Luận văn Nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn gene E6 và E7 của human papilomavirus type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuật multiplex rt-Pcr - Trần Minh Định

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn gene E6 và E7 của human papilomavirus type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuật multiplex rt-Pcr - Trần Minh Định

1. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN TRN MINH ĐNH NGHIÊN CU PHÁT HIN S GN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO B GENE NGƯI BNG K THUT MULTIPLEX RTPCR LUN VĂN THC SĨ: SINH HC BUÔN MA THUT, NĂM 2011
2. B GIÁO DC VÀ ĐÀO TO TRƯNG ĐI HC TÂY NGUYÊN TRN MINH ĐNH NGHIÊN CU PHÁT HIN S GN CHÈN GENE E6 VÀ E7 CA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO B GENE NGƯI BNG K THUT MULTIPLEX RTPCR Chuyên ngành: Sinh hc thc nghim Mã s : 60 42 30 LUN VĂN THC SĨ: SINH HC Ngưi hưng dn khoa hc: TS. Võ Th Phương Khanh BUÔN MA THUT, NĂM 2011
3. i LI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cu ca riêng tôi. Các s liu, kt qu nêu trong lun văn là trung thc và chưa ñưc ai công b trong bt kỳ mt công trình nào khác. Ngưi cam ñoan Trn Minh Đnh
4. ii LI CM ƠN Đ hoàn tt khóa lun này, tôi xin bày t lòng cm ơn chân thành và sâu sc ti: Lãnh ño trưng Đi hc Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chc năng ñã t chc Đào to, qun lý và to ñiu kin thun cho tôi hoàn tt khóa hc và lun văn. Các Thy, Cô giáo trong và ngoài trưng ñã nhit tình ging dy và cung cp nhng kin thc quý báu trong sut khóa hc. TS. Võ Th Phương Khanh, ngưi luôn quan tâm, nhit tình hưng dn và to mi ñiu kin thun li ñ tôi hoàn thành khóa lun. PGS. TS Nguyn Anh Dũng ñã có nhng trao ñi quý báu và to ñiu kin thun li ñ tôi hoàn thành khóa lun. B môn SHTN, B môn Sinh hc thc vt và Phòng thí nghim CNSH&MT là các ñơn v ñã to ñiu kin thun li ñ tôi thc hin và hoàn tt khóa lun. Các anh, ch và các bn hc viên lp Cao hc SHTNK3; ñã luôn quan tâm, chia s và ñng viên tôi trong sut khóa hc cũng như sut thi gian thc hin khoa lun. Đc bit là bn Hưng (Công ty CP TBR) ñã nhit tình và có nhng trao ñi quý báu trong quá trình thc hin ñ tài; phòng Dch v, Công ty Vit Á ñã cung cp chng vi sinh vt tham kho. Cô Giang (phòng khám ña khoa Nguyn Dũng), anh Nguyn (phòng khám ña khoa Hng Đc), bn Vit (Bnh vin ña khoa Thin Hnh), Cô Oanh (BS sn khoa, phòng khám s 120 H Tùng Mu) và các anh ch ti phòng xét nghim Bnh vin ña khoa Thin Hnh, phòng khám ña khoa Nguyn Dũng, phòng khám s 120 H Tùng Mu, phòng khám s 46 Phan Chu Trinh, phòng khám ña khoa Hng Đc ñã nhit tình giúp ñ tôi trong quá trình thu thp mu dch pht c t cung.
5. iii Cui cùng, xin gi li cm ơn chân thành nht ti nhng ngưi thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, ñng viên tôi trong sut quá trình hc tp cũng như thc hin lun văn. Buôn Ma Thut , ngày tháng năm 2011 Tác gi Trn Minh Đnh
6. iv MC LC Trang M ĐU 1 1. Tính cp thit ca ñ tài 1 2. Mc tiêu ca ñ tài 2 3. Ý nghĩa khoa hc 2 4. Ý nghĩa thc tin 2 Phn I TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Đnh nghĩa ung thư c t cung 3 1.2. Tác nhân gây ung thư c t cung 4 1.21. Tác nhân 4 1.2.2. Các type ca Human papillomavirus 4 1.2.3. B gen ca virus HPV type 16 5 1.2.4. S xâm nhim v mt phân t hin tưng chèn gen ca virus HPV nguy cơ cao vào b gen ngưi 6 1.2.5. Tình hình nghiên cu gn chèn gen E6 và E7 ca HPV vào b gen ngưi hin nay 9 1.3. Tình hình bnh ung thư c t cung trên th gii và Vit Nam 11 1.3.1. Tình hình bnh ung thư c t cung trên th gii 11 1.3.2. Tình hình bnh ung thư c t cung ti Vit Nam 12 1.4. Các phương pháp ph bin chun ñoán ung thư c t cung hin nay 13 1.4.1. Chn ñoán lâm sàng 13 1.4.2. Các phương pháp chn ñoán da trên t bào c t cung 14 1.4.3. Các phương pháp chun ñoán tác nhân HPV gây ung thư c t cung 15 1.5. Phương pháp RT – PCR trong chun ñoán gn chèn gen gây ung thư c t cung 19 1.6. Các phương pháp ñiu tr tn thương tin ung thư và ung thư c t cung 20 1.6.1. Điu tr tn thương tin ung thư c t cung 20 1.6.2. Điu tr ung thư c t cung 21
7. v 1.7. Các loi vaccine phòng HPV hin nay 21 Phn II NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 23 2.1. Ni dung nghiên cu 23 2.2. Đa ñim và thi gian nghiên cu 23 2.2.1. Đa ñim nghiên cu 23 2.2.2. Thi gian nghiên cu 23 2.3. Vt liu, hóa cht, dng c và thit b nghiên cu 23 2.3.1. Vt liu nghiên cu 24 2.3.2. Hoá cht nghiên cu 25 2.3.3. Dng c, thit b nghiên cu 27 2.3.3.1. Dng c nghiên cu 27 2.3.3.2. Thit b nghiên cu 27 2.4. Phương pháp nghiên cu 28 2.4.1. Phương pháp thit k và kim tra mi 28 2.4.1.1. Thit k và kim tra mi 28 2.4.1.2. Đánh giá kh năng khuch ñi ca h mi thit k 30 2.4.1.3. Gii trình t kim tra sn phm khuch ñi 30 2.4.2. Phương pháp thu và bo qun mu bnh phm 31 2.4.3. Phương pháp tách chit t bào thu nhn RNA tng s 31 2.4.4. Phương pháp kim soát ni phn ng 32 2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR 33 2.4.5.1. Phn ng RT 33 2.4.5.2. Phn ng multiplex PCR 33 2.4.6. Phương pháp ñin di kim tra sn phm multiplex RT – PCR 34 2.4.7. Phương pháp xây dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR 35 2.4.7.1. Nghiên cu nng ñ enzym DNase I x lý dch sau tách chit thu nhn hoàn toàn RNA tng s 35 2.4.7.2. Kho sát nhit ñ lai ca h mi 36
8. vi 2.4.7.3. Kho sát nng ñ mi 36 2.4.7.4. Kho sát nng ñ Mg 2+ 39 2.4.7.5. Kho sát nng ñ dNTP 39 2.4.7.6. Kho sát ñ nhy ca quy trình 39 2.4.7.7. Kho sát ñ ñc hiu ca quy trình 40 2.4.9. Bưc ñu ng dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR trên các mu bnh phm thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut 40 Phn III KT QU VÀ THO LUN 41 3.1. Nghiên cu thit k và kim tra mi khuch ñi ñc hiu gen E6 và E7 ca HPV type 16 41 3.1.1. Thit k và kim tra mi 41 3.1.2. Đánh giá kh năng khuch ñi ca h mi thit k 44 3.1.3. Gii trình t kim tra sn phm khuch ñi 45 3.2. Xây dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR 47 3.2.1. Nghiên cu nng ñ enzym DNase I x lý dch mu sau tách chit 47 3.2.2. Kho sát nhit ñ lai ca h mi 49 3.2.3. Kho sát nng ñ mi trong phn ng PCR 50 3.2.4. Kho sát nng ñ Mg 2+ 54 3.2.5. Kho sát nng ñ dNTP 55 3.2.6. Kho sát ñ nhy ca quy trình 56 3.2.7. Kho sát ñ ñc hiu ca quy trình 57 3.2.8. Quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR 58 3.3. Bưc ñu ng dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR trên các mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut 60
9. vii Phn IV KT LUN VÀ KIN NGH 65 4.1. Kt lun 65 4.2. Kin ngh 66 TÀI LIU THAM KHO PH LC
10. viii CÁC CH VIT TT AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome: Hi chng suy gim min dch mc phi ngưi. BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Công c tìm kim các trình t tương ñng. Bp base pairs: Cp base CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia: Tn thương trong t bào biu mô c t cung. Cs Cng s CD Chng dương cDNA complementary DNA: DNA b sung dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate dGTP Deoxyguanosine triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate dTTP Deoxythymidine triphosphate EDTA ethylenediaminetetraacetic acid EMBL European Molecular Biology Labolatories: Hi các phòng thí nghim Sinh hc phân t Châu Âu. HPV Human Papilomavirus IARC International Agenecy For Research on Cancer IDT Intergrated DNA Technology Kb Kilo base mRNA Messenger Ribonucleotide acid NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung tâm Quc gia v thông tin Công ngh Sinh hc.
11. ix PCR Polymerase chain reaction: Phn ng kéo dài chui. PK Phòng khám PKĐK Phòng khám ña khoa RNA Ribonucleotide acid RT Reverse Transcriptase RTPCR Reverse Transcriptase Polymerase chain reaction TAE Tris acetate EDTA Taq Thermus aquaticus TE Tris acid – EDTA Tm melting Temperature: Nhit ñ bin tính.
12. x DANH MC CÁC HÌNH NH Trang Hình 1.1: S phát trin ca các t bào bt thưng trong bnh ung thư c t cung 3 Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 4 Hình 1.3: Cu trúc b gene ca Human papillomavirus type 16 5 Hình 1.4: Quá trình xâm nhim và gây bnh ca HPV type nguy cơ cao trong t bào ch 7 Hình 1.5: Sơ ñ biu din phân b t l ung thư c t cung trên th gii 10 Hình 1.6: T bào c t cung bình thưng và nghch sn 13 Hình 2.1: Thang DNA 100bp 26 Hình 2.2: Sơ ñ biu th v trí gn mi E6fE6r trên gene E6 và trên amplicon 31 Hình 3.1: Kt qu ñánh giá kh năng khuch ñi ca h mi thit k 44 Hình 3.2: Kt qu thc hin phn ng multiplex PCR trên 3 mu chng dương chưa x lý enzym DNase I 45 Hình 3.3: Kt qu kho sát nng ñ enzym DNase I x lý dch sau tách chit 47 Hình 3.4: Kt qu kho sát nhit ñ lai ca h mi 47 Hình 3.5: Kt qu kho sát nng ñ h mi trong phn ng 48 Hình 3.6: Kt qu kho sát nng ñ Mg 2+ 52 Hình 3.7: Kt qu kho sát nng ñ dNTP 53 Hình 3.8: Kt qu kho sát ñ nhy ca quy trình 54 Hình 3.9: Kt qu kho sát ñ ñc hiu ca quy trình 55 Hình 3.10: Kt qu kim chng quy trình phát hin gn chèn gene E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gene ngưi trên các mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut 61
13. xi DANH MC CÁC BNG Trang Bng 1.1: T l tin trin ca các giai ñon CIN sang ung thư c t cung 9 Bng 1.2: Các phương pháp ñiu tr tn thương tin ưng thư c t cung 19 Bng 2.1: Các chng vi sinh vt và mu bnh phm tham kho s sng trong ñ tài 23 Bng 2.2: Đa ñim và s lưng mu thu thp s dng trong ñ tài 24 Bng 2.3: Trình t amplicon tng hp làm chng ni 24 Bng 2.4: Nng ñ ca 2 cp mi kho sát trong ñ tài 36 Bng 3.1: Kt qu thit k mi 41 Bng 3.2: Đc tính ca h mi thit k 42 Bng 3.3: Cu trúc th cp ca h mi thit k 42 Bng 3.4: Cu trúc heterodimer (kcal/mole) ca h mi thit k 42 Bng 3.5: Kt qu kho sát nhit ñ lai ca h mi 48 Bng 3.6: Kt qu kho sát nng ñ h mi trong phn ng 49 Bng 3.7: Kt qu kho sát ñ nhy ca quy trình 54 Bng 3.8: Sơ ñ quy trình phát hin gn chèn gene E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gene ngưi bng k thut multiplex RTPCR 56 Bng 3.9: Kt qu gii trình t gene E6 và E7 ca HPV type 16 gn chèn vào b gene ngưi 58 Bng 3.10: Kt qu kim chng quy trình phát hin gn chèn gene E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gene ngưi trên các mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut 62
14. 23 Phn II NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 2.1. Ni dung nghiên cu 1. Nghiên cu thit k và kim tra mi khuch ñi ñc hiu gen E6 và E7 ca HPV type 16. 2. Xây dng quy trình phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR Nghiên cu nng ñ enzym DNase I x lý dch sau tách chit Kho sát nhit ñ lai ca h mi Kho sát nng ñ mi Kho sát nng ñ Mg 2+ Kho sát nng ñ dNTP Kho sát ñ nhy ca quy trình Kho sát ñ ñc hiu ca quy trình 3. Bưc ñu ng dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR trên các mu mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut. 2.2. Đa ñim và thi gian nghiên cu 2.2.1. Đa ñim nghiên cu Phòng thí nghim Sinh hc phân t B môn Sinh hc thc nghim, Khoa KHTN&CN, trưng Đi hc Tây Nguyên. Phòng thí nghim CNSH&MT, trưng Đi hc Tây Nguyên. 2.2.2. Thi gian nghiên cu Đ tài thc hin t tháng 09/2010 ti tháng 08/2011. 2.3. Vt liu, hóa cht, dng c và thit b nghiên cu
15. 24 2.3.1. Vt liu nghiên cu + Mu chng dương: 3 mu chng dương (CD1, CD2, CD3) là mu bnh phm thu nhn t bnh nhân ung thư c t cung ñã ñưc xác ñnh do HPV type 16 gây ra, ñưc cung cp t Khoa Ung bưu, Bnh vin Đa khoa Cn Thơ. + 8 chng vi sinh vt và 1 mu bnh phm s sng trong ñ tài Bng 2.1: Các chng vi sinh vt và mu bnh phm s sng trong ñ tài STT Tên vi sinh vt Ngun gc S lưng DNA ca ngưi không b Khoa Ung bưu, Bnh vin 1 1 ung thư c t cung ña khoa Cn Thơ 2 HPV type 18 1 3 HPV type 11 1 4 HPV type 6 1 5 HPV type 33 Công ty c phn công ngh 1 6 HPV type 45 Vit Á, Tp. H Chí Minh 1 7 E.coli 1 8 Chlamydia trachomatis 1 9 Neisseria gonorrhoeae 1 + Mu chng âm: nưc ct. + 86 mu bnh phm dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut – Đăk Lăk. Bng 2.2: Đa ñim và s lưng mu thu thp s dng trong ñ tài STT Đa ñim thu mu S mu thu thp 1 Bnh vin ña khoa Thin Hnh 64 2 Phòng khám ña khoa Hng Đc 2
16. 25 3 Phòng khám s 46 Phan Chu Trinh 2 4 Phòng khám ña khoa Nguyn Dũng 7 5 Phòng khám s 120 H Tùng Mu 11 Tng cng 86 + Chng ni: là yu t kim soát ni phn ng nhm kim chng phn ng có din ra bình thưng hay không. Mt ñon amplicon có kích thưc 400bp ñưc tng hp ti Công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chng ni, trình t amplicon ñưc thit k vi 2 v trí li (mismatch) th hin qua bng 2.3 Bng 2.3: Trình t amplicon tng hp làm chng ni Kích Trình t amplicon (5’ – 3’) thưc (bp) CACAGAGCTGCAAACAACTAT CCAATTATCAACAATTACTACAT GCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAGCTTGGTGACAACG CTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCC ACTCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCT GACCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTTGCTGAC AAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCAC 400 TACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTG GAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGA CCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAAC CGTCAAAAGCCACTGTG TC Ghi chú: C v trí mismatch trên amplicon 2.3.2. Hoá cht nghiên cu + Hóa cht dùng cho tách chit t bào thu nhn RNA tng s Dung dch 1 (Trizol X100): phenol 38%, guanidium thyocianate 0.8M, glycerol 5%, chnh v pH 4.0. Dung dch 2: Chloroform.
17. 26 Dung dch 3: Isopropanol tuyt ñi có cha cht tr ta. Dung dch 4: Ethanol 70%. Dung dch 5: Nưc x lý vi DEPC. Hóa cht ñưc cung cp t Công ty C phn Công ngh Vit Á – Tp. H Chí Minh. + Hóa cht dùng cho phân hy DNA thu nhn RNA tng s Dnase I(hãng Fermentas) + Hoá cht dùng cho phn ng multiplex RT – PCR
    Phn ng RT Đ tài s dng b Kit cDNA synthesis KIT (VA.A 92003B) ca Công ty c phn công ngh Vit Á.
    Phn ng multiplex PCR Mi xuôi và mi ngưc (tng hp t Công ty IDT, Hoa Kỳ) dNTPs (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) 2mM mi loi (hãng Fermentas) Taq DNA polymerase 500 U (hãng Fermentas) Dung dch ñm 10X (hãng Fermentas) MgCl 2 25 mM (hãng Fermentas) Nưc ct 2 ln ñã loi b enzym Dnase, Rnase. + Hoá cht dùng cho ñin di trên gel agarose Agarose (hãng Biorad). Dung dch ñin di TAE 50X: 40mM Tris 20mM Acetic Acid 1mM EDTA (hãng Fermentas) Dung dch np mu 6X: 10 mM TrisHCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol 60 mM EDTA (hãng Fermentas) Dung dch nhum mu Ethidium bromide.
18. 27 Thang DNA 100 bp (hãng Fermentas). Hình 2.1. Thang DNA 100bp 2.3.3. Dng c, thit b nghiên cu 2.3.3.1. Dng c nghiên cu Micropipettes loi: 10l, 100l, 1000l (hãng Axygen – Hoa Kỳ). Đu tip thưng, loi: 10l, 100l, 1000l (hãng Greiner) Filter tip loi: 10l, 100l, 1000l (hãng Greiner) Eppendorf 1.5ml (loi thưng và loi Biopure), eppendorf 0.2ml np phng (hãng Greiner) Vt liu tiêu hao: găng tay không phn, khu trang, cn 70 0, 2.3.3.2. Thit b nghiên cu Máy tính và các phn mm chuyên dng ñ thit k và ñánh giá mi Máy Vortex (hãng IKA) T lnh âm 30 0C và t lnh thưng Máy ly tâm lnh tc ñ 13000 vòng/phút (hãng Hettich) T tách chit DNA/RNA vô trùng T ñt phn ng PCR vô trùng
19. 28 Máy PCR (C1000 Thermal Cycler – hãng Biorad) Máy nhit khô Ni hp kh trùng (hãng Study) Lò vi sóng H thng ñin di hãng (Biorad) GelDoc XR vi phn mm chuyên dng kt ni máy tính (Biorad). 2.4. Phương pháp nghiên cu 2.4.1. Phương pháp thit k và kim tra mi 2.4.1.1. Thit k và kim tra mi 2.4.1.1.1. Các phn mm h tr thit k và kim tra mi Clustal X 1.81 (EMBL, Châu Âu) Annhyb 4.922, năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ) Phn mm trc tuyn Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ) ( Phn mm trc tuyn BLAST (NCBI, Hoa Kỳ) ( 2.4.1.1.2. K thut thit k và kim tra mi Quy trình thit k và kim tra h mi gm 5 bưc cơ bn sau: Bưc 1: Thu thp các trình t gen ca gen E6 và E7 HPV type 16 t ngân hàng gen ca NCBI ( Bưc 2: Sp gióng các trình t gen thu ñưc bng phn mm Clustal, so sánh và xác ñnh vùng bo tn ca gen E6 và E7 t các vùng bo tn thit k mi phù hp. Bưc 3: Tham kho các cp mi ñã công b trên các bài báo uy tín quc t hoc thit k mi.
20. 29 Bưc 4: Sp gióng các trình t gen E6 và E7 vi tng mi xuôi, mi ngưc, ñánh giá mc ñ tương ñng ca các trình t trên bng phn mm clustal. Bưc 5: Phân tích và ñánh giá các thông s ca mi v Tm, %GC, hairpin (kp tóc), self – dimer, hetero – dimer, ñ tương ñng, kích thưc sn phm PCR to thành bng các phn mm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), Oligo Analyzer. T ñó, chn cp mi thích hp nht ñ thc hin phn ng multiplex RT PCR. Sau khi thit k và kim tra, các cp mi ñt tiêu chun v mt lý thuyt s ñưc gi tng hp nhân to ti Công ty IDT (Hoa Kỳ). 2.4.1.1.3. Mt s tiêu chun thit k và ñánh giá mi Trong giai ñon thit k mi, qua tham kho mt s tài liu v thit k mi ca Andrew Wallace (1996), Alkami Biosystems (1999) , mt s tiêu chun ca mi ñưc rút ra như sau: Chiu dài ca mi tt nht nm trong khong 18 – 25 cp base. Thành phn các nucleotide ca mi phi cân bng. Các mi có hiu qu khuch ñi tt nht là nhng mi có các base loi G, C tp trung thành nhóm và chim t l khong t 40% 60%. Ngoài ra, các base cui ñu 3’hay gn ñu 3’ ca các mi này nên là G, C, GC hoc CG. Nhit ñ nóng chy (Tm) ca mi là mt thông s quan trng có nh hưng ln ñn kh năng bt cp ca mi vi DNA bn mu. Đ ñt hiu qu nhân bn tt nht, nhit ñ nóng chy ca mi nm trong khong 50 0C – 72 0C. Ngoài ra, nhit ñ nóng chy mi xuôi và mi ngưc không ñưc cách bit quá xa, ti ña khong 50C. Trong cu trúc ca mi không ñưc có nhng vùng trình t có th t bt cp b sung vi nhau vì nhng vùng này có th hình thành cu trúc kp tóc (hairpin loop) cht ch làm gim hiu qu nhân bn ca mi. Ngoài ra, cn tránh chn
21. 30 nhng mi có kh năng bt cp b sung cht ch vi nhau ñu 3’ do ñiu này có th dn ti vic to các mi dimer, selfdimer (mi bt cp vi nhau), heterodimer (mi này bt cp vi mi khác), làm gim hiu sut ca phn ng PCR. Mc năng lưng ( ∆G) hình thành nên các cu trúc th cp ca các mi phi > 9 kcal/mol. Khi tìm kim và so sánh các trình t tương ñng bng công c BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), giá tr E (xác sut ca tương ñng xut hin không ngu nhiên) càng nh thì mc ñ tương ñng càng cao; giá tr Score, ch s query coverage càng cao thì mc ñ tương ñng càng cao [8; 9]. 2.4.1.2. Đánh giá kh năng khuch ñi ca h mi thit k Tin hành tách chit RNA ca các mu chng dương ñã xác ñnh ung thư c t cung do HPV type 16 gây ra. Thc hin phn ng multiplex RTPCR vi chng ni luôn ñưc b sung trong mi phn ng giai ñon PCR. Mi hot ñng bình thưng s có vch ca gen E6 và E7 như mong mun. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.1.3. Gii trình t kim tra sn phm khuch ñi Đ khng ñnh sn phm khuch ñi là trình t ca gen E6 và E7 ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi, chúng tôi gi sn phm PCR ñn công ty Macrogen (Hàn Quc) ñ gii trình t. Sau khi gii trình t, kt qu ñưc kim tra thông qua phn mm ClustalX 1.81 và so sánh vi các trình t chun ñưc công b trên GenBank thông qua chương trình BLAST trên NCBI nhm tìm kim trình t tương ñng vi ñon trình t nhân bn ñưc. Kt qu có ñưc t s so sánh bng công c BLAST s cho phép kt lun v tính ñc hiu ca sn phm PCR thu ñưc.
22. 31 2.4.2. Phương pháp thu và bo qun mu bnh phm 86 mu dch pht c t cung ñưc các nhân viên y t thu nhn t các bnh nhân ti khám sn ti các Phòng khám và Bnh vin trên ña bàn thành ph Buôn Ma Thut. Mu la ñưc chn là các mu có kt qu Pap nghi ng hoc viêm nhim nng và bnh nhân 26 tui tr lên. Mu ñưc bo qun trong dung dch TE1X và vn chuyn v phòng thí nghim trong ñiu kin t 0 0C ti 4 0C. Ti phòng thí nghim, bo qun mu 20 0C. 2.4.3. Phương pháp tách chit t bào thu nhn RNA tng s Đ tách chit t bào thu nhn RNA tng s, s dng phương pháp ta trong phenol/chloroform theo phương pháp ca Chomczynski & Sacchi (1987). Quy trình tách chit ñã ñưc thương mi hóa và cung cp t Công ty CP Công ngh Vit Á – Tp. H Chí Minh, quy trình bao gm các bưc sau: Đánh du các eppendorf 1.5ml Biopure. Hút tt c các dung dch ñu s dng ñu tip có phin lc. Các mu bnh phm ñưc vortex k. Sau ñó, hút 200l vào các eppendorf vô trùng có cha sn 900l dung dch 1. Vortex 30 giây, ñ yên 10 phút. Thêm 200l dung dch 2 (lc k trưc khi hút), trn ñu, ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Cn thn hút 600l dch trong ni có cha RNA (tránh làm xáo trn hai lp) và mt eppendorf biopure khác có cha sn 600l dung dch 3 (trn ñu trưc khi s dng). Trn ñu hn hp, ñ yên 10 phút nhit ñ lnh, sau ñó ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút. Hn hp sau khi ly tâm ñưc loi b dch ni, thu cn. Cho t t 900l dung dch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút. Tip tc loi b ht dch ni và thu cn. Đ khô nhit ñ 60 0C trong 10 phút. Sau ñó, thêm vào 50l dung dch DEPC.
23. 32 Nu chưa thc hin phn ng RT, bo qun mu ñã tách chit 20 0C. 2.4.4. Phương pháp kim soát ni phn ng Nhm khng ñnh trong mi phn ng PCR không có hin tưng c ch, ñ tài tin hành thit k và tng hp 1 ñon amplicon có kích thưc 400 bp ti công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chng ni (internal control) và luôn b sung trong mi phn ng PCR nng ñ 10 4 bn sao/ml. Nhm tit kim chi phí, ñ tài s dng mi khuch ñi gen E6 ñ khuch ñi amplicon ca chng ni nhưng trên mch khuôn ca amplicon ñã to ra các ñim li (mismatch) ti v trí nucleotid th 3 tính t ñu 3’OH ca v trí mi bt cp vi mch khuôn amplicon. Vic to ra các ñim li trên mch khuôn ca amplicon nhm mc ñích mi s khuch ñi gen E6 vi hiu sut cao hơn khuch ñi amplicon. Như vy, trong mi phn ng s luôn xut hin vch ca chng ni có kích thưc 400 bp nhm chng minh phn ng PCR din ra bình thưng, không có hin tưng c ch phn ng và âm tính là âm tính tht. Hình 2.2. Sơ ñ biu th v trí gn mi E6fE6r trên gen E6 và trên amplicon
24. 33 A: v trí gn mi E6fE6r trên gen E6 to sn phm có kích thưc 287bp B: v trí mismatch và gn mi E6fE6r trên amplicon to sn phm có kích thưc 400bp 2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR 2.4.5.1. Phn ng RT Phn ng RT ñ phiên mã ngưc RNA thành cDNA. Thành phn 1 phn ng 20l bao gm: 12.5l dch tách chit RNA, 1l enzym RT, 6.5 l RT buffer. Đy np eppendorf tht k, ñt vào máy PCR. Thao tác thc hin trong ñiu kin ñá ñang tan. Cài ñt chương trình luân nhit cho phn ng RT: 25 0C – 10 phút, 42 0C 30 phút, 85 0C – 5 phút, gi 40C 2.4.5.2. Phn ng multiplex PCR Thành phn cho mt phn ng 25l bao gm: 2.5l dung dch ñm (buffer) 10X; 0.625 unit Taq DNA polymerase; 3.0 mM MgCl 2 ; 280M dNTPs; Mi xuôi và mi ngưc E6: mi mi 500nM; Mi xuôi và mi ngưc E7: mi mi 500nM; 1l chng ni nng ñ 10 4 bn sao/ml; 2.5l dch cDNA. Thêm nưc ct hai ln cho ñ 25l. Thao tác thc hin trong ñiu kin ñá ñang tan Cài ñt chương trình luân nhit ca phn ng PCR: Bưc 1: 95 0C 5 phút 1 chu kỳ Bưc 2: 95 0C 30 giây 55 0C 30 giây 39 chu kỳ 72 0C 30 giây Bưc 3: 72 0C 6 phút 1 chu kỳ
25. 34 2.4.6. Phương pháp ñin di kim tra sn phm multiplex RT – PCR 2.4.6.1. Nguyên tc Nguyên tc ca phương pháp ñin di da vào ñc tính cu trúc ca các nucleic acid tích ñin âm nên dưi tác ñng ca ñin trưng s di chuyn v cc dương. S dng ethidium bromide ñ phát hin s hin din ca DNA sau khi nhum là nh Ethidium bromide có kh năng gn chèn vào phân t DNA và phát màu dưi ñèn UV. 2.4.6.2. Pha hóa cht và chun b gel agarose
    Pha dch np mu Thành phn ca dch np mu như sau: 600 l glycerol + 0.25% xylene cyanol ff, thêm dung dch TAE 1X cho ñ 1000 l.
    K thut ñ gel agarose 2% Cân 2g agarose, thêm 100 ml TAE 1X, ñun tan hoàn toàn, ñ ngui 60 0 C, ñ vào giá nm ngang có lp lưc, ch gel ñông, ñt vào bn ñin di có cha dung dch TAE 1X, rút lưc khi gel. 2.4.6.3. K thut ñin di kim tra sn phm multiplex RT PCR Thành phn ñin di bao gm 7l sn phm PCR hoc chng dương, chng âm vi 3 l dch np mu. Cho hn hp trên vào các ging trên gel agarose 2%. Đin di ñin th 50V, 5 phút. Tăng lên 80V, 30 phút. Nhum gel trong dung dch TAE 1X có ethidium bromide 15 phút. Quan sát kt qu ñin di thông qua thit b chp hình chuyên dng GelDoc XR có kt ni phn mm chuyên dng (Biorad). Kích thưc các sn phm PCR ñưc ghi nhn s ñi chiu vi chng dương, chng âm và thang chun 100bp.
26. 35 2.4.7. Phương pháp xây dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR Quy trình multiplex PCR thc hin trên chng dương là mu bnh phm ung thư c t cung ñã ñưc xác ñnh do HPV type 16 gây ra. Trong mi phn ng luôn b sung chng ni giai ñon PCR nhm kim soát ni phn ng. Phn PCR din ra bình thưng nu chng ni xut hin vch 400 bp sau khi ñin di. 2.4.7.1. Nghiên cu nng ñ enzym DNase I x lý dch sau tách chit thu nhn hoàn toàn RNA tng s RNA ca chng dương ñưc tách chit theo phương pháp ta trong phenol/chloroform. V nguyên tc, dung dch Trizol pH 4 ñã loi b ht DNA (vn tn ti pH 8). Tuy nhiên, trong thc nghim, có th không loi ht DNA trong quá trình tách chit, do vy, b gen ca HPV có th còn sót li s ñưc khuch ñi sau phn ng PCR làm kt qu dương tính. Kt qu dương tính này có th là dương tính gi do ñưc khuch ñi t gen E6 và E7 trong DNA ca HPV còn sót li sau tách chit. Trong khi ñó, gen E6 và E7 tn ti trong b gen HPV DNA s không có kh năng gây ung thư do b khóa bi gen E2 ca virut HPV. Vì vy, ñ loi b hoàn toàn DNA có th còn sót li sau tách chit, tip tc x lý bng DNase I nhm thu nhn hoàn toàn RNA cho phn ng và làm tăng ñ chính xác ca quy trình. T các mu chng dương cho kt qu dương tính khi phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vi phn ng multiplex RTPCR và multiplex PCR s la chn và tin hành kho sát nng ñ DNase I x lý DNA còn sót li. Theo khuyn cáo ca nhà sn xut [61], nng ñ DNase I thích hp cho phân gii DNA còn sót li sau tách chit là 1U DNase I/phn ng. Do vy, ñ tài tin hành kho sát nng ñ DNase I thích hp cho phân gii DNA còn sót li sau tách chit theo dãy nng ñ sau: 1, 2, 3, 4 và 5 U DNase I /phn ng.
27. 36 Như vt, nng ñ DNase I cho kt qu âm tính sau khi multiplex PCR s là nng ñ DNase I thích hp s dng ñ x lý DNA còn sót li. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.7.2. Kho sát nhit ñ lai ca h mi Trong phn ng PCR, nhit ñ lai là mt yu t quan trng. Nhit ñ lai thp s to các vch ký sinh hoc bt cp không chuyên bit gây hin tưng dương tính gi. Nhit ñ lai cao làm gim hiu qu bt cp gia mi vi mch khuôn và kt qu có th gây nên hin tưng âm tính gi. Do vy, ñ la chn nhit ñ lai ti ưu, ñ tài tin hành kho sát nhit ñ lai theo gradient nhit ñ: 50, 50.7, 52, 53.9, 56, 58.3, 59.4 và 60 0C. Nhit ñ lai kho sát cho tín hiu vch rõ nét nht khi ñin di s là nhit ñ lai ti ưu ca quy trình. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.7.3. Kho sát nng ñ mi Nng ñ mi trong mi phn ng PCR phi ñưc tính toán ti ưu bng thc nghim. Nu nng ñ mi quá cao s dn ñn hin tưng khuch ñi ký sinh, ngưc li hiu qu khuch ñi ca phn ng không cao. Ngoài ra, trong phn ng multiplex PCR thưng xy ra hin tưng cp mi cnh tranh nhau nên kt qu phn ng PCR trên mi cp mi s không ti ưu, do ñó vic ti ưu nng ñ mi mi trong phn ng multiplex PCR là cn thit. Nng ñ mi trong phn ng PCR ph bin nht là t 100 – 500nM [49]. Nng ñ ca 2 cp mi kho sát ñưc th hin trong bng 2.4. Bng 2.4. Nng ñ ca 2 cp mi kho sát trong phn ng multiplex PCR Mi Mi E6fE6r (nM) Mi E7fE7r (nM) T l cp mi 1:1 100 100 1:2 200
28. 37 1:3 300 1:4 400 1:5 500 2:1 100 2:2 200 2:3 200 300 2:4 400 2:5 500 3:1 100 3:2 200 3:3 300 300 3:4 400 3:5 500 4:1 100 4:2 200 4:3 400 300 4:4 400 4:5 500 5:1 100 5:2 200 5:3 500 300 5:4 400 5:5 500 1:1 100 2:1 200 100 3:1 300 4:1 400
29. 38 5:1 500 1:2 100 2:2 200 3:2 300 200 4:2 400 5:2 500 1:3 100 2:3 200 3:3 300 300 4:3 400 5:3 500 1:4 100 2:4 200 3:4 300 400 4:4 400 5:4 500 1:5 100 2:5 200 3:5 300 500 4:5 400 5:5 500 Nng ñ mi cho tín hiu rõ nét nht trong phn ng có chng dương s ñưc chn cho các nghiên cu tip theo. Thí nghim ñưc lp li 3 ln.
30. 39 2.4.7.4. Kho sát nng ñ Mg 2+ Nng Mg 2+ có th nh hưng ñn nhit ñ bin tính DNA khuôn mu, quá trình ca mi, tính ñc hiu ca sn phm PCR, hot tính ca Taq DNA polymerase và ñ chính xác ca kt qu. Nng ñ Mg 2+ quá cao s làm cho DNA si ñôi n ñnh hơn làm cho kt qu PCR nghèo ñi. Mt khác, còn làm cho hin tưng bt cp gi n ñnh hơn dn ñn xut hin sn phm PCR không ñc hiu vi s lưng khá ln. Nu nng ñ Mg 2+ quá thp s nh hưng xu ñn quá trình tng hp DNA. Do vy, cn phi xác ñnh ti ưu nng ñ Mg 2+ nhm ñm bo hiu sut khuch ñi và tính ñc hiu cho sn phm PCR [49]. Nng ñ Mg 2+ ti ưu s khác nhau ñi vi các cp mi và mu khác nhau. Dãy nng ñ kho Mg 2+ trong thí nghim ñưc kho sát như sau: 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 và 5.0 mM. Nng ñ Mg 2+ cho tín hiu rõ nét nht trong phn ng có chng dương s là nng ñ Mg 2+ ti ưu ca quy trình. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.7.5. Kho sát nng ñ dNTP Trong thí nghim, luôn s dng nng ñ 4 loi dNTP bng nhau. Nu hn hp dNTP không cân bng s làm gim ñ chính xác ca Taq DNA polymerase. Nng ñ tng cng ca 4 loi dNTP trong phn ng trong khong 200M– 1000M nhưng nng ñ thưng ñưc s dng là 200 250M [49]. Trong thí nghim, nng ñ 4 loi dNTP tng cng ñưc kho sát theo dãy nng ñ sau: 120; 160; 200; 240 và 280M. Nng ñ dNTP cho tín hiu rõ nét nht trong phn ng có chng dương s là nng ñ dNTPs ti ưu ca quy trình. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.7.6. Kho sát ñ nhy ca quy trình
31. 40 Đ nhy là mt yu t quyt ñnh giá tr ca phương pháp chn ñoán. Đ nhy cho bit lưng bn sao nh nht mà mt phương pháp có th cho kt qu dương tính. Dch RNA s dng cho thí nghim ñưc tách chit t mu dương tính có mt ñ 10 6 bn sao mRNA E6 và E7/ml. Dch này ñưc pha loãng bc 10 liên tip to thành các mt ñ: 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 bn sao mRNA E6 và E7/ml. Sau ñó, thc hin phn ng multiplex RTPCR. Đ nhy ca quy trình là mt ñ chng dương thp nht cho kt qu dương tính trong phn ng multiplex RTPCR. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.7.7. Kho sát ñ ñc hiu ca quy trình Tin hành thc hin phn ng multiplex RTPCR vi các ñi tưng khác nhau có th có mt trong dch pht c t cung như: DNA ca ngưi không b ung thư c t cung (ñưc cung cp t Khoa Ung bưu, Bnh vin ña khoa Cn Thơ); HPV type 18, HPV type 11, HPV type 6, HPV type 33, HPV type 45, E.coli, Chlamydia trachomatis , Neisseria gonorrhoeae (ñưc cung cp t Công ty c phn công ngh Vit Á, Tp. H Chí Minh), kèm theo mu chng dương. Quy trình s ñc hiu khi cho kt qu dương tính vi mu chng dương và âm tính vi các ñi tưng còn li. Thí nghim ñưc lp li 3 ln. 2.4.8. Bưc ñu ng dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR trên các mu dch pht c t cung bnh phm thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut Thc hin phn ng multiplex RTPCR ñã nghiên cu trên 86 mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut – Đăk Lăk, qua ñó xác ñnh s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi.
32. 65 Phn IV KT LUN VÀ KIN NGH 4.1. Kt lun Qua nghiên cu và thc hin ñ tài, chúng tôi ñi ti mt s kt lun sau: 1. Thit k thành công h mi phát hin ñc hiu s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. 2. Thit k thành công chng ni nhm kim soát ni phn ng. 3. Bưc ñu xây dng thành công các ñiu kin ca quy trình phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR Nng ñ enzym DNase I thích hp cho x lý DNA còn sót li sau tách chit: 2 U/phn ng. Nhit ñ lai ti ưu ca phn ng: 56 0C. Nng ñ mi ti ưu cho phn ng ti 400nM vi cp mi E6fE6r và 500nM vi cp mi E7fE7r. Nng ñ Mg 2+ ti ưu cho phn ng: 3mM Nng ñ dNTP ti ưu cho phn ng: 200M Đ nhy ca quy trình 10 3 bn sao mRNA E6 và E7/ml Quy trình nghiên cu ñc hiu cho phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. 4. Kt qu gii trình t sn phm khuch ñi ca qui trình ñã khng ñnh sn phm khuch ñi thuc gen E6 và E7 ca HPV type 16 do gn chèn vào b gen ngưi. 5. Kim chng quy trình trên 86 mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut và ñã phát hin 1 mu thu ti phòng khám s 120 H Tùng Mu có gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi.
33. 66 4.2. Kin ngh Nhm hoàn thin và nâng cao hiu qu phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut sinh hc phân t, ñ tài có mt s kin ngh sau: 1. Tip tc nghiên cu hoàn thin ñánh giá hiu lc sơ cp và th cp ca quy trình nhm to KIT ñ ng dng cho chn ñoán tin ung thư c t cung do HPV type 16 gây ra bng k thut multiplex RTPCR. 2. M rng nghiên cu hoàn thin quy trình chn ñoán tin ung thư c t cung trên các HPV type khác thuc nhóm type "nguy cơ cao" gây ung thư c t cung bng k thut multiplex RTPCR.
34. 41 Phn III KT QU VÀ THO LUN 3.1. Nghiên cu thit k và kim tra mi khuch ñi ñc hiu gen E6 và E7 ca HPV type 16 3.1.1. Thit k và kim tra mi Sau khi thit k và kim tra mi bng phn mn ClustalX 1.81 (EMBL, Châu Âu) và Annhyb 4.922 (Olivier Friard, Hoa Kỳ), trình t mi ñưc th hin trong bng 3.1. Bng 3.1. Kt qu thit k mi Ký Kích thưc V trí trên hiu Tên mi Trình t mi 5’ – 3’ Gen sn phm gen mi (bp) E6f Mi xuôi CACAGAGCTGCAAACAACTATACA 116–139 E6 287 E6r Mi ngưc GACACAGTGGCTTTTGACAGT 402–382 E7f Mi xuôi AGCTCAGAGGAGGAGGATGA 91–110 E7 183 E7r Mi ngưc GCACACAATTCCTAGTGTGC 273254 Qua bng 3.1 cho thy mi xuôi E6f có v trí t nucleotide 116 ti nucleotide 139 và mi ngưc E6r có v trí t nucleotide 420 ti nucleotide 382 ca gen E6. Cp mi E6f – E6r khuch ñi mt ñon DNA có kích thưc 287 bp. Mi xuôi E76f có v trí t nucleotide 91 ti nucleotide 110 và mi ngưc E7r có v trí t nucleotide 273 ti nucleotide 254 ca gen E76. Cp mi E76f – E76r khuch ñi mt ñon DNA có kích thưc 183 bp. Thông tin v ñc tính và cu trúc th cp ca mi th hin qua bng 3.2; 3.3 và 3.4.
35. 42 Bng 3.2. Đc tính ca h mi thit k Đc tính mi Chiu dài Tm ( 0C) %GC mi (bp) Tên mi E6f 24 55.4 41.7 E6r 21 55.6 47.6 E7f 21 56.9 55 E7r 20 54.3 50 Bng 3.3: Cu trúc th cp ca h mi thit k Đc tính mi Hairpin loop Selfdimer Năng lưng Tm ( 0C) (kcal/mole) Tên mi (kcal/mole) E6f 0.29 29.20 7.05 E6r 0.34 19.9 3.30 E7f 1.19 38.3 6.34 E7r 4.69 40.5 9.73 Bng 3.4: Cu trúc heterodimer (kcal/mole) ca h mi thit k Tên mi E6f E6r E7f E7r E6f 7.05 5.84 7.91 5.25 E6r 3.3 4.74 5.25 E7f 6.34 6.24 E7r 9.73 Thông qua bng 3.2; chiu dài, nhit ñ bin tính và %GC ca các mi thit k ñu ñt theo tiêu chun thit k mi. Đc bit, nhit ñ bin tính ca các mi chênh lch nhau không cao và nhit ñ bin tính trung bình ca các mi là 55.5 0C.
36. 43 S chênh lch nhit ñ bin tính ca các mi không cao là ñiu kin thun li cho mi bt cp vi mch khuôn ñt hiu qu cao. Cu trúc th cp ca mi là các cu trúc ñưc hình thành ngay khi trng thái bình thưng như cu trúc hairpin loop (cu trúc kp tóc), Selfdimer (s t bt cp ca mi), heterodimer (s bt cp ca mi này vi mi khác), Các cu trúc này có th b phá hy bi nhiu tác nhân như nhit ñ, S hình thành cu trúc th cp ca mi s làm gim hiu qu bt cp gia mi vi mch khuôn; do vy, làm gim hiu qu khuch ñi sn phm trong phn ng PCR. Qua bng 3.3, ñc tính cu trúc kp tóc ca mi (hairpin loop) phù hp vi tiêu chun thit k mi. Mc năng lưng to thành cu trúc kp tóc ca các mi ñu >9 kcal/mole; do vy, cu trúc này d dàng b phá v bi nhit. Mt khác, nhit ñ bin tính ca các cu trúc kp tóc thp hơn nhit ñ bin tính ca mi. Điu này khng ñnh, ti nhit ñ bt cp gia mi và mch khuôn thì cu trúc kp tóc ca mi ñã b phá hy và hiu qu bt cp gia mi vi mch khuôn không b nh hưng bi cu trúc này. Bên cnh ñó, năng lưng to cu trúc Selfdimer ca mi E6f, E6r và E7f ñu >9 kcal/mole phù hp vi tiêu chun lý thuyt nhưng năng lưng to cu trúc Selfdimer ca mi E7r là 9.73 kcal/mole nh hơn tiêu chun thit k ca mi (> 9 kcal/mole). Tuy nhiên, mc năng lưng to cu trúc này không vưt quá cao so vi tiêu chun và có th phá v nh tăng nhit ñ ti bưc gn mi. Do vy, ñ tài vn la chn và bng thc nghim ñã cho thy cp mi E7 vn hot ñng bình thưng. Ti bng 3.4, cũng tương t, mc năng lưng to cu trúc th cp hetero dimer ca mi E6f, E6r và E7f ñt tiêu chun thit k. Ngoi tr năng lưng to cu trúc Selfdimer ca mi E7r là 9.73 kcal/mole nh hơn tiêu chun thit k ca mi (> 9 kcal/mole). Tuy vy, s chênh lch này không quá cao và bng thc nghim cũng cho thy cp mi E7 hot ñng bình thưng.
37. 44 Kim tra tính ñc hiu ca mi v mt lý thuyt bng phn mn trc tuyn BLAST trên NCBI cho thy: mi xuôi E6f và mi ngưc E6r ch tương ñng vi các trình t gen E6 ca HPV type 16 ñưc công b trên cơ s d liu NCBI, mc ñ tương ñng là 100%, ch s nhn din mc ñ tương ñng là 100%; mi xuôi E7f và mi ngưc E7r ch tương ñng vi các trình t gen E7 ca HPV type 16 ñưc công b trên cơ s d liu NCBI, vi mc ñ tương ñng là 100%, ch s nhn din mc ñ tương ñng là 100% (ph lc 1). Như vy, h mi thit k là ñc hiu cho phát hin gen E6 và E7 ca HPV type 16. T các kt qu trên v mt lý thuyt, ñ tài ñã thit k cp mi E6fE6r và E7fE7r ñt tiêu chun cho phát hin gen E6 và E7 ca HPV type 16. Cp mi ñt tiêu chun ñưc la chn và gi tng hp ti Công ty IDT (Hoa Kỳ). 3.1.2. Đánh giá kh năng khuch ñi ca h mi thit k Sau khi tách chit RNA ca chng dương ñã xác ñnh ung thư c t cung do HPV type 16 gây ra, tin hành thc hin phn ng multiplex RTPCR và thu ñưc kt qu th hin qua hình 3.1 400 287 183 Hình 3.1. Đánh giá kh năng khuch ñi ca h mi thit k Ghi chú: N: chng âm; T: thang 100 bp; CD1, CD2, CD3: chng dương 1, 2, 3 Kt qu cho thy, trong mi phn ng, chng ni luôn xut hin vch có kích thưc 400bp như thit k, các mu chng dương (CD1, CD2, CD3) xut hin 2
38. 45 vch, mt có kích thưc 287bp (ca gen E6) và mt có kích thưc 183bp (ca gen E7) ñúng như mong mun. Các vch ñu rõ nét và không có băng ký sinh. Như vy, chng ni hot ñng bình thưng và sau ñin di cho vch có kích thưc ñúng như thit k. Cp mi thit k có kh năng khuch ñi ñon DNA có kích thưc 287bp ca gen E6 và 183bp ca gen E7 ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi, các vch ñu rõ nét và không có băng ký sinh. 3.1.3. Gii trình t kim tra sn phm khuch ñi Sau khi gi 2 sn phm khuch ñi ký hiu E6_E6 (khuch ñi t gen E6) và E7_E7 (khuch ñi t gen E7) ca mu chng dương CD1 ñưc gi ti công ty Macrogen (Hàn Quc) ñ gii trình t, mi sn phm khuch ñi gii trình t c 2 mch. Kt qu ñưc trình bày qua bng 3.5 và ph lc 3. Bng 3.5: Kt qu gii trình t gen E6 và E7 ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi Kích Kích Ký hiu Tên thưc Trình t nucleotide (5’ – 3’) thưc gii mu gii mch gii thit ñưc (bp) k (bp) GNNTACTNNGNTNGANGGTGTGTACTGCAGCA ACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGC TTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGG Mch GAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAA 234 xuôi GTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTAT TGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTAGAACAG CAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATT E6_E6 AGG 287 NNNNCNNGNANATNANCACACAACGGTTTGTT GTATTGCTGTTCNAATGTTGTTCCATACAAACT ATAACAATAATGTCTATACTCACTAATTTTAGA Mch ATAAAACTTTAAACATTTATCACATACAGCATA 237 ngưc TGGATTCCCATCTCTATATACTATGCATAAATC CCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCACGTCGCA GTAACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATA TTATTTCA
39. 46 NNGGNNNGANAGNNTGANAGCAGAACCGGAC Mch AGAAGCCCATTTACAATTATTGTAACCTTTTGT TGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTA 134 xuôi CAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGA E7_E7 AGAC 183 ANNNTNAGNCTNAGTACGATGTCTACGTGTGT Mch GCTTTGTACGCACAACCGAAGCGTAGAGTCAC ACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGG 134 ngưc GCTCTGTCCGGTTCTGCTTGTCCAGCTGGACCA TCTA Ghi chú: N: nucleotide không xác ñnh. Qua bng 3.5 cho thy kích thưc gii trình t thu ñưc ca 2 sn phm ñu thp hơn so vi kích thưc thit k. Kích thưc trong thit k ñi vi khuch ñi ñon gen E6 là 287bp nhưng kích thưc gii trình t thu ñưc ca mu E6_E6 vi mch xuôi là 234bp, mch ngưc là 237bp. Tương t, kích thưc thit k khuch ñi ñon gen E7 là 183bp nhưng kích thưc gii trình t thu ñưc ca mu E7_E7 vi mch xuôi và mch ngưc là 134bp. Có s chênh lch và s nucleotic là do trong k thut gii trình t, các nucleotide ca các mi s không ñưc gii li. Mt khác, mt s nucleotide ñu tiên trong quá trình gii thưng b nhiu tín hiu, không xác ñnh chính xác tên loi nucleotide và ñưc ký hiu là N. Do vy, sn phm gii trình t thu ñưc s cho kích thưc nh hơn so vi sn phm trong thit k và khuch ñi. Kt qu gii trình t ñưc kim tra bng phn mm ClustalX 1.81 cho thy: trình t nucleotide gii ñưc ca mch xuôi, mch ngưc mu E6_E6 và E7_E7 nm trong vùng thit k khuch ñi sn phm và thuc gen E6 (v trí t nucleotide 116 ti 402) do HPV type 16 gn chèn. Tương t như vy, trình t nucleotide gii ñưc ca mch xuôi, mch ngưc mu E7_E7 nm trong vùng thit k khuch ñi sn phm thuc gen E7 (v trí t nucleotide 273 ti 91) ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi (ph lc 4).
40. 47 Ngoài ra, nhm ñánh giá mc ñ tương ñng ca sn phm khuch ñi vi các trình t gen ñưc công b, ñ tài s dng phn mm BLAST ñ tìm kim các trình t gen ñưc công b trên NCBI tương ñng vi sn phm gii trình t. Kt qu cho thy sn phm gii trình t ch tương ñng vi các trình t gen E6 và E7 ca HPV type 16 vi mc ñ tương ñng 99% ñi vi sn phm khuch ñi t gen E6 và 98% ñi vi sn phm khuch ñi t gen E7 (ph lc 5) . Như vy, bng lý thuyt và thc nghim ñu cho thy, sn khuch ñi là ca gen E6 và E7 ca HPV type 16 do gn chèn và quy trình nghiên cu phát hin ñc hiu s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. 3.2. Xây dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR 3.2.1. Nghiên cu nng ñ enzym DNase I x lý dch mu sau tách chit RNA ca chng dương ñưc tách chit theo phương pháp ta trong phenol/chloroform. Đ loi b hoàn toàn DNA trong dung dch mu sau tách chit, enzym DNase I ñưc s dng vi các nng ñ khác nhau. Đ tài tin hành thc hin phn ng Multiplex PCR trên 3 mu chng dương chưa x lý enzym DNase I vi dch sau tách chit, kèm theo chng âm và thu ñưc kt qu th hin ti hình 3.2 Hình 3.2: Phn ng Multiplex PCR trên 3 mu chng dương chưa x lý enzym DNase I Ghi chú: N: chng âm; T: thang 100 bp; CD1, CD2, CD3: chng dương 1, 2, 3
41. 48 Kt qu hình 3.2 cho thy: chng ni luôn xut hin vch 400bp, ñiu này chng t không có hin tưng c ch phn ng; chng âm cho kt qu âm tính chng t không có hin tưng nhim chéo. Chng dương 2 và 3 không xut hin vch ca gen E6 và E7 chng t không còn DNA có cha gen E6 và E7 còn sót li sau tách chit. Tuy nhiên, ti mu chng dương 1 có xut hin vch ti 287bp và 183bp tương ng kích thưc khuch ñi ca gen E6 và E7. Điu này khng ñnh DNA có cha gen E6 và E7 vn còn sót li sau tách chit. DNA này có th là t DNA ca ngưi ñã b gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 hoc DNA ca b gen HPV type 16. Hai gen E6 và E7 ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi s phiên mã to mRNA và dch mã to protein ung gây ung thư. Trong khi ñó, gen E6 và E7 tn ti trong b gen HPV type 16 không th phiên mã to mRNA và dch mã to protein do b khóa bi gen E2 ca virut. Mt khác, mc tiêu ca quy trình là xác ñnh có hay không có hin tưng gn chèn gen E6 và E7 gây ung thư c t cung ca HPV type 16 vào b gen ngưi. Do vy, trong quá trình tách chit nu không loi b hoàn toàn DNA t HPV type 16 thì kt qu có th là dương tính gi do sn phm ñưc khuch ñi t gen E6 và E7 ca HPV type 16 b tách ri khi b gen virut, nm t do trong môi trưng phn ng, khong phai ñưc khuch ñi t gen ñã ñưc gn chèn. Đ loi b hoàn toàn DNA còn sót li sau tách chit nhm loi b kh năng dương tính gi, dch sau tách chit phi ñưc x lý vi enzym DNase I. T mu chng dương cho kt qu dương tính khi phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vi phn ng multiplex PCR không qua x lý DNA ñưc la chn và tin hành kho sát nng ñ enzym DNase I x lý. Nng ñ DNase I kho sát theo dãy gradient 1, 2, 3, 4 và 5U/phn ng, sau ñó thc hin phn ng multiplex PCR, kt qu ñưc ghi nhn qua hình 3.3
42. 49 1 2 T 3 4 5 400 287 183 Hình 3.3: Kho sát nng ñ enzym DNase I x lý dch sau tách chit Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nng ñ 1U/phn ng; 2: nng ñ 2U/phn ng; 3: nng ñ 3U/phn ng; 4: nng ñ 4U/phn ng; 5: nng ñ 5U/phn ng. Qua hình 3.3, ti nng ñ enzym DNase I 1U/phn ng vn xut hin vch ti 287bp và 183bp ca gen E6 và E7 vi kích thưc như thit k, nhưng nng ñ enzym DNase I t 2U/phn ng tr lên thì không còn xut hin vch ca gen E6 và E7 ca HPV type 16. Như vy, nhm tit kim enzym DNase I x lý dch sau tách chit, ñ tài la chn nng ñ enzym DNase I thích hp 2U DNase I/phn ng. 3.2.2. Kho sát nhit ñ lai ca h mi Nhit ñ lai thp s to các vch ký sinh hoc bt cp không chuyên bit, gây hin tưng dương tính gi, nhit ñ lai cao làm gim hiu qu bt cp gia mi vi mch khuôn và có th gây nên hin tưng âm tính gi. Đ tài tin hành kho sát nhit ñ lai theo dãy nhit ñ: 50; 50.7; 52; 53.9; 56; 58.3; 59.4; 60 0C và thu ñưc kt qu ti hình 3.4 và bng 3.6 T 1 2 3 4 5 6 7 8 T Hình 3.4: Kho sát nhit ñ lai ca h mi
43. 50 Ghi chú: 1: 50 0C; 2: 50.7 0C; 3: 52 0C; 4: 53.9 0C; 5: 56 0C; 6: 58.3 0C; 7: 59.4 0C; 8: 60 0C Bng 3.6: Kho sát nhit ñ lai ca h mi Nhit ñ lai ( 0C) 50 50,7 52 53,9 56 58,3 59,4 60 Kt qu + + + ++ ++++ +++ ++ + Ghi chú: + xut hin vch sau ñin di ++ vch sau ñin di ñm +++ vch sau ñin di rt ñm ++++ vch sau ñin di rt ñm và nét Vch ca gen E6 và E7 xut hin ti tt c các nhit ñ lai ñem kho sát, cưng ñ tín hiu vch ñm dn t 50 0C ti 56 0C và gim dn t 56 0C ti 60 0C. Tuy nhiên, nhit ñ lai trong kho sát ti 56 0C (ging 5) cho tín hiu vch ca gen E6 và E7 ñm và rõ nét nht. Như vy, 56 0C là nhit ñ lai ti ưu ca h mi. 3.2.3. Kho sát nng ñ mi trong phn ng PCR Nng ñ mi trong mi phn ng PCR phi ñưc tính toán ti ưu bng thc nghim. Nu nng ñ mi quá cao s dn ñn hin tưng khuch ñi ký sinh, ngưc li hiu qu khuch ñi ca phn ng không cao. Ngoài ra, trong phn ng PCR thưng xy ra vic các cp mi cnh tranh nhau nên hiu qu phn ng PCR trên mi cp mi s không cao; do ñó, vic ti ưu nng ñ mi mi trong phn ng PCR là cn thit. Đ tài tin hành kho sát nng ñ ca mi cp mi t 100nM ti 500nM và thu ñưc kt qu qua hình 3.5 Hình 3.5: Kho sát nng ñ h mi trong phn ng
44. 51 Ghi chú: Hình 3.5 B: T : thang DNA 100bp; 11 : 300nM mi E6fE6r, 100nM mi E7fE7r; 12 : 300nM mi E6fE6r, 200nM mi E7fE7r; 13 : 300nM mi E6fE6r, 300nM mi E7fE7r; 14 : 300nM mi E6fE6r, 400nM mi E7fE7r; 15 : 300nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r; 16 : 400nM mi E6fE6r, 100nM mi E7fE7r; 17 : 400nM mi E6fE6r, 200nM mi E7fE7r; 18 : 400nM mi E6fE6r, 300nM mi E7fE7r; 19 : 400nM mi E6fE6r, 400nM mi E7fE7r; 20 : 400nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r. Hình 3.5F: T: thang DNA 100bp; 41 : 500nM mi E6fE6r, 400nM mi E7fE7r; 42 : 400nM mi E6fE6r, 400nM mi E7fE7r; 43 : 300nM mi E6fE6r, 400nM mi E7f E7r; 44 : 200nM mi E6fE6r, 400nM mi E7fE7r; 45 : 100nM mi E6fE6r, 400nM mi E7fE7r; 46 : 500nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r; 47 : 400nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r; 48 : 300nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r; 49 : 200nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r; 50 : 100nM mi E6fE6r, 500nM mi E7fE7r. Bng 3.7: Kho sát nng ñ h mi trong phn ng Mi Mi E6f – E6r Mi E7f E7r Kt qu T l mi (nM) (nM) Gen E6 Gen E7 1:1 100 + 1:2 200 + + 1:3 100 300 + + 1:4 400 + + 1:5 500 + + 2:1 100 + 2:2 200 + + 200 2:3 300 + + 2:4 400 + +
45. 52 2:5 500 + + 3:1 100 + 3:2 200 + + 3:3 300 300 + + 3:4 400 + + 3:5 500 + + 4:1 100 + 4:2 200 + + 4:3 400 300 + + 4:4 400 + + 4:5 500 ++ ++ 5:1 100 + 5:2 200 + + 5:3 500 300 + + 5:4 400 + + 5:5 500 + + 1:1 100 + 2:1 200 + 3:1 300 100 + 4:1 400 + 5:1 500 + 1:2 100 + + 2:2 200 + + 3:2 300 200 + + 4:2 400 + + 5:2 500 + +
46. 53 1:3 100 + + 2:3 200 + + 3:3 300 300 + + 4:3 400 + + 5:3 500 + + 1:4 100 + + 2:4 200 + + 3:4 300 400 + + 4:4 400 + + 5:4 500 + + 1:5 100 + + 2:5 200 500 + + 3:5 300 + + 4:5 400 ++ ++ 5:5 500 + + Ghi chú: + xut hin vch sau ñin di không xut hin vch sau ñin di ++ vch sau ñin di rt ñm và rõ nét Hình 3.5 và bng 3.7 cho thy: kt qu ñin di ñu xut hin vch ca gen E6 ñúng như thit k ti tt c các nng ñ ca cp mi E6fE6r ñem kho sát, cưng ñ tín hiu vch sau ñin di ñm dn theo di tăng nng ñ ca cp mi E6fE6r. Ngưc li, nng ñ ca cp mi E7fE7r ti 100nM trong kho sát không cho tín hiu vch ca gen E7. Điu này có th là do nng ñ mi quá thp chưa ñ khuch ñi gen E7 to ra s lưng ln bn hoc có s cnh tranh gia cp mi E6 vi cp mi E7fE7r hoc do s c ch gia các mi vi nhau. Tuy nhiên, nng ñ ca cp mi E7fE7r t 200nM tr lên trong mi phn ng ñem kho sát ñu cho tín hiu
47. 54 vch ca gen E7 ñúng như mong mun. Tín hiu vch ca gen E7 ñm dn t 200 ti 400nM và m hơn ti nng ñ 500nM. V ñánh giá chung hiu qu khuch ñi ca 2 cp mi trong mt phn ng ñã cho thy, ti nng ñ 400nM ca cp mi E6fE6r và 500nM ca cp mi E7fE7r (ging 20 ca hình 3.5B và ging 47 ca hình 3.5F) ñu cho tín hiu vch khuch ñi ca gen E6 và E7 ñm, rõ nét nht. Do vy, ñ tài la chn nng ñ cp mi E6fE6r ti 400nM và cp mi E7f E7r ti 500nM là nng ñ ti ưu ca h mi trong phn ng. 3.2.4. Kho sát nng ñ Mg 2+ Nng ñ Mg 2+ nh hưng ñn nhit ñ bin tính DNA khuôn mu, quá trình ca mi, tính ñc hiu ca sn phm PCR, hot tính ca Taq DNA polymerase và ñ chính xác ca kt qu. Nng ñ Mg 2+ quá cao s làm cho DNA si ñôi n ñnh hơn. Mt khác, nó còn làm gia tăng hin tưng bt cp gi dn ñn sut hin sn phm PCR không ñc hiu vi s lưng khá ln. Nu nng ñ Mg 2+ quá thp s nh hưng xu ñn quá trình tng hp DNA. Do vy, cn phi ti ưu nng ñ Mg 2+ trong mi phn ng nhm ñm bo hiu sut khuch ñi và tính ñc hiu ca sn phm PCR. Nng ñ Mg2+ trong thí nghim ñưc kho sát ti các nng ñ: 1.0; 1.5; 2.0; 2.5; 3.0; 3.5; 4.0; 4.5 và 5.0 mM và thu ñưc kt qu qua hình 3.6. T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 T Hình 3.6: Kho sát nng ñ Mg 2+
48. 55 Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nng ñ Mg 2+ ti 1.0mM; 2: nng ñ Mg 2+ ti 1.5mM; 3: nng ñ Mg 2+ ti 2.0mM; 4: nng ñ Mg 2+ ti 2.5mM; 5: nng ñ Mg 2+ ti 3.0mM; 6: nng ñ Mg 2+ ti 3.5mM; 7: nng ñ Mg 2+ ti 4.0mM; 8: nng ñ Mg 2+ ti 4.5mM; 9: nng ñ Mg 2+ ti 5.0 mM Kt qa ñin di ti hình 3.6 cho thy tt c các phn ng PCR ñu cho sn phm khuch ñi. Tuy nhiên, sn phm khuch ñi rõ và nét nht khi thc hin vi nng ñ Mg 2+ ti 3 mM (ging 5). Như vy, 3 mM là nng ñ Mg 2+ ti ưu cho phn ng PCR. 3.2.5. Kho sát nng ñ dNTP Trong mi phn ng luôn s dng nng ñ 4 loi dNTP bng nhau, nu hn hp dNTP không cân bng s làm gim ñ chính xác ca Taq DNA polymerase. Trong thí nghim, nng ñ 4 loi dNTP tng cng trong mi phn ng ñưc kho sát theo dãy sau: 120; 160; 200; 240 và 280M và thu ñưc kt qu: 1 2 3 4 5 T Hình 3.7: Kho sát nng ñ dNTP Ghi chú: T: thang 100bp; 1: nng ñ 120M; 2: nng ñ 160M; 3: nng ñ 200M; 4 : nng ñ 240M; 5: nng ñ 280M Kt qu kho sát nng ñ dNTP ti hình 3.7 cho thy tt c các nng ñ dNTP trong kho sát ñu xut hin vch như mong mun, trong ñó tín hiu vch ñm dn theo nng ñ dNTP t 120 ti 280 M. Ti nng ñ 120 M ca dNTP
49. 56 ñem kho sát xut hin vch rt m; tín hiu vch ñm và rõ nét nht th hin ti nng ñ 280 M (ging s 5). Tuy nhiên, nhm tit kim dNTP, ñ tài la chn nng ñ dNTP ti ưu ca phn ng PCR ti 200 M. 3.2.6. Kho sát ñ nhy ca quy trình Đ nhy là mt yu t quyt ñnh giá tr ca phương pháp chn ñoán. Đ nhy cho bit lưng bn sao nh nht mà mt phương pháp có th cho kt qu dương tính. T mu chng dương ñã bit trưc mt ñ là 10 6 bn sao mRNA E6 và E7/ml. Mu ñưc tách chit và pha loãng bc 10 liên tip to thành các mt ñ: 10 6; 10 5; 10 4; 10 3; 10 2; 10 1 bn sao mRNA E6 và E7/ml; sau ñó, thc hin phn ng multiplex RTPCR. Hình 3.8 và Bng 3.7 trình bày kt qu kho sát ñ nhy ca quy trình. Hình 3.8: Kho sát ñ nhy ca quy trình Ghi chú: T: thang 100bp; 1: 10 1; 2: 10 2; 3: 10 3; 4: 10 4; 5: 10 5 và 6: 10 6 bn sao mRNA E6 và E7/ml Bng 3.8: Kho sát ñ nhy ca quy trình Mt ñ chng dương (bn 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 10 1 sao mRNA E6 và E7/ml) Kt qu + + + +
50. 57 Qua hình 3.8 và bng 3.8 cho thy vch mc tiêu ca gen E6 và E7 xut hin t mt ñ 10 3 ti 10 6 bn sao mRNA E6 và E7/ml và cưng ñ tín hiu vch ñm dn theo mt ñ tăng dn ca mu chng. Ti mt ñ 10 1 và 10 2 bn sao mRNA E6 và E7/ml không cho tín hiu vch. Như vy, gii hn phát hin hay ñ nhy ca quy trình là 10 3 bn sao mRNA E6 và E7/ml. 3.2.7. Kho sát ñ ñc hiu ca quy trình Nhm kho sát ñ ñc hiu ca quy trình, ñ tài thc hin phn ng multiplex RTPCR vi các ñi tưng có th có mt trong dch pht c t cung như: DNA ca ngưi không b ung thư c t cung (ñưc cung cp t Khoa Ung bưu, Bnh vin ña khoa Cn Thơ), HPV type 18, HPV type 11, HPV type 6, HPV type 33, HPV type 45, E.coli , Chlamydia trachomatis , Neisseria gonorrhoeae (ñưc cung cp t Công ty c phn công ngh Vit Á, Tp. H Chí Minh). Hình 3.9: Kho sát ñ ñc hiu ca quy trình Ghi chú: CD: chng dương; T: thang DNA 100bp; N: chng âm; A: DNA ca ngưi không b ung thư c t cung; B: HPV type 18, C: HPV type 11; D: HPV type 6; E: HPV type 33; F: HPV type 45; G: E.coli; H: Chlamydia trachomatis ; K: Neisseria gonorrhoeae . Kt qu th hin qua hình 3.9 cho thy chng ni luôn xut hin vch 400 bp, chng âm âm tính và quy trình ch cho tín hiu vch ca gen E6, E7 ca chng
51. 58 dương tc t mu ca ngưi b ung thư c t cung do HPV type 16 gây ra và âm tính vi các ñi tưng còn li trong kho sát. Do vy, bng thc nghim, quy trình nghiên cu là ñc hiu cho phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. 3.2.8. Quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR Sau khi hoàn thành kho sát các yu t ca quy trình phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR, quy trình ñưc tóm tt qua sơ ñ ti bng 3.8 Bng 3.9: Sơ ñ quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR Mu bnh phm bo qun trong dung dch TE 1X ti 20 0C Tách chit mu theo phương pháp ta trong phenol/chlorofom Giai ñon tách chit mu (kho ng 2h 30’) X lý dch tách chit vi 2U/phn ng enzym Dnase I, Rnase free
52. 59 Thc hin phn ng RT Thành phn 1 phn ng 20l: 12.5l dch tách chit RNA, 1l enzym RT, 6.5 l RT buffer Chương trình luân nhit: 25 0C – 10 phút, 42 0C 30 phút, 85 0C – 5 phút, gi 40C Giai ñon Thc hin phn ng Multiplex PCR thc hin Trình t mi phm ng Ký hiu mi Trình t mi 5’ – 3’ multiplex E6f CACAGAGCTGCAAACAACTATACA RTPCR E6r GACACAGTGGCTTTTGACAGT (khong 2h E7f AGCTCAGAGGAGGAGGATGA 30’) E7r GCACACAATTCCTAGTGTGC Thành phn 1 phn ng 25l: 2.5l 10X buffer; 0.625 u Taq DNA polymerase; 3.0 mM MgCl 2 ; 200M dNTP; Mi E6fE6r: mi mi 400nM; Mi E7fE7r: mi mi 500nM; 1l chng ni mt ñ 10 4 bn sao/ml; 2.5l dch cDNA và thêm nưc ct hai ln cho ñ 25l Chương trình luân nhit: 95 0C 5 phút 1 chu kỳ 95 0C 30 giây 56 0C 30 giây 39 chu kỳ 72 0C 30 giây 0 72 C 6 phút 1 chu kỳ Đin di Gm 7l sn phm PCR hoc chng dương hoc chng âm, vi 3l dch np mu Giai ñon Đin di trên gel agarose 2%, ñin th 50V trong 5 phút. Sau ñó 80V trong ñin di và 30 phút. Nhum gel trong dung dch TAE 1X có ethidium bromide trong 15 ñc kt phút qu Đc kt qu (khong Chng ni luôn xut hin vch có kích thưc 400bp, chng dương dương tính, 1h) chng âm âm tính thì phn ng din ra bình thưng. Xut hin vch 287bp và 183bp kt lun có gn chèn gene E6 và E7 ca HPV type 16 b gene ngưi, ngưc li không có gn chèn gene.
53. 60 Thi gian cho toàn b quy trình (t tách chit mu ti ñc kt qu): 6 – 7 gi. 3.3. Bưc ñu ng dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi bng k thut multiplex RTPCR trên các mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut 86 mu dch pht c t cung ñưc thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut – Đăk Lăk t tháng 4 ti tháng 6 năm 2011, mu ñưc tách chit và thc hin phn ng multiplex RTPCR. Trong mi phn ng luôn kèm theo chng dương, chng âm, chng ni và kt qu ñưc trình bày qua hình 3.10 và bng 3.9 T () (+) H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 (+) T () H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H21 H22 T H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 (+) () T
54. 61 H34 H35 H36 H37 H38 T () (+) H39 H40 H41 H42 H43 T (+) () H44 H45 Đ46 Đ47 H48 H49 H50 H51 H52 H53 T H54 H55 H56 (+) () T H57 D58 H59 H60 H61 H62 H63 H64 H65 T () (+) H66 H67 H68 C69 C70 D71 D72 D73 D74 M75 M76 T M77 M78 M79 (+) ( ) T M80 M81 M82 M83 M84 D85 D86 Hình 3.10: Kt qu bưc ñu ng dng quy trình phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi trên các mu bnh phm thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut
55. 62 Ghi chú: T: thang DNA 100bp; (): chng âm; (+) : chng dương; H: ging ng vi mu thu ti Bnh vin ña khoa Thiên Hnh; Đ: ging ng vi mu thu ti phòng khám ña khoa Hng Đc; C: ging ng vi mu thu ti phòng khám ña khoa s 46 Phan Chu Trinh; D: ging ng vi mu thu ti phòng khám ña khoa Nguyn Dũng; M: ging ng vi mu thu ti phòng khám s 120 H Tùng Mu Bng 3.10: Kt qu bưc ñu ng dng quy trình phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi trên các mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut Ký Kt Ký hiu Kt Ký hiu Kt STT hiu STT STT qu mu qu mu qu mu 1 H01 30 H30 59 H59 2 H02 31 H31 60 H60 3 H03 32 H32 61 H61 4 H04 33 H33 62 H62 5 H05 34 H34 63 H63 6 H06 35 H35 64 H64 7 H07 36 H36 65 H65 8 H08 37 H37 66 H66 9 H09 38 H38 67 H67 10 H10 39 H39 68 C68 11 H11 40 H40 69 C69 12 H12 41 H41 70 D70 13 H13 42 H42 71 D71 14 H14 43 H43 72 D72 15 H15 44 H44 73 D73 16 H16 45 Đ45 74 M74 17 H17 46 Đ46 75 M75 18 H18 47 H47 76 M76 19 H19 48 H48 77 M77 20 H20 49 H49 78 M78 21 H21 50 H50 79 M79 22 H22 51 H51 80 M80 + 23 H23 52 H52 81 M81
56. 63 24 H24 53 H53 82 M82 25 H25 54 H54 83 M83 26 H26 55 H55 84 M84 27 H27 56 H56 85 D85 28 H28 57 D57 86 D86 29 H29 58 H58 Ghi chú: (– ) không phát hin có gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. (+) có phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. Thông qua kt qu ñưc th hin ti hình 3.10 và bng 3.10 cho thy: chng ni luôn xut hin vch trong mi phn ng sau ñin di chng t không có hin tưng c ch phn ng, chng dương xut hin 2 vch ng vi 2 gen khuch ñi E6 và E7 chng t mi hot ñng bình thưng, chng âm không xut hin vch chng t không có hin tưng nhim chéo gia các phn ng. Như vy, phn ng multiplex RTPCR din ra bình thưng, không có hin tưng c ch phn ng. Ti hình 3.10 và bng 3.10 cũng cho thy quy trình nghiên cu ñã phát hin 1/86 mu dch pht c t cung (mu M80) thu thp ti Buôn Ma Thut có s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. Sn phm khuch ñi gen E6 và E7 ca mu M80 dương tính ñưc gi gii trình t ti Công ty Macrogen (Hàn Quc) vi ký hiu E6_E6F và E67_E7F. Kt qu gii trình t sn phm khuch ñi E6_E6F và E67_E7F (ph lc 8.1) và kim tra bng phn mm ClustalX 1.81 (ph lc 8.2) cho thy: trình t nucleotide gii ñưc ca sn phm khuch ñi E6_E6F (ca mu M80) nm trong vùng thit k khuch ñi sn phm và thuc gen E6 (v trí t nucleotide 116 ti 402) và trình t nucleotide gii ñưc ca sn phm khuch ñi E7_E7F (ca mu M80) nm trong vùng thit k khuch ñi sn phm thuc gen E7 (v trí t nucleotide 91 ti 273) ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi.
57. 64 Đánh giá mc ñ tương ñng ca sn phm khuch ñi t mu M80 vi các trình t gen ñưc công b trên ngân hàng gen (Genebank) thông qua phn mm BLAST trên NCBI, sn phm khuch ñi t mu M80 ch tương ñng vi các trình t gen E6 và E7 ca HPV type 16 vi mc ñ tương ñng 97% ñi vi sn phm khuch ñi ca gen E6 và 99% ñi vi sn phm khuch ñi ca gen E7 (ph lc 8.3) . Như vy, sn phm khuch ñi là ca gen E6 và E7 ca HPV type 16 gn chèn vào b gen ngưi.
58. P 1 PH LC Ph lc 1 Kt qu kim tra tính ñc hiu ca h mi v mt lý thuyt 1. Tính ñc hiu ca mi E6f
59. P 2 2. Tính ñc hiu ca mi E6r
60. P 3 3. Tính ñc hiu ca mi E7f
61. P 4 4. Tính ñc hiu ca mi E7r
62. P 5 Ph lc 2 Kt qu kho sát nng ñ h mi E6fE6r : E7fE7r trong phn ng Ghi chú: Hình A: ging T: thang DNA 100bp; ging 15: nng ñ cp mi E6f E6r ti 100nM: cp E7fE7r tăng t 100 – 500nM; ging 610: nng ñ cp mi E6fE6r ti 200nM: cp E7fE7r tăng t 100 – 500nM
63. P 6 Hình B: T: thang DNA 100bp; 1115: nng ñ cp mi E6fE6r ti 300nM: cp E7fE7r tăng t 100 – 500nM; 1620: nng ñ cp mi E6fE6r ti 400nM: cp E7fE7r tăng t 100 – 500nM Hình C: 2125: nng ñ cp mi E6fE6r ti 500nM: cp E7fE7r tăng t 100 – 500nM Hình D: T: thang DNA 100bp; 2630: nng ñ cp mi E6fE6r tăng t 100 – 500nM: cp E7fE7r ti 100nM Hình E: T: thang DNA 100bp; 3135: nng ñ cp mi E6fE6r tăng t 100 – 500nM: cp E7fE7r ti 200nM; 3640: nng ñ cp mi E6fE6r tăng t 100 – 500nM: cp E7fE7r ti 300nM Hình F: T: thang DNA 100bp; 4145: nng ñ cp mi E6fE6r tăng t 100 – 500nM: cp E7fE7r ti 400nM; 4650: nng ñ cp mi E6fE6r tăng t 100 – 500nM: cp E7fE7r ti 500nM
64. P 7 Ph lc 3 Kt qu gii trình t sn phm khuch ñi t chng dương CD1 1. Kt qu gii trình t mch xuôi ca mu E6_E6 2. Kt qu gii trình t mch ngưc ca mu E6_E6
65. P 8 3. Kt qu gii trình t mch xuôi ca mu E7_E7 4. Kt qu gii trình t mch ngưc ca mu E7_E7
66. P 9 Ph lc 4 Kim chng kt qu gii trình t vi mt s trình t gen trong nghiên cu bng phn mm ClustalX 1.81 1. Kim chng kt qu gii trình t mch xuôi ca mu E6_E6 vi mt s trình t gen E6 ca HPV type 16 trong nghiên cu 2. Kim chng kt qu gii trình t mch ngưc ca mu E6_E6 vi mt s trình t gen E6 ca HPV type 16 trong nghiên cu
67. P10 3. Kim chng kt qu gii trình t mch xuôi ca mu E7_E7 vi mt s trình t gen E7 ca HPV type 16 trong nghiên cu 4. Kim chng kt qu gii trình t mch ngưc ca mu E7_E7 vi mt s trình t gen E7 ca HPV type 16 trong nghiên cu Ghi chú: du (*) biu th mc ñ tương ñng
68. P11 Ph lc 5 Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen tương ñng vi sn phm gii trình t 1. Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen công b trên Genebank tương ñng vi sn phm gii trình t ca mch xuôi mu E6_E6
69. P12 2. Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen công b trên Genebank tương ñng vi sn phm gii trình t ca mch ngưc mu E6_E6
70. P13 3. Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen công b trên Genebank tương ñng vi sn phm gii trình t ca mch xuôi mu E7_E7
71. P14 4. Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen công b trên Genebank tương ñng vi sn phm gii trình t ca mch ngưc mu E7_E7
72. P 15 Ph lc 6 Thông tin mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut Thi gian Đa ñim thu Ký hiu STT H tên bnh nhân Tui Nơi cư trú thu mu mu mu 1 H01 Tr n Th Thu Ba 29 EaSup Đăk Lăk 2 H02 Vi Th Quỳnh 27 EaSup Đăk Lăk 3 H03 Hu ỳnh th Hu 33 Krông Năng Đăk Lăk 4 H04 Ng c Th Nguyt 34 Krông Bông Đăk Lăk 24/04/2011 5 H05 Nguy n Th Yn 49 Ea H’leo Đăk Lăk 6 H06 Nguy n Th Huyn 40 Krông Ana Đăk Lăk 7 H07 Nguy n Th Bình 35 Cu Kuin Đăk Lăk 8 H08 Tr nh Th Huyn 35 Ea H’leo Đăk Lăk BVĐK Thin 9 H09 Ph m Th Nhài 34 Lăk Đăk Lăk Hnh 10 H10 Nguy n Th Thun 40 Krông Bông Đăk Lăk 11 H11 Tr n Th Hòa 26 Ea Kar Đăk Lăk 12 H12 Tr n Th Hnh 28 Cu Jut Đăk Nông 13 H13 Lò Th Phưng 27 Krông Nô Đăk Nông 30/04/2011 14 H14 Lăng Th Hu 29 Buôn Đôn Đăk Lăk 15 H15 Kim Th Lương 40 Đăk Mil Đăk Nông 16 H16 Nguy n Th Tính 44 Ea Sup Đăk Lăk 17 H17 Nguy n Th Thanh 36 Ea Kar Đăk Lăk 18 H18 H Th Mai 41 Krông Păk Đăk Lăk 19 H19 Hà Th Kiu 38 Cư M’gar Đăk Lăk 20 H20 Đàm Th Đào 33 Cư Jut Đăk Nông 21 H21 Ph m Th Thúy 26 Krông Nô Đăk Nông BVĐK Thin 22 H22 Phan Th Hin 53 Krôn g Buk Đăk Lăk 1/05/2011 Hnh 23 H23 Nguy n Th Bình 48 Ea Kar Đăk Lăk 24 H24 Vũ Th Mai 40 Krông Buk Đăk Lăk 25 H25 HNiva Nie 27 Krông Ana Đăk Lăk 26 H26 Đ Th Hu 28 Krông Bông Đăk Lăk
73. P 16 27 H27 Nguy n Th Lâm 47 Cư Kuin Đăk Lăk 28 H28 Lê Th Thúy An 26 Đăk Glong Đăk Nông 29 H29 Nguy n Th Ánh Tuyt 54 Ea H’leo Đăk Lăk 30 H30 Tr n Th Lc 41 Tp. Buôn Ma Thu t Đăk Lăk BVĐK Thin 31 H31 Ngô Th Thúy Liu 55 Ea Kar Đăk Lăk 8/05/2011 Hnh 32 H32 Tr n Th ngc Tuyt 33 Cư M’gar Đăk Lăk 33 H33 Nguy n Th Thit 27 Tp. Buôn Ma Thu t Đăk Lăk 34 H34 Hu ỳnh Th Ngc Hương 36 Tp. Buôn Ma Thu t Đăk Lăk 35 H35 Vũ Th Cm 39 Krông Buk Đăk Lăk 36 H36 Lê Th Ngôn 48 Tp. Buôn Ma Thu t Đăk Lăk 37 H37 Nguy n Ngc Kim Chi 37 Krông Ana Đăk Lăk 38 H38 Phan Th Thơm 30 Cư Kuin Đăk Lăk BVĐK Thin 39 H39 Tri u Th Thanh 26 Cư Jut Đăk Nông 14/05/2011 Hnh 40 H40 Tr n Th Mn 40 Tp. Buôn Ma Thu t Đăk Lăk 41 H41 Nguy n Vit Hi 26 Cư Kuin Đăk Lăk 42 H42 HGen 31 Cư M’gar Đăk Lăk 43 H43 Nguy n Th Thân 43 Krông Năng Đăk Lăk 44 H44 Trương Th Hin 26 Ea Sup Đăk Lăk 45 Đ45 Thúy Ki u 31 Krông Năng Đăk Lăk 22/05/2011 PK Hng Đc 46 Đ46 Lê Th Thu Thy 53 Đăk Mil Đăk Nông 47 H47 Lê Th M Ngc 27 TX. Buôn H Đăk Lăk 48 H48 Nguy n Th Hoa 52 Krông Năng Đăk Lăk 49 H49 Cao Th M Yn 41 Krông Năng Đăk Lăk 50 H50 Phan Th Hu 35 Krông Buk Đăk Lăk BVĐK Thin 51 H51 Nguy n Th Tuyt Mai 26 TX. Buôn H Đăk Lăk 28/05/2011 Hnh 52 H52 Nguy n Th Hng 26 Cư Kuin Đăk Lăk 53 H53 Bùi Th Hnh 46 Tp. Buôn Ma Thut Đăk Lăk 54 H54 Doãn Th Hu 27 Krông Nô Đăk Nông 55 H55 H Nuôn Kbuôr 51 TX. Buôn H Đăk Lăk 56 H56 Nguy n Th Thit 26 Buôn Đôn Đăk Lăk 28/05/2011 PKĐK Nguyn 57 D57 Nguyn Th Minh Nguyt 29 TP. Buôn Ma Thut Đăk Lăk
74. P 17 Dũng 58 H58 Phan Th Hoa Lài 26 Cư Jut Đăk Nông 59 H59 Nguy n Th Anh 38 Ea Kar Đăk Lăk 60 H60 Dương Th Lc 47 Krông Nô Đăk Lăk 61 H61 Añrơng H Luy n 26 Ea H’leo Đăk Lăk BVĐK Thin 62 H62 Đào Th Thanh Hà 49 Ea Kar Đăk Lăk 29/05/2011 Hnh 63 H63 Tr n Th Tâm 29 Đăk Mil Đăk Nông 64 H64 Nguy n Th Hiu 39 Krông Năng Đăk Lăk 65 H65 Tr n Th Thy 26 Ea Kar Đăk Lăk 66 H66 Lưu Th Tho Quyên 35 Tp. Buôn Ma Thut Đăk Lăk 67 H67 Nguy n Th Thanh Hưng 41 Cư Kuin Đăk Lăk PK 46 Phan 68 C68 Nguy n Th Liên 35 Lăk Đăk Lăk 5/06/2011 Chu Trinh 69 C69 Lê Th Thùy Hương 38 Tp . Buôn Ma Thut Đăk Lăk PKĐK Nguyn 70 D70 Nguy n Th Loan 36 Tp. Buôn Ma Thut Đăk Lăk 5/06/2011 Dũng 71 D71 Hu ỳnh Tú Anh 32 Tp . Buôn Ma Thut Đăk Lăk PKĐK Nguyn 72 D72 Hu ỳnh Th Nga 45 Cư M’gar Đăk Lăk 25/06/2011 Dũng 73 D73 Nguy n Th Anh Thi 29 Tp . Buôn Ma Thut Đăk Lăk 74 M74 Tr n Th Sương 26 Tp . Buôn Ma Thut Đăk Lăk 75 M75 Lê Th Hai 31 Tp . Buôn Ma Thut Đăk Lăk 76 M76 Ph m Th Trang 43 Krông Ana Đăk Lăk 77 M77 Lê Hoàng Vy 41 Krông Nô Đăk Nông 78 M78 Bo Phương 31 Đăk Mil Đăk Nông PK 120 H 25/6/2011 79 M79 Tr n Th Hoa 37 Krông Nô Đăk Nông Tng Mu 80 M80 H’Ming 52 Tp. Buôn Ma Thut Đăk Lăk 81 M81 Ph m Th Hc 35 Krông Ana Đăk Lăk 82 M82 Nã Thanh Huy n 35 Krông Păk Đăk Lăk 83 M83 Nguy n Th Thương 53 Krông Ana Đăk Lăk 84 M84 Khu t Th Hoàng 33 Kr ông Păk Đăk Lăk PKĐK Nguyn 85 D85 Nguy n Th Nhung 29 Cư Jut Đăk Nông 26/6/2011 Dũng 86 D86 Nguy n Th M Dung 29 Tp . Buôn Ma Thut Đăk Lăk
75. P 18 Ph lc 7 Kt qu phát hin gn chèn gene E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gene ngưi trên các mu dch pht c t cung thu thp ti Tp. Buôn Ma Thut bng k thut multiplex RTPCR Ký Thi gian Đa ñim STT hiu H tên bnh nhân Tui Kt qu thu mu thu mu mu 1 H01 Trn Th Thu Ba 29 2 H02 Vi Th Quỳnh 27 3 H03 Huỳnh th Hu 33 4 H04 Ngc Th Nguyt 34 24/04/2011 5 H05 Nguyn Th Yn 49 6 H06 Nguyn Th Huyn 40 7 H07 Nguyn Th Bình 35 8 H08 Trnh Th Huyn 35 BVĐK 9 H09 Phm Th Nhài 34 Thin 10 H10 Nguyn Th Thun 40 Hnh 11 H11 Trn Th Hòa 26 12 H12 Trn Th Hnh 28 13 H13 Lò Th Phưng 27 30/04/2011 14 H14 Lăng Th Hu 29 15 H15 Kim Th Lương 40 16 H16 Nguyn Th Tính 44 17 H17 Nguyn Th Thanh 36 18 H18 H Th Mai 41 19 H19 Hà Th Kiu 38 20 H20 Đàm Th Đào 33 21 H21 Phm Th Thúy 26 22 H22 Phan Th Hin 53 BVĐK 23 H23 Nguyn Th Bình 48 1/05/2011 Thin 24 H24 Vũ Th Mai 40 Hnh 25 H25 HNiva Nie 27 26 H26 Đ Th Hu 28 27 H27 Nguyn Th Lâm 47 28 H28 Lê Th Thúy An 26 8/05/2011 BVĐK 29 H29 Nguyn Th Ánh Tuyt 54
76. P 19 Thin 30 H30 Trn Th Lc 41 Hnh 31 H31 Ngô Th Thúy Liu 55 32 H32 Trn Th ngc Tuyt 33 33 H33 Nguyn Th Thit 27 34 H34 Huỳnh Th Ngc Hương 36 35 H35 Vũ Th Cm 39 36 H36 Lê Th Ngôn 48 37 H37 Nguyn Ngc Kim Chi 37 38 H38 Phan Th Thơm 30 BVĐK 39 H39 Triu Th Thanh 26 14/05/2011 Thin 40 H40 Trn Th Mn 40 Hnh 41 H41 Nguyn Vit Hi 26 42 H42 HGen 31 43 H43 Nguyn Th Thân 43 44 H44 Trương Th Hin 26 PK Hng 45 Đ45 Thúy Kiu 31 22/05/2011 Đc 46 Đ46 Lê Th Thu Thy 53 47 H47 Lê Th M Ngc 27 48 H48 Nguyn Th Hoa 52 49 H49 Cao Th M Yn 41 50 H50 Phan Th Hu 35 BVĐK 51 H51 Nguyn Th Tuyt Mai 26 28/05/2011 Thin 52 H52 Nguyn Th Hng 26 Hnh 53 H53 Bùi Th Hnh 46 54 H54 Doãn Th Hu 27 55 H55 H Nuôn Kbuôr 51 56 H56 Nguyn Th Thit 26 PKĐK 28/05/2011 Nguyn 57 D57 Nguyn Th Minh Nguyt 29 Dũng 58 H58 Phan Th Hoa Lài 26 59 H59 Nguyn Th Anh 38 60 H60 Dương Th Lc 47 BVĐK 61 H61 Añrơng H Luyn 26 29/05/2011 Thin 62 H62 Đào Th Thanh Hà 49 Hnh 63 H63 Trn Th Tâm 29 64 H64 Nguyn Th Hiu 39 65 H65 Trn Th Thy 26
77. P 20 66 H66 Lưu Th Tho Quyên 35 67 H67 Nguyn Th Thanh Hưng 41 PK 46 Phan 68 C68 Nguyn Th Liên 35 5/06/2011 Chu Trinh 69 C69 Lê Th Thùy Hương 38 PKĐK 70 D70 Nguyn Th Loan 36 5/06/2011 Nguyn 71 D71 Huỳnh Tú Anh 32 Dũng PKĐK 72 D72 Huỳnh Th Nga 45 25/06/2011 Nguyn 73 D73 Nguyn Th Anh Thi 29 Dũng 74 M74 Trn Th Sương 26 75 M75 Lê Th Hai 31 76 M76 Phm Th Trang 43 77 M77 Lê Hoàng Vy 41 78 M78 Bo Phương 31 PK 120 H 25/6/2011 79 M79 Trn Th Hoa 37 Tng Mu 80 M80 H’Ming 52 + 81 M81 Phm Th Hc 35 82 M82 Nã Thanh Huyn 35 83 M83 Nguyn Th Thương 53 84 M84 Khut Th Hoàng 33 PKĐK 85 D85 Nguyn Th Nhung 29 26/6/2011 Nguyn 86 D86 Nguyn Th M Dung 29 Dũng Ghi chú: “” không phát hin có gn chèn gen; “+” phát hin có gn chèn gen
78. P 21 Ph lc 8 Kt qu gii và kim chng trình t t mu dch pht c t cung thu thp phát hin có gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 8.1 Kt qu gii trình t sn phm khuch ñi t mu dch pht c t cung thu thp phát hin gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi 8.1.1 Kt qu gii trình t gen ca mu E6_E6F Kích thưc Trình t nucleotide (5’ – 3’) (bp) NNNNNNNATTTANATGTGTGTACTGCANGCAACAGTTACTG CGACGTGAGCATATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCAT AGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCAGTGTGTGATAAAT 242 GTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGATATTATT GTTATAGTGTGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACAAC AAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTA 8.1.2 Kt qu gii trình t gen ca mu E7_E7F
79. P 22 Kích thưc Trình t nucleotide (5’ – 3’) (bp) TNNNNNCGTTCCTGCTAGCAGACCGGACAGAGCCCATTA CAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTT 138 CGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACT TTGGAAGACCTGTTAATGG 8.2 Kim chng kt qu gii trình t t mu thu thp phát hin gn chèn gen vi mt s trình t gen trong nghiên cu bng phn mm ClustalX 8.2.1 Km chng kt qu gii trình t gen ca mu E6_E6F vi mt s trình t gen E6 ca HPV type 16 trong nghiên cu
80. P 23 8.2.2 Km chng kt qu gii trình t gen ca mu E7_E7F vi mt s trình t gen E7 ca HPV type 16 trong nghiên cu Ghi chú: du (*) biu th mc ñ tương ñng 8.3 Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen tương ñng vi sn phm gii trình t 8.3.1 Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen công b trên Genebank tương ñng vi sn phm gii trình t gen ca mu E6_E6F
81. P 25 8.3.2 Kt qu BLAST tìm kim các trình t gen công b trên Genebank tương ñng vi sn phm gii trình t gene ca mu E7_E7F
82. P 26 Buôn Ma Thut, ngày tháng năm 2012 CÁN B HƯNG DN LUN VĂN HC VIÊN THC HIN TS. Võ Th Phương Khanh Trn Minh Đnh CH TCH HI ĐNG CHM LUN VĂN PGS.TS. Nguyn Xuân Thao
83. TÀI LIU THAM KHO I. Tài liu ting Vit 1. Phm Hng Anh và Cs (2002), Tình hình bnh ung thư Hà Ni giai ñon 1969 – 1999, Hi tho quc gia phòng chng ung thư năm 2002, Tp chí Y hc thc hành, s 431. 2. H Huỳnh Thùy Dương (2002), Sinh hc phân t , NXB Giáo Dc. 3. Nguyn Văn Hưng, Lê Huyn Ái Thúy, Nguyn Hùng Cưng, Phm Văn Thc (2009); Xây dng quy trình Realtime RTPCR xác ñnh mRNA E6 và E7 ca Human papilloma virus (HPV) 16 và 18 ; K yu Hi ngh Công ngh Sinh hc toàn Quc khu vc phía Nam; trang 253 – 258. 4. Vũ Th Nhung (2008), Đc ñim min dch ca HPV , Tp chí Thi s y hc 5. Quyn Đình Thi (2005), Nhng k thut cơ bn trong phân tích DNA , NXB Khoa Hc và K Thut Hà Ni. 6. Khut Hu Thanh (2006), Cơ s di truyn phân t và k thut gene, NXB Khoa Hc và K Thut Hà Ni. 7. Nguyn Duy Thăng và cs (2005), Nghiên cu ghi nhn ung thư qun th ti Tha Thiên Hu giai ñon 20032005 , Tp chí Thông tin Y Dưc, trang 2630 8. Phm Văn Ty, 2005, Virus hc , NXB Giáo Dc II. Tài liu ting Anh 9. Alkami Biosystems. Inc (1999), Alkami Quick Guide for PCR , p. 1921. 10. Andrew Wallace (1996), PCR primer design . 11. Alliance for Cervical Cancer Prevention (ACCP) (2004), The Case for Investing in Cervical Cancer Prevention , Cervical Cancer Prevention Issues in Depth, No. 3. 12. F. X, Bosch, M. M. Manos, N. Munoz, M. Sherman, A. M. Jansen, J. Peto, M. H. Schiffman, V. Moreno, R. Kurman, K. V. Shah, et al (1995); Prevalence of
84. human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective ; J. Natl. Cancer Inst; p. 796–802. 13. FX Bosch, de Sanjose S (2003); Human papillomavirus and cervical cancer burden and assessment of causality ; J Natl Cancer Inst Monogr, p313. 14. SA. Corden, L J. SantCassia, A J Easton, A G Morris (1999), The intergration of HPV18 DNA in cervical carcinoma , Clin pathol: mol Pathol, pp.275281. 15. G. M Clifford, J. S. Smith, M. Plummer, N. Munoz, and S. Franceschi (2003); Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis ; Br. J. Cancer; p. 63–73. 16. CP. Crum, DW. Abbott, BJ. Quade (2003); Cervical cancer screening: from the papanicolaou smear to the vaccine era ; Journal of Clinical Oncology , pp. 224 230. 17. G. Clifford, S. Franceschi, M. Diaz, N. Munoz, LL. Villa (2006); HPV type distribution in women with and without cervical neoplastic diseases ; Vaccine, p. 26–34. 18. Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2007), Genital HPV infection—CDC Fact Sheet , www.cdc.gov/std.HPV/STDFactHPV.htm 19. EM. De Villiers (1997), Papillomavirus and HPV typing ; Clin Dermatol; p. 199–206. 20. Feng WangJohanning, W. Lu Danielle, Yueying Wang, Martin R. Johnson, Gary L. Johanning (2002 ), Quantitation of Human Papillomavirus 16 E6 and E7 DNA and RNA in Residual Material from ThinPrep Papanicolaou Tests Using RealTime Polymerase Chain Reaction Analysis ; Cancer; p. 21992210 21. J. Ferlay, F. Bray, P. Pisani, DM. Parkin (2004); International Agency for Research on Cancer (IARC). GLOBOCAN 2002: Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide . IARCPress; Cancer Base No. 5.
85. 22. S. Franceschi (2005), The International Agency for Research on Cancer (IARC) commitment to cancer prevention: the example of papillomavirus and cervical cancer , Recent Results in Cancer Research, pp.277297. 23. IH. Frazer (2006), HPV vaccines , International Journal of Gynecology & Obstetrics, pp.8188. 24. Gaelle Boulet, Caroline Horvath, Davy Vanden Broeck, Shaira Sahebali, Johannes Bogers (2007); Human papillomavirus: E6 and E7 oncogenes ; The International Journal of Biochemistry & Cell Biology; p. 2006–2011 25. P. Geisler, M.D. Kelley, J. Manahan, M.D. Georgiann Linnemeier, M.D. Greg A. Miller, MD. Hanse Geiler, MD. Molecular biology of cervical cancerprecursors , Division of Gynecologic Oncology, St. Vincent hospitals, Indianapolis, Indiana, pp. 286288. 26. MA. Gold (2006); Current cervical cancer screening guidelines and impact of prophylactic HPV vaccines. New Options in HPV Prevention . www.obgmanage ment.com . 27. J. B. Hudson, M. A. Bedell, D. J. McCance, and L. A. Laiminis (1990); Immortalization and altered differentiation of human keratinocytes in vitro by the E6 and E7 open reading frames of human papillomavirus type 18 ; J. Virol; p. 519–526. 28. DM. Harper, EL. Franco, CM. Wheeler et al (2004); Efcacy of a bivalent L1 viruslike particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randomised controlled trial , Lancet pp.17571765. 29. LW. Huang, SL. Chao, BH. Lee (2008); Integration of human papillomavirus type16 and type18 is a very early event in cervical carcinogenesis ; J Clin Pathol, p. 627631.
86. 30. Irene Kraus, Tor Molden, Ruth Holm, A. Kathrine Lie, Frank Karlsen, Gunnar B. Kristensen, and Hanne Skomedal (2006); Presence of E6 and E7 mRNA from Human Papillomavirus Types 16, 18, 31, 33, and 45 in the Majority of Cervical Carcinomas ; Journal of Clinical Microbiology; p. 13101317. 31. S. Jeon, BL. AllenHoffmann and PF. Lambert (1995); Integration of human papillomavirus type16 and type18 is a very early event in cervical carcinogenesis ; J. Virol; p. 2989–2997. 32. M. Jacob, FF. Broekhuizen, W. Castro, J. Sellors (2005); Experience using cryotherapy for treatment of cervical precancerous lesions in lowresource settings ; International Journal of Gynecology & Obstetrics, pp.1320. 33. L. Koutsky (1997), Epidemiology of genital human papillomavirus infection . American Journal of Medicine, pp.38. 34. R. Klaes, SM. Woerner, R. Ridder, N. Wentzensen, M. Duerst, A. Schneider, B. Lotz, P. Melsheimer, M. von Knebel Doeberitz (1999); Detection of HighRisk Cervical Intraepithelial Neoplasia and Cervical Cancer by Amplification of Transcripts Derived from Integrated Papillomavirus Oncogenes ; Cancer Res. Dec, p. 61326136. 35. LA. Koutsky, DM. Harper (2006); Current fndings from prophylactic HPV vaccine trials ; Vaccine, pp.114121. 36. AT. Lorincz, R. Reid, AB. Jenson, MD. Greenberg, W. Lancaster, RJ. Kurman (1992); Human papillomavirus infection of the cervix: relative risk associations of 15 common anogeneital types ; Obstet Gynecol; p. 328–337. 37. K. Munger, W. C. Phelps, V. Bubb, P. M. Howley, and R. Schlegel (1989); The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocytes ; J. Virol; p. 4417–4421.
87. 38. K. Munger, and P. M. Howley (2002); Human papillomavirus immortalization and transformation functions ; Virus Res; p. 213–228. 39. N. Munoz, F. X. Bosch, S. de Sanjose, R. Herrero, X. Castellsague, K. V. Shah, P. J. Snijders, and C. J. Meijer (2003); Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer ; N. Engl. J. Med; pp. 518– 527. 40. B.J. Morris (2005); Cervical human papillomavirus screening by PCR: Advantage of targeting the E6/E7 region ; Clin Chem Lab Med; pp. 1171 – 1177. 41. AB. Moscicki, M. Schifman, S. Kjaer, LL. Villa (2006); Updating the natural history of HPV and anogenital cancer ; Vaccine, pp4251. 42. HYS. Ngan, CL. Timble (2004); Preinvasive lesions of the cervix ; International Journal of Gynecology and Obstetrics, pp4549. 43. A.G. Ostor (1993); Natural history of cervical intraepithelial neoplasia: a critical review ; Int. J. Gynecol. Pathol, p. 186–192 44. Panu Peitsaro, Bo Johansson, and Stina Syrjänen (2002); Integrated Human Papillomavirus Type 16 Is Frequently Found in Cervical Cancer Precursors as Demonstrated by a Novel Quantitative RealTime PCR Technique ; Journal of Clinical Microbiology; p. 886891. 45. Population Reference Bureau (PRB) and Alliance for Cervical Cancer Prevention (ACCP) (2004); Preventing Cervical Cancer Worldwide , Washington, DC: PRB; Seattle: ACCP. 46. DM. Parkin, F. Bray (2006); The burden of HPVrelated cancers ; Vaccine, p. 11–25. 47. M. Pett and N. Coleman (2007); Integration of highrisk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis ; J Pathol, p. 356–367. 48. Package Insert, Gardasil® (2007); Whitehouse Station , NJ: Merck & Co., Inc.
88. 49. Ralph Raphley (2000); The Nucleic Acid Protocols Handbook ; Humana Press Inc., p. 337 – 340. 50. J. Sellors, K. Lewis, N. Kidula, K. Muhombe, V. Tsu, C. Herdman (2003); Screening and management of precancerous lesions to prevent cervical cancer in lowresource settings ; Asian Pacifc Journal of Cancer Prevention, pp.277 280. 51. R. Sankaranarayanan, L. Gafkin, M. Jacob, J. Sellors, S. Robles (2005); A critical assessment of screening methods for cervical neoplasia ; International Journal of Gynecology & Obstetrics, pp.412. 52. M. Spitzer (2006); Human papillomavirus: epidemiology, natural history, and clinical sequelae. New Options in HPV Prevention. Supplement to OBG Management , www.obgmanagement.com 53. JS. Smith, L. Lindsay, B. Hoots et al (2007); Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and highgrade cervical lesions: a meta analysis update; Int J Cancer, p. 621 632. 54. Sambrook Joseph, David W. Russell (2001); Molecular Cloning – A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory press; vol. 2, pp. 8.188.25, 8.107 8.108. 55. Ruediger Klaes, Stefan M. Woerner, Ruediger Klaes Ridder, Nicolas Wentzensen, Mathias Duerst, Achim Schneider (1999), Detection of highrisk cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer by amplification of transcrips derived from intergrated Papollomavirus oncogenes . Cancer Res. Dec, p. 61326136. 56. J. M. Walboomers, M. V. Jacobs, M. M. Manos, F. X. Bosch, J. A. Kummer, K. V. Shah, P. J. Snijders, J. Peto, C. J. Meijer, and N. Munoz (1999); Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide ; J. Pathol; p. 12–19.
89. 57. H. Zur Hausen and E. M. de Villiers (1994); Human papillomaviruses ; Rev. Microbiol; p. 427–447. 58. I. Zehbe, E. Wilander (1997); Human papillomavirus infection and invasive cervical neoplasia: a study of prevalence and morphology ; J Pathol, p. 270–275. 59. World Health Organization (WHO) (2006), Comprehensive Cervical Cancer Control: A Guide to Essential Practice . Geneva: WHO III. Tài liu t Internet 60. vaungthuophunu 61. 62. 63. 64. 65. 1021215396.html 66. 67. 68. 69. khoe/2011/08/hon5000phunumacungthucotu cungmoinam1/ 70. phunumacungthucotucungdanggia tang/20115/89898.vnplus 71. khoe/Phathiensomungthucotucung/30136748/248/ 72. khoe/Ungthucotucung80doHPV/30165042/248/ 73. bds.com/ContentDetails.aspx?ID=1a3c30cb145b4bc 74. soatungthuco tucungbangsoivasinhthietcotucung.htm
90. 1 M ĐU 1. Tính cp thit ca ñ tài HPV là virut gây u nhú và gây nhiu bnh ngưi, ñc bit là ph n như ung thư c t cung, mn cơm, mn cóc, các sùi mào gà da, âm h, hu môn, ph n, HPV là nguyên nhân chính gây ung thư c t cung, chim 97% tng s trưng hp [15, 30, 39, 56]. Đây là loi ung thư khá ph bin ph n, ñng th hai sau ung thư vú. Hàng năm, trên th gii có hơn na triu ph n b ung thư c t cung và trên 50% trong s này t vong do phát hin bnh giai ñon mun [71]. Vit Nam, theo thng kê chưa ñy ñ, trong 10 năm qua, mi năm có khong 6000 ph n cht vì bnh này, cao gp ñôi s ph n cht vì AIDS, mc dù ung thư c t cung có th ñưc cha khi hoàn toàn nu ñưc phát hin sm [73]. Hin nay ñã tìm thy hơn 100 type HPV, trong ñó khong 40 type tác ñng lên ñưng sinh dc nhưng ch 13 type có nguy cơ gây bnh cao, ñc bit type 16. Type 16 hin din trong hơn 50% s ca mc bnh ung thư c t cung [13]. Kh năng gây bnh ung thư ca HPV type 16 là do protein sm E6 và E7 ñưc mã hóa t gen sm E6 và E7 ca chúng gây ra. Hai protein này thúc ñy quá trình chuyn bin ca khi u ác tính, ñng thi c ch h thng tiêu dit và ñàn áp khi u ca cơ th [27; 37; 38; 39]. C th, protein E6 kích thích phân gii p53 là cht ñiu khin chu kỳ t bào; protein E7 gn vào pRb là cht ñiu hòa tăng sinh t bào. Như vy protein E6, E7 ca virut kìm hãm chc năng chng ung thư ca protein p53 và pRb trong cơ th [8]. Khi virut xâm nhim t bào, b gen virut tn ti dng plasmid ñc lp vi b gen t bào. trng thái ñó, gen E6 và E7 không hot ñng do s c ch ca gen E2. Nu có s gn chèn gen E6 và E7 vào b gen t bào, 2 gen này thoát khi s c ch s hot ñng mã hóa to protein E6, E7. Do vy, da vào s hin din ca mRNA E6 và E7 có th xác ñnh mt cách chính xác s gn chèn gen gây ung thư c t
91. 2 cung ca HPV vào b gen ngưi. Nu phát hin sm s gn chèn gen E6, E7 HPV vào b gen t bào c t cung, kh năng cha khi bnh hoàn toàn ñn 95%, ngưc li t l sng thêm 5 năm còn khong 5% [64]. Hin nay có nhiu phương pháp ñưc s dng chn ñoán ung thư c t cung do HPV type 16 gây ra như phương pháp t bào hc, phương pháp PCR, realtime PCR, Tuy nhiên, các phương pháp này ch chn ñoán ngưi bnh có hay không có tác nhân gây ung thư, không chn ñoán ñưc mt cách chính xác kh năng b ung thư. Vi nhng ý nghĩa trên, chúng tôi thc hin ñ tài: “Nghiên cu phát hin s gn chèn gene E6 và E7 ca Human papilomavirus type 16 vào b gene ngưi bng k thut multiplex RTPCR” 2. Mc tiêu ca ñ tài Nghiên cu phát hin s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 gây ung thư c t cung vào b gen ngưi bng k thut multiplex RT – PCR. 3. Ý nghĩa khoa hc Kt qu ca ñ tài là cơ s xác ñnh s gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 gây ung thư c t cung vào b gen ngưi. 4. Ý nghĩa thc tin Sn phm ca ñ tài là cơ s cho chn ñoán và xác ñnh tin ung thư c t cung ph n do hin tưng gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi, là cơ s cho la chn liu pháp ñiu tr thích hp, góp phn bo v sc kho cho cng ñng.
92. 3 Phn I TNG QUAN TÀI LIU 1.1. Khái nim ung thư c t cung Ung thư c t cung là nhng tn thương ác tính phát trin ti c t cung. Ung thư xut hin khi các t bào c t cung bin ñi và phát trin bt thưng mt cách không kim soát. Ung thư c t cung tin trin bng cách có th xâm ln ti ch hay lan rng ñn nhng cơ quan khác ca cơ th và gây t vong. Nhim lâu dài virut Papilloma là ñiu kin cn ñ dn ñn ung thư c t cung. Theo nghiên cu ca Cơ quan Quc t v ung thư thì 99,7% các trưng hp ung thư c t cung có s hin din ca HPV type nguy cơ cao [46]. C t cung gm hai phn: c ngoài và c trong C ngoài gm các t bào biu mô lát ging t bào biu mô lát ca âm ño nhưng trơn láng hơn. C trong là biu mô tuyn gn ging như biu mô ca ni mc t cung. Ch tip giáp gia biu mô lát ca c ngoài và biu mô tuyn ca c trong ñưc gi là l c ngoài mô hc. Đây là vùng chuyn tip (transformation zone) ca hai loi biu mô. Các trưng hp ung thư c t cung ñu xut phát t vùng này [46]. Giai ñon IB sm Giai ñon IB mun Giai ñon IIB T cung C t cung Âm ño Ung thư Hình 1.1: S phát trin ca các t bào bt thưng trong bnh ung thư c t cung
93. 4 1.2. Tác nhân gây ung thư c t cung 1.2.1. Tác nhân [39, 52] Hu ht các trưng hp b bnh ung thư c t cung là do HPV gây ra. HPV type 16 thuc: H: Papovaviridae Ging: Papillomavirus Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 Loài: Human papillomavirus HPV type 16 không có v bao, ñưng kính 50 55nm, capsid hình khi ña din. 1.2.2. Các type ca HPV Hin nay, ngưi ta phát hin có hơn 100 type HPV, mà s khác nhau v b gen gia các type ch khong 10% [19]. Da vào kh năng gây ung thư, HPV ñưc chia thành hai loi: Type nguy cơ cao (high – risk type): gm các type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82. Các type này có kh năng gây ung thư cao, thưng liên quan ñn lon sn và ung thư c t cung [52]. Type nguy cơ thp (low – risk type): gm các type 6, 11, 26, 42, 44, 54, 70, 73, chúng ch gây ra các mn cóc vùng sinh dc hoc các bt thưng t bào c t cung hoc có th không biu hin triu chng bnh trong kt qu lâm sàng [52]. Trong các type nguy cơ cao, hai type có liên quan ñn khong 70% trưng hp mc bnh là type 16 và 18 [17, 53]. Riêng type 16 ñưc nhn thy là ph bin nht, chúng hin din trong khong 50% trưng hp b bnh ung thư c t cung [13, 19, 36]. So sánh v mc ñ nguy him gia các type, theo Giáo sư Anthony Gunnel (Vin Karolisnka, Stockhom), vi nhng ph n nhim HPV type 16 nng ñ cao, nguy cơ b ung thư c t cung tăng gp 6 ln so vi ph n nhim HPV các type khác [64].
94. 5 1.2.3. B gen ca virut HPV type 16 HPV type 16 có b gen là chui DNA xon kép, tn ti dưi dng vòng (hoc episome), ch mã hoá cho sáu gen sm (E) và hai gen mun (L). Cũng như ña s virut, HPV có hin tưng các gen chng lên nhau ñưc hình thành trong quá trình tin hóa ñ s dng ti ña tim năng gen trong mt b gen rt nh bé [8]. Hình 1.3: Cu trúc b gen ca HPV type 16 B gen ca HPV type 16 có chiu dài 7906bp và ñưc chia làm 3 vùng chính [14, 55]:
    Vùng sm (early region): chiu dài khong 4kb; gm 6 gen là: E1, E2, E4, E5, E6, E7. Vùng này có chc năng mã hóa cho nhng protein không cu trúc liên quan ñn cơ ch sinh ung thư. Trong ñó, hai gen gây ung thư quan trng nht là E6 và E7 ln lưt có chiu dài khong 500bp và 300bp [39, 52].  Gen E6 ca HPV type 16 mã hóa cho Protein E6 ca virut. Protein này có th tương tác vi khong 12 protein khác nhau trong t bào ch nhưng quan trng nht là protein p53. Protein p53 là protein c ch khi u và kim soát chu trình t bào, giúp cho t bào cht theo chương trình ñã ñnh sn hay còn gi ñây là quá trình apoptosis. Khi Protein E6 ca HPV type 16 gn kt vi protein p53 ca cơ th làm
95. 6 protein p53 b bt hot và dn ti hin tưng t bào không b cht ñi theo chương trình ca chúng hay còn gi là bt t hóa t bào [4, 25].  Gen E7 ca HPV type 16 mã hóa cho protein E7 ca virut. Protein này khi kt hp vi protein retinoblastoma (pRb) ca t bào ch s làm bt hot pRb. Trong quá trình bit hóa t bào biu mô, pRb là yu t chính ñiu hòa chu trình t bào, giúp t bào phát trin theo chương trình ca chúng. Vì vy, s gn kt ca protein E7 ca virut vào pRb ca t bào ch s làm bt hot pRb. Kt qu là t bào tăng sinh liên tc và chuyn thành ung thư [47].
    Vùng mun (late region): chiu dài khong 3kb; gm 2 gen mun là: L1 và L2. Chc năng ca vùng này là mã hóa protein cu trúc gm 2 protein v ca virut. Ngưi ta thưng da vào vùng này ñ phân type ca virut và nghiên cu sn xut vaccine HPV.
    Vùng không mã hóa (long control region LCR) : chiu dài khong 1kb. Vùng này có vai trò ñiu hòa s nhân ñôi và biu hin gen ca virut. 1.2.4. S xâm nhim v mt phân t, hin tưng chèn gen ca virut HPV type 16 vào b gen ngưi Hin nay, ngưi ta vn chưa xác ñnh ñưc cơ ch gn chèn gen E6 và E7 ca HPV type 16 vào b gen ngưi. Nhưng vi các nghiên cu t trưc ti nay, quá trình xâm nhim và gây ung thư c t cung ca HPV các type nguy cơ cao cũng như type 16 ñã ñưc mô t khá ñy ñ và rõ ràng [63]. C t cung bình thưng có mt ch hp gi là “vùng chuyn tip t bào biu mô tr gai” (transformation zone). S xâm nhim HPV type 16 thưng xy ra vùng này nht do chúng thích hp vi ñc tính bin ñi t t bào ñáy thành t bào gai. Trưc tiên, HPV type 16 s xâm nhim vào lp t bào ñáy, nhân bn to ra các bn sao và th b sung, ñng thi biu hin các gen sm E1, E2, E4, E5, . Hot ñng này ñưc tin hành tách bit vi b gen ch trong nhân t bào. Các lp t bào
96. 7 ñáy b nhim virut tip tc chu trình bit hoá bin ñi thành t bào gai, lúc này hai gen mun L1 và L2 mi ñưc biu hin và to ra các phn còn li ca virut. Nh hot ñng tăng sinh liên tc ñ thay th các t bào già, cht, các virut HPV type 16 mi to thành s ñưc phóng thích ra ngoài [63]. Hình 1.4: Quá trình xâm nhim và gây bnh ca HPV type 16 trong t bào ch Vic nhim HPV type 16 là ñiu kin cn nhưng chưa ñ ñ gây ung thư c t cung. S kin cho vic bt ñu gây bnh là hin tưng chèn gen ca HPV type 16 vào b gen ngưi, dn ñn ri lon các chc năng t bào. Hin tưng chèn gen ca HPV type 16 vào b gen ngưi ñưc phát hin trong hơn 90% trưng hp ung thư c t cung [47]. trng thái bình thưng, b gen virut HPV type 16 tn ti dưi dng DNA plasmid, ñc lp vi nhân t bào ch, trong ñó có hai gen gây ung thư quan trng nht là E6 và E7. Hai gen này ch biu hin kh năng gây ung thư khi ñưc phiên
97. 8 mã thành mRNA, sau ñó dch mã thành protein. Nhưng trng thái bình thưng, chúng không phiên mã sang mRNA theo hot ñng nhân bn ca virut vì do b c ch và kìm hãm bi gen E2 ca HPV type 16, do vy, chúng tn ti ñc lp theo b gen virut mà không nh hưng ñn b gen t bào ch nu không có hin tưng chèn gen xy ra [24]. Vic t bào b nhim dai dng type 16 s làm cu trúc t bào c t cung ri lon và chu trình t bào b xáo trn. Đn mt lúc nào ñó, khi nhim sc th ngưi b mt n ñnh, mt s v trí d gãy trên nhim sc th s tr nên lng lo và yu t. Dưi mt ñiu kin thun li nào ñó, b gen ca virut HPV type 16 s chèn vào các v trí trên, gn kt hai gen E6 và E7 vào b gen t bào ch. Khi ñó chúng ñưc phiên mã thành mRNA, dch mã thành protein theo hot ñng ca t bào [24]. Khi gn vào b gen t bào ch, hai gen sinh ung thư E6 và E7 s mt ñi s kim soát ca gen E2 nên biu hin rõ kh năng gây ung thư. Mt vài nghiên cu cho thy, E6 và E7 có nhim v mã hoá cho hai protein làm c ch hai h thng tiêu dit và ñàn áp khi u p53 và pRb ca t bào ch. Vic bt hot h thng p53 s dn ñn hin tưng bt t hoá t bào (do kích hot enzym telomerase – có vai trò kéo dài ñu telomere ca nhim sc th) và bt hot pRb s làm cho t bào tăng sinh liên tc, gây mt n ñnh t bào và chuyn thành ung thư c t cung [24]. Khi các t bào ung thư bt ñu xâm ln vào mô liên kt, có chiu hưng lan rng dc theo màng ñáy ñưc gi là ung thư xâm ln (invasive cancer). Ung thư c t cung nu tin trin nng có th di căn sang bng, phi và mt s nơi khác. Trưc khi chuyn bin thành ung thư, t giai ñon nhim HPV type 16, t bào còn phi tri qua các giai ñon tn thương trong t bào biu mô c t cung hay nghch sn c t cung ( Cervical Intraepithelial Neoplasia CIN ). Tuỳ mc ñ nng nh mà ngưi ta chia CIN thành ba loi: CIN I, CIN II và CIN III, trong ñó CIN III tn thương nng nht. Hu ht các nghiên cu ñu cho rng, hin tưng chèn gen
98. 9 ca HPV type 16 ch xy ra trưng hp b CIN II, III và ung thư c t cung, còn CIN I ch hin din DNA virut dưi dng episome [29]. Mt vài thng kê cho thy, ñi vi nhng bnh nhân ñang giai ñon CIN I thì có khong 60% trưng hp t thoái bin, 30% vn gi nguyên tình trng, 10% tin trin thành CIN III và trong ñó 1% tr thành ung thư. Vi CIN II, 40% t thoái bin, 40% gi nguyên tình trng, 20% tin trin thành CIN III và trong ñó 5% chuyn sang ung thư. Đi vi CIN III, có 33% t thoái bin và hơn 12% chuyn thành ung thư [43]. Bng 1.1: T l tin trin ca các giai ñon CIN sang ung thư c t cung Din bin t bào Chuyn t CIN T thoái CIN I CIN II CIN III III sang ung thư bin (%) (%) (%) (%) Trng thái t bào (%) CIN I 60 30 10 1 CIN II 40 40 20 5 CIN III 33 67 12 Theo mt nghiên cu khác v mi tương quan gia t l gn chèn và mc ñ tn thương CIN trong t bào c t cung, hin tưng gn chèn xut hin trong 4.5% trưng hp CIN II, 15.6% ñi vi CIN III và cao nht là 87.5% ñi vi bnh nhân ñã b ung thư c t cung [34]. 1.2.5. Tình hình nghiên cu gn chèn gen E6 và E7 ca HPV vào b gen ngưi hin nay Trên th gi, Feng WangJohanning và cng s (2002), nghiên cu v ñnh lưng DNA và RNA ca gene E6 và E7 HPV type 16 bng k thut Realtime PCR ñã ñưa ra kt lun: S dng Kit STAT60 (Tel – Test Int., Friendswood, TX) ñ