Giáo trình môn học Trao đổi chất và năng lượng - Mai Xuân Lương

Nội dung text: Giáo trình môn học Trao đổi chất và năng lượng - Mai Xuân Lương

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT F 7 G GIÁO TRÌNH TRAO ĐỔI CHẤT VÀ NĂNG LƯỢNG GS.TS. MAI XUÂN LƯƠNG 2005
2. Trao đổi chất và năng lượng - 31 - CHƯƠNG 4. TRAO ĐỔI CARBOHYDRATE TRONG QUÁ TRÌNH HÔ HẤP. Glucid là những thành phần cấu tạo đầu tiên của tế bào được tạo ra bởi các cơ thể quang hợp từ CO2 và H2O nhờ năng lượng ánh sáng. Quá trình trao đổi glucid xảy ra sau đó trong những cơ thể này dẫn đến sự hình thành hàng loạt các hợp chất hữu cơ khác nhau mà rất nhiều trong số chúng được cơ thể động vật dùng làm thức ăn. Động vật tiếp nhận một số lượng lớn glucid để dùng làm chất dinh dưỡng dự trữ, hoặc oxy-hóa và thu nhận năng lượng ở dạng ATP, hoặc chuyển hóa thành lipid với mục đích tích lũy được nhiều năng lượng hơn, hoặc tổng hợp hàng loạt các thành phần cấu tạo của tế bào. Chỉ có một phần nhỏ glucid thực vật là có ích cho dinh dưỡng của con người, bởi vì trong bộ máy tiêu hóa của con người không có những enzyme cần thiết để phân hủy cellulose và một số polyssaccharide thực vật thành monosaccharide. Những glucid chủ yếu có giá trị dinh dưỡng đối với con người là tinh bột, glycogen, các disaccharide như saccharose, lactose và maltose. Trong chương này chúng ta sẽ xem xét bằng cách nào các loại đường, mà chủ yếu là glucose, được hấp thụ, vận chuyển vào tế bào và sau đó được sử dụng để sản sinh năng lượng và tạo ra hàng loạt các hợp chất hữu cơ cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của cơ thể sống. I. SỰ TIẾP NHẬN VÀ HÌNH THÀNH GLUCOSE TRONG TẾ BÀO. Bước đầu tiên của trao đổi glucose là biến nó thành glucoso-6-phosphate sau khi nó đi vào tế bào. Glucoso-6-phosphate là một ngã tư quan trọng của trao đổi glucose vì nó tham gia vào một số con đường trao đổi tiếp theo: 1/ tổng hợp và phân hủy glycogen, 2/ sản sinh lactate và ATP (glycolys), 3/ gluconeogenes, và 4/ tổng hợp pentose và các hexose khác. Thủy phân glucoso-6-phosphate thành glucose và Pi cũng là một hướng chuyển hóa của glucoso-6-phosphate xảy ra trong gan, thận và đường ruột và là biện pháp chủ yếu để duy trì hàm lượng bình thường của glucose trong máu. Vì vậy, trước hết cần phải xem xét cơ chế vận chuyển glucose vào tế bào, các enzyme xúc tác các quá trình hình thành và thủy phân glucoso-6-phosphate và các cơ chế điều hòa các quá trình này. 1. Sự thâm nhập của glucose vào tế bào. trong khi đó nồng độ glucose trong máu là vào khoảng 5mM, tức khoảng 90mg trong một dl máu. Vì vậy sự thâm nhập glucose vào tế bào xảy ra theo chiều gradient nồng độ. Tuy nhiên nó không xảy ra bằng cách khuếch tán đơn giản và thụ động mà cần có một hệ thống vận chuyển đặc hiệu. Có hai kiểu hệ thống vận chuyển chủ yếu được ghi nhận: phụ thuộc và không phụ thuộc insulin. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
3. Trao đổi chất và năng lượng - 32 - Các hệ thống vận chuyển không phụ thuộc insulin được tìm thấy trong tế bào gan (hepatocyte), tế bào hồng cầu (erythrocyte) và não. Trong hepatocyte tốc độ tiếp nhận D-glucose bị ức chế bởi florizin, một glycoside của một độc tố polyphenol thực vật, và cytochalasin B. Galactose và fructose cũng được tiếp nhận bởi hệ thống này với tốc độ thấp hơn so với glucose. Sự tiếp nhận glucose trong erythrocyte cũng bị phlorizin ức chế nhưng không có quan hệ với lisulin. Người ta cho rằng chất vận chuyển glucose trong erythrocyte là một protein (MW=200.000) cấu tạo từ 4 phần dưới đơn vị có kích thước như nhau. Cơ chế vận chuyển hexose trong hepatocyte cũng rất giống với cơ chế trong erythrocyte. Các hệ thống vận chuyển phụ thuộc insulin: Tế bào cơ và tế bào tạo mỡ (adipocyte) có các hệ thống vận chuyển glucose phụ thuộc insulin. Các nghiên cứu với adipocyte cho thấy insulin làm tăng Vmax nhưng không làm thay đổi hằng số cân bằng của phản ứng vận chuyển glucose. Hơn nữa, nếu gắn insulin với receptor của glucose trên màng tế bào chất, quá trình vận chuyển glucose sẽ bị ảnh hưởng theo hai cách khác nhau: 1/ chuyển các protein vận chuyển glucose từ màng microsome nội bào đến màng tế bào chất và bằng cách đó làm tăng số lượng protein vận chuyển glucose trên màng tế bào chất; và 2/ sau khi di chuyển, hoạt tính của protein vận chuyển tăng lên khoảng hai lần so với trường hợp không xử lý insulin. Tế bào vi khuẩn cũng có một số hệ thống vận chuyển glucose thuộc cả hai loại: cần cung cấp năng lượng và không cần cung cấp năng lượng. Loại hệ thống cần cung cấp năng lượng được tìm thấy trong Escherichia coli, Salmonella typhimurium và Staphylococcus aureus, và sử dụng phosphoenolpyruvate làm nguồn năng lượng với sự tham gia của ba loại protein khác nhau. Ở bước thứ nhất của quá trình này do enzyme I xúc tác phospho-enolpyruvate phản ứng với một protein trong bào tương (MW=9.400) có tên là HPr để tạo ra phospho-HPr: Enzyme I Phosphoenolpyruvate + HPr ––––––––> Pyruvate + P ~ HPr Mg2+ Để được vận chuyển, glucose phản ứng với P ~ HPr, tạo ra glucoso-6- phosphate với sự xúc tác của enzyme II: P ~ HPr + Glucose –––––––––> glucoso-6-phosphate + HPr Bằng cách này glucose ngoại bào trở thành glucoso-6-phosphate nội bào. 2. Phosphoryl-hóa glucose. Hexokinase và glucokinase. Mọi tế bào cần trao đổi glucose đều chứa các enzyme kinase để xúc tác phản ứng phosphoryl hóa glucose thành glucoso-6-phosphate với sự tham gia của ATP. Có hai loại kinase tham gia trong quá trình này là hexokinase và glucokinase. Cả hai cùng xúc tác một phản ứng nhưng có các tính chất phân tử và động học khác GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
4. Trao đổi chất và năng lượng - 33 - nhau. Phức hệ Mg2+-ATP được sử dụng như một cơ chất và phản ứng không có tính ' thuận ngịch, với ∆Go = -5Kcal/mol, do mức năng lượng của glucoso-6-phosphate thấp hơn và trạng thái của phức hệ Mg2+-ADP ổn định hơn so với phức hệ Mg2+- ATP. Hexokinase được tìm thấy trong tất cả các mô và tồn tại ở 3 dạng isoenzyme I, II và III. Trong não chủ yếu chứa dạng I, còn trong cơ vân chủ yếu chứa dạng II, nhưng trong tất cả các mô, trừ gan, đều có mặt cả 3 dạng với số lượng khác nhau. Tính chất động học của 3 dạng rất giống nhau, có gía trị Km thấp đối với glucose (từ 8 đến 30 micromol). Mỗi dạng đều có thể sử dụng các monosaccharide khác làm cơ chất để tạo ra các 6-phosphate tương ứng. Glucoso-6- phosphate là chất ức chế đối với cả 3 dạng và tác dụng ức chế thể hiện khi chất này gắn với một trung tâm không phải là trung tâm hoạt động. Dạng hexokinase II chủ yếu có mặt trong bào tương, trong khi dạng I vừa nằm trong bào tương vừa gắn với ty thể. Khác với các dạng hexokinase của động vật có vú chỉ chứa một phần dưới đơn vị với MW-100.000, hexokinase nấm men chứa hai phần dưới đơn vị giống nhau (MW=50.000), và hoạt tính của nó không chịu ảnh hưởng của glucoso-6- phosphate. Glucokinase, thường được gọi là hexokinase IV, là một protein monomer (MW=48.000), hầu như chỉ có mặt trong gan. Chỉ có glucose và mannose là cơ chất tự nhiên của nó và giá trị Km tương ứng đối với hai cơ chất này là 12 và 33 mM. Cùng với gía trị Km khá cao đối với glucose, glucokinase còn khác hexokinase ở chỗ hoạt tính của nó không bị glucoso-6-phosphate ức chế. Các tính chất này thể hiện qua sự khác nhau giữa vận chuyển glucose vào gan và vào các mô khác. Mặc dù quá trình trao đổi bình thường của glucose trong gan chịu ảnh hưởng của insulin, gan không đòi hỏi insulin để tiếp nhận glucose. Tế bào gan dễ dàng cho phép glucose di chuyển ra vào. Hơn nữa, khác với các mô như cơ và mô mỡ, trong đó sự tiếp nhận glucose phụ thuộc insulin, glucose chỉ được gan tiếp nhận trong điều kiện đường huyết cao. Như vậy, glucokinase có vai trò như một cái bẫy đối với lượng glucose-huyết dư thừa trong gan, không chịu sự chi phối của nồng độ glucoso-6- phosphate, và bằng cách đó cho phép tích lũy glucose ở dạng glycogen hoặc acid béo sau khi nó được tiếp tục chuyển hóa. Rõ ràng là tính chất của enzyme hoàn toàn thích nghi với vai trò của nó trong trao đổi chất tế bào. Hàm lượng glucokinase trong gan phụ thuộc tuổi, chế độ ăn uống và trạng thái hormone của cơ thể động vật. Trong gan của bào thai chỉ chứa hexokinase; hàm lượng của nó giảm xuống sau khi sinh cùng với sự xuất hiện glucokinase. Điều này có thể liên quan với đời sống của bào thai mà trong đó glucose được cung cấp qua nhau. Hàm lượng glucokinase cũng rất phụ thuộc vào việc sử dụng glucid trong chế độ ăn uống: cung cấp glucose cho động vật là một yếu tố kích thích tổng hợp glucokinase. Nguyên nhân của bệnh tiểu đường cũng có thể là do insulin ảnh hưởng đến việc tổng hợp protein enzyme. Một số hormone khác cũng có tác dụng điều hòa mức độ glucokinase: epinephrine và glucagon ức chế sự khôi phục glucokinase trong các động vật nhịn đói sau khi phục hồi cung cấp glucose, trong khi đó các hormone corticoid của tuyến vỏ thượng thận giúp nhanh chóng khôi phục việc tổng hợp glucokinase của gan khi tiếp tục cung cấp thức ăn. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
5. Trao đổi chất và năng lượng - 34 - 3. Dephosphryl-hóa glucose. Glucoso-6-phosphatase. Glucoso-6-phosphate có tác dụng góp phần duy trì nồng độ glucose trong máu khi nó bị thủy phân thành glucose và phosphate vô cơ. Enzyme glucoso-6- phosphatase : xúc tác phản ứng Mg2+ Glucoso-6-phosphate + H2O ––––––> Glucose + Pi được tìm thấy trong gan, thận và đường ruột, tức ba cơ quan có vai trò trong việc cung cấp bổ sung glucose cho máu. Glucoso-6-phosphatase là một enzyme liên kết với màng của mạng nội chất nhám và là một hệ thống gồm 4 thành phần, như mô tả trong hình 10. Hệ thống này bao gồm: 1/ glucoso-6-phosphate translocase, ký hiệu là T1, có nhiệm vụ vận chuyển glucose từ bào tương vào khoang của mạng nội chất; 2/ phosphatase, nằm về phía khoang của mạng nội chất, làm nhiệm vụ thủy phân glucoso-6-phosphate; 3/ một loại phosphate translocase vô cơ, ký hiệu là T2 , giúp vận chuyển Pi từ mạng nội chất ra bào tương và 4/ glucose translocase, ký hiệu là T3 , giúp glucose di chuyển từ khoang của mạng nội chất ra phía bào tương một cách dễ dàng. Trong chuỗi phản ứng có sự tham gia của carbamoyl-phosphate (CP). Hình10. Sơ đồ cấu tạo của hệ thống glucoso-6-phosphatase II. GLYCOLYS. Nghiên cứu quá trình dị hóa trong tế bào, theo truyền thống, thường được bắt đầu bằng việc tìm hiểu các quá trình lên men, hay hô hấp trong điều kiện kỵ khí, mà cơ sở của nó là quá trình glycolys , trong đó bao gồm một trật tự các phản ứng phân giải glucose thành acid pyruvic. Truyền thống này có ba lý do: Thứ nhất là cơ thể sống có lẻ xuất hiện trên Trái đất vào lúc mà bầu khí quyển không có oxy, nên hô hấp kỵ khí được xem là dạng đơn giản nhất của cơ chế sinh học cho phép thu nhận năng lượng từ các chất dinh dưỡng. Thứ hai là đa số những cơ thể hiếu khí tồn tại ngày nay đều còn giữ được khả năng tích lũy năng lượng lấy từ glucose bằng phương pháp đơn giản này với tư cách là giai đoạn chuẩn bị để oxy-hóa tiếp tục các sản phẩm hình thành trong giai đoạn này trong điều kiện có oxy. Thứ ba là các giai đoạn phản ứng enzyme của quá trình phân hủy glucose trong điều kiện kỵ khí và cơ chế tích lũy năng lượng trong quá trình này đã được hiểu biết khá chi tiết. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
6. Trao đổi chất và năng lượng - 35 - Với những lý do đó glycolys có thể là một mô hình quan trọng để nghiên cứu các quá trình phức tạp hơn. 1. Glycolys là cơ sở của các quá trình lên men. Tất cả các cơ thể dị dưỡng đều thu nhận năng lượng từ các phản ứng oxy-hóa khử. Trong quá trình lên men (hô hấp kỵ khí) vai trò của chất nhận điện tử cuối cùng được thực hiện bởi một phân tử hữu cơ nào đó hình thành trong quá trình lên men. Như vậy, lên men là một quá trình oxy-hóa khử nội bộ. Mức độ oxy-hóa tổng quát của sản phẩm oxy-hóa trong quá trình này không khác với mức độ oxy-hóa của các chất bị lên men. Trong số nhiều kiểu lên men mà cơ chất là glucose, quan trọng nhất là hai kiểu lên men có quan hệ chặt chẽ với nhau sau đây: - Lên men lactic dẫn đến sự hình thành hai phân tử acid lactic từ một phân tử glucose. Kiểu lên men này đặc trưng cho nhiều vi sinh vật và tế bào của động vật bậc cao, kể cả động vật có vú. - Lên men rượu dẫn đến sự hình thành hai phân tử ethanol và hai phân tử CO2 từ một phân tử glucose. Cả hai kiểu lên men này đều xảy ra với sự xúc tác của hệ enzyme glycolys. Sự khác nhau giữa chúng chỉ thể hiện ở giai đoạn cuối cùng, sau khi hình thành acid pyruvic. Trong lên men lactic acid pyruvic bị khử thành acid lactic, còn trong lên men rượu phản ứng này được thay bằng hai phản ứng khác để dẫn đến sự hình thành ethanol và CO2 . Mặc dù trong cả hai quá trình lên men này đều không có sự tham gia của oxy phân tử, song trong chúng đều xảy ra các phản ứng oxy-hóa khử. Chính vì vậy mà trong hai sản phẩm của quá trình lên men rượu CO2 là chất có mức độ oxy-hóa cao hơn, còn ethanol - có mức độ khử cao hơn; hoặc trong acid pyruvic - sản phẩm cuối cùng duy nhất của quá trình lên men lactic, một đầu mức độ khử cao, còn đầu kia có mức độ oxy-hóa cao. Trong khi đó ở hợp chất ban đầu (glucose) các nguyên tử hydro được phân bố đều đặn hơn. Đặc điểm quan trọng thứ hai của hai quá trình lên men này, hay nói chung, của glycolys là chúng kèm theo tổng hợp ATP từ ADP và phosphate vô cơ. Nếu không có các phản ứng phosphoryl-hóa ADP đồng thời này thì glycolys và lên men nói chung không thể xảy ra. Phương trình tổng quát của lên men lactic và lên men rượu có thể viết dưới dạng sau: - Lên men lactic: C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi –––> 2 CH3 -CHOH-COOH + 2 ATP + 2H2O - Lên men rượu: C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi ––––> 2 CH3 -CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 2H2O Để phân tích sự biến thiên năng lượng của glycolys, ta tách quá trình tổng quát trên đây thành hai bộ phận: chuyển hóa glucose thành acid lactic (quá trình giải phóng năng lượng) và tổng hợp ATP từ ADP và Pi (quá trình hấp thu năng lượng): Glucose ––––> 2 Lactate, ∆Go'1 = -47,0 Kcal/mol GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
7. Trao đổi chất và năng lượng - 36 - 2 ADP + 2 Pi ––––> 2 ATP ∆Go'2 = 2 x 7,3 = 14,6 Kcal/mol. Từ đó biến thiên năng lượng tự do tổng số của glycolys là ∆Go' S = ∆Go'1 + ∆Go'2 = -47,0 + 14,6 = -32,4 Kcal/mol Từ các số liệu này có thể thấy rằng sự phân giải glucose thành acid lactic kèm theo giải phóng một số năng lượng thừa để phosphoryl-hóa ADP thành ATP. Có thể tính được một cách dễ dàng rằng trong hai phân tử ATP này tích lũy được 14,6 x 100/47,0 = 31% năng lượng tự do giải phóng khi phân giải glucose thành acid lactic. Con số này thu được với nồng độ 1,0M. Nếu lưu ý đến nồng độ thực của các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của phản ứng trong tế bào, thì hiệu suất của glycolys còn có thể lớn hơn. Nếu trừ đi số năng lượng đã tích lũy trong hai phân tử ATP, năng lượng tự do của glycolys vẫn còn giảm 32,4 Kcal. Điều này cho thấy tại sao trên thực tế là quá trình không thuận nghịch, mà trạng thái cân bằng lệch hẵn về phía hình thành acid lactic. Tuy nhiên, đa số giai đoạn của quá trình này đều có giá trị biến thiên năng lượng tự do không lớn, và do đó chúng là những phản ứng thuận nghịch. Chiều ngược của những phản ứng này được tế bào sử dụng trong việc tổng hợp lại glucose từ acid lactic. 2. Các phản ứng của glycolys. Tập hợp các phản ứng kế tiếp nhau của glycolys được xem là giai đoạn đầu tiên trong số 5 giai đoạn của quá trình hô hấp hiếu khí. Toàn bộ quá trình glycolys xảy ra trong bào tương và có thể chia làm hai giai đoạn như mô tả trong hình 11. Ở giai đoạn 1 glucose được phosphoryl-hóavà sau đó bị phân giải thành hai phân tử glyceraldehyde-3-phosphate. Ở giai đoạn 2 glyceraldehyde-3-phosphate chuyển hóa thành acid pyruvic. Nếu quá trình xảy ra trong điều kiện kỵ khí thì, như ta đã biết, acid pyruvic tiếp tục chuyển hóa thành acid lactic hoặc ethanol. Giai đoạn thứ nhất được xem như giai đoạn chuẩn bị. Ở giai đoạn này mọi hexose đều được lôi cuốn vào quá trình glycolys bằng cách được phosphoryl-hóa nhờ ATP để sau đó tạo ra sản phẩm chung là glyceraldehyde-3-phosphate. Giai đoạn thứ hai bao gồm các phản ứng oxy-hóa - khử và cơ chế tích lũy năng lượng, trong đó ADP được phosphoryl-hóa thành ATP. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
8. Trao đổi chất và năng lượng - 37 - Toàn bộ quá trình glycolys bao gồm ba kiểu phản ứng hóa học mà các con đường của chúng liên quan mật thiết với nhau: Glucose Glycogen, tinh bột ATP Pvc Glucoso-1-phosphate ADP Tích lũy các dạng Glucoso-6-phosphate đường đơn giản và chuyển hóa chu Fructoso-6-phosphate thànhvglycer- aldehyde ATP 3-phosphate ADP Fructoso-1,6-diphosphate 2 (Glyceraldehyde-3-phosphate) 2 NAD+ Pvc 2 (1,3-Diphosphoglycerate) 2 ADP 2 NAD.H 2ATP 2 (3-Phosphoglycerate) Oxyhóa khử và tồng hợp ATP; 2 (2-Phosphoglycerate) Hình thành acid lactic 2 (Phosphoenolpyruvate) 2 ADP 2 ATP 2 (Pyruvate) 2NAD+ 2(Lactate) Hình 11: Sơ đồ tổng quát của quá trình glycolys * Các phản ứng của giai đoạn I. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
9. Trao đổi chất và năng lượng - 38 - 1/ Phản ứng phân giải bộ khung carbon của glucose thành acid pyruvic (con đường của các nguyên tử carbon); 2/ Phản ứng mà trong đó phosphate vô cơ trở thành nhóm phosphate tận cùng của phân tử ATP (con đường của các nhóm phosphate); 3/ Phản ứng oxy-hóa - khử (con đường vận chuyển điện tử). * Các phản ứng của giai đoạn I. 1/ Phosphoryl-hóa D-glucose. Mg2+ α-D-Glucose + ATP ––––> α -D-Glucoso-6-phosphate + ADP ' ∆Go = -4Kcal/mol Phản ứng này được xem như phản ứng khởi động của glycolys, trong đó phân tử glucose kém hoạt động nhận gốc phosphate tận cùng của ATP và phân bố lại điện tử trong các liên kết, nhờ đó được hoạt hóa ở dạng glucoso-6-phosphate để có thể tham gia vào các chuyển hóa tiếp theo. Trong số 7,3Kcal do ATP cung cấp, 4,0 Kcal được giải phóng ở dạng nhiệt, còn 3,3Kcal được tích lũy ở dạng hóa năng trong phân tử glucoso-6-phosphate hoạt động. Xúc tác phản ứng là các enzyme hexokinase và glucokinase mà chúng ta đã được làm quen trong mục trước. Do năng lượng tự do giảm đáng kể, nên phản ứng chỉ xảy ra theo chiều thuận. Quá trình ngược lại được xúc tác bởi một enzyme khác - α-D-glucoso-6-phosphatase: α-D-Glucoso-6-phosphate + H2O ––> α-D-Glucose + P i ∆Go ' = -3,3 Kcal/mol. 2/ Chuyển hóa glucoso-6-phosphate thành fructoso-6-phosphate. α-D-Glucoso-6-(P) –––> β-D-Fructoso-6-(P) ∆Go' = + 0,4Kcal/mol Phản ứng đồng phân hóa này được thực hiện nhờ enzyme phosphoguco- isomerase. Nó dễ dàng xảy ra theo cả hai chiều. Trong glycolys mặc dù phản ứng thuận có ∆Go' > 0 song vẫn xảy ra được là nhờ giá trị âm của phản ứng trước đó. Biến thiên năng lượng tự do tiêu chuẩn của cả hai phản ứng (1) và (2) gộp lại vẫn còn giá trị âm (-3,6Kcal/mol). 3/ Phosphoryl-hóa fructoso-6-phosphate thành fructoso-1,6-diphosphate. Mg2+ β-D-Fructoso-6-(P) + ATP –––> β-D-Fructoso-1,6-di(P) + ADP ∆Go' = -3,4Kcal/mol Phản ứng này được xem là phản ứng khởi động thứ hai, trong đó sử dụng thêm một phân tử ATP để phosphoryl-hóa fructoso-6-phosphate ở vị trí C-1. Trong số 7,3Kcal của ATP 3,9Kcal được tích lũy lại, còn 3,4Kcal được giải phóng. Nếu cộng ∆Go' của cả 3 phản ứng, ta có giá trị -7,0Kcal, tức K'eq của cả 3 phản ứng > 105 . Phosphoryl-hóa fructoso-6-phosphate là giai đoạn rất quan trọng, vì sự điều hòa quá trình glycolys được thực hiện thông qua điều hòa hoạt tính của enzyme phospho-fructokinase xúc tác phản ứng này. Hoạt tính của nó bị ức chế bởi ATP và citrate (ở nồng độ cao) và được kích thích bởi ADP và AMP. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
10. Trao đổi chất và năng lượng - 39 - Giá trị âm cao của ∆Go' cho thấy phản ứng trong tế bào không thể xảy ra theo chiều ngược. Phản ứng ngược được xúc tác bởi một enzyme khác. Đó là diphospho- fructosophosphatase: Fructoso-1,6-di(P) + H2O ––> Fructoso-6-(P) + Pi 4/ Phản ứng phân giải fructoso-1,6-diphosphate thành glyceraldehyde-3- phosphate và dioxyacetonephosphate: D-Fructoso-1,6-di(P) ––> Dioxyacetone-(P) + Glyceraldehyde-3-(P) ∆Go' = +5,73Kcal/mol Phản ứng được xúc tác bởi enzyme aldolase. Do ∆Go' có giá trị dương khá cao nên rất khó hình dung rằng phản ứng có thể xảy ra theo chiều thuận. Tuy nhiên, nhờ tổng biến thiên năng lượng tự do của 3 phản ứng trước đó có giá trị âm khá cao (-7,0Kcal/mol), cũng như nhờ sức kéo nhiệt động học của các phản ứng sau nó nên phản ứng xảy ra một cách dễ dàng. 5/ Phản ứng chuyển hóa tương hỗ giữa các dạng triosophosphate: Dioxyacetonephosphate ––> Glyceraldehyde-3-phosphate ∆Go' = +1,83 Kcal/mol Phản ứng do enzyme triosophosphate isomerase xúc tác. Nó cần thiết cho glycolys vì trong hai loại triosophosphate xuất hiện khi phân giải fructoso-1,6- diphosphate chỉ có D-glyceraldehyde-3-phosphate có thể chuyển hóa tiếp tục. Phản ứng này kết thúc giai đoạn I của glycolys. ∆Go' của hai phản ứng sau cùng cộng lại có giá trị khoảng +7,5Kcal/mol. Nếu cộng ∆Go' của cả 5 phản ứng của giai đoạn chuẩn bị trên đây, ta có giá trị +0,5Kcal/mol. Để glycolys có thể tiếp tục xảy ra, các phản ứng kế tiếp phải là những phản ứng giải phóng nhiều năng lượng tự do để tạo ra một sức kéo nhiệt động học. * Các phản ứng của giai đoạn II. 6/ Phản ứng oxy-hóa glyceraldehyde-3-phosphate thành acid 1,3- diphosphoglyceric. Đây là một trong những giai đoạn quan trọng nhất của glycolys, vì năng lượng giải phóng khi oxy-hóa aldehyde 3-phosphoglyceric được giữ lại ở dạng sản phẩm cao năng 1,3-diphosphoglycerate. Việc phát hiện cơ chế này do Warburg thực hiện trong những năm 1937-1938 được xem là một trong những phát minh quan trọng nhất của sinh học hiện đại. Lần đầu tiên trong lịch sử sinh hóa đã phát hiện được cơ chế của các phản ứng enzyme cho phép năng lượng giải phóng trong phản ứng oxy hóa các phân tử hữu cơ có thể được tích lũy lại trong các phân tử ATP. Toàn bộ quá trình này được xúc tác bởi enzyme glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Đây là một enzyme có cấu trúc phức tạp. Enzyme thu nhận được từ nấm men có trọng lượng phân tử 140.000 và được cấu tạo từ 4 phần dưới đơn vị giống nhau, mỗi phần dưới đơn vị là một chuỗi polypeptide chứa khoảng 330 gốc aminoacid. Phương trình tổng quát của phản ứng có thể viết dưới dạng sau đây: 2 -Glyceraldehyde-3-phosphate + 2NAD+ + 2Pi ––> ––> 2(1,3-diphosphoglycerate) + 2NAD.H + 2H+ ∆Go' = 2 x 1,5Kcal/mol + 3,0 Kcal. Trong phản ứng này chức aldehyde của glyceraldehyde-3-phosphate bị oxy-hóa thành chức carboxyl. Tuy nhiên, thay cho acid 3-phosphoglyceric đã hình thành acid 1,3-diphosphoglyceric, mà như ta đã biết, có giá trị âm của ∆Go' còn cao GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
11. Trao đổi chất và năng lượng - 40 - hơn cả ATP. Phản ứng có giá trị dương của ∆Go' không lớn lắm nên có thể xảy ra theo cả hai chiều, tùy thuộc vào nồng độ của các chất ban đầu và sản phẩm của phản ứng. Trong khi phần lớn các phản ứng oxy-hóa là những phản ứng giải phóng năng lượng thì phản ứng này lại có ∆Go' > 0. Để hiểu được sự diễn biến năng lượng của nó, cần phải tách nó thành hai quá trình riêng biệt. Ký hiệu glyceraldehyde-3- 2- phosphate là R-CHO, còn acid 1,3-diphosphoglyceric là R-COOPO3 , hai quá trình riêng biệt này có thể được viết ở dạng như sau: + - + 1/ R-CHO + H2O + NAD ––> R-COO + NAD.H + H ∆Go' = -10,3Kcal/mol; - 2- 2/ RCOO + Pi –––––––––––> RCOOPO3 + H2O ∆Go' = +11,8Kcal/mol. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
12. Trao đổi chất và năng lượng - 41 - Như vậy, ∆Go's = ∆Go'1 + ∆Go'2 = -10,3 + 11,8 = +1,5Kcal/mol Nếu tính cả số năng lượng tích lũy lại trong phân tử NAD.H với giá trị khoảng 50Kcal/mol (năng lượng này chỉ có ý nghĩa trong điều kiện hiếu khí), ta sẽ thấy tầm quan trọng to lớn về phương diện năng lượng của phản ứng oxy hóa - khử này. Nếu xem xét sự biến thiên năng lượng đơn thuần qua các giá trị ∆Go' thì cho đến phản ứng này tổng giá trị ∆Go' bằng +3,5Kcal/ mol, tức chuyển về phía bất lợi cho glycolys. Cơ chế của quá trình oxy-hóa quan trọng này đã được nghiên cứu khá chi tiết. Kết qủa thu được cho phép xây dựng sơ đồ mô tả trong hình 12. Mỗi một trong 4 phần dưới đơn vị giống hệt nhau của enzyme liên kết Hình 12. Sơ đồ diễn biến của phản ứng với một phân tử NAD+ và có một trung oxy hóa glyceraldehyde-3-phosphate tâm hoạt động mà thành phần rất quan thàng acid 1,3-diphosphoglyceric. trọng của nó là nhóm -SH. Trước tiên, enzyme kết hợp với NAD+ và vì thế nhóm -SH bị phong toả. Sau đó chức aldehyde của cơ chất tương tác với nhóm -SH, tạo ra một thiosemi- acetal. Giai đoạn tiếp theo là vận chuyển nguyên tử hydro vốn liên kết đồng hóa trị với glyceraldehyde-3-phosphate đến NAD+ liên kết, khử nó thành NAD.H, đồng thời hình thành thioester giữa nhóm -SH của enzyme với nhóm carboxyl của cơ chất. Phân tử NAD ở trạng thái khử vẫn không tách khỏi enzyme mà nhường hydro (và điện tử) của mình cho phân tử NAD+ (có trong môi trường) để được trở lại trạng thái oxy-hóa. Phức hệ giữa cơ chất và enzyme ở giai đoạn này được gọi là acyl-enzyme. Gốc acyl sau đó được chuyển từ nhóm -SH của enzyme sang phân tử phosphate vô cơ để tạo ra sản phẩm oxy-hóa 1,3-diphosphoglycerate, đồng thời giải phóng enzyme tự do ở dạng oxy-hóa để xúc tác chu kỳ phản ứng tiếp theo. 7/ Phản ứng vận chuyển nhóm phosphate từ 1,3-diphosphoglycerate đến ADP: 1,3-Diphosphoglycerate hình thành trong phản ứng trên tiếp tục phản ứng với ADP để tổng hợp ATP: 2(1,3-Diphosphoglycerate) + 2ADP⎯⎯> 2(3-Phosphoglycerate) + 2ATP ∆Go' = -4,5Kcal/mol x 2 = -9,0Kcal Phản ứng được xúc tác bởi enzyme phosphoglycerate kinase. Giá trị âm khá cao của phản ứng này là yếu tố thúc đẩy phản ứng xảy ra rước đó. Đến đây hai phân tử ATP được phục hồi, đồng thời tổng giá trị ∆Go' đã chuyển về phía có lợi (- 5,5Kcal/mol). 8/ Phản ứng chuyển hóa 3-phosphoglycerate thành 2-phosphoglycerate: GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
13. Trao đổi chất và năng lượng - 42 - Mg2+ 2(3-phosphoglycerate) ⎯⎯> 2(2-phosphoglycerate) ∆Go' = +0,75Kcal/mol x 2 = +1,5Kcal Xúc tác phản ứng là enzyme phosphoglyceromutase. Trong phản ứng gốc phosphate từ vị trí C-3 trong acid glyceric được chuyển sang vị trí C-2, nhờ đó làm tăng tính hoạt động của gốc phosphate trong phân tử. Do biến thiên năng lượng tự do tiêu chuẩn tương đối thấp nên phản ứng xảy ra theo cả hai chiều. Enzyme phosphoglyceromutase tồn tại ở hai dạng. Một trong hai dạng này tạo ra sản phẩm trung gian của phản ứng là 2,3-diphosphoglycerate, tức tương tự như cơ chế tác dụng của phosphoglucomutase trong phản ứng chuyển hóa tương hỗ giữa glucoso-6-phosphate và glucoso-1-phosphate. 9/ Phản ứng dehydrate-hóa 2(2-Phosphoglycerate) ⎯⎯> 2(Phosphoenolpyruvate) + 2H2O ∆Go' = +0,2Kcal/mol x 2 = +0,4Kcal Đây là phản ứng thứ hai của glycolys mà trong đó xuất hiện liên kết cao năng. Nó được xúc tác bởi enzyme enolase. Hoạt động của enzyme đòi hỏi có mặt Mg2+ hoặc Mn2+. Mặc dù phản ứng về mặt hình thức là tách phân tử nước từ các nguyên tử carbon thứ hai và thứ ba của 2-phosphoglycerate, song nó cũng được xem là một quá trình oxy-hóa - khử trong nội bộ phân tử, vì khi tách bỏ phân tử nước, mức độ oxy-hóa của nguyên tử C-2 tăng lên, còn của C-3 giảm xuống. Phản ứng không làm biến đổi đáng kể năng lượng tự do tiêu chuẩn. Tuy nhiên, việc tách gốc phosphate từ chất ban đầu (2-phosphoglycerate) và từ sản phẩm (2- phosphoenolpyruvate) kèm theo những giá trị biến thiên năng lượng tự do tiêu chuẩn hoàn toàn khác nhau (-4,2Kcal đối với 2-phosphoglycerate và -14,8Kcal đối với 2-phosphoenolpyruvate). Như vậy, rõ ràng là phản ứng dehydrate-hóa 2- phosphoglycerate thành phosphoenol-pyruvate kèm theo sự bố trí lại năng lượng trong phân tử. 10/ Phản ứng vận chuyển gốc phosphate từ phosphoenolpyruvate đến ADP: 2 Phosphoenolpyruvate + 2ADP ⎯⎯> 2 Pyruvate + 2ATP ∆Go' = -7,5Kcal/mol x 2 = -15,0Kcal Phản ứng được xúc tác bởi enzyme pyruvate kinase. Rõ ràng phản ứng cuối cùng này của glycolys rất thuận lợi về năng lượng và K'eq của nó > 109 . Hơn thế nữa, hai phân tử ATP lại được hình thành là phần lợi nhuận thu được của tế bào nhờ glycolys. Ta có thể tính được tổng biến thiên năng lượng tự do tiêu chuẩn của toàn bộ quá trình là -19,4Kcal/mol glucose. 3. Các phản ứng sau glycolys. Glycolys với tư cách là giai đoạn đầu của quá trình hô hấp hiếu khí được xem là kết thúc với sự hình thành acid pyruvic. Chất này tùy thuộc vào điều kiện môi trường (có mặt hay vắng mặt oxy) và tùy thuộc vào tứng loại tế bào (ví dụ tế bào vi khuẩn, động vật, thực vật hay nấm men) có thể tiếp tục trải qua các con đường biến hóa khác nhau. Như ta đã biết, trong điều kiện kỵ khí, acid pyruvic có thể chuyển hóa thành acid lactic (ở vi khuẩn lactic) hoặc thành ethanol (ở nấm men). Sự chuyển hóa acid pyruvic thành các chất này được xem như là các cơ chế thích nghi của sinh vật đối với điều kiện thiếu oxy. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
14. Trao đổi chất và năng lượng - 43 - Như ta đã thấy ở trên, trong chuỗi các phản ứng của glycolys hai phân tử NAD+ bị khử thành NAD.H. Chức năng của NAD trong tế bào là vận chuyển năng lượng. Nó hoạt động như một con thoi để chuyển các điện tử giàu năng lượng từ chất này đến chất khác. Sau khi tiếp nhận điện tử từ cơ chất, nó nhanh chóng chuyển điện tử đó cho một chất nhận khác để lại tiếp tục vận chuyển các điện tử khác. Tế bào chỉ có một số lượng phân tử NAD hạn chế và vì vậy những phân tử này cần phải được sử dụng đi sử dụng lại liên tục. Giả sử các phân tử NAD.H hình thành trong glycolys không nhanh chóng trút bỏ các điện tử nhận được (tức được oxy-hóa ngược lại thành NAD+) thì toàn bộ các phân tử NAD của tế bào đã biến hết thành dạng khử và glycolys phải dừng lại ở phản ứng thứ 6. Như đã thảo luận trên đây về phản ứng 6, hơn 50Kcal/mol năng lượng tự do được tích lũy trong các phân tử NAD.H. Để tế bào gặt hái được số năng lượng dồi dào này, NAD.H cần phải chuyển điện tử đến các mức năng lượng thấp hơn thuộc một chất nhận có khả năng tích nhiều điện tích âm hơn nào đó. Trong điều kiện hiếu khí oxy là chất nhận điện tử sau cùng. Nhưng trong điều kiện kỵ khí chính acid pyruvic sẽ nhận điện tử từ NAD.H và bị khử thành acid lactic: Pyruvate + NAD.H + H+ ⎯⎯> Lactate + NAD+ ∆Go' = -6,0 Kcal/mol Xúc tác phản ứng là enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có cấu trúc khá phức tạp. Ở động vật bậc cao nó tồn tại ít nhất ở 5 dạng isoenzyme có ái lực khác nhau với cơ chất. Do ∆Go' có giá trị âm khá cao nên phản ứng lệch hẵn về phía hình thành acid lactic. Acid lactic được xem là sản phẩm cuối cùng của glycolys (trong điều kiện kỵ khí). Sau khi hình thành, nó có thể thấm qua màng tế bào để được giải phóng ra môi trường như một sản phẩm bị loại. Ở động vật bậc cao, khi tế bào cơ hoạt động quá mạnh trong điều kiện thiếu oxy, một lượng khá lớn acid lactic được đưa vào máu. Trong gan nó được chuyển hóa ngược lại thành glucose trong một quá trình có tên gọi là gluconeogenez. Cảm giác mỏi hoặc tê cơ là do sự tích lũy acid lactic làm cho độ pH bị lệch về phía acid. Trong một số trường hợp khác acid pyruvic không trực tiếp nhận điện tử từ NAD.H mà nó chỉ làm công việc này sau khi bị decarboxyl-hóa thành acetaldehyde: Pyruvate ––––> Acetaldehyde + CO2 Xúc tác cho phản ứng không thuận nghịch này là enzyme pyruvate decarboxylase. Hoạt động của enzyme đòi hỏi sự có mặt của thyamine pyrophosphate với tư cách là coenzyme và ion Mg2+ . Cuối cùng, với sự xúc tác của enzyme alcohol dehydrogenase acetaldehyde nhận điện tử từ NAD.H để bị khử thành ethanol, đồng thời khôi phục phân tử NAD+ : Acetaldehyde + NAD.H + H+ ––––> Ethanol + NAD+ 4. Các phản ứng lôi cuốn các loại carbohydrate khác vào quá trình glycolys. * Glycogen và tinh bột được lôi cuốn vào quá trình glycolys nhờ hai enzyme glycogen phosphorylase (hay phosphorylase tinh bột) và phosphogluco- mutase. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
15. Trao đổi chất và năng lượng - 44 - Glycogen phosphorylase và phosphorylase tinh bột là những đại diện của nhón enzyme α-1,4-glucanphosphorylase, xúc tác phản ứng 2- (Glucose) n + HPO3 ––––> (Glucose) n-1 + glucoso-1-phosphate Trong phản ứng này liên kết α-1,4-glycoside ở đầu tận cùng không khử của mạch glycogen (hoặc tinh bột) bị tách ra khỏi mạch với sự tham gia của phosphate vô cơ để tạo ra sản phẩm glucoso-1-phosphate. Phản ứng tiếp tục cho đến khi gặp mạch nhánh, tức liên kết α-1,6-glycoside mà chúng không thể phân giải được. Để glycogen phosphorylase tiếp tục thực hiện tác dụng của mình. cần phải có sự hỗ trợ của enzyme thủy phân α-1,6-glucosidase để phân giải liên kết 1,6 tại điểm phân nhánh. Glucoso-1-phosphate tiếp tục chuyển hóa thành glucoso-6-phosphate nhờ enzyme phosphoglucomutase: Glucoso-6-phosphate ––––> Glucoso-1-phosphate Enzyme này chứa gốc serine và nhóm -OH của gốc serine đó trong quá trình xúc tác gắn bằng liên kết ester với acid phosphoric. Hoạt động của enzyme cần Mg2+ và glucoso-1,6-diphosphate với tư cách là sản phẩm trung gian của phản ứng: Phosphoenzyme + Glucoso-1-(P) ––––> Dephosphoenzyme + Glucoso-1,6-di(P) Dephosphoenzyme + Glucoso-1,6-di(P)–––> Phosphoenzyme + Glucoso-6-(P). * D-Mannose và D-fructose để tham gia quá trình glycolys, trước hết cần được phosphoryl-hóa nhờ hexokinase thành D-mannoso-6-phosphate và D-fructoso- 6-phosphate. D-fructoso-6-phosphate đã là một sản phẩm trung gian của glycolys; còn D-mannoso-6-phosphate cần phải được tiếp tục chuyển hóa thành D-fructoso-6- phosphate nhờ enzyme phosphomannoizomerase. * D-Galactose được phosphoryl-hóa nhờ galactokinase thành galactoso-1- phosphate. Sau đó chất này được epimer-hóa thành D-glucoso-1-phosphate. Bước chuyển hóa sau cùng này được thực hiện qua một số giai đoạn với sự tham gia của UTP. * Các pentose cũng được lôi cuốn vào quá trình glycolys sau khi sơ bộ chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate trong chu trình pentoso-phosphate. * Glycerine và glycerol-3-phosphate - sản phẩm phân giải của triacyl- glycerine và glycerophospholipid - cũng có thể được lôi cuốn vào quá trình glycolys. Glycerine được phosphoryl-hóa thành glycerol-3-phosphate nhờ glycerokinase: Glycerol + ATP –––> Glycerol-3-phosphate + ADP. Glycerol-3-phosphate sau đó bị oxy-hóa với sự xúc tác của glycerophosphate dehydrogenase thành dioxyacetonephosphate - một sản phẩm trung gian của glycolys: Glycerol-3-phosphate + NAD+ ––––> dioxyacetonephosphate + NAD.H + H+ GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
16. Trao đổi chất và năng lượng - 45 - III. DECARBOXYL-HÓA OXY-HÓA ACID PYRUVIC VÀ CHU TRÌNH ACID TRICARBOXYLIC Trong điều kiện có oxy phân tử acid pyruvic không cần thiết phải hoạt động như một chất nhận điện tử. Các điện tử giàu năng lượng trong các phân tử NAD.H được chuyển cho oxy, còn acid pyruvic tiếp tục bị oxy-hóa thành khí carbonic và nước. Nhờ đó một số rất lớn năng lượng chứa trong phân tử acid pyruvic (590Kcal/mol) tiếp tục được giải phóng để tổng hợp thêm nhiều ATP hơn. Ngay cả acid lactic cũng có thể được chuyển hóa ngược lại thành acid pyruvic (đồng thời khôi phục phân tử NAD.H đã sử dụng) để tiếp tục bị oxy-hóa. 1. Decarboxyl-hóa oxy-hóa acid pyruvic. Giai đoạn thứ hai của quá trình hô hấp hiếu khí bao gồm các phản ứng decarboxyl-hóa oxy-hóa acid pyruvic thành acetyl-CoA. Phương trình tổng quát của các phản ứng này có dạng: + + Pyruvate + NAD + CoA-SH –––> Acetyl-S-CoA + NAD.H + H + CO2 ∆Go’= -8,0Kcal/mol. Trong phản ứng này coenzyme A đóng vai trò vận chuyển nhóm acyl tương tự như ATP là chất vận chuyển phosphate. Liên kết thioester trong acetyl-CoA là một kiểu liên kết cao năng. Biến thiên năng lượng tự do tiêu chuẩn của phản ứng thủy phân acetyl-CoA có giá trị âm khá cao: Acetyl-CoA + H2O –––> Acetate + CoA-SH ∆Go' = -7,52Kcal/mol Hệ thống pyruvate dehydrogenase xúc tác cho quá trình decarboxyl-hóa oxy- hóa acid pyruvic bao gồm 3 enzyme và 5 coenzyme khác nhau tập hợp lại thành một cơ cấu thống nhất. Vai trò của mỗi thành phần trong hệ thống được tình bày trong hình 13. Hình 13 . Cơ chế hoạt động của hệ thống pyruvate dehydrogenase. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
17. Trao đổi chất và năng lượng - 46 - Toàn bộ quá trình có thể được chia thành 5 giai đoạn. Ở giai đoạn I acid pyruvic bị decarboxyl-hóa cới sự xúc tác của enzyme pyruvate decarboxylase (E1) có nhóm hoạt động là thyamine pyrophosphate (TPP). Trong phản ứng này pyruvate sau khi mất CO2 biến thành dẫn xuất oxyethyl ở trạng thái liên kết với nhóm thyamine pyrophosphate của E1. Ở giai đoạn II nhóm oxyethyl được chuyển đến cho một trong hai nguyên tử lưu huỳnh của nhóm disulfide vòng của acid lipoic. Acid lipoic là một acid béo no, trong đó các nguyên tử C-6 và C-8 gắn với nhóm disulfide và tạo nên mạch vòng 5 cạnh (hình 14). Nó dễ dàng bị khử thành acid dihydrolipoic. Lúc đó nhóm disulfide biến thành hai nhóm -SH. Acid lipoic tồn tại ở trạng thái liên kết đồng hóa trị với enzyme dihydrolipoyl transacetylase (E2) bằng cách tạo nên liên kết peptide với nhóm ε-amine của lysine trong thành phần của phân tử enzyme. Khi chuyển nhóm oxyethyl từ thyamine-pyrophosphate đến acid lipoic cũng xảy ra đồng thời phản ứng oxy-hóa khử: nhóm oxyethyl bị oxy-hóa thành nhóm acetyl do mất hai nguyên tử hydro, trong đó một nguyên tử gắn với acid lipoic để khử nó thành dạng dithiol. Ở giai đoạn III nhóm acetyl được chuyển từ gốc acid lipoic cho nhóm -SH của coenzyme A để tạo ra acetyl-CoA, tách chất này ra khỏi Hình 14. Cấu tạo của acid enzyme E2. Ở giai đoạn IV xảy ra phản lipoic ứng tái oxy hóa dạng dithiol của acid lipoic thành dạng disulfide với sự xúc tác của enzyme dihydrolipoyl- dehydrogenase (E3) mà coenzyme là FAD. Trong phản ứng FAD trong thành phần của E3 bị khử thành FAD.H2 . Ở giai đoạn cuối cùng E3 -FAD.H2 bị tái oxy-hóa với sự tham gia của + + NAD . Kết qủa là khôi phục trạng thái oxy-hóa của E3 -FAD và NAD bị khử thành NAD.H . Phức hệ pyruvate dehydrogenase đã tách được từ ty thể của tim lợn và từ E. coli có M=4,0x106. Nó bao gồm 24 phân tử pyruvate dehydrogenase (M=90.000), mỗi phân tử chứa một gốc thyamine pyrophosphate, một phân tử dihydrolipoyl transacetylase (cấu tạo từ 24 chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi có M=36.000, chứa một gốc acid lipoic, và 12 phân tử dihydrolipoyl dehydrogenase (M=55.000), mỗi phân tử gắn với một gốc FAD. Đường kính của phức hệ này vào khoảng 350 ± 50⊕ , cao 225 ±25 ⊕ Phức hệ pyruvate dehydrogenase bị ức chế bởi các hợp chất của arsen do những chất này phản ứng với hai nhóm thiol của acid lipoic, tạo ra cấu trúc vòng không hoạt động. Phức hệ enzyme còn bị ức chế bởi ATP. Khi hàm lượng ATP trong tế bào bắt đầu vượt quá mức độ nhất định, hệ thống pyruvate dehydrogenase GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
18. Trao đổi chất và năng lượng - 47 - sẽ lập tức ngừng hoạt động để dình chỉ việc cung cấp chất đốt (acetyl-CoA) cho chu trình acid tricarboxylic. 2. Các phản ứng của chu trình acid tricarboxylic. Các phản ứng của chu trình acid tricarboxylic được xem là giai đoạn thứ ba của hô hấp hiếu khí. Các phản ứng của chu trình này được mô tả trong hình 15. Chu trình acid tricarboxylic là đoạn đường chung của các quá trình dị hóa oxy-hóa của tất cả các loại "chất đốt" tế bào trong điều kiện hiếu khí. Trong chu trình này các nhóm acetyl bị phân giải để giải phóng CO2 và các nguyên tử hydro. Những nguyên tử hydro này (hay những điện tử tương ứng với chúng) được lôi cuốn vào chuỗi hô hấp mà ta sẽ xét tới sau. Phương trình tổng quát của chu trình tricarboxylic có thể viết dưới dạng sau đây: CH3 - COOH + 2H2O –––> 2CO2 + 8H Từ phương trình này ta thấy tất cả oxy phân tử, phosphate vô cơ và ATP đều không tham gia trực tiếp vào chu trình. Chức năng chủ yếu của chu trình là dehydrogen-hóa acid acetic để cuối cùng tạo ra hai phân tử CO2 và 4 cặp hydro. Tất cả enzyme của chu trình acid tricarboxylic cũng như của các phản ứng decarboxyl-hóa oxy-hóa acid pyruvic và các phản ứng của chuỗi hô hấp đều định vị trong cơ chất của ty thể. Một số enzyme của chu trình acid tricarboxylic cũng được phát hiện trong bào tương (aconitase, fumarase, malate dehydrogenase). Tuy nhiên, những enzyme này tác dụng lên các con đường trao đổi chất khác. Hình 15 . Chu trình citrate (Chu trình acid tricarboxylic, GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
19. Trao đổi chất và năng lượng - 48 - chu trình Krebs). Toàn bộ chu trình acid tricarboxylic bao gồm 7 phản ứng sau đây: 1/ Phản ứng citrate synthase. C=O-S-CoA CH3 (Acetyl-CoA) O=C-S-CoA COOH + ––––––> CH2 ––––––> CH2 + CoA-SH O HO-C-COOH HO-C-COOH C-COOH CH2 CH2 CH2 COOH COOH COOH (Acid oxaloacetic) (Acid citric) Phản ứng nghiêng hẵn về phía tổng hợp acid citric, vì cắt đứt liên kết cao năng thioester dẫn đến giảm đáng kể năng lượng tự do (∆Go'= -7, 7Kcal/ mol). Citrate syntase là một enzyme điều hòa, vì nó bị ức chế bởi ATP và NAD.H. 2/ Phản ứng aconitase. Enzyme aconitase (aconitate hydratase) thực hiện sự chuyển hóa tương hỗ giữa citrate, cis-aconitate và isocitrate: COOH COOH COOH CH2 CH2 CH2 HO-C-COOH –––> C-COOH ––––> HC-COOH CH2 α-cetoglutarate + CO2 + NAD.H + H Ở nhiều loại động thực vật bậc cao có hai loại isocitrate dehydrogenase: một loại sử dụng chất nhận điện tử là NAD+ , còn loại kia - NADP+. Cả hai enzyme đều có mặt trong ty thể, song loại thứ hai (phụ thuộc NADP) còn có mặt trong bào tương. Tìm hiểu chức năng của hai enzyme này, người ta đã đi đến kết luận là chỉ có enzyme phụ thuộc NAD tham gia trong chu trình acid tricarboxylic, còn enzyme thứ hai chủ yếu phục vụ cho các phản ứng sinh tổng hợp liên quan đến chu trình này. Isocitrate dehydrogenase phụ thuộc NAD cần Mg2+ và Mn2+ cho hoạt động của mình. Phản ứng do nó xúc tác kèm theo việc giảm đáng kể năng lượng tự do. Đây là một enzyme dị lập thể. Hoạt tính của nó được tăng cường nhờ ADP do chất này gây hiệu ứng dị lập thể lên enzyme. Trong khi đó AMP và các nucleoside 5'- GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
20. Trao đổi chất và năng lượng - 49 - phosphate khác (trừ dADP) không gây hiệu ứng này. Ngược lại, NAD.H và ATP có tác dụng ức chế hoạt tính của enzyme. Khi hàm lượng của ADP trong tế bào tăng lên vì một lý do nào đó (ví dụ vì ATP bị phân giải quá nhanh trong các phản ứng sử dụng năng lượng), tốc độ oxy- hóa acid citric tự động tăng lên, làm tăng tốc độ của toàn bộ chu trình acid tricarboxylic. Tăng tốc độ của các phản ứng của chu trình sẽ dẫn đến việc tăng nhanh quá trình vận chuyển điện tử và phosphoryl-hóa oxy-hóa, tức chuyển hóa ADP thành ATP. Khi tăng hàm lượng ATP trong tế bào, hàm lượng của ADP sẽ bị giảm, và do đó hoạt động của isocitrate dehydrogenase sẽ bị ức chế. Sự tích lũy NAD.H trong ty thể cũng có tác dụng tương tự. 4/ Phản ứng oxy-hóa acid α- cetoglutaric thành acid succinic. Oxy-hóa acid α-cetoglutaric thành acid succinic là một quá trình gồm hai giai đoạn. ở giai đoạn đầu acid α-cetoglutaric bị decarboxyl-hóa oxy-hóa thành succinyl-CoA: + + α-Cetoglutarate + NAD + CoA-SH ⎯> Succinyl-CoA + CO2 + NAD.H + H ∆Go' = -8,0Kcal/mol Phản ứng này giống như phản ứng oxy-hóa acid pyruvic thành acetyl-CoA và CO2. Cơ chế của hai phản ứng hầu như giống nhau. Trong cả hai thường hợp đều cần có các coenzyme TPP, acid lipoic, CoA-SH, NAD+ và FAD. Phức hệ α- cetoglutarate dehydrogenase về cấu trúc rất giống với phức hệ pyruvate dehydrogenase. Sản phẩm cuối cùng của phản ứng này - succinyl-CoA - là một thioester cao năng. Ở giai đoạn kế tiếp nó bị mất nhóm CoA-SH trong phản ứng với sự tham gia của GDP và phosphate vô cơ. Năng lượng giải phóng trong phản ứng tích lũy lại trong liên kết phosphate tận cùng của GTP: Succinyl-CoA + Pi + GDP ⎯→ Succinate + CoA-SH + GTP ∆Go' = -0,7Kcal/mol Phản ứng này được xúc tác bởi enzyme succinyl thiokinase (succinyl-CoA synthetase). GTP sau đó nhường gốc phosphate tận cùng cho ADP để tạo ra phân tử ATP. 5/ Phản ứng succinate dehydrogenase. Enzyme succinate dehydrogenase xúc tác phản ứng này là một flavoprotein: Succinate + E-FAD ⎯→ Fumarate + E-FAD.H2 Enzyme này có một số tính chất của enzyme dị lập thể. Nó được hoạt hóa bởi phosphate, succinate và fumarate; trong khi đó nó bị ức chế cạnh tranh bởi oxaloacetate và malonate. 6/ Phản ứng fumarase. Với sự xúc tác của enzyme fumarase (fumarate hydratase) xảy ra với sự chuyển hóa thuận nghịch acid fumaric thành acid malic. Biến thiên năng lượng tự do của phản ứng không lớn nên nó dễ dàng xảy ra theo cả hai chiều. Trọng lượng phân tử của enzyme vào khoảng 200.000. Phân tử được cấu tạo từ 4 phần dưới đơn vị. Mỗi phần dưới đơn vị riêng lẻ không có hoạt tính xúc tác. Phản ứng không đòi hỏi coenzyme. ATP làm giảm ái lực của fumarase với fumarate và do đó ức chế phản ứng khi nồng độ fumarate thấp hơn mức độ bão hòa. 7/ Phản ứng malate dehydrogenase. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
21. Trao đổi chất và năng lượng - 50 - L-Malate + NAD+ ⎯→ Oxaloacetate + NAD.H + H+ ∆Go' = 7,1Kcal/mol Mặc dù phản ứng có ∆Go' > O, song trong tế bào nó dễ dàng xảy ra theo chiều thuận do sản phẩm của phản ứng oxaloacetate và NAD.H nhanh chóng được sử dụng. Tế bào của các cơ thể bậc cao có hai loại malate dehydrogenase. Loại thứ nhất định vị trong ty thể, còn loại thứ hai - trong bào tương. Chúng có trọng lượng phân tử giống nhau nhưng khác nhau bởi thành phần aminoacid, đặc điểm điện di và hoạt tính xúc tác. Enzyme trong ty thể lại bao gồm ít nhất 5 dạng khác nhau cùng có hoạt tính xúc tác như nhau nhưng có cấu trúc không giống nhau. Xem xét toàn bộ các phản ứng của chu trình acid tricarboxylic, ta có thể thấy từ một phân tử glucose ở giai đoạn này của hô hấp tạo ra bốn phân tử CO2, hai phân tử ATP và 16 nguyên tử hydro. Nhờ 16 nguyên tử hydro này mà sau hai vòng của chu trình sẽ hình thành 6 phân tử NAD.H và 2 phân tử FAD.H2. Ý nghĩa của chu trình sẽ được thấy rõ khi xem xét các giai đoạn tiếp theo của hô hấp. Tuy nhiên, ý nghĩa của chu trình không chỉ hạn chế ở khía cạnh năng lượng. Chu trình acid tricarboxylic liên quan không những với dị hóa mà với cả đồng hóa với tư cách là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng cũng như năng lượng cho các quá trình sinh tổng hợp. Có hàng loạt các phản ứng liên quan với nó, mà nhờ đó một số sản phẩm trung gian của chu trình, như α-cetoglutarate, succinate, oxaloacetate có thể được đưa ra khỏi chu trình và được sử dụng để tổng hợp aminoacid. Mặt khác, do phần lớn phản ứng của chu trình là thuận nghịch nên chúng đồng thời được sử dụng để tạo ra các sản phẩm trung gian của chu trình từ aminoacid. Bình thường, các phản ứng mà nhờ đó những sản phẩm trung gian nhất định được đưa ra khỏi chu trình, hoặc ngược lại, được đưa vào chu trình thiết lập trạng thái cân bằng động với nhau, nhờ đó nồng độ của những sản phẩm trung gian này trong ty thể được giữ ở mức độ ổn định. Trong việc giữ thế ổn định này có sự tham gia của một số phản ứng enzyme đặc biệt thường được gọi là các phản ứng bù đắp. Những phản ứng này làm nhiệm vụ bổ sung nguồn dự trữ các sản phẩm trung gian của chu trình acid tricarboxylic. Đáng lưu ý hơn cả là các phản ứng bù đắp sau đây: Phản ứng pyruvate carboxylase. Mg 2+ Pyruvate + CO2 + ATP ⎯→ Oxaloacetate + ADP + Pi ∆Go' = -0,5Kcal/mol Khi chu trình acid tricarboxylic bị thiếu oxaloacetate hoặc thiếu các sản phẩm trung gian khác, nhờ phản ứng này mà dự trữ oxaloacetate được tăng lên. Ngược lại, khi thừa oxaloacetate, nó có thể bị decarboxyl-hóa thành pyruvate và CO2 . Là một enzyme dị lập thể, hoạt tính của nó chịu ảnh hưởng của acetyl-CoA. Khi vắng mặt acetyl-CoA, tốc độ của phản ứng thuận rất thấp. Khi acetyl-CoA có dư, phản ứng sẽ được kích thích để tạo ra nhiều oxaloacetate hơn, tức tạo điều kiện để oxy-hóa được nhiều acetyl-CoA hơn. Phản ứng này chủ yếu phát huy tác dụng trong gan và thận của động vật bậc cao. Trong các mô khác, ví dụ cơ tim, chức năng bù đắp được thực hiện nhờ hai phản ứng khác với sự xúc tác của hai enzyme: malic-enzyme và phospho- enolpyruvate carboxylase: GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
22. Trao đổi chất và năng lượng - 51 - + + L-Malate + NADP ⎯→ Pyruvate + CO2 + NADP.H + H và Phosphoenolpyruvate + CO2 + IDP ⎯→ Oxaloacetate + ITP Chức năng bù đắp cho chu trình acid tricarboxylic ở thực vật và nhiều vi sinh vật được thực hiện nhờ một chu trình biến dạng của chu trình acid tri- carboxylic có tên là chu trình glyoxilate. IV. PHOSPHORYL HÓA OXY HÓA. Trong trật tự các phản ứng dị hóa glucose mà ta đã xem xét trên đây xó 4 phân tử ATP được hình thành trong các phản ứng liên hợp với các phản ứng oxy hóa aldehyde 3-phosphoglyceric và acid α-cetoglutaric. Số phân tử ATP này mới chỉ là một phần nhỏ năng lượng sản sinh trong toàn bộ quá trình phân hủy một phân tử glucose thành khí carbonic và nước. Số năng lượng còn lại một phần được giải phóng ở dạng nhiệt vốn cần để thúc đẩy quá trình phản ứng, một phần khác được tích lũy trong các coenzyme khử NAD.H và FAD.H2 vốn có thế khử tiêu chuẩn rất cao và do đó là những hợp chất rất giàu năng lượng (bảng III.2). Như ta đã thấy, có tất cả 12 phân tử thuộc loại này được hình thành khi phân hủy một phân tử glucose, bao gồm 2 NAD.H trong glycolis, 2 NAD.H trong phản ứng decarboxyl hóa oxy hóa acid pyruvic thành acetyl-CoA và 6 NAD.H cùng 2 FAD.H2 trong chu trình acid tricarboxylic. Trong điều kiện hiếu khí những hợp chất giàu năng lượng này sẽ chuyển điện tử của mình cho oxy không khí để khôi phục lại trạng thái oxy hóa NAD+ và FAD. Tuy nhiên, oxy không trực tiếp nhận điện tử từ các coenzyme khử. Các điện từ cùng với proton vốn gắn liền với chúng được đưa đến chất nhận cuối cùng qua một chuỗi chất vận chuyển trung gian định vị trên màng trong của ty thể, có tên gọi là chuỗi hô hấp. Năng lượng giải phóng trong quá trình vận chuyển điện tử này sau đó được hệ enzyme ATP-ase cũng định vị trên màng trong của ty thể dùng để tổng hợp ATP trong quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. Sự hiểu biết của con người hiện nay về phosphoryl hóa oxy hóa (và cả phosphoryl hóa quang hợp) dựa trên giả thuyết hóa thẩm thấu do Peter Mitchell đề xuất năm 1961, theo đó hiệu số nồng độ proton giữa hai phía của màng trong của ty thể (và màng thylacoid của lục lạp) là động lực quan trọng cho quá trình sinh tổng hợp ATP từ ADP và Pvc. Có 3 điểm giống nhau cơ bản giữa phosphoryl hóa oxy hóa và phosphoryl hóa quang hợp: 1/ Cả hai quá trình đều gắn với dòng điện tử xuyên qua một chuỗi các chất vận chuyển trung gian ở dạng khử gắn với màng, bao gồm các hợp chất quinone, cytochrome và các protein chứa sắt – lưu huỳnh; 2/ Năng lượng tự do giải phóng do dòng điện tử “đi xuống” gắn liền với sự vận chuyển proton “đi lên” xuyên qua hệ thống màng không thấm đối với proton. Sự phối hợp này giúp tích lũy một phần năng lượng ở dạng thế điện hóa xuyên màng; 3/ Dòng proton xuyên màng theo chiều giảm nồng độ của chúng xảy ra xuyên qua các kênh đặc hiệu, dẫn đến sự cung cấp năng lượng cho sinh tổng hợp ATP. Trong mục này chúng ta xem xét trước quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, bắt đầu bằng sự mô tả các thành phần của chuỗi vận chuyển điện tử trên màng trong GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
23. Trao đổi chất và năng lượng - 52 - của ty thể, trật tự các chất vận chuyển được tổ chức thành các phức hệ chức năng để hoạt động, đồng thời, sẽ xét tới cơ chế hoá thẩm thấu mà nhờ đó sự vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp dẫn đến sinh tổng hợp ATP. Ty thể được phân cách khỏi các cơ quan tử khác của tế bào bởi lớp màng kép. Màng ngoài cho phép các phân tử nhỏ và các ion xuyên qua. Các kênh xuyên màng cấu tạo từ protein cho phép phần lớn các phân tử vớ M < 5000 qua lại dễ dàng. Trong khi đó màng trong không xuyên thấm đối với phần lớn các phân tử nhỏ và ion, kể cả ion H+. Trên màng này định vị các thành phần của chuỗi hô hấp và phức hệ enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp ATP. Trong thành phần của chuỗi hô hấp ngoài NAD và các flavoprotein còn có 3 nhóm vận chuyển điện tử khác. Đó là benzoquione kỵ nước (ubiquinone) và hai nhóm protein chứa sắt là các cytochrome và Fe-S-protein. Hình 16. Sơ đồ mô tả chuỗi hô hấp và hoạt động của quá trình phosphoryl hóa oxy hóa. Trong tất cả các phản ứng xảy ra trên chuỗi hô hấp các điện tử di chuyển từ NAD.H, succinate hoặc một số chất cho điện tử sơ cấp khác, xuyên qua các flavoprotein, ubiquinone Fe-S-protein và các cytochrome để cuối cùng đến với O2 (hình 16). Dựa vào thế khử của chúng có thể sắp xếp các chất vận chuyển theo trật tự: NAD.H, UQ, cytochrome b, cytochrome c1, cytochrome c, cytochrome a+a3. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
24. Trao đổi chất và năng lượng - 53 - Bảng IV.1. Thành phần protein của chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể Phức hệ enzyme Khối Số lượng Các nhóm lượng (kDa) phần dưới đơn vị thêm NAD.H- 850 > 25 FMN,Fe-S dehydrogenase Succinate 140 4 FAD, Fe-S dehydrogenase Ubiquinone, Heme, cytochrome c 250 10 Fe-S oxydoreductase Cytochrome c 13 1 Heme Cytochrome c oxydase 160 6-13 Heme, CuA,CuB Xử lý nhẹ màng trong của ty thể bằng chất tẩy rửa, cho phép phát hiện 4 phức hệ vận chuyển điện tử, Mỗi phức hệ có thành phần rất đặc trưng (bảng IV.1). Mỗi phức hệ có khả năng xúc tác vận chuyển điện tử qua một khu vực của chuỗi hô hấp. Các phức hệ I và II xúc tác vận chuyển điện tử đến ubiquinone từ hai chất cho khác nhau là NAD.H (phức hệ I) và succinate (phức hệ II). Phức hệ III vận chuyển điện tử từ ubiquinone đến cytoxhrome c, còn phức hệ IV tiếp tục vận chuyển điện tử từ cytochrome c đến O2. Ngoài 4 phức hệ trên, trên màng trong của ty thể còn có hẹâ enzyme sinh tổng hợp ATP, ký hiệu là phức hệ FoF1, hay đôi khi còn được gọi là phức hệ V. Qua hình 16 ta có thể thấy rõ các điện tử đạt đến UQ qua các phức hệ I và II. UQ.H2 làm nhiệm vụ như một chất vận chuyển linh động đối với điện tử và proton. Nó chuyển điện tử cho phức hệ III để sau đó phức hệ III chuyển tiếp cho cytochrome c. Phức hệ IV chuyển điện tử từ cytochrome c đến O2. Dòng điện tử xuyên qua các phức hệ I, III và IV kèm theo dòng proton từ cơ chất của ty thể đi ra khoảng không gian giữa 2 màng tạo ra gradient proton xuyên màng – động lực để hệ enzyme ATP-ase sử dụng trong việc sinh tổng hợp ATP sau đó. Như vậy, nhờ hoạt động của chuỗi hô hấp mà toàn bộ năng lượng tích lũy trong các coenzyme khử NAD.H và FAD.H2 đã được giải phóng. Phần lớn số năng lượng đó, như ta đã thấy, đã chuyển hóa thành năng lượng của gradient proton giữa hai phía của màng trong của ty thể. Gradient này hình thành được là nhờ tính không xuyên thấm của ion H+ qua màng này. Ngăn trong bị mất H+ sẽ tính điện âm, còn ngăn ngoài có nhiều ion H+ nên tích điện dương. Kết quả xuất hiện một hiệu số + điện thế. Phức hệ FoF1 là nơi duy nhất cho phép ion H quay ngược từ ngăn ngoài vào ngăn trong. Khi dòng điện (ở đây là dòng H+ chứ không phải là dòng e-) chạy qua, phức hệ này sẽ được cấp năng lượng để tổng hợp ATP từ ADP và Pvc. Như vậy, nhờ có sự hòa hợp giữa phức hệ FoF1 với chuỗi hô hấp mà năng lượng giải phóng trong các phản ứng oxy hóa NAD.H và FAD.H2 có thể được dùng để tổng hợp ATP. Vì vậy kiểu tổng hợp ATP này được gọi là phosphoryl hóa oxy hóa trong chuỗi hô hấp. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
25. Trao đổi chất và năng lượng - 54 - Ngoài tác dụng làm nguồn năng lượng trực tiếp để tổng hợp ATP, gradient proton còn được sử dụng để bơm các phân tử ATP từ trong cơ chất của ty thể ra tế bào chất. Trên cơ sở mức chênh lệch năng lượng giữa NAD.H, FAD.H2 với dạng oxy hóa tương ứng (NAD+ và FAD) người ta cho rằng khi nhường điện tử của mình cho oxy phân tử qua chuỗi hô hấp cho phép tạo ra 3 ATP từ NAD.H và 2 ATP từ FAD.H2. Riêng các phân tử NAD.H hình thành trong quá trình glycolis vốn xảy ra trong tế bào chất chỉ cho phép tạo ra số phân tử ATP tương đương với FAD.H2 trong ty thể. Đó là do kết quả của một cơ chế vận chuyển các đương lượng khử từ tế bào chất vào ty thể có tên là cơ chế con thoi glycerophoosphate. Theo cơ chế này NAD.H của tế bào chất được dùng để khử dioxyacetone phosphate thành glycerophosphate. Sau đó glycerophosphate đi vào ty thể. Tại đó với sự tham gia của FAD nó bị oxy hóa ngược lại thành dioxyacetone phosphate, còn FAD bị khử thành FAD.H2. Cả hai phản ứng đều được xúc tác bởi glycerophosphate dehydrogenase nhưng với sự tham gia của hai coenzyme khác nhau. Kết quả là các đương lượng khử trong tế bào chất ở dạng NAD.H được chuyển vào ty thể ở dạng FAD.H2. Nhờ hoạt động của chuỗi hô hấp liên hợp với phức hệ FoF1 mà năng lượng tự do giải phóng từ một phân tử glucose trong quá trình glycolis có thể dẫn đến sự hình thành thêm 4 phân tử ATP, nâng tổng số ATP của giai đoạn này lên 6 phân tử. Trong khi đó ở giai đoạn hiếu khí tiếp theo ngoài 2 ATP xuất hiện trực tiếp trong chu trình acid tricarboxilic còn hình thành thêm (6x3) + (2x2) = 28 phân tử ATP nữa. Do đó khi oxy hóa hoàn toàn một phân tử glucose thành khí carbonic và nước tạo ra được 36 phân tử ATP, trong đó 6 phân tử ở giai đoạn kỵ khí và 30 phân tử ở giai đoạn hiếu khí. Trong mỗi phân tử ATP tích lũy 7,3 Kcal. Như vậy trong 36 phân tử ATP tích lũy được 7,3 x 36 = 263 Kcal. Trong khi đó biến thiên năng lượng tự do của phản ứng C6H12O6 + 6O2 ⎯→ 6CO2 + 6H2O là 686 Kcal. Từ đó ta có thể thấy rõ hiệu suất tích lũy năng lượng của phản ứng này là 263 x 100 / 686 = 38%. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
26. Trao đổi chất và năng lượng - 55 - CHƯƠNG 5. TRAO ĐỔI CARBOHYDRATE TRONG QUÁ TRÌNH QUANG HỢP. I. KHÁI NIỆM VỀ QUANG HỢP Có thể hiểu được quang hợp – photosynthesis – qua tên gọi của nó. Photo có nghĩa là ánh sáng, còn synthesis có nghĩa là tổng hợp. Như vậy, quang hợp là quá trình, trong đó xảy ra sự hình thành các hợp chất hữu cơ nhờ sử dụng năng lượng ánh sáng. Sự xuất hiện khả năng sử dụng năng lượng ánh sáng là một bước tiến hóa quan trọng của cơ thể sống trên trái đất. Quang hợp là kiểu dinh dưỡng được thực hiện bởi lá và các bộ phận có màu lục khác của cây. Trong các bộ phận này có một nhóm hợp chất được gọi là sắc tố quang hợp. Chúng có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng và biến chúng thành năng lượng hóa học và một chất khử để được sử dụng trong việc tổng hợp đường glucose và các chất hữu cơ khác nuôi cây. Phương trình tổng quát của quang hợp có dạng như sau: năng lượng ánh sáng 6CO2 + 6H2O ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ C6H12O6 + 6O2 Các nhà khoa học đã phát hiện được rằng quá trình quang hợp bao gồm hai pha là pha sáng và pha tối. Pha sáng có nhiệm vụ sử dụng năng lượng ánh sáng để tạo ra hai lọai hợp chất cần cho pha tối xảy ra sau đó chất giàu năng lượng, hay hợp chất cao năng ATP, và hợp chất ỡ dạng khử là NADPH. NADPH được sử dụng để khử CO2 thành đường glucose và các hợp chất hữu cơ khác trong pha tối, còn ATP được sử dụng như nguồn năng lượng cho quá trình khử này. Glucose và các carbohydrate khác trở thành nguyên liệu và nguồn năng lượng để tổng hợp aminoacid, protein, lipid và nhiều hợp chất khác cần cho sự sống của tế bào. Phương trình tổng quát nêu trên chưa nói gì đến các sản phẩm trung gian của quá trình quang hợp, trong đó tạo thành đường glucose và giải phóng oxy phân tử. Ngòai ra, nó cũng không nói gì đến các phản ứng mà trong đó năng lượng ánh sáng biến hóa thành năng lượng hóa học. Hình 5.1 mô tả những vấn đề cơ bản của quang hợp. Trong hình này hộp hình chữ nhật tượng trưng cho các vấn đề quan trọng nhất của quang hợp. Các nhà khoa học đã biết được cái gì rơi vào hộp này và các gì đi ra từ nó. Nhưng các quá trình xảy ra trong hộp vẫn cò nhiều điều bí ẩn. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
27. Trao đổi chất và năng lượng - 56 - Hình 5.1. Sơ đồ mô tả các quá trình cơ bản của quang hợp 1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quang hợp. Các nhà nghiên cứu quang hợp đầu tiên đã phát hiện được rằng khí carbonic và nước là nguyên liệu đầu tiên, còn carbohydate và oxy phân tử là sản phẩm cuối cùng của quang hợp. Ở đây xuất hiện một số câu hỏi. Trong trường hợp nào tốc độ của quá trình nhanh hơn: khi cường độ ánh sáng mạnh hay khi cường độ ánh sáng yếu? Ở đâu quá trình này xảy ra nhanh hơn: trong các tế bào xanh đậm hay xanh nhạt? Để trả lời các câu hỏi này cần đề xuất các giả thuyết có thể kiểm tra được bằng thực nghiệm. Kết quả của những thí nghiệm này cho phép nêu ra được những khái niệm mới về bản thân của quá trình quang hợp. Trong quá trình quang hợp có sự tham gia của hai chất khí; khí carbonic và oxy. Các nhà vật lý và hóa học đã đề xuất một số phương pháp đo số lượng của các lọai khí này. Một phương pháp là theo dõi áp suất và thể tích khí, còn phương pháp thứ hai liên quan với việc phân tích hóa học. Một trong những phương pháp đo tốc độ quang hợp đơn giản nhất là theo dõi tốc độ sử dụng CO2 hoặc tốc độ giải phóng oxy, hoặc theo dõi đồng thời cả hai. Thông thường, sự đo lường này được thực hiện nhờ một thiết bị đơn giản có tên gọi là manomét. Vì trong quang hợp sử dụng năng lượng ánh sáng nên hoàn toàn có thể giả thuyết rằng quá trình này cần phải xảy ra nhanh hơn khi cường độ ánh sáng cao hơn. Giả thuyết này được xác nhận ở cường độ ánh sáng tương đối yếu. Khi tăng cường độ ánh sáng sẽ làm tăng tốc độ quang hợp. Tuy nhiên, ở cường độ ánh sáng lớn đường cong sẽ không thay đổi, và tiếp tục tăng cường độ ánh sáng hầu như không ảnh hưởng đến quang hợp. Điều này có thể giải thích như thế nào? Trước khi giải thích hiện tượng này hãy làm quen với một số kết quả của các thí nghiệm đơn giản về nghiên cứu quang hợp. Chúng ta cũng có thể giả thuyết rằng tốc độ quang hợp cần phải tăng lên cùng với sự tăng số lượng khí carbonic. Khi hàm lượng khí carbonic không cao, tốc độ quang hợp rất thấp. Khi tăng nồng độ CO2 tốc độ quang hợp sẽ tăng lên, nhưng chỉ đến một điểm nhất định, sau đó tăng nồng độ CO2 không còn ảnh hưởng đến tốc độ quang hợp nữa. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
28. Trao đổi chất và năng lượng - 57 - Bây giờ chúng ta hãy phối hợp hai thí nghiệm để tìm thấy sự phụ thuộc của quang hợp vào nồng độ CO2 ở ba cường độ ánh sáng khác nhau. Kết quả của các thí nghiệm này ở dạng một số đường cong trình bày trong hình 5.2. Hình 5.2. Sự phụ thuộc của tốc độ quang hợp vào nồng độ CO2 ở các cường độ khác nhau. Qua hình này chúng ta thấy rằng ở nồng độ CO2 thấp tốc độ quang hợp phụ thuộc vào hàm lượng CO2. Khi hàm lượng CO2 cao tốc độ quang hợp phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Vì vậy chúng ta có thể nói rằng một trong hai thông số (ánh sáng và nồng độ CO2) có hàm lượng thấp hơn sẽ xác định tốc độ cuối cùng của quang hợp. Chúng ta có thể nhớ đến các trường hợp khác, trong đó các hạn chế tương tự ảnh hưởng đến một quá trình nào đó. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quang hợp đã tìm thấy được các quy luật thú vị. Hầu như tất cả các phản ứng hóa học, bao gồm cả các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme, đều xảy ra với tốc độ nhanh hơn ở nhiệt độ cao – đến các giá trị nhiệt độ xác định. Từ 0o đến 40oC các phản ứng enzyme xảy ra nhanh hơn khoảng hai lần khi nhiệt độ tăng lên 10o. Tuy nhiên, các phản ứng quang hóa sử dụng năng lượng ánh sáng và thường không phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự tăng năng lượng của phân tử khi tăng nhiệt độ là không đáng kể so với năng lượng được phân tử thu nhận khi hấp thụ lượng tử ánh sáng. Số năng lượng này đủ để bắt đầu quá trình quang hợp. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình quang hợp được minh họa trong hình 5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên tốc độ quang hợp cho thấy rằng tốc độ quang hợp ở cường độ ánh sáng thấp hầu như không thay đổi. Ánh sáng là yếu tố hạn chế. Nhưng ở cường độ ánh sáng cao việc tăng nhiệt độ làm tăng quá trình quang hợp đúng như trong trường hợp đối với bất kỳ phản ứng enzyme nào. Từ đây có thể rút ra kết luận rằng quá trình quang hợp được hình thành ít nhất từ hai kiểu phản ứng: phản ứng quang hóa (xảy ra trong ánh sáng và không phụ thuộc vào nhiệt độ) và phản ứng enzyme (xảy ra trong tối và nhạy cảm với nhiệt độ). Điều này giải thích tại sao việc tăng không hạn chế cường độ ánh sáng không làm tăng GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
29. Trao đổi chất và năng lượng - 58 - vô giới hạn tốc độ quang hợp. Nói cách khác, các phản ứng enzyme vốn không phụ thuộc vào cường độ ánh sáng, là yếu tố hạn chế tốc độ quang hợp. Hình 5.3. Sự phụ thuộc của tốc độ quang hợp vào nhiệt độ Nhiều nhà khoa học đã chứng minh rằng quá trình quang hợp bao gồm rất nhiều phản ứng enzyme. Khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ của quang hợp các nhà khoa học đã đề xuất sự bắt đầu đáng lưu ý bản chất của quang hợp. Ở dạng phương trình đơn giản CO2 + H2O ⎯⎯→ (CH2O) + O2 còn dấu diếm nhiều phản ứng trung gian. Có thể giả thuyết rằng các cơ thể tự dưỡng đầu tiên dần dần dung nạp vào mình tất cả các phản ứng trung gian này để cuối cùng biến thành hàng lọat các phản ứng của quá trình quang hợp. 2. Phân tử biến hóa năng lượng Nếu tế bào tự dưỡng bị nghiền nát và khối màu lục được hòa tan trong ethanol hoặc acetone và tách chúng bằng phương pháp sắn ký thi hầu như lúc nàu cũng thu nhận được hai hợp chất. Những hợp chất này thuộc nhóm các chất có tên gọi là chlorophyll (chất diệp lục). Một trong số chúng được gọi là chlorophyll a, có chất thứ hai có tên là chlorophyll b. Công thức cấu tạo của chlorophylla được trình bày trong hình 5.4. Khi tìm hiểu cấu trúc này ta thấy rằng các nguyên tử nitơ và carbon tạo ra các vòng, những vòng này lại tạo ra một vòng lớn hơn mà trung tâm của nó là nguyên tử manhê. Nghiên cứu thực nghiệm tiếp theo đối với hai lọai chlorophyll, mà đặc biệt đối với chlorophyll a, cho thấy chúng hấp thụ rất tốt các tia có bước sóng trong vùng đỏ và xanh của quang phổ nhìn thấy và phản xạ phần ánh sáng màu lục. Hòa tan và phân tích chlorophyll bằng phương pháp sắc ký trên giấy chỉ cho phép thu nhận các kết quả sơ bộ. Sau đó chúng ta có thể nghiên cứu sự hấp thụ các bước sóng khác nhau của ánh sáng nhìn thấy được thực hiện bởi chlorophyll a hòa tan trong ethanol hoặc trong một dung môi khác. Bằng các thiết bị khác nhau chúng ta cũng có thể đo được chiều dài bước sóng ánh sáng được hấp thụ bởi chlorophyll a trong tế bào sống. Chiều dài các bước sóng hấp thụ bởi chlorophyll a của tế bào sống khác với chiều dài các bước sóng được hấp thụ bởi chlorophyll a hòa tan. Thí nghiệm của nhiều tác giả cho thấy rằng trong tế bào sống có đến mấy lọai chlorophyll a. Chúng hấp thụ các tia có chiều dài bước sóng khác nhau trong vùng quang phổ màu đỏ, mặc dù khi hòa tan sắc tố chỉ phát hiện được một lọai chlorophyll a. Kết quả khó hiểu này chỉ được giải thích sau khi phát hiện được rằng chlorophyll a trong tế bào sống liên kết chặt chẽ với protein và lipid của các cấu trúc tế bào chất được biết với tên gọi là lục lạp (chloroplast). GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
30. Trao đổi chất và năng lượng - 59 - Hình 5.4. Công thức cấu tạo của chlorophyll a Ngoài chlorophyll cơ thể thực vật còn chứa các sắc tố quang hợp khác màu vàng hoặc màu da cam. Chúng hấp thụ ánh sáng với bước sóng xác định và chuyển năng lượng ánh sáng hấp thụ đươc cho chlorophyll. Tuy nhiên, không một sắc tố nào trong số chúng có thể thay thế được cho chlorophyll. Trong các tế bào không chứa chlorophyll thì quang hợp không thể xảy ra. Tính chất đặc biệt của chlorophyll là ở chỗ năng lượng ánh sáng do chúng hấp thụ có thể được sử dụng sau đó trong các phản ứng hóa học của quá trình quang hợp. Các phản ứng hóa học này sẽ xác định tổng số năng lượng tích lũy trong các liên kết của các hợp chất hóa học dùng để nuôi cây, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển. II. KHÁI NIỆM VỀ TÍCH CHẤT HAI GIAI ĐOẠN CỦA QUANG HỢP. Trên cơ sở thực nghiệm người ta đã xác định được rằng quá trình quang hợp bao gồm hai loại phản ứng: phản ứng sáng liên quan trực tiếp với việc sử dụng năng lượng ánh sáng, và phản ứng tối, trong đó CO2 bị khử thành các hợp chất hữu cơ. Khái niệm về tính hai pha của quang hợp được đúc rút từ kết qủa thí nghiệm của Hill (1937). Bằng cách chiếu sáng chế phẩm phi tế bào chứa chlorophyll thu được từ tế bào quang hợp trong điều kiện tồn tại chất nhận điện tử nhân tạo, ví dụ kali ferricyanate (A), oxy phân tử sẽ được giải phóng, đồng thời chất nhận điện tử bị khử theo phương trình: h√ 2H2O + 2A⎯→ 2AH2 + O2 Điều đặc biệt quan trọng là phản ứng không đòi hỏi sự tham gia của CO2. Như vậy, Hill đã cho thấy khả năng tách quá trình giải phóng O2 ra khỏi quá trình khử CO2 . Phản ứng trên đây ngày nay được gọi là phản ứng Hill , còn chất A được gọi là thuốc thử Hill. Người ta cũng đã phát hiện được rằng thuốc thử Hill trong tế bào GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
31. Trao đổi chất và năng lượng - 60 - là NADP+. Trong điều kiện lục lạp được chiếu sáng, nó sẽ nhận điện tử để bị khử thành NADP.H, đồng thời giải phóng oxy phân tử. Như vậy, phản ứng Hill trong tế bào có dạng: h√ + + 2H2O + 2NADP ⎯→ 2NADP.H + 2H + O2 Trên cơ sở của phản ứng này người ta cho rằng một trong những sản phẩm cuối cùngcủa pha sáng là một tác nhân khử nào đó (có thể là NADP.H) màsau đó trong pha tối sẽ được sử dụng để khử CO2 . Khái niệm về tính chất hai pha của quang hợp được tiếp tục củng cố nhờ Arnon phát hiện quátrình phosphoryl-hóa quang hợp năm1954. Ông nhận thấy rằng khi chiếu sáng lục lạp trong điều kiện có mặt ADP và phosphate vô cơ thì ATP sẽ được tổng hợp mà cũng không cần có sự tham gia của CO2 . Trên cơ sở của các thí nghiệm nói trên người ta đi đến kết luận rằng ở giai đoạn đầu của quá trình quang hợp năng lượng ánh sáng không những được dùng để khử NADP+ mà còn có tác dụng thực hiện phản ứng phosphoryl-hóa ADP thành ATP. NADP.H và ATP hình thành ở pha sáng sẽ được sử dụng trong pha tối để khử CO2 và các chất nhận điện tử khác. 1. pha sáng của quang hợp a/ Trong quang hợp có sự tham gia của các phản ứng sáng và các phản ứng tối. Các nhà khoa học phát hiện được những chất tham gia và được tạo thành trong quá trình quang hợp vẫn không trả lời được một câu hỏi quan trọng là: cái gì xảy ra với năng lượng ánh sáng do thực vật hấp thụ trong quá trình này. Cần nhớ rằng năng lương không thể tự nó xuất hiện và mất đi. Nó chỉ có thể chuyển từ dạng này sang dạng khác. Đã phát hiện được rằng các hợp chất hữu cơ – sản phẩm của quang hợp - có mức năng lượng cao hơn mức năng lương của CO2 và nước là các nguyên liệu để tạo ra chúng. Phần năng lượng hóa học dư thừa chỉ có thể được thu nhận do kết quả tác động của ánh sáng. Như vậy, quang hợp là quá trình biến hóa năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học. Quang hợp là một lọai cầu nối giữa năng lượng mặt trời và dạng năng lượng cần cho sự sống trên trái đất. Không có các quá trình nào khác trong tế bào có thể sử dụng trực tiếp năng lượng mặt trời. Nó chỉ có thể được sử dụng sau khi được biến hóa thành năng lượng hóa học. Sự biến hóa này được thực hiện trong các cơ thể có khả năng quang hợp. Chúng hấp thụ năng lượng mặt trời và sử dụng nó để gắn các nguyên tử của nước và khí carbonic với nhau để tạo ra các liên kết hóa học có mức năng lượng cao hơn.Vác sản phẩm của sự “gắn bó” này là tạo ra oxy và các hợp chất hữu cơ cần thiết để đáp ứng nhu cầu năng lượng của thực vật và động vật. Sau khi đã xác định được cái gì xảy ra trong quang hợp, các nhà khóa học bắt đầu tìm hiểu quá trình này xảy ra như thế nào. Các quá trình bên trong của quang hợp mô tả trong cái hộp hìinh chữ nhật của hình 5.1 vẫn còn nhiều điều bí ẩn. Cần phải làm sáng tỏ những điều bí ẩn này. Các phát hiện đầu tiên về nội dung của cái hộp này đã được nhà khoa học người Anh F.F. Blecman phát hiện vào năm 1905. Ông bắt đầu nghiên cứu ảnh hưởng của độ sáng, hay cường độ ánh sáng và giả thuyết rằng vì quá trình quang hợp được di GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
32. Trao đổi chất và năng lượng - 61 - chuyển bởi năng lượng ánh sáng nên ở cường độ ánh sáng cao hơn quá trình tổng hợp sẽ xảy ra nhanh hơn. Khi Blecman đo và xây dựng đường biểu diễn tốc độ quang hợp ở các cường độ ánh sáng khác nhau, ông đã ghi nhận được sự phụ thuộc mô tả trong hình 5.2. Ở các cường độ ánh sáng ban đầu tương đối thấp khi tăng cường độ ánh sáng thì tốc độ quang hợp sẽ tăng. Tuy nhiên, ở các giá trị cao của cường độ ánh sáng sẽ dẫn đến một giá trị giới hạn. Tiếp tục tăng cường độ ánh sáng sẽ hầu như không làm tăng tốc độ quang hợp nữa. Sau đó Blecman nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của nhiệt độ và ánh sáng lên quang hợp (hình 5.3) và phát hiện được rằng ở nhiệt độ giữa 30 và 40oC cùng với việc tăng nhiệt độ tốc độ của quang hợp sẽ giảm không phụ thuộc vào cường độ ánh sáng. Nhưng trong khoảng 0-30oC việc tăng nhiệt độ dẫn đến các kết quả khác nhau liên quan với cường độ ánh sáng. Ở các cường độ ánh sáng thấp tăng nhiệt độ hầu như không ảnh hưởng đến quang hợp. Ngược lại, ở cường độ ánh sáng cao tăng nhiệt độ làm tăng đáng kể tốc độ quang hợp. Xuất phát từ các kết quả thí nghiệm của mình Blecman đi đền kết luận rằng trong quang hợp có sự tham gia của các phản ứng sáng và tối. Nói chung, phản ứng tối có thể xảy ra hoặc không xảy ra trong tối. Các phản ứng này được gọi là phản ứng tối với ý nghĩa chúng có thể xảy ra mà không cần đến ánh sáng. Blecman đã kết luận rằng, khi trong các thí nghiệm của mình cường độ chiếu sáng chưa đủ thì tốc độ quang hợp hoàn toàn được xác định bởi chính cường độ ánh sáng. Khi chiếu sáng chưa đủ, việc tăng nhiệt độ không thể đẩy mạnh tốc độ quang hợp. Ở những cường độ ánh sáng đủ lớn để duy trì phản ứng sáng, tốc độ quang hợp sẽ được xác định chủ yea bởi tốc độ xảy ra các phản ứng enzyme tong tối. Khái niệm theo đó cho rằng trong quang hợp có sự tham gia của phản ứng tối là hoàn toàn mới. Bây giờ các nhà khoa học đã có thể phát hiện được phần đóng góp trong quang hợp của các phản ứng sáng và của các phản ứng không phụ thuộc ánh sáng. b/ Trong phản ứng sáng có sự tham gia của nước. Trong quang hợp có hai chất bị phân hủy là H2O và CO2. Có thể cho rằng sự phân hủy của một chất xảy ra trong phản ứng sáng, còn sự phân hủy của chất kia - trong các phản ứng tối. Vậy chất nào bị phân hủy trong điều kiện nào? Có một thời gian các nhà khoa học có thiên hướng cho rằng ngòai ánh sáng phân hủy CO2. Quan điểm này lần đầu tiên được đề xuất từ năm 1796. Trong vòng nhiều năm sau đó nó trở nên rất hấp dẫn đối với các nhà hóa học với lý do là nó cho phép giải thích dễ dàng sự hình thành carbohydrate – sản phẩm chủ yếu của quang hợp. Đến năm 1930 Van Hil đã đề xuất giả thuyết hoàn toàn ngược lại. Ông nghiên cứu quang hợp ở vi khuẩn, trong đó oxy không được giải phóng. Một số vi khuẩn có khả năng quang hợp tạo ra carbohydrate từ CO2 và H2S, chứ không phải từ nước (H2O). Trong quang hợp của những vi khuẩn này lưu hùynh là sản phẩm phụ. Kết quả là nó được giải phóng hoặc được tích lũy trong tế bào vi khuẩn. Trong trường hợp này oxy không được giải phóng. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
33. Trao đổi chất và năng lượng - 62 - So sánh phương trình quang hợp của vi khuẩn với phương trình quang hợp của thực vật, Van Hil đi đến kết kuận rằng ánh sáng không phân hủy CO2. Vì sao ông lại đi đến kết luận này? So sánh phương trình quang hợp của vi khuẩn CO2 + 2H2S → (CH2O) + 2S + H2O với phương trình quang hợp của thực vật CO2 + 2H2O → (CH2O) + O2 + 2H2O dễ dàng thấy rõ là phương trình quang hợp của thực vật có một số thay đổi. – ở cả hai vế đều thêm một phân tử nước. Các phương trình quang hợp của vi khuẩn và thực vật khác nhau ở chỗ ở vế bên trái thay cho nước là sunfua hydro, còn vế bên phải thay cho oxy (O2) là hai nguyên tử lưu huỳnh (2S). Van Hil đã kết luận rằng trong các phản ứng sáng trong tế bào vi khuẩn phân hủy sunfua hydro chứ không phải CO2 vì kết quả là giải phóng lưu huỳnh chứ không phải là oxy.Ông đã giả thuyết rằng các phản ứng sáng trong quang hợp của thực vật và vi khuẩn là như nhau. Mà vì trong các phản ứng sáng ở vi khuẩn phân hủy sunfua hydro nên trong các phản ứng sáng ở thực vật cần phải phân hủy một chất chứa hydro là nước. Sau đó hydro tương tác với CO2 và tạo ra CH2O. Các nguyên tử khác – oxy ở thực vật và lưu huỳnh ở vi khuẩn – được giải phóng như các sản phẩm phụ. Như vậy, Theo giả thuyết của Van Hil, chức năng của ánh sáng trong quang hợp củ thực vật là phân hủy nước chứ không phải phân hủy CO2. Giả thuyết này dẫn đến một số kết luận lý thú. Quang hợp của thực vật về bản chất là vận chuyển hydro từ nước đến CO2. Trong trường hợp này nước là chất cho hydro, còn CO2 là chất nhận nó. Để tạo ra hai phân tử nước cần bốn nguyên tử hydro cho mỗi phân tử CO2. Tòan bộ oxy giải phóng trong quang hợp là thu nhận được trong sự phân hủy nước chứ không phải phân hủy CO2. Vậy điều gì xảy ra trong các phản ứng tối của quang hợp? Các giả thuyết mới gắn liền các phản ứng tối với sự phân hủy CO2. Bây giờ chúng ta có thể cho rằng “hộp bí mật” trong hình 1.1 chứa đượng những điều bí ẩn của quang hợp được chia thành hai hộp nhỏ: a/ ”hộp sáng”, trong đó chứa đựng điều bí mật của việc phân hủy nước bởi ánh sáng thành oxy và hydro; b/ “Hộp tối” chứa bí mật của sự chuyển hóa CO2 thành carbohydrate. Khoa học chỉ có thể tiến lên phía trước khi nào các giả thuyết được xác minh bằng thực nghiệm. Giả thuyết của Van Hil dựa trên cơ sở sự giống nhau của quang hợp ở vi khuẩn và ở thực vật. Xuất phát từ chỗ một số bộ phận của các quá trình này giống nhau, ông cho rằng, có lẻ, cả các bộ phận khác cũng giống nhau. Các nhà khoa học bắt đầu tìm kiếm các khẳng định trực tiếp về giả thuyết này. Họ muốn phát hiện thực ra cái gì xảy ra trong các “hộp”. Bằng cách nào nước bị phân hủy bởi ánh sáng? Hydro chuyển từ các phản ứng sáng đến các phản ứng tối như thế nào? Bằng cách nào CO2 được chuyển hóa thành carbohydrate trong các phản ứng tối? Chúng ta hãy xem xét trước “hộp tối” và tình trạng của CO2. c/ Pha sáng của quang hợp dẫn đến sự hình thành ATP và NADPH. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
34. Trao đổi chất và năng lượng - 63 - Năng lượng lấy từ đâu để tích lũy trong các phân tử ATP và NADPH? Chúng ta đã biết rằng nó được cung cấp bởi ánh sáng trong quá trình quang hợp. Như vậy, trong quang hợp năng lượng ánh sáng được biến hóa thành năng lượng hóa học. ATP và NADPH được tạo ra không phải trong các phản ứng sáng riêng biệt mà do kết quả của hàng lọat các phản ứng. Trật tự các phản ứng này được gọi là “pha sáng” của quang hợp. Hãy lưu ý rằng oxy cũng là sản phẩm của quang hợp ở thực vật, nhưng nó không liên quan với các phản ứng của chu trình Calvin. Vì vậy, có thể mong đợi rằng oxy đượctạora cùng với ATP và NADPH trong pha sáng của quang hợp. Pha sáng của quang hợp có tác dụng thúc đẩy tòan bộ quá trình quang hợp. Một chiếc ô tô di chuyển được nhờ năng lượng do động cơ tạo ra. Động cơ chiếc ô tô biến hóa năng lượng hóa học của chất đốt thành năng lượng cơ học để quay bánh xe. Vậy “động cơ” của quang hợp thực hiện sự biến hóa năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học là gì? Có thể giả thuyết một cách tự nhiên rằng “động cơ “ của quang hợp có chứa chlorophyll vì, như đã nóio ở trện, chlorophyll là sắc tố sđầu tiên hấp thụ ánh sáng. Trong lát cắt của lá dưới kính hiển vi chlorophyll trong tế bào được nhìn thấy chúng tham gia trong thành phần của các hạt riêng biệt. Những hạt này được gọi là lục lạp (chloroplast) . Số lượng chloroplast trong các tế bào quang hợp không cố định. Tế bào lá chứa khỏang 20-100 chloroplast, còn tảo đơn bào – chỉ từ 1 đến 2. Hình dạng của chloroplast cũng rất khác nhau. Chloroplast của thực vật bậc cao thường có dạng đĩa bề dày khoảng 2 micron và đường kính khoảng 5 micron. Nhờ kính hiển vi điện tử các nhà sinh học đã có thể biết được nhiều điều hơn về chloroplast, ví dụ thành phần cấu tạo và đặc điểm cấu trúc của chúng. Tóm lại. chloroplast là “động lực” của quang hợp. Tương tự như chlorophyll, chúng chứa các enzyme và các chất xúc tác khác cần cho sự chuyển hóa năng lượng ánh sáng thành năng lượng hóa học. Trên thực té toàn bộ quá trình quang hợp ở thực vật xảy ra trong chloroplast. Vậy làm sao đã xác địch được quá trình này?. Đã một trăm năm trôi qua các nhà thực vật học cho rằng quang hợp, có lẻ, chỉa xảy ra trong chloroplast, nhưng chứng minh điều này trong một thời gian dài không phải dễ dàng. Đến năm 1937, R. Hill. cộng tác viên của trường đại học Cambridg của nước Anh, đã phát hiện được rằng, nếu lục lạp được tách từ tế bào sống, chúng sẽ bắt đầu giải phóng oxy. Dể điều này xảy ra, chỉ cần một môi trường chứa một số hợp chất của sắt. Phản ứng này được gọi là phản ứng Hill. Tuy nhiên, bản thân nó chưa khẳng địng rằng các chloroplast cách ly có thể tạo ra carbohydrate từ khí carbonic. Mà thiếu các dẫn chứng, các nhà khoa học không thể tin tưởng được rằng quang hợp hòan tòan được thực hiện trong chloroplast. Các nghiên cứu tiết theo được thực hiện bởi Arnon và những người cộng tác. Họ đã tìm ra hai phát kiến quan trọng. Thứ nhất là ông đã phát hiện được rằng cá chloroplast tách rời trong ánh sáng quả thật chuyển hóa khí carbonic thành carbohydrate, và thứ hai là ông đã xác định được rằng các chloroplast tách rời có thể tạo ra ATP ngoaØi ánh sáng thậm chí trong trưởng hợp khi CO2 không tiếp cận với chúng. (Quá trình mới này của sự tổng hợp GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
35. Trao đổi chất và năng lượng - 64 - ATP được gọi là phosphoryl hóa quang hợp). Chúng ta sẽ gọi quá trình này là sự hình thành ATP trong ánh sáng. Phương tình tương ứng có thể được trình baqy như sau: chloroplast ADP + Pvc ⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ ATP ÁÙnh sáng Đầu tiên có thể tưởng rằng sự hình thành ATP trong ánh sáng giải thích được nguồn gốc của toàn bộ ATP trong quang hợp. Trên thực tế sự hình thành ATP trong ánh sáng chỉ là một phần của tổng số hợp chất này vốn được tạo ra trong quá trình quang hợp. Sau một thời gian Arnon và những người cộng tác đã phát hiện được một kiểu phản ứng khác, trong đó sự hình thành ATP ngòai ánh sáng gắn liền vời sự hình thành NADPH và oxy phân tử. Phương trình tổng quát của quá trình này có thể được diễn đạt như sau: chloroplast + 2NADP + 2ADP + 2Pvc + 2H2O ⎯⎯⎯⎯⎯⎯→ 2NADPH + 2H + 2ATP + 2O2 ÁÙnh sáng Quá trình đầu tiên trong hai quá trình tạo ra ATP ngoài ánh sáng, mà kế qủa của nó là chỉ tạo ra ATP được gọi là quang phosphoryl hóa có tính chu kỳ. Quá trình thứ hai mà tronmg đó ngòai ATP còn tạo ra oxy và NADPH được gọi là quang phosphoryl hóa không có tính chu kỳ. Để kết luận mục này, cần phải nhớ rằng trong pha sáng của quang hợp có sự hình thành ATP theo các con đường quang phosphoryl hóa có tính chu kỳ và không có tính chu kỳ dưới tác động của ánh sáng. Quang phosphoryl hóa không có tính chu kỳdẫn đến sự hình thành ATP và NADPH, còn quang phosphoryl hóa có tính chu kỳbổ sung thêm ATP cần cho sự họat động bình thường của chu trình Calvin. Nguồn năng lượng đảm bảo cho sự diễn biến của các quá trình này là ánh sáng. d/ Năng lượng ánh sáng tạo ra dòng điện tử. Đến đây chúng ta chỉ mới mô tả các quá trình hình thành ATP bằng các con đường quang phosphoryl hóa có tính chu kỳ và không có tính chu kỳ xảy ra ngoài ánh sáng, mà chưa nói gì về việc bằng cách nào năng lượng ánh sáng được sử dụng để tạo ra ATP và NADPH. Khi các phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng, chúng “bị kích động” và chuyển năng lượng hấp thụ được cho các điện tử của mình. Các điện tử với mức năng lượng cao có thể rời khỏi phân tử bị kích động và liên kết với các phân tử của một chất khác. Các phân tử liên kết với các địn tử với mức năng lượng cao sẽ thu nhận năng lượng bổ sung được các điện tử mang tới và bản thân trở thành phân tử “cao năng” hay “giàu năng lượng”. Trong quang hợp năng lượng ánh sáng được hấp thụ bởi chính các phân tử chlorophyll. Các nhà khoa học cho rằng các phân tử chlorophyll bị kích động sẽ nhường các điện tử giàu năng lượng. Những điện tử này được chiếm lấy bởi các phân tử khác, làm cho năng lượng hóa học của chúng tăng lên. Năng lượng ánh sáng biến thành năng lượng hóa học vào lúc chúng được chuyển cho các phân tử khác và bằng cách đó lại giải phóng năng lượng hóa học có được để tạo ra ATP và NADPH. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
36. Trao đổi chất và năng lượng - 65 - Các nghiên cứu về quang hợp đã tạo cơ sở để cho rằng các điện tử được cho bởi chlorophyll bị kích động kết bợp với feredoxin, một protein chứa các nguyên tử sắt. Chất này được tìm thấy trong tất cả các tế bào quang hợp. Thuyết tổng quát của trao đổi năng lượng trong quang hợp để tổng hợp ATP theo cơ chế quang phosphoryl hóa có tính chu kỳ được trình bày trong hình 5.6. Hình 5.6. Tổng hợp ATP theo cơ chế quang phosphoryl hóa có tính chu kỳ Các nhà khoa học thống nhất cho rằng năng lượng do feredoxin tiếp nhận được sẽ được giải phóng trong quá trình vận chuyển điện tử. Feredoxin chuyển điện tử cho một chất khác, chất này lại chuyển cho chất tiếp theo v.v sau mỗi bước vận chuyển sẽ giải phóng một phần năng lượng. Nó được dùng để tổng hợp ATP. Cuối cùng “chi hết” phần năng lượng thừa và lấp đầy “chỗ trống” do điện tử đã được chuyển cho feredoxin. Sau khi điện tử đả trở về với chlorophyll lại bắt đầu một chu kỳ mới của sự hấp thụ ánh sánh và trao đổi năng lượng. Còn quá trình quang phosphoryl hóa không có tính chu kỳ xảy ra như thế nào? Các nhà khoa học cho rằng các giai đoạn cơ bản của trao đổi năng lượng ở đây cũng giống như những gì xảy ra trong quang phosphoryl hóa có ttính chu kỳ, nhưng trong trườnfg hợp này có một vài sự khác biệt quan trọng. Sự giống nhau là các phân tử chlorophyll bị kích động bởi ánh sáng cũng chuyển điện tử cho feredoxin. Nhưng các điện tử đã được chuyển cho feredoxin không quay trở về với chlorophyll theo vòng kín và không lấp chỗ khuyết điện tử trong phân tử chlorophyll. Thay vào đó chúng được chuyển cho NADP+. NADP+ cũng tiếp nhận hai proton từ phân tử tử nước. Kết quả là NADP+ bị khử thành NADPH. Chỗ khuyết điện tử trong phân tử chlorophyll được bù đắp bởi các điện tử của nước. Sau khi phân tử nước đã chuyển điện tử và proton thì chì còn lại các nguyên tử oxy. Chúng kết hợp với nhau thành phân tử oxy (O2) và được giải phóng ở dạng khí. Đồng thời tạo ra ATP (hình 5.7) Ngày nay đã thu được khá nhiều khái niệm về pha sáng của quang hợp, nhưng nhiều điều cần phải phát hiện và thu nhận những kết quả chính xác. Đặc biệt rõ ràng nhất là còn thiếu các khái niệm chính xác về bản chất của các phản ứng quang hợp dẫn đến giải phóng oxy từ nước. Quá trình quang hợp nói chung có thể được hình dung như mô tả trong hình 1.8 và đang là đối tượng nghiên cứu của nhiều nhà hóa sinh học. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
37. Trao đổi chất và năng lượng - 66 - Sự hấp thụ ánh sáng bởi chlorophyll trong pha sáng dẫn đến các phản ứng vận chuyển điện tử, làm giải phóng oxy từ nước và tạo ra ATP và NADPH. Những hợp chất này đảm bảo cho việc xảy ra chu trình Calvin và tổng hợp đường. Hình 5.7. Tổng hợp ATP theo cơ chế quang phosphoryl hóa không có tính chu kỳ 2. Pha tối của quang hợp Qua hình 5.8 chúng ta thấy rằng trên cùng một biểu đồ trình bày cả hai pha của quang hợp – pha sáng và pha tối – và cho thấy mối quan hệ giữa chúng. Hình 1.8. Sơ đồ của quá trình quang hợp theo các khái niệm hiện đại. GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học
38. Trao đổi chất và năng lượng - 67 - Đường được hình thành trong quang hợp trở thành một chất dinh dưỡng, từ đó với sự tham gia của các yếu tố dinh dưỡng khóang tham gia tổng hợp các hợp chất hữu cơ quan trọng khác để nuôi cây, giúp cây sinh trưởng và phát triển. NADP.H và ATP hình thành trong pha sáng của quang hợp được lục lạp sử dụng để tổng hợp carbohydrate và các hợp chất hữu cơ khác. Các quá trình tổng hợp này không cần ánh sáng nên được gọi là pha tối của quang hợp. Người ta đã phát hiện được rằng pha tối của quang hợp bao gồm một số con đường khác nhau, trong đó quan trọng nhất là chu trình Calvin (con đường C3) cà chu trình Hatch – Slack (con đường C4). a/ Chu trình Calvin. Sau nhiều năm nghiên cứu (1946-1961) Melvin Calvin thuộc trường đại học 14 Berkeley (Hoa kỳ) với công cụ chủ yếu là O2 đã tìm ra một trật tự các phản ứng cố định CO2 trong quang hợp mà ngày nay chúng ta gọi là chu trình Calvin.Chu trình này còn được gọi là con đường C3 do sản phẩm được hình thành đầu tiên là ột hợp chất 3 carbon – acid 3-phosphoglyceric. Toàn bộ chu trình bao gồm các phản ứng sau đây: E1 1/ 6CO2 + Ribuloso-1,5-di (P) ⎯→ 12 Acid 3-Phosphoglyceric E2 2/ 12 Acid 3-(P)-glyceric + 12ATP ⎯→ 12 Acid 1,3-Di(P)-glyceric+ 12 ADP E3 3/ 12 Acid 1,3-Di(P)-glyceric + 12NADP.H + 12 H+ ⎯→ + ⎯→12 Glyceraldehyde-3-(P) + 12NADP + 12Pvc E4 4/ 5 Glyceraldehyde-3-(P) ⎯→ 5 Dioxyacetone-phosphate E5 5/ 3 Glyceraldehyde-3-(P) + 3 Dioxyacetone-phosphate ⎯→ ⎯→ 3 Fructoso-1,6-di(P) E6 6/ 3 Fructoso-1,6-di(P) ⎯→ 3 Fructoso-6-(P) + 3Pvc E7 7/ Fructoso-6-(P) ⎯→ Glucoso-6-(P) E8 8/ Glucoso-6-(P) + H2O ⎯→ Glucose + Pvc E9 9/ 2 Fructoso-6-(P) + 2 Glyceraldehyde-3-(P) ⎯→ ⎯→ 2 Xyluloso-5-(P) + 2 Erytroso-4-(P) E5 10/ 2 Erytroso-4-(P)+ 2 Dioxyacetone-phosphate ⎯→ ⎯→ 2 Cedoheptuloso-1,7-di(P) E10 11/ 2 Cedoheptuloso-1,7-di(P) + 2H2O ⎯→ ⎯→ 2 Cedoheptuloso-7-(P) + 2 Pvc E9 GS.TS. Mai Xuân Lương Khoa Sinh học