhau) + S y: t t nh t là dùng phương pháp s y phun 3.1.4.2 S n xu t sinh kh i t o: ð c đi m t bào c a các lo i t o là cĩ di p l c t nên chúng cĩ kh năng quang h p. Ph n ng quang h p c a t o: CO 2 + 4H 2O CH 2O + 3H 2O + O 2 . S c đ nh và kh CO 2 thành hydratcacbon c a t o theo chu trình Kalvin. Nuơi t o ngồi vi c cung c p protein cịn cĩ tác d ng tránh đư c s làm giàu dinh dư ng đ i v i các thu v c do nư c th i đư c làm s ch b ng vi + 3 khu n gây nên (tránh tích t các ch t khống như NH4 , NO 3 , PO 4 ) 1. Yêu c u v t o gi ng: T c đ sinh trư ng nhanh Năng su t quang h p cao Cĩ s c ch ng ch u v i đi u ki n ngo i c nh Sinh kh i cĩ thành ph n hố h c thích h p T bào luơn tr ng thái huy n phù, khơng dính b t vào thành b ho c l ng xu ng đáy. D tách sinh kh i (nh v t, l c) 2. Các lo i t o thư ng dùng: Vit o: Chlorela, Scendemus, Dunaliella Vi khu n lam: Spirulina 3. Cơng ngh nuơi : * Qui trình cơng ngh : Chu n b mơi trư ng c y t o gi ng nuơi t o thu ho ch * Mơi trư ng: đ chu n bi mơi trư ng nuơi t o ngư i ta cĩ th s d ng nư c máy, nư c bi n, nư c th i đã qua x lí. C n b sung thêm các ch t khống c n thi t vào mơi trư ng cho t o phát tri n. * ði u ki n nuơi: t o thích h p v i mơi trư ng cĩ pH = 8,5 ÷10 và nhi t 0 đ 20 ÷40 C. Trong quá trình nuơi b o đ m cung c p đ ánh sáng và CO 2.
- * Thu ho ch: cĩ th thu ho ch t o b ng cách l c, v t ho c cào. ð t n d ng h t các ch t khống ngư i ta cĩ th s d ng l i mơi trư ng sau khi đã tách t o. 3.2 S n xu t n m men bánh mì: N m men bánh mì là sinh kh i c a ch ng Sacch.cerevisiae v n cịn s ng. 3.2.1 Yêu c u đ i v i gi ng n m men bánh mì Sinh s n nhanh Ch u đư c mơi trư ng r đư ng Cĩ l c làm n b t cao: cĩ kh năng lên men đư ng sacarose, glucese, maltose, cĩ ho t l c zimaza và maltaza cao. Ít b thay đ i khi b o qu n. T bào l n đ d tách sinh kh i. Ho t l c zimaza và maltaza là th i gian (phút) đ sinh ra 10ml khí CO 2 khi lên men dung d ch 5% đư ng glucoza ho c maltoza b ng men ép v i t l là 2,5% so v i lư ng d ch đư ng. 3.2.2 Cơng ngh s n xu t: 1. Qui trình cơng ngh : Chu n b mơi trư ng dinh dư ng c y gi ng nuơi tách n m men x lí thành ph m. 2. Chu n b mơi trư ng dinh dư ng: Ngư i ta thư ng s d ng r đư ng đ làm mơi trư ng nuơi c y n m men bánh mì. Trư c khi pha mơi trư ng thì c n ph i x lí r đư ng. R đư ng nghèo ch t dinh dư ng, đ c bi t là các ch t cung c p ngu n nitơ và photpho cho nên ph i b sung. Ngồi ra, đ tăng sinh kh i nhanh trong mơi trư ng c n ph i cĩ m t s vitamin như: biotin, inositon, axit pentotenic.v.v. 3. C y gi ng: Gi ng ph i b o đ m đúng yêu c u và đư c nuơi c y trư c cho đ s lư ng t bào. Quá trình nuơi c y gi ng c n th c hi n nghiêm ng t v ch đ vơ trùng và nhu c u dinh dư ng c a n m men. 4. Nuơi n m men: M c đích c a giai đo n này là t o đư c lư ng sinh kh i l n và cĩ ho t l c cao. ð n m men sinh trư ng và phát tri n t t thì trong quá trình lên men c n chú đ n các y u t như: nhi t đ gi trong kho ng 27 ÷30 0C; pH c a mơi trư ng 4 ÷5,5; cung c p đ y đ oxy; b o đ m n ng đ và thành ph n các ch t dinh dư ng theo yêu c u; n ng đ t bào n m men tích lu đư c ph i đ t m c thích h p. 5. Thu nh n sinh kh i: Sau khi lên men xong thì ti n hành tách sinh kh i. Cĩ th tách sinh kh i b ng cách l c ho c li tâm.
- 6. X lí n m men: Tuỳ theo yêu c u c a s n ph m (ư t ho c khơ) mà quá trình x lí khác nhau. ð thu nh n n m men ư t thì ti n hành r a sinh kh i đã thu đư c r i đem ép. N m men ư t khĩ b o qu n và th i gian b o qu n khơng lâu. ð b o qu n lâu thì c n ph i s y khơ n m men. Khi s y n m men chú ý khơng đ nhi t đ s y vư t quá 30 0C. 3.2.3 S n xu t men nư c: 1. Nguyên li u: b t, malt ho c ch ph m amylaza c a n m m c. 2. Mơi trư ng nhân gi ng: b t tr n nư c (t l 1:3) n u chin làm ngu i 48 50 oC b sung ch ph m amylaza (3% malt ho c 0,8 ÷ 1% ch ph m enzym n m m c như Asp.awamori ho c Asp.oryzae và d ch gi ng vi khu n. Gi 8 14 gi , cho đ n khi mơi trư ng đ t t i 11 ÷12 o axít (1 o=1ml NaOH 1N/100ml) thì đưa vào c y n m men. 3. D ch gi ng vi khu n: l y nư c malt cĩ n ng đ 12 oBx thêm 1 ít o CaCO 3. C y vi khu n Lactobacterium Delbruckii và gi nhi t đ 50 ÷ 52 C trong 1 ÷2 ngày. Trư c khi đưa vào s d ng ph i nhân gi ng ti p. 4. C y n m men: mơi trư ng sau khi đã axít hố đư c làm ngu i đ n 28 30 oC r i ti p gi ng n m men đã nuơi c y trư c vào (t l 5 ÷10%), gi nhi t đ này 14 ÷15 gi khơng s c khí ho c s c khí gián đo n. nhi t đ này vi khu n lactic ng ng tích t axít. N m men s d ng đư ng và axít đ tăng trư ng sinh kh i. Trong mơi trư ng cĩ axít n m men s phát tri n t t và h n ch các vi sinh v t l . CHƯƠNG IV: S N XU T AXIT AMIN Axit amin thư ng b sung vào th c ăn cho ngư i và gia súc. V i m c đích này ngư i ta c n đ n các axit amin khơng thay th . Trong đĩ, quan tr ng nh t là các axit amin L lyzin, L triptophan, L methionin, L treonin. Ph n l n các lo i protein đư c khai thác t th c v t do đĩ ho c thi u axit amin này ho c axit amin khác. Vì th , vi c b sung axit amin vào th c ph m s làm tăng giá tr c a protein. Ngồi ra, các axit amin cịn cĩ tính ch t làm tăng mùi v c a các s n ph m th c ph m. 4.1 Các phương pháp s n xu t axit amin: 4.1.1 Phương pháp t ng h p hố h c: Phương pháp này dùng đ s n xu t m t s axit amin như: glyxin, alanin, metyonin, triptophan. Phương pháp t ng h p hố h c thư ng cho m t h n h p các d ng đ ng phân L và D axit amin. Trong 2 d ng này ch cĩ d ng L là thích h p cho dinh dư ng. Do đĩ vi c tách 2 d ng này r t khĩ khăn và tr nên t n kém.
- 6. X lí n m men: Tuỳ theo yêu c u c a s n ph m (ư t ho c khơ) mà quá trình x lí khác nhau. ð thu nh n n m men ư t thì ti n hành r a sinh kh i đã thu đư c r i đem ép. N m men ư t khĩ b o qu n và th i gian b o qu n khơng lâu. ð b o qu n lâu thì c n ph i s y khơ n m men. Khi s y n m men chú ý khơng đ nhi t đ s y vư t quá 30 0C. 3.2.3 S n xu t men nư c: 1. Nguyên li u: b t, malt ho c ch ph m amylaza c a n m m c. 2. Mơi trư ng nhân gi ng: b t tr n nư c (t l 1:3) n u chin làm ngu i 48 50 oC b sung ch ph m amylaza (3% malt ho c 0,8 ÷ 1% ch ph m enzym n m m c như Asp.awamori ho c Asp.oryzae và d ch gi ng vi khu n. Gi 8 14 gi , cho đ n khi mơi trư ng đ t t i 11 ÷12 o axít (1 o=1ml NaOH 1N/100ml) thì đưa vào c y n m men. 3. D ch gi ng vi khu n: l y nư c malt cĩ n ng đ 12 oBx thêm 1 ít o CaCO 3. C y vi khu n Lactobacterium Delbruckii và gi nhi t đ 50 ÷ 52 C trong 1 ÷2 ngày. Trư c khi đưa vào s d ng ph i nhân gi ng ti p. 4. C y n m men: mơi trư ng sau khi đã axít hố đư c làm ngu i đ n 28 30 oC r i ti p gi ng n m men đã nuơi c y trư c vào (t l 5 ÷10%), gi nhi t đ này 14 ÷15 gi khơng s c khí ho c s c khí gián đo n. nhi t đ này vi khu n lactic ng ng tích t axít. N m men s d ng đư ng và axít đ tăng trư ng sinh kh i. Trong mơi trư ng cĩ axít n m men s phát tri n t t và h n ch các vi sinh v t l . CHƯƠNG IV: S N XU T AXIT AMIN Axit amin thư ng b sung vào th c ăn cho ngư i và gia súc. V i m c đích này ngư i ta c n đ n các axit amin khơng thay th . Trong đĩ, quan tr ng nh t là các axit amin L lyzin, L triptophan, L methionin, L treonin. Ph n l n các lo i protein đư c khai thác t th c v t do đĩ ho c thi u axit amin này ho c axit amin khác. Vì th , vi c b sung axit amin vào th c ph m s làm tăng giá tr c a protein. Ngồi ra, các axit amin cịn cĩ tính ch t làm tăng mùi v c a các s n ph m th c ph m. 4.1 Các phương pháp s n xu t axit amin: 4.1.1 Phương pháp t ng h p hố h c: Phương pháp này dùng đ s n xu t m t s axit amin như: glyxin, alanin, metyonin, triptophan. Phương pháp t ng h p hố h c thư ng cho m t h n h p các d ng đ ng phân L và D axit amin. Trong 2 d ng này ch cĩ d ng L là thích h p cho dinh dư ng. Do đĩ vi c tách 2 d ng này r t khĩ khăn và tr nên t n kém.
- 4.1.2 Phương pháp trích ly t d ch thu phân: Phương pháp này thư ng dùng đ thu nh n L cystein, L cystin, L leuxyn, L asparagin, L tyrozin. ð s n xu t axit amin theo phương pháp này, đ u tiên ph i ti n hành thu phân nguyên li u giàu protein và sau đĩ dùng các phương pháp khác nhau đ trích ly axit amin c n s n xu t ra kh i dung d ch thu phân. 4.1.3 Phương pháp t ng h p nh vi sinh v t: Phương pháp này cĩ 2 phương án: 1. Lên men tr c ti p: các axit amin đư c t o thành t các nguyên li u r ti n nh vi sinh v t. 2. Chuy n hố các ti n ch t c a axit amin nh vi sinh v t. S lên men tr c ti p cĩ ý nghĩa l n hơn và hi n nay đã hồn ch nh cơng ngh đ s n xu t hàng lo t các axit amin. 4.2 S n xu t axit amin nh vi sinh v t: 4.2.1 S t ng h p axit amin t bào vi sinh v t: Hystidin Glucoza Ribozo 5 P Glucozo 6 P Sixtein Eritrozo 4 P 3 P glyxerat Serin Glyxin Valin Triptophan Tirozin Semilalanin Pyruvat α xetoizovalerat CH 3COCOOH Lơxin Alanin +CO 2 Oxalatxetat (HOOCCOCH 2COOH) Xitrat Asparagin Aspartat Fumarat α xetoglutarat Lyzin Treonin Methionin Glutamat Izol ơxin Glutanin Prolin Arginin Sơ đ 2: Sơ đ t ng h p axit amin t bào vi sinh v t Các axit amin trong t bào vi sinh v t đư c t o thành do quá trình trao đ i cacbon và nitơ. Vi c t ng h p các axit amin tr i qua hàng lo t nh ng ph n ng ph c t p v i s xúc tác c a nhi u lo i enzym khác nhau, nhưng cĩ th qui v 2 lo i ph n ng là amin hố và chuy n amin:
- 1. Ph n ng amin hố: g m 2 giai đo n: • Giai đo n 1: t o iminoaxit. Giai đo n này khơng cĩ s tham gia c a enzym. NH R CO COOH + NH 3 R C COOH + H 2O • Giai đo n 2: chuy n iminoaxit thành aminoaxit nh enzym dehydrogenaza NH NH 2 dehydrogennaza R C COOH + H 2O → R C COOH NADH 2 NAD NADH 2: nicotinamitadenin dinucleotit d ng kh 2. Ph n ng chuy n amin: ph n ng này x y ra nh s xúc tác c a enzym aminotransferaza NH 2 R1 R2 R1 CO COOH + R 2 CH COOH CH NH 2 + CO COOH COOH 4.2.2 Qui trình cơng ngh : Nguyên li u x lí chu n b mơi trư ng dung d ch c y vi sinh v t nuơi vi sinh v t gi ng s n ph m x lí s n ph m lên men 1.Nguyên li u: b o đ m cung c p ngu n cacbon, nitơ và các nguyên t khác đ vi sinh v t phát tri n và t ng h p đư c nhi u s n ph m. Cung c p ngu n cacbon: dùng r đư ng, nguyên li u giàu tinh b t ho c m t s lo i nguyên li u khác. Ngu n nitơ: thư ng dùng là urê, cũng cĩ th dùng các lo i mu i amoni. Các h p ch t khống: KH 2PO 4, MgSO 4, MnSO 4 Các ch t kích thích sinh trư ng: vitamin, axit amin. 2.X lí: Làm s ch Thu phân
- 3.Chu n b mơi trư ng dinh dư ng: Cĩ n ng đ và thành ph n thích h p ph thu c vào ch ng vi sinh v t và gi ng s n xu t. ði u ch nh pH cho mơi trư ng và thanh trùng mơi trư ng. 4.Chu n b gi ng a.Ch ng vi sinh v t: ð s n xu t axit amin ngư i ta cĩ th s d ng nhi u ch ng vi sinh v t khác nhau, tuy nhiên đ s n xu t ngư i ta ph i t o các bi n ch ng ho c lo i b s c ch b ng s n ph m cu i cùng c a vi sinh v t. b.Nuơi gi ng: ð đ lư ng gi ng cho s n xu t ngư i ta ph i ti n hành nuơi c y qua nhi u bư c. Các ch ng vi sinh v t dùng trong s n xu t axit amin ph n l n là các đ t bi n cho nên n u c y chuy n nhi u l n s g p th h i bi n và nh hư ng đ n s c s n xu t. Trong s n xu t axit amin khơng bao gi đư c dùng sinh kh i c a m trư c làm gi ng cho m sau. 5.Lên men: Thư ng s d ng phương pháp lên men chìm. Trong quá trình lên men c n chú ý đi u ch nh các thơng s k thu t: nhi t đ lên men, pH mơi trư ng, s thơng khí, b sung các ch t dinh dư ng, phá b t và m t s các y u t khác. 6.Thu nh n s n ph m: Tuỳ thu c vào lo i s n ph m và m c đích s d ng mà quá trình thu nh n s n ph m khơng gi ng nhau: • Dùng đ ch bi n th c ăn gia súc: Thu nh n dư i d ng canh trư ng: H n h p sau khi lên men cơ đ c b t khơ Tách sinh kh i cơ đ c s n ph m • Dùng trong ch bi n th c ph m ho c y h c: Ph i tinh ch qua nhi u cơng đo n đ thu nh n các ch ph m k thu t ho c tinh khi t. 4.3 K thu t s n xu t m t s axit amin: 4.3.1 S n xu t L lyzin: 1. Ch ng vi sinh v t: Ch ng s n xu t là m t th đ t bi n c n homoxerin c a Corynebacterium glutamicum (cịn g i là Micrococus glutamicus ). Dư i đi u ki n lên men thích h p ch ng này cĩ th s n xu t t i 50g lyzin/lit mơi trư ng. Nguyên li u thư ng dùng là glucoza hay m t r v i n ng đ 150g/lit. 2. Phương trình lên men t ng quát: Brevib.raffe22 100C 6H12 O6+219O 2+86NH 3 → 35C 6H14 N2O2 + 16C 8H13 O4 + 262CO 2 + 380H 2O + 1669KJ
- 3. Cơ ch : Glucoza Pyruvat Oxalaxetat Aspactat 1 β Aspactyl photphat Aspactat β semialdehyt 3 2 Lyzin Homoxerin Treonin Methionin Izoleuxin Sơ đ 3: Cơ ch t ng h p lyzin c a Corynebacterium glutamicum 1 Enzym aspactokinaza; 2 Enzym homoxerindehydrogenaza;3 Enzym dihydropicolinat syntetaza. Lyzin là m t axit amin thu c h aspactat và đư c t ng h p qua m t con đư ng trao đ i ch t phân nhánh mà qua đĩ homoxerin, metionin, treonin, izolơxin cũng đư c t o thành. Nh ng đư ng ch m ch m bi u di n s c ch b i s n ph m cu i cùng. ch ng hoang d i lyzin và treonin cùng gây ra m t s c ch ph i h p (E) đ i v i aspactokinaza(1). Do khuy t homoxerindehydrogenaza(2) mà khơng cĩ s t o thành treonin. Dihydropicolinat Syntetaza(3) khơng m n c m d l p th nên s c ch b i s n ph m cu i cùng b tri t tiêu và cĩ s t ng h p th a lyzin (50g/l). 4. Lên men : Ngu n hydratcacbon thích h p cho t ng h p lyzin là glucose, fructose, maltose và saccarosse. Các đư ng như lactose, rafinose, pentose các ch ng sinh lyzin khơng đ ng hố đư c. Cho nên ngư i ta thư ng s d ng các lo i nguyên li u như r đư ng, d ch thu phân t tinh b t (ngơ, s n) đ làm mơi trư ng s n xu t lyzin. N ng đ đư ng trong mơi trư ng lên men kho ng 10 12%. Trong quá trình lên men, nh m đ tăng hi u su t thu h i lyzin cĩ th b sung thêm đư ng đ nâng cao n ng đ đư ng lên t i 25% (nhưng cũng th n tr ng vì cĩ khi hi u
- su t sinh lyzin khơng tăng mà cịn nh hư ng x u đ n vi sinh v t do làm tăng áp su t th m th u c a mơi trư ng). Ngu n nitơ hay dùng là urê, NH 3 ho c các mu i amon. T l gi a C:N đĩng vai trị quan tr ng, nĩ nh hư ng đ n hi u su t t ng h p lyzin. Thư ng b sung các mu i amon v i hàm lư ng kho ng 2%. Ngồi ra cịn ph i b sung vào mơi trư ng các ch t cung c p ngu n ph tpho như KH 2PO 4 và K 2HPO 4 (b o đ m lư ng phơtpho đ t 0,008 0,02mg/lít; n u n ng đ này lên đ n 1,6 2mg/lít thì s t o thành lyzin b ng ng). Do đĩ khơng nên dùng photphat amon đ làm ngu n cung c p nitơ và photpho. Ph i b sung các mu i cĩ ch a các nguyên t Mg, Fe, Cu, Mn (thư ng b sung MgSO 4 0,03%; cịn Fe, Cu, Mn cĩ trong r đư ng và cao ngơ). Các ch t kích thích sinh trư ng: + Biotin: c n kho ng 8 15mg/lít, n u quá ít (1 2mg/l) thì s n ph m ch y u s là axit glutamic, (biotin và B 1 cĩ trong cao ngơ, đ c bi t trong r đư ng mía cĩ nhi u biotin) + Thiamin(B 1): n u khơng cĩ s t o thành alanin + Treonin: khơng cĩ, ho c ít s kìm hãm s phát tri n c a vi sinh v t nhưng dư s d n t i s c ch b ng s n ph m cu i cùng. Hàm lư ng thích h p trong kho ng 200 800mg/l. + Methionin: nĩ nh hư ng t i sinh trư ng c a vi sinh v t, hàm lư ng thích h p: 150 250mg/l. Cĩ th dùng homoxerin đ thay cho treonin và methionin. B o đ m mơi trư ng cĩ pH=7 7,6 và ph i thanh trùng. Lư ng gi ng cho o vào đ lên men là 5 10%. Nhi t đ lên men là 30 32 C, cung c p O 2 2 4g/1l.h; trong quá trình lên men dùng urê ho c nư c NH 3 đ đi u ch nh pH. T ng th i gian lên men 50 72h. 5.Thu nh n s n ph m: Tuỳ vào d ng ch ph m (d ch nuơi c y, d ch cơ đ c, b t ho c tinh th ) mà quá trình thu nh n s n ph m cĩ khác nhau. D ch nuơi c y là ch ph m thu đư c sau lên men và cĩ th dùng tr c ti p pha vào th c ăn gia súc. Dung d ch cơ đ c: đ ch ng hư h ng thì d ch sau lên men đư c axít hố b ng HCl đ n pH=5 và b sung dung d ch NaHSO 3 25% (t l 0,4% so v i d ch lên men) r i đem cơ chân khơng cho đ n khi đ t n ng đ ch t khơ 35 40%. Ch ph m này dùng trong chăn nuơi. B t: t d ch cơ đ c cĩ th b sung thêm các ch t đ n (b t xương, cám ) r i s y khơ và nghi n nh . Ho c d ch cơ đ c đem s y phun đ thu ch ph m d ng b t.
- ð thu nh n các tinh th lyzin thì ph i s d ng nhi u phương pháp và ti n hành qua nhi u bư c: H n h p sau lên men l c (li tâm) sinh kh i dung d ch nh h p ph trao đ i ion Dùng dung d ch NH 4OH 2 3,5% đ nh h p ph . Dùng HCl axit hố đ n pH=5 r i cơ đ c đ n khi đ t n ng đ 30 50% làm l nh 10 12 oC đ tr tinh. ð cĩ ch ph m tinh khi t thì đem tinh th k t tinh l n 1 k t tinh l i nhi u l n (hồ tan vào c n). 4.3.2 S n xu t L treonin: Cho đ n nay treonin chưa đư c s n xu t qui mơ l n b ng con đư ng vi sinh v t vì vi c gây t o các th đ t bi n t ng h p th a L treonin g p nhi u khĩ khăn so v i lyzin. Cĩ th đ t đư c m t s s n xu t th a treonin nh 3 bư c đ t bi n sau: M t tính m n c m d l p th c a homoxerindehydrogenaza m n c m v i treonin. Tr dư ng izolơxin. Tr dư ng metionin. 4.3.3 S n xu t L triptophan: Nh vào s t ng h p c a vi sinh v t, L triptophan cĩ th thu nh n b ng hai con đư ng: chuy n ti n ch t c a triptophan thành triptophan nh s giúp đ c a các h enzym vi sinh v t; ho c thu nh n triptophan nh s đ t bi n do thi u tirozin và fenilalanin c a các ch ng vi sinh v t. 4.3.3.1 Phương pháp chuy n ti n ch t: 1. Ti n ch t: Nh vi sinh v t cĩ th thu nh n đư c triptophan t các ti n ch t khác nhau. Hi u su t thu h i s n ph m t các ti n ch t khác nhau là khơng gi ng nhau. M t s ti n ch t hay s d ng: Axit antranilic hi u su t thu h i 98,8% Indol 87,2% Indol + Cerin (1:2) 92,5% Indol + Cistein (1:2) 89,5% Indol + Alanin (1:4) 87,0% 2. Ch ng vi sinh v t: ð chuy n các ti n ch t ngư i ta cĩ th s d ng nhi u ch ng vi sinh v t khác nhau. Riêng đ i v i axit antranilic ngư i ta hay dùng nh t là n m men Candida utilis ho c Hansunella.
- 3. Cơ ch : Khi s d ng axit antranilic làm tièn ch t thì cơ ch c a quá trình như sau: COOH NH 2 NH axit antranilic indol COOH piridoxalfotfat CH 2─CH─COOH+H 2O HOCH 2─CHNH 2+ serin NH 2 NH NH Triptophan Sơ đ 4: Cơ ch chuy n axit antranilic thành triptophan 4. K thu t lên men: Quá trình s n xu t chia làm hai giai đo n: thu nh n sinh kh i và chuy n hố ti n ch t nh s giúp đ c a sinh kh i đã thu nh n đư c. Giai đo n đ u khơng khác m y so v i quá trình nuơi c y các lo i vi sinh v t gi ng khác. T c là quá trình cũng đi t ng gi ng g c ng nghi m bình tam giác lư ng sinh kh i thu đư c ph thu c vào phương pháp nuơi c y gi ng. H th y r ng n u lư ng gi ng đưa vào lên men càng l n thì m c đ chuy n hố c a axít antranilic càng l n. Ngu n cung c p cacbon cho gi ng phát tri n là sacaroza ho c m t r (v i hàm lư ng t 6,3 20%), ngu n cung c p nitơ là urê v i lư ng t 0,5 1%. Ngồi ra cịn b sung thêm (%): K 2HPO 4 0,01, MgSO 4 0,005,CaCl2 0,01. B o đ m mơi trư ng cĩ pH=7,5 ÷8 và vơ trùng. Ti n hành nuơi gi ng nhi t đ 28 ÷30 0C, th i gian nuơi c a m i c p khơng quá 24 gi . Yêu c u gi ng đ t 3 ÷5 gam sinh kh i khơ/1lít mơi trư ng. Giai đo n hai đư c th c hi n trong thi t b lên men. ð u tiên chu n b mơi trư ng nuơi gi ng trong thi t b lên men và chuy n men gi ng đã nuơi giai đo n 1 vào. Ti p t c nuơi gi ng trong 24 gi nhi t đ 28 ÷30 0C và thơng khí khơng ít hơn 7g O 2/l.h. N u trong quá trình nuơi gi ng cĩ xu t hi n b t thì ph i dùng d u phá b t. Sau 24 gi nuơi gi ng cho vào thi t b lên men dung d ch axít antranilic 5% trong rư u và dung d ch amoniac 50% đ lên men. Lúc này thơng khí b o đ m cung c p 3 ÷4 gam O 2/l.h.
- Sau khi cho dung d ch axít vào đư c 3 4 gi thì b sung thêm dung d ch r đư ng 25%. Ti p theo, c sau 12 gi thì b sung dung d ch r đư ng, sau 6 gi thì b sung dung d ch ammoniac và axit antranilic m t l n. T ng th i gian c a giai đo n 2 là 120 ÷140 gi . Quá trình lên men (giai đo n 2) th c hi n pH c a mơi trư ng ≈ 8,0 và nhi t đ lên men kho ng 30 0C. 3. Thu nh n s n ph m: Dung d ch sau lên men cĩ ch a 7,8 ÷12,5% ch t khơ, trong đĩ cĩ 0,3 ÷0,5% triptophan. Ph n l n triptophan (85 ÷88%) n m trong pha l ng. Do đĩ đ thu nh n ch ph m tinh khi t thì ph i tinh ch d ch l c. Cịn n u dùng cho chăn nuơi thì s d ng d ng cơ đ c cĩ c sinh kh i n m men. ð làm th c ăn gia súc thì d ch sau lên men đem cơ đ c cịn l i 1/3 th tích, sau đĩ đem s y trong thi t b s y phun (t o=110 ÷120 oC) đ thu nh n b t dùng b sung cho th c ăn gia súc. Trong thành ph n c a b t này g m cĩ: Ch t khơ 90% Protein 48 ÷54% Triptophan 1÷3% Vitamin (mg/kg): + B 1 : 15 ÷18,5 + B 2 : 24,5 ÷32,5 + PP : 620 ÷680 Axit amin khác 6%. Trong đĩ cĩ ch a nhi u các axit amin như: lyzin, histidin, treonin, xerin, glutamate, prolin, glyxin, valin, tirozin, phenilalanin, acparagin, acginin ð thu nh n ch ph m triptophan tinh khi t thì phái qua các bư c sau: Tách sinh kh i b ng li tâm Dùng HCl axit hố đ n pH = 1 và tách các k t t a Ti n hành trao đ i ion Nh h p ph nh dung d ch ammoniac 5% Cơ đ c dung d ch nhi t đ 60 ÷70 0C Làm l nh đ n 4 ÷60C đ tr tinh Tách tinh th triptophan R a các tinh th b ng rư u etylic S y các tinh th nhi t đ 60 0C Các ph li u c a quá trình tinh ch này cĩ th dùng cho chăn nuơi. 4.3.3.2 Thu nh n nh các ch ng đ t bi n: S thu nh n triptophan cũng như tirozin và phenilalanin cĩ th th c hi n trên các ch ng đ t bi n c a E. coli ho c Bacillus subtilis. Quá trình t ng h p tirozin, triptophan và phenilalanin đi theo sơ đ sau:
- Glucose Axit fotfoenol pyruvic Eritrozo 4 P Axit skimic Axit antranilic Axit corismic Triptophan Axit prephenic Axit phenylpyruvic Axit hydroxyphenylpyruvic Phenylalanine Tirozin Sơ đ 5: Cơ ch t ng h p triptophan, phenilalanin, tirozin trong t bào vi sinh v t ð t ng h p th a triptophan ngư i ta dùng ch ng e. coli tr dư ng tirozin và phenylalanine. CHƯƠNG V: S N XU T CH PH M ENZYM 5.1 Nh ng tính ch t ưu vi t c a enzyme Enzym là m t ch t xúc tác sinh h c. Nĩ cĩ đ y đ các tính ch t c a ch t xúc tác hố h c, ngồi ra cịn cĩ nh ng ưu vi t sau: 1. Cĩ tính chuyên hố cao (tính đ c hi u): m i enzyme ch tác d ng lên m t cơ ch t nh t đ nh nào đĩ theo ý mu n mà khơng gây nên m t bi n đ i nào khác. Ví d : amylaza ch thu phân tinh b t, proteaza ch thu phân protein.v.v. 2. Cư ng l c xúc tác l n: v i m t lư ng nh enzyme cĩ th làm xúc tác đ chuy n hố m t lư ng cơ ch t l n. Ví d : 1g pepxin cĩ kh năng thu phân 50kg tr ng, 1g rennin cĩ th làm đơng t 72 t n s a, 1mol catalaza cĩ th làm 6 chuy n hố 5x10 mol H2O2 trong 1 giây. 3. Tác d ng trong m t đi u ki n êm d u: ph n l n các enzyme ho t đ ng nhi t đ khơng cao, pH thư ng là trung tính và áp su t thư ng. 4. Enzym khơng đ c h i: t t c các lo i enzyme đ u cĩ ngu n g c t sinh v t nên khơng đ c h i đ i v i s c kh e con ngư i. Chính vì nh ng ưu vi t đĩ mà trong nh ng năm g n đây ch ph m enzyme đư c s d ng r ng rãi và ngành cơng nghi p enzyme cũng đư c phát tri n khơng ng ng. 5.2 Ngu n nguyên li u đ thu nh n enzyme: Enzyme cĩ th thu nh n t nhi u ngu n nguyên li u khác nhau như: đ ng v t, th c v t và vi sinh v t.
- Glucose Axit fotfoenol pyruvic Eritrozo 4 P Axit skimic Axit antranilic Axit corismic Triptophan Axit prephenic Axit phenylpyruvic Axit hydroxyphenylpyruvic Phenylalanine Tirozin Sơ đ 5: Cơ ch t ng h p triptophan, phenilalanin, tirozin trong t bào vi sinh v t ð t ng h p th a triptophan ngư i ta dùng ch ng e. coli tr dư ng tirozin và phenylalanine. CHƯƠNG V: S N XU T CH PH M ENZYM 5.1 Nh ng tính ch t ưu vi t c a enzyme Enzym là m t ch t xúc tác sinh h c. Nĩ cĩ đ y đ các tính ch t c a ch t xúc tác hố h c, ngồi ra cịn cĩ nh ng ưu vi t sau: 1. Cĩ tính chuyên hố cao (tính đ c hi u): m i enzyme ch tác d ng lên m t cơ ch t nh t đ nh nào đĩ theo ý mu n mà khơng gây nên m t bi n đ i nào khác. Ví d : amylaza ch thu phân tinh b t, proteaza ch thu phân protein.v.v. 2. Cư ng l c xúc tác l n: v i m t lư ng nh enzyme cĩ th làm xúc tác đ chuy n hố m t lư ng cơ ch t l n. Ví d : 1g pepxin cĩ kh năng thu phân 50kg tr ng, 1g rennin cĩ th làm đơng t 72 t n s a, 1mol catalaza cĩ th làm 6 chuy n hố 5x10 mol H2O2 trong 1 giây. 3. Tác d ng trong m t đi u ki n êm d u: ph n l n các enzyme ho t đ ng nhi t đ khơng cao, pH thư ng là trung tính và áp su t thư ng. 4. Enzym khơng đ c h i: t t c các lo i enzyme đ u cĩ ngu n g c t sinh v t nên khơng đ c h i đ i v i s c kh e con ngư i. Chính vì nh ng ưu vi t đĩ mà trong nh ng năm g n đây ch ph m enzyme đư c s d ng r ng rãi và ngành cơng nghi p enzyme cũng đư c phát tri n khơng ng ng. 5.2 Ngu n nguyên li u đ thu nh n enzyme: Enzyme cĩ th thu nh n t nhi u ngu n nguyên li u khác nhau như: đ ng v t, th c v t và vi sinh v t.
- 5.2.1 ð ng v t: Enzyme n m trong các cơ quan n i t ng c a đ ng v t: Tu t ng: ch a nhi u enzyme amylaza, maltaza, proteaza, esteraza, lipaza.v.v. D dày ch a nhi u enzyme pepxin, các enzyme tiêu hố (trong ngăn th tư c a d dày bị cĩ 1 lo i vi khu n cĩ kh năng sinh t ng h p xenlulaza), trong d dày c a bê và nghé cĩ ch a enzyme rennin làm đơng t s a. Ru t: ch a ch y u là enzyme enterokinaza cĩ kh năng phá v các liên k t peptit. Gan: là cơ quan ch a r t nhi u enzyme. Khơng th thu enzyme t đ ng v t trên qui mơ cơng nghi p đư c vì th i gian nuơi đ ng v t quá dài nên khơng kinh t . 5.2.2 Th c v t: Ngư i ta cĩ th thu đư c m t s enzyme trong th c v t thư ng đ ng như thu papain t đu đ , bromelain t d a, amylaza t malt, plazmin (c papain) t h ficus (sung, v ). Trong các h đ u cĩ enzyme ureaza. Trong thu c lá cĩ ch a enzyme amylaza, esteraza, pectinaza, proteaza. Trong chè cĩ ch a nhi u enzyme oxy hố kh như polyphenoloxydaza. Trong rau qu cũng ch a nhi u lo i enzyme khác nhau. Thu enzyme t th c v t cũng khơng kinh t vì mu n cĩ nhi u th c v t thì ph i tr ng nên ph i cĩ đ t và chi phí t n kém trong vi c chăm bĩn. 5.2.3 Vi sinh v t: So v i đ ng v t và th c v t thì vi c thu nh n enzyme t vi sinh v t cĩ nhi u l i th hơn. T vi sinh v t cĩ th thu nh n đư c nhi u enzyme khác nhau, trong đĩ cĩ nh ng lo i khơng th thu nh n đư c t đ ng v t ho c th c v t. B ng cách thay đ i đi u ki n nuơi c y ho c dùng tác nhân đi u ch nh ngư i ta cĩ th đi u khi n quá trình sinh t ng h p enzyme c a vi sinh v t theo ý mu n. Vi sinh v t cĩ kh năng sinh s n và phát tri n nhanh, t ng h p enzyme v i t c đ c c kỳ l n trong m t th i gian ng n. Chính vì th vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t ít t n th i gian. Enzyme thu nh n t vi sinh v t cĩ ho t tính r t m nh, vư t xa các enzyme t các ngu n sinh v t khác. Vi sinh v t cĩ kh năng sinh s n, phát tri n và t ng h p enzyme trên các mơi trư ng dinh dư ng đơn gi n, d ki m và r ti n (cĩ th là ph li u c a các ngành s n xu t khác nhau). Cho nên vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t cũng r t kinh t .
- Chính vì các l i th trên nên ngu n enzyme t vi sinh v t cĩ th đưa vào ngành s n xu t ch ph m enzyme cơng nghi p. B ng 1: Kh năng s d ng các lo i enzyme t vi sinh v t Lo i enzyme Vi sinh v t S d ng Amylaza Bacillus Subtilis, Bacillus Bia và rư u (phân hu tinh b t Stearotherophilus. thành đư ng lên men, s n xu t nha) α amylaza Asp.niger S n xu t bánh mì, bánh ng t Asp.oryzac (thu phân m t ph n tinh b t) Glucoamylaza Asp.niger S n xu t glucoza, bia (làm Asp.oryzac gi m hàm lư ng dextrin) Endomycopsis bispora Pectnaza Asp.niger S n xu t và làm trong d ch qu , Asp.oryzac các ch ph m rau cho dinh Sclerotinia libertina dư ng tr sơ sinh. Các xenluloza Trichoderma viride CN th c ph m (làm tan thành t bào th c v t rau), rư u (thu nh n đư ng t xenluloza). ðextranaza Penicillium funiculorum S n xu t dexran v i kích thư c phân t nh t đ nh. Ch t b sung cho thu c đánh răng. Invectaza Sacch.Cerevisiac D ch hố đư ng đ làm keo, s n xu t m t ong nhân t o. Các proteaza Bacil.Subtilis, Bacil.Cereus B sung vào b t gi t đ lo i Bacil.Stearotheroopilus, protein, làm m m th t, ch t tr Streptomyces griseus, tiêu hố, dùng trong cơng ngh Asp.oryzac làm phim Enzym làm đơng Mucor pusillus S n xu t fomat s a Keratinaza Streptomyces fradiac Ngành da (kh lơng) β galactozidaza Asp.niger, Pen.notatum B o qu n th c ph m (lo i O 2) Xác đ nh glucoza (ch n đốn b nh đái đư ng). Streptokinaza Streptococcus, ði u tr (tiêu c c ngh n) Spec.chotridium ði u tr các v t thương, v t histolyticum b ng L asparaginaza Eschericha coli, Erivinia ði u tr b nh b ch c u aroidac Penixilinazylaza Escherichia coli SX các penixilin bán t ng h p
- 5.3 S n xu t enzym t vi sinh v t: Quá trình s n xu t g m 3 giai đo n: Tuy n ch n vi sinh v t và c i t o gi ng Nuơi c y vi sinh v t Tách và tinh ch enzym 5.3.1 Tuy n ch n vi sinh v t và c i t o gi ng: 1. Tuy n ch n: Kh năng t o enzym c a vi sinh v t r t đa d ng và phong phú. M i lo i enzym cĩ th thu nh n đư c t nhi u ch ng vi sinh v t khác nhau và ngư c l i m t ch ng vi sinh v t cũng cĩ kh năng sinh nhi u lo i enzym. Ví d : Aspergillus oryzae Amylaza cĩ th thu nh n nh Bacillus Subtilis Bac.Stearothermophilus α Amylaza Asp.niger Asp.oryzae Asp.awamori Glucoamylaza Asp.oryzae, niger Endomycopsis, awamori Asp.niger Pectinaza Asp. oryzae Asp.awamori Asp.oryzae Proteaza Bac.Subtilis Streptomyces griseus Proteinaza Asp.awamori, flavus, Candidus Bac.mesentericus, Bac.Subtilis Xenlulaza Trichoderma viride Asp.terreus Kh năng sinh enzym c a các ch ng vi sinh v t khơng gi ng nhau và khác nhau ngay c trong cùng m t ch ng. Vì v y, khi tuy n ch n vi sinh v t ph i ti n hành tìm ki m, phân l p, l a ch n hàng ch c, hàng trăm th m chí đ n hàng nghìn gi ng vi sinh v t khác nhau m i cĩ đư c nh ng ch ng vi sinh v t cĩ ho t l c cao trong vi c t o nh ng enzym c n thi t. 2. C i t o gi ng: ð nâng cao s c s n xu t enzym c a vi sinh v t cũng như làm tăng cư ng ho t tính c a enzym ngư i ta ph i s d ng các phương pháp khác nhau đ c i t o gi ng, đ c bi t là phương pháp gây đ t bi n. B ng phương pháp đ t bi n nhi u nư c đã thu đư c nh ng ch ng vi sinh v t cĩ nh ng đ c tính t t, ch t ng
- h p m t ho c vài ba enzym nhưng đ u cĩ ho t tính cao so v i ch ng nguyên thu ban đ u. 5.3.2 Nuơi vi sinh v t: 5.3.2.1 Các y u t nh hư ng t i s t ng h p enzym: 1. nh hư ng c a thành ph n mơi trư ng dinh dư ng: Là y u t quan tr ng cĩ nh hư ng l n đ n s phát tri n và t ng h p enzym c a vi sinh v t. Cùng m t lo i vi sinh v t nhưng n u nuơi c y trên các mơi trư ng cĩ thành ph n dinh dư ng khác nhau thì m c đ t o thành enzym và thành ph n enzym đư c t o thành cũng khác nhau. Ví d : nuơi Asp.oryzae b ng phương pháp b m t trên mơi trư ng cám đ i m ch thì cĩ th t o đư c nhi u enzym, trong đĩ cĩ các lo i enzym cĩ ho t tính cao như amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza. Nhưng n u nuơi trên mơi trư ng Kzapek c i ti n v i nitrat và tinh b t thì ch t o thành ch y u là α amylaza, cịn các enzym khác t o thành v i lư ng khơng đáng k . Hi n tư ng này đư c gi i thích b ng lý thuy t sinh t ng h p c m ng enzym. Hi n tư ng c m ng này ch th y vi sinh v t ch khơng th y đ ng và th c v t. Khi trong mơi trư ng cĩ nh ng ch t khĩ đ ng hố vi sinh v t ph i ti t vào mơi trư ng m t ho c nh ng enzym tương ng đ phân hu nĩ thành nh ng ch t cĩ th đ ng hố đư c. Cho nên khi thêm các ch t c m ng vào mơi trư ng dinh dư ng thì kh năng sinh t ng h p enzym c a vi sinh v t cĩ th tăng lên g p nhi u l n so v i trư ng h p bình thư ng. ð nh nghĩa: M t quá trình sinh t ng h p đư c g i là c m ng n u như nĩ ch x y ra m c đ đáng k khi trong mơi trư ng cĩ cơ ch t đ c hi u c a enzym này ho c các ch t trao đ i cĩ c u trúc tương t cơ ch t. Các enzym thu c lo i này g i là enzym c m ng, các cơ ch t kích thích quá trình t ng h p này g i là ch t c m ng. Mu n t ng h p đư c enzym c m ng c n cĩ 4 đi u ki n: Th nh t: Cĩ gen tương ng trong nhi m s c th Th hai: Cĩ nguyên li u đ y đ đ xây d ng các phân t enzyme đĩ (các axit amin, các h p ph n coenzyme). Th ba: Cĩ năng lư ng c n thi t cho vi c t ng h p enzyme. Th tư: Cĩ ch t c m ng. N u cĩ đ 3 đi u ki n trên nhưng thi u ch t c m ng thì enzyme cũng khơng đư c t o thành. Trong cơng ngh s n xu t enzyme c n ph i l a ch n ch t c m ng thích h p và xác đ nh n ng đ t i ưu c a nĩ trong mơi trư ng đ cĩ hi u su t sinh t ng h p cao nh t. 2. nh hư ng c a đ m: Trong phương pháp nuơi c y b m t, đ m c a mơi trư ng cĩ v trí đ c bi t quan tr ng. Khi đ m th p vi sinh v t b rơi vào tình tr ng b t l i cho ho t
- đ ng s ng nên cĩ khuynh hư ng t o bào t và h n ch s t ng h p enzyme. Khi đ m quá cao thì đ tơi x p và thống khí c a canh trư ng b gi m, do đĩ s t ng h p enzyme khĩ khăn. ð m cho phép vi sinh v t t ng h p enzyme t t thư ng t 53 ÷65%, ph thu c vào đ c đi m sinh lí c a vi sinh v t, vào c u trúc cơ h c c a mơi trư ng và đi u ki n thốt m c a mơi trư ng nuơi c y. 3. pH c a mơi trư ng: So v i phương pháp nuơi chìm thì phương pháp b m t ít ch u nh hư ng c a pH mơi trư ng đ n quá trình sinh t ng h p enzyme vì trong quá trình nuơi pH c a mơi trư ng khá n đ nh. V i phương pháp nuơi c y chìm pH mơi trư ng bi n đ i khá rõ r t trong quá trình nuơi và gây nh hư ng l n t i s t ng h p enzyme. Do đĩ, ngư i ta thư ng đi u ch nh pH đ thu đư c enzyme v i hi u su t cao. M i lo i enzyme thư ng đư c t ng h p m nh trong m t vùng pH xác đ nh đ i v i t ng lo i vi sinh v t. Ví d : amylaza và pectinaza c a n m m c đư c t ng h p m nh trong mơi trư ng cĩ pH=4,5 ÷5, cịn proteaza trong mơi trư ng cĩ pH=6 ÷6,5. 4. Nhi t đ : Ph n l n các vi sinh v t cĩ kh năng t ng h p m nh các enzyme đ u thu c lo i ưa nhi t trung bình, cĩ nhi t đ t i thích 22 ÷32 0C. V i vi khu n cĩ lo i thích nhi t đ cao hơn (35 ÷55 0C) và chúng cĩ kh năng t ng h p các enzyme cĩ đ b n nhi t cao. Khi nâng nhi t đ mơi trư ng t i quá m c thích h p thì kh năng sinh t ng h p enzyme b gi m rõ r t. 5. Oxy: ð vi sinh v t sinh trư ng và phát tri n đư c thì ph i cĩ oxy. Do đĩ, trong th i kỳ tích lu sinh kh i ph i cung c p đ y đ oxy cho mơi trư ng. 6. Th i gian nuơi: Th i gian nuơi c y thích h p c a m i lo i vi sinh v t đư c xác đ nh b ng th i gian cho phép tích t enzyme t i đa. Th i gian đĩ ph thu c vào ch ng vi sinh v t và ít ph thu c vào enzyme chúng t ng h p. 5.3.2.2 L a ch n mơi trư ng nuơi c y: Thành ph n mơi trư ng dinh dư ng là m t trong nh ng y u t cĩ nh hư ng quy t đ nh đ n ho t đ ng s ng c a vi sinh v t cũng như kh năng sinh t ng h p enzyme c a chúng. ð b o đ m nh ng yêu c u t i thi u cho vi sinh v t phát tri n và t ng h p enzyme thì trong mơi trư ng c n cĩ các ch t ch a cacbon, nitơ, hydro, oxy và các ch t khống như Mg, Ca, P,S , Fe, K .v.v. Ngu n cung c p cacbon thư ng dùng là gluxit. Khi s d ng đư ng c n nh r ng m t s đư ng cĩ tác d ng kìm hãm s sinh t ng h p m t s enzyme
- thu phân. Ví d : đư ng glucose cĩ th kìm hãm sinh t ng h p m t s enzyme h amylaza. Ngồi gluxit cũng cĩ th s d ng ngu n cacbon khác như m , d u, axit h u cơ, rư u. Trong s các axit h ư cơ thì axit lactic đư c vi sinh v t h p th d dàng hơn c . Axit này cĩ nhi u trong nư c chi t ngơ. Cho nên cao ngơ đư c dùng v a là ngu n b sung đ m v a là ngu n cung c p cacbon cho vi sinh v t phát tri n. Ngu n cung c p nitơ cĩ th là các h p ch t h u cơ ho c vơ cơ. Các h p ch t h u cơ là nh ng h p ch t giàu đ m như cao ngơ, b t đ u tương, khơ đ u, khơ l c Ngu n nitơ vơ cơ như urê, NH 3, các mu i amơn. Ngồi ra, m t s axit amin, bazơ purin (adenine, guanine ), pyrimidin cũng đư c b sung vào mơi trư ng nuơi c y. Các axit amin cĩ tác d ng khác nhau đ i v i vi sinh v t cũng như vi c sinh t ng h p enzyme. Nhi u axit amin cĩ kh năng tăng cư ng sinh t ng h p enzyme, m t s khác l i kìm hãm ho c khơng cĩ nh hư ng rõ r t. Các nguyên t khống cũng cĩ nh hư ng rõ r t đ n quá trình sinh t ng h p enzyme. Các nguyên t này bao g m c nguyên t đa lư ng và vi lư ng. Vi lư ng là s t, k m, đ ng, coban. Các nguyên t này thư ng cĩ trong nư c ho c trong các thành ph n h u cơ khác c a mơi trư ng (b t, cao ngơ) do đĩ khơng c n b sung ho c ch b sung d ng v t. N ng đ c a các nguyên t này tăng s kìm hãm m nh s phát tri n c a vi sinh v t. Các nguyên t đa lư ng đư c đưa vào dư i d ng mu i vơ cơ nhưng c n tính c hàm lư ng c a chúng đã cĩ s n trong các thành ph n c a mơi trư ng. Trong các nguyên t này c n lưu ý đ n P và S vì 2 nguyên t này là thành ph n c u t o c a nhi u ch t quan tr ng, nh t là nucleotit, lipit, vitamin Các y u t sinh trư ng: các vitamin ch y u dùng đ kích thích sinh trư ng c a vi sinh v t. Tuy nhiên c n nh r ng, trong nhi u trư ng h p mơi trư ng thích h p cho s sinh trư ng c a vi sinh v t chưa h n đã là thích h p đ sinh t ng h p enzyme. Cĩ khi mơi trư ng kìm hãm s tích lu sinh kh i t bào nhưng v n tăng cư ng sing t ng h p enzyme. ð xác đ nh thành ph n mơi trư ng dinh dư ng thích h p cho m i vi sinh v t cĩ th ti n hành l a ch n trên cơ s kinh nghi m ho c dùng các phương pháp tốn h c qui ho ch th c nghi m. Khi l a ch n nguyên li u đ chu n b mơi trư ng c n chú ý r ng, trong các nguyên li u t nhiên cĩ ch a nhi u ch t khác nhau, k c các nguyên t khống đa lư ng cũng như vi lư ng và cĩ c các y u t sinh trư ng. Do v y, trong nhi u trư ng h p khơng c n b sung thêm các lo i mu i vơ cơ. M t khác, các nguyên li u này r ti n do v y nĩ thư ng dùng trong cơng nghi p đ s n xu t ch ph m enzyme t vi sinh v t.
- Các nguyên li u t nhiên thư ng dùng đ chu n b mơi trư ng là cám g o, b t ngơ, b t đ u tương, khơ l c ho c các ph li u như men bia, r đư ng Trong các nguyên li u này thì cám g o và b t ngơ là ngu n cacbon t t nh t. Cịn n m men bia t phân, khơ l c là ngu n nitơ t t nh t. Khi chu n b mơi trư ng cịn c n ph i chú ý đ n các ch t cĩ tác d ng đi u hồ sinh t ng h p enzyme, đ c bi t là các ch t c m ng. ð i v i m i lo i enzyme cĩ th cĩ nhi u ch t c m ng cho nên ph i l a ch n ch t c m ng cĩ hi u qu nh t. Ví d như ch t c m ng c a sinh t ng h p amylaza là tinh b t, dextrin; c a proteaza là các protein cĩ tr ng lư ng phân t nh . S d ng các ch t c m ng thư ng làm tăng đáng k lư ng enzyme đư c t ng h p. Tuy nhiên, khi l a ch n ch t c m ng c n tính tốn c n th n v giá thành c a nĩ. 5.3.2.3 Các phương pháp nuơi c y vi sinh v t: Cĩ nhi u phương pháp khác nhau đ nuơi vi sinh v t t ng h p enzyme. 1. Phương pháp b m t: Phương pháp này thích h p đ nuơi các lo i n m m c vì kh năng phát tri n c a nĩ nhanh, m nh nên ít t p nhi m. • Qui trinh cơng ngh : Mơi trư ng ph i tr n làm m h p đánh tơi và làm ngu i gieo m c gi ng vào thi t b nuơi vào phịng nuơi nuơi m c canh trư ng. Các ch t dinh dư ng thư ng là các nguyên li u t nhiên như các ch t th i c a cơng ngh th c ph m ho c h n h p c a nhi u ch t. Trong mơi trư ng c n thêm ch t c m ng c n thi t cho s t ng h p enzym ho c b sung thêm ch t dinh dư ng ngu n nitơ, photpho như nư c chi t ngơ, khoai tây, d ch t phân n m men ð b o đ m đ x p c a mơi trư ng c n cĩ ch t làm x p như tr u (10 ÷20%). Trư c khi gieo c y c n thanh trùng mơi trư ng đ đ m b o khơng b nhi m vi sinh v t l . Quá trình nuơi c y kéo dài t 33 ÷48h. Cĩ các hi n tư ng: Th i nhi t, c n gi t o=28 ÷32 oC Gi m m, gi ϕphịng =96 ÷100% Cung c p O 2: trong quá trình m c phát tri n l y O 2 và th i CO 2 c n cung c p khơng khí vơ trùng. • Ưu như c đi m c a phương pháp: Ưu: Cho n ng đ enzym cao hơn so v i phương pháp b m t Cĩ th s y khơ nhanh chĩng mơi trư ng (d ng thơ) mà khơng nh hư ng đ n ho t l c enzym. Tránh s nhi m trùng tồn b kh i canh trư ng T n ít đi n năng.
- Như c: Khĩ cơ gi i hố, t đ ng hố. Năng su t th p. T n nhi u lao đ ng. T n nhi u m t b ng. 2. Phương pháp nuơi c y chìm: • V i phương pháp này vi sinh v t phát tri n trong mơi trư ng l ng cĩ s c khí và khu y đ o liên t c. Ngu n cacbon s d ng trong phương pháp này là tinh b t, các ch t th i cĩ đư ng như r đư ng và các nguyên li u khác. Ngu n nitơ hay dùng là ch t h u cơ như cao ngơ, d ch men bia, d ch thu phân, khơ l c Ngồi ra trong thành ph n mơi trư ng cũng c n b sung thêm các ch t khống. Mơi trư ng c n đư c thanh trùng b ng cách s c hơi tr c ti p to=121 ÷125 oC trong th i gian 60 ÷90 phút đ i v i mơi trư ng ch a nguyên li u b t, đ m thơ và 20 ÷30 phút v i các lo i mơi trư ng cĩ ch a đư ng. Trong quá trình nuơi c y chìm c n ph i s c khí vơ trùng và khu y đ o liên t c. N u cĩ b t ph i dùng d u phá b t. Th i gian t 1 ÷4 ngày tuỳ ch ng. Ph i chú ý đi u ch nh pH. • Ưu, như c: + Ưu: Ti t ki m di n tích D cơ gi i hố, t đ ng hố. S d ng h p lí ch t dinh dư ng, tránh lãng phí. Thu enzym ít t p ch t ð m b o v sinh, vơ trùng nên ít nhi m vi sinh v t l . + Như c: N ng đ enzym th p, c n làm đ c canh trư ng trư c khi tách nên giá thàcao. T n đi n do s c khí. N u khơng đ m b o vơ trùng s nhi m hàng lo t. 3. Phương pháp nuơi chìm 2 bư c: Bư c 1: vi sinh v t nuơi trong thi t b đ phát tri n t i đa. Bư c 2: chuy n sinh kh i sang thi t b khác đ sinh t ng h p enzym. 5.3.3 Tách và tinh ch enzym: Trong th c t enzym đư c s d ng nhi u d ng khác nhau. M t s lĩnh v c cĩ th s d ng dư i d ng canh trư ng khơ mà ch t lư ng s n ph m khơng thay đ i (như s n xu t rư u, cơng ngh thu c da). ða s các ngành cơng nghi p (ch y u là th c ph m và cơng nghi p nh ) địi h i ph i s d ng các ch ph m enzym s ch (g i là ch ph m k thu t). Cịn trong y h c ph i s d ng các ch ph m enzym tinh khi t. Tuy nhiên, cho đ n nay chưa tìm đư c m t phương
- pháp chung đ tách m t enzym nào đĩ mà ph i ph i h p nhi u phương pháp khác nhau. Quá trình làm s ch enzym g m 2 giai đo n là chi t enzym và tách enzym. 5.3.3.1 Chi t enzym: M c đích c a cơng đo n này là tách các enzym ra kh i canh trư ng sau lên men. Quá trình này ph thu c vào lo i enzym (ngo i bào hay n i bào) và mơi trư ng lên men (l ng ho c r n) mà ti n hành khác nhau. ð i v i enzym ngo i bào n m trong canh trư ng l ng thì ti n hành tách sinh kh i đ thu dung d ch cĩ ch a enzyme. N u enzym ngo i bào n m trong canh trư ng r n (x p) thì dùng nư c vơ trùng ho c các dung d ch đ m thích h p đ chi t enzym. ð thu các enzym n i bào thì ph i ti n hành phá v t bào b ng m t trong các phương pháp sau: Phương pháp đ ng hố (nghi n trong máy đ ng hố) Nghi n v i b t thu tinh, cát T phân Làm l nh đơng và tan giá l p đi l p l i nhi u l n Nh tác đ ng c a siêu âm Dùng áp su t th m th u cao Phương pháp khuy ch tán Sau khi phá v t bào thì dùng nư c c t ho c dung d ch mu i lỗng ho c các dung d ch đ m thích h p đ chi t enzym. 5.3.3.2 Tách enzym: M c đích c a giai đo n này là làm s ch và tách các enzym ra kh i h n h p ph thu c vào m c đ tinh s ch c a các ch ph m enzym mà quá trình tách cũng r t khác nhau. 1. Thu nh n ch ph m k thu t: Ch ph m enzym k thu t là ch ph m enzym đư c tinh ch sơ b cĩ th ch a m t ho c vài enzym ch y u. ð thu ch ph m enzym k thu t thì đ u tiên ph i cơ đ c dung d ch enzym nhi t đ 30 oC cho đ n khi đ t n ng đ 20g/lit. Sau đĩ ti p t c cơ nhi t đ 40 oC cho đ t n ng đ 30 ÷50g/lit. Khi cơ cĩ th cho thêm ch t b o qu n ho c ch t n đ nh. Ti p theo đem s y phun v i nhi t đ khơng vư t quá 70 oC. Ngồi ra đ thu ch ph m enzym k thu t ngư i ta cũng cĩ th k t t a b ng dung mơi h u cơ ho c mu i trung tính và sau đĩ cho ch t n đ nh vào s y khơ r i nghi n. Dung mơi h u cơ thư ng dùng là rư u etylic, izopropylic, axeton k t t a b ng dung mơi h u cơ d a trên nguyên t c khi thêm dung mơi vào dung d ch enzym thì l c hút gi a các phân t protein enzym tích đi n và các phân t
