Giáo trình Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải

Nội dung text: Giáo trình Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải

1. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 Nghiên c u ho t tính enzym ngo i bào c a m t s ch ng Bacillus m i phân l p và kh n ăng ng d ng chúng trong x lý n ưc th i Ngơ T Thành, Bùi Th Vi t Hà*, Vũ Minh ð c, Chu V ăn M n Khoa Sinh, Tr ưng ð i h c Khoa h c T nhiên, ðHQGHN, 334 Nguy n Trãi, Hà Ni, Vi t Nam Nh n ngày 02 tháng 4 n ăm 2007 Tĩm t t. Vi khu n thu c chi Bacillus phân b r ng rãi trong t nhiên, đa d ng v sinh thái. Các lồi Bacillus đã, đang và ngày càng tr thành nh ng vi sinh v t quan tr ng hàng đu v m t ng dng. Các ng d ng c a chúng bao trùm hàng lo t l ĩnh v c, t s n xu t th c ph m th cơng truy n th ng đ n cơng ngh lên men hi n đ i, đ n sinh h c phân t , y-dưc h c ch a các b nh hi m nghèo, m ph m, x lý mơi tr ưng ơ nhi m, thu h i b c kim lo i t các ph li u. Chính vì l đĩ nên đã cĩ ngày càng nhi u các nghiên c u sâu v chi Bacillus này c ũng nh ư m r ng ng d ng ca chúng đ i v i đ i s ng con ngu i. T thiên nhiên nhi t đ i và á nhi t đ i đa d ng c a Vi t Nam, chúng tơi đã thu nh n các ch ng Bacillus cĩ ho t tính phong phú t các vùng sinh thái khác nhau nh m t ng b ưc xây d ng b s ưu t p các ch ng c a chi vi khu n quan tr ng này. Trong k t qu nghiên c u, chúng tơi phân l p đưc 236 ch ng Bacillus t các m u đ t và n ưc th i khác nhau, trong đĩ đã kh o sát ho t tính các enzym ngo i bào nh ư proteaza, amylaza và CMC-aza c a 236 ch ng. Trong s đĩ, các ch ng T20, TR6 và TH5 cĩ tác d ng t t trong x lý n ưc th i. Các giá tr BOD 5 c a n ưc th i nhà máy s a Vinamilk Gia Lâm Hà N i đưc x lý l c cĩ và khơng cĩ dch nuơi ch ng T20 l n l ưt là 1250 và 730mg/L. Các giá tr BOD 5 c a n ưc th i y đưc x lý lc cĩ và khơng cĩ huy n d ch t bào TR6 l n l ưt là 800 và 610mg/L. Các giá tr BOD 5 c a n ưc th i sơng Tơ L ch x lý l c cĩ và khơng cĩ d ch nuơi ch ng TH5 pha lỗng l n l ưt là 165 và 92mg/L. T khĩa : Bacillus .spp, enzyme, wastewater treatment. 1. ðt v n đ ∗∗∗ ch y t y r a [1,2], cơng nghi p th c ph m - bánh k o - đ u ng [3,4], cơng nghi p d ưc Vi khu n thu c chi Bacillus cĩ ti m n ăng ph m [5], cơng nghi p thu c da [1,6], cơng ln v các enzym ngo i bào. Nhi u trong s các nghi p d t [5], và trong x lý ch t th i [1,7]. enzym ngo i bào này là nh ng enzym thu Riêng v ng d ng vi khu n này trong x lý phân các phân t h u c ơ l n. Chính vì th vi nưc th i thì ch ưa th y tài li u nào cơng b . khu n này cĩ nhi u ng d ng trong các l ĩnh Tuy nhiên, nh ư trên đã nĩi, nhi u enzym ngo i vc khác nhau [1] nh ư: cơng nghi p s n xu t bào c a Bacillus là enzym thu phân các phân t h u c ơ l n, và vì trong n ưc th i sinh ho t và ___ nưc th i t cơng nghi p th c ph m nĩi chung ∗ Tác gi liên h . ðT: 84-4-38588856 rt giàu ch t h u c ơ nên vi c ng d ng vi E-mail: habtv@vnu.edu.vn 101
2. 102 N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 khu n này đ x lý các lo i n ưc th i đĩ là cĩ 3. K t qu và th o lu n tri n v ng. Bài báo này trình bày ba ho t tính enzym thu phân ngo i bào c a m t s ch ng 3.1. Phân l p Bacillus Bacillus và th ăm dị kh n ăng ng d ng đ x lý n ưc th i sơng Tơ L ch và n ưc th i nhà máy T các m u đ t các vùng đa lý thu c sa Vinamilk Gia Lâm Hà N i. Nh ng ch ng nhi u t nh khác nhau, đã phân l p đưc 236 này n m trong s 236 ch ng m i phân l p t ch ng Bacillus . M t s ch ng đã đưc ki m tra các vùng đa lý khác nhau nh m khai thác tính v các ho t tính enzym thu phân ngo i bào, đa d ng v sinh lý và s thích ng b ng enzym nh ư đưc trình bày d ưi đây. ca Bacillus [8]. 2. Nguyên li u và ph ươ ng pháp nghiên c u T20 M27 2.1. Vi sinh v t Các ch ng Bacillus dùng trong nghiên c u đưc phân l p t đ t nhi u vùng đa lý và t Hình 1. Vùng phân hu gelatin c a hai ch ng T20 nưc th i sơng Tơ L ch Hà N i c ũng nh ư n ưc và M27. th i nhà máy s a Vinamilk Gia Lâm Hà N i. 3.2 Ho t tính proteaza 2.3. Phân l p Bacillus - Các ch ng T20 và M27 th hi n ho t tính Các m u phân lp đưc pha lỗng t i đ 0 phân hu gelatin và phân hu s a g y, nh ư nêu pha lỗng c n thi t r i đưc x lý nhi t 80 C trong hình 1 trong đĩ ch ng T20 m nh h ơn trong 15 phút, sau đĩ đưc c y g t lên mơi ch ng M27. tr ưng th ch dinh d ưng. Nuơi nhi t đ 28- 30 0C trong 24 gi . Các khu n l c m c lên đưc - Các ch ng TR1, TR5, TR6, TR12, TR13 ki m tra hi n vi và ki m tra các đ c đim khác, và TR14 th hi n m t ho t tính proteaza đưc nu phù h p v i các đ c đim c a Bacillus thì cm ng b i 1% s a g y, nh ư nêu trong hình 2. đưc c y chuy n sang th ch nghiêng đ b o qu n. 2.3. Xác đnh ho t tính proteaza, amylaza và xenlulaza (CMC-aza) Các ho t tính này đưc xác đ nh theo k thu t khu ch tán trên th ch 2.4. Xác đnh nhu c u oxy sinh hố 5 ngày (BOD 5) (Theo tiêu chu n Vi t Nam ISO 5815:1989). Hình 2. Tác d ng c m ng c a s a g y đi v i ho t tính proteaz a c a 6 ch ng TR.
3. N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 103 bng tinh b t v i cùng l ưng thì 17/20 ch ng th hi n vịng phân hu tinh b t (hình 5). Hình 3. Kh n ăng phân hu s a g y c a 20 ch ng (TH1-TH20) trên mơi tr ưng MP. Hình 5. Ho t tính phân hu tinh b t c a các ch ng t TH1 đn TH20. Bên trái là các l đưc tra d ch nuơi - Các ch ng t TH1 đ n TH20 th hi n kh các ch ng trên mơi tr ưng HA+1% tinh b t; t t c năng phân hu s a g y nh ư trên hình 3, trong các ch ng đ u khơng th hi n ho t tính phân hu đĩ các ch ng TH5 và TH8 là m nh nh t. tinh b t, đây ch trình bày m t s ch ng trong đĩ. Bên ph i là các l đưc tra d ch nuơi các ch ng trên 3.3. Ho t tính amylaza mơi tr ưng HA trong đĩ glucoza đưc thay b ng tinh b t, k t qu là m t s ch ng th hi n ho t tính - Các ch ng T20 và M27, trong th nghi m phân hu tinh b t. cy đim, đ u th hin ho t tính amylaza, v i đưng kính vịng phân hu b ng 19,5 và 20mm theo th t . 3.4. Ho t tính CMC-aza - Các ch ng TR4, TR6, TR8, TR10, TR12, - Hai ch ng T20 và M27 đu th hi n ho t và TR14, trong th nghi m đ c l , m c dù tính CMC-aza m c 20mm, theo th nghi m khơng th hi n ho t tính amylaza ngo i bào trên cy đim trên mơi tr ưng MT4. mơi tr ưng HA d ch th nh ưng đã th hi n ho t - Các ch ng t TR1 đ n TR14, tr ch ng s tính này trên mơi tr ưng HA d ch th +1% tinh 10, t t c đ u th hi n ho t tính CMC-aza trên bt (hình 4). mơi tr ưng HA ki m (hình 6a), và ho t tính này tăng lên đáng k n u mơi tr ưng nuơi đưc b sung CMC (hình 6b). Hình 4. Tác d ng c m ng c a tinh b t đ i v i amylaza c a 7 ch ng nghiên c u. - Các ch ng t TH1 đ n TH20, trong th nghi m đ c l , đ u khơng th hi n ho t tính Hình 6a. Các ch ng t TR1 đ n TR14 nuơi trên mơi phân hu tinh b t trên mơi tr ưng HA và mơi tr ưng HA ki m, tr ch ng s 10, đ u th hi n vịng tr ưng HA + 1% tinh b t. Tuy nhiên, n u ho t tính CMC-aza, theo th nghi m đ c l . glucoza trong mơi tr ưng HA đưc thay th
4. 104 N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 Nhìn chung, c ba ho t tính enzym nĩi trên (proteaza, amylaza và CMC-aza) các ch ng nghiên c u là r t đa d ng, c v m c đ ho t tính và v m c đưc c m ng. ðiu đĩ t o nhi u kh n ăng l a ch n nh ng ch ng thích hp cho m c đích x lý mơi tr ưng ơ nhi m hu c ơ. 3.5. Th ăm dị kh n ăng x lý n ưc th i Hình 6b. Các ch ng TR mang s hi u 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 th hi n m t ho t tính CMC-aza đưc c m 3.5.1. X lý n ưc th i nhà máy s a ng b ng CMC m c đ khác nhau. Vinamilk Gia Lâm Hà N i Dch nuơi 4 ngày tu i c a ch ng T20 trên Các ch ng t TH1 đ n TH20 đ u khơng mơi tr ưng HA đưc lo i b t bào và dùng làm bi u hi n ho t tính CMC-aza trên mơi tr ưng ch ph m (ch ph m T20), đưc b sung vào HA, nh ưng 14 ch ng trong s đĩ bi u hi n ho t nưc th i theo t l 1/2 (v/v) và x lý hi u khí tính này trên mơi tr ưng HA+1% CMC (hình 7). lc. Hình 8 cho th y ch ph m T20 làm gi m đáng k BOD 5ca n ưc th i đưc x lý, xu ng cịn 730, so v i 1250mg/L c a cơng th c x lý lc khơng cĩ ch ph m. Ký hi u ch ng Hình 7. Kh n ăng phân hu CMC c a các ch ng t TH1 đn TH20, theo th nghi m đ c l . 14 ch ng cĩ đưng kính vùng phân hu > 10mm là nh ng ch ng cĩ ho t tính. Hình 9. Tác d ng c a ch ph m TR6 trong x lý nưc th i. ð i ch ng 1: M u n ưc th i khơng x lý. ði ch ng 2: M u n ưc th i x lý l c khơng b sung ch ph m. Trong m t thí nghi m khác, 10ml huy n dch t bào TR6 cĩ OD 600 = 0,6 đư c b sung vào 50ml n ưc th i tr ưc khi x lý l c. H ình 9 Hình 8. Tác d ng c a ch ph m T20 trong x lý cho th y ch ph m này làm gi m rõ r t BOD 5 nưc th i. ð i ch ng 1: M u n ưc th i khơng x lý. ca n ưc th i, xu ng cịn 610 so v i 800mg/L ði ch ng 2: M u n ưc th i x lý l c khơng b ca m u x lý l c khơng b sung ch ph m. sung ch ph m.
5. N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 105 ph m bào t cĩ th là m t gi i pháp khác nh m tránh hi u ng ph cĩ th cĩ v a nêu. 4. K t lu n ðã phân l p đưc 236 ch ng Bacillus t các m u đ t và n ưc th i khác nhau, trong đĩ đã kh o sát ho t tính các enzym ngo i bào nh ư proteaza, amylaza và CMC-aza c a 236 ch ng. Trong s đĩ, các ch ng T20, TR6 và TH5 cĩ tác d ng t t trong x lý n ưc th i. Các giá tr BOD 5 c a n ưc th i nhà máy s a Vinamilk Gia Hình 10. Hi u qu x lý n ưc th i b ng ch ph m Lâm Hà N i đưc x lý l c cĩ và khơng cĩ d ch TH5. Hai cơng th c x lý v i ch ph m là XL2 và nuơi ch ng T20 l n l ưt là 1250 và 730mg/L. XL3 xem chi ti t trong bài. Các giá tr BOD 5 c a n ưc th i y đưc x lý 3.5.2. X lý n ưc th i sơng Tơ L ch lc cĩ và khơng cĩ huy n d ch t bào TR6 l n lưt là 800 và 610mg/L. Các giá tr BOD 5 c a Huy n d ch t bào ch ng TH5 cĩ OD 600 = nưc th i sơng Tơ L ch x lý l c cĩ và khơng 1,7 đưc dùng hai n ng đ , nh ư trong các cĩ d ch nuơi chng TH5 pha lỗng l n l ưt là cơng th c thí nghi m sau đây: 165 và 92mg/L. + ðC 1 ( đi ch ng 1): n ưc th i tr ưc x lý. + ðC 2 ( đi ch ng 2): n ưc th i đ yên khơng l c, 30 0C, 5 ngày. Li c m ơn + XL 1: x lý l c 200 vịng/phút, 30 0C, 5 ngày. Cơng trình cĩ s h tr c a ch ươ ng trình + XL 2: x lý l c cĩ ch ph m (10ml/50ml NCCB trong KHTN (B KH&CN). Các tác gi nưc th i), 200 vịng/phút, 30 0C, 5 ngày. xin chân thành c m ơn PGS.TS Ki u H u nh đã đc và gĩp cho b n th o. + XL 3: x lý l c cĩ ch ph m (10m ch ph m pha lỗng g p đơi/50ml n ưc th i), 200 vịng/phút, 30 0C, 5 ngày. Tài li u tham kh o Hình 10 cho th y ch ph m TH5 hai n ng đ khác nhau (cơng th c XL2 và XL3) làm [1] R. Gupta, Q.K. Beg, P.Lorenz, Bacterial alkaline gi m m nh BOD 5 xu ng cịn 116,67 và proteases: molecular approaches and industrial 92,2mg/L theo th t , so v i 165,55mg/L applications, Appl Microbiol Biotechnol 59 cơng th c x lý khơng cĩ ch ph m. ðiu đáng (2002) 15. chú ý là n ng đ th p c a ch ph m (cơng [2] H. Outtrup, T.S. Jorgensen ST, The importance th c XL3) hi u qu x lý l i cao h ơn n ng đ of Bacillus species in the production of industrial cao c a ch ph m (cơng th c XL2). ðiu này enzymes. In: Berkeley R, Heyndrickx M, Logan N, De Vos P (eds), Applications and cĩ th liên quan đn m t hi u ng ph : vi c đưa systematics of Bacillus and relatives, Blackwell ch ph m n ng đ cao vào n ưc th i cĩ th publishing, UK, 2002, pp 206-218. cũng đưa thêm ch t h u c ơ vào đĩ, do đĩ bù l i [3] P.G. Dalev, Utilization of waste feathers from mt ph n BOD đưc gi m do tác d ng c a ch poultry slaughter for production of a protein ph m. Vì v y trong th c ti n x lý, s d ng ch concentrate, Bioresour Technol 48 (1994) 265.
6. 106 N.T. Thành và nnk. / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên và Cơng nghệ 25 (2009) 101-106 [4] B.D. Rebeca, Pena-Vera MT, Diaz – Castaneda isolate of Bacillus subtilis K 2, for use in leather M, Production of fish protein hydrolysates with processing, J Chem Technol Biotechnol 74 (1999) 5. bacterial proteases; yield and nutritional value, [7] M. Kubo, J. Okajima, F. Hasumi, Isolation and J Food Sci 56 (1991) 309. characterization of soybean waste – degrading [5] M. Schallmey, A. Singh, P.O.Ward, Developments microorganisms and analysis of fertilizer effects in the use of Bacillus species for industrial of the degraded products, Applied and production, Can J Microbiol 50 (2004) 1. Environmental Microbiology 60 (1994) 243. [6] A. Hammed, T. Keshavarz, C.S. Evan, Effect of [8] F.G. Priest, Extracellular Enzyme synthesis in dissolved oxygen tension and pH on the the Genus Bacillus , Bacteriological Reviews production of extracellular protease from a new 41 (1977) 711. Study on extracellular enzymes of some newly isolated Bacillus strains and their ability to use them for wastewater treatment Ngo Tu Thanh, Bui Thi Viet Ha, Vu Minh ðuc, Chu Van Man Faculty of Biology, College of Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam 236 Bacillus strains were isolated from soil and wastewater samples. The activities of extracellular enzymes of 36 isolates were investigated. Most of them secreted extracellular protease, amylase, and carboxymetylcellulase. Under the laboratory conditions, the wastewater treament with preparations made from strains T20, TR6 and TH5 decreased significantly BOD 5 values of wastewaters. Examples: BOD 5 values of wastewater from Vinamilk Gia Lam Ha Noi treated by shaking without and with cultural fluid of the strain T20 were 1250 and 730 mg/L, respectively; BOD 5 values of wastewater from To Lich river treated by shaking without and with diluted cell suspension of the strain TH5 were 165 and 92 mg/L, respectively. Keywords : Bacillus .spp, enzyme, wastewater treatment.